保存血紅蛋白血液替代品的方法

專利名稱：保存血紅蛋白血液替代品的方法
相關申請本申請是1998年10月14日提交的共同待審美國專利申請序列No.09/173,189的繼續，美國專利申請序列No.09/173,189是1997年11月19日提交的現在放棄的共同待審美國專利申請序列No.08/974,658的部分繼續申請，美國專利申請序列No.08/974,658是1995年6月7日提交的美國專利申請序列No.08/471,583，目前已頒布的專利5,691,452的繼續，美國專利申請序列No.08/471,583是1995年6月2日提交的美國專利申請序列No.08/458,916，目前已頒布的專利5,840,852的部分繼續申請，美國專利申請序列No.08/458,916是是1995年3月23日提交的美國專利申請序列No.08/409,337，目前已頒布的專利5,854,209的繼續，這些申請的全部內容都通過在此引述而合并于本篇。
人類血紅蛋白，作為血液替代品，具有滲透活性及運輸和傳遞氧的能力，但它也具有快速從循環系統排除的不利之處，通過腎途徑及通過血管壁，致使半衰期非常短，因此通常具有不滿意的半衰期。并且，人類血紅蛋白還常常被中毒量的內毒素，細菌和/或病毒污染。
非人類血紅蛋白具有與人類血紅蛋白相同的不足。此外，非人類源的血紅蛋白還常常被蛋白質，如抗體的污染，這樣會在受體內產生免疫系統反應。
以前，已經使用了至少四種其他種類的血液替代品，包括全氟化合物，合成血紅蛋白類似物，脂質體-包裹的血紅蛋白，和化學修飾的血紅蛋白。然而，許多這些血液替代品一般具有短血管內停留時間，被循環系統作為外源物質排除，或滯留在肝臟，脾臟和其他組織中。并且，許多這些血液替代品與生命系統沒有生物相容性。
因此，盡管制備血紅蛋白-基血液替代品目前已很先進，但仍存在需要含有足夠低量的污染物如內毒素，細菌，病毒，磷脂和非血紅蛋白蛋白質以預防免疫系統反應及任何由于血液替代品輸入引起的毒性作用的血液替代品。此外，血液替代品必須還能在環境條件下給組織運輸和傳遞充分量的氧，并必須具有良好的血管內停留時間。
并且，較好地，血液替代品1)具有通常與全血的腫脹活性等同的腫脹活性，2)在沒有交叉配血或敏感性測試的情況下，能被輸入到大多數受體中，3)可使用最小的冷藏量長時間保存。
本發明的概述本發明涉及保存脫氧血紅蛋白血液替代品的方法，并涉及保存的脫氧血液替代品。
本發明涉及保存脫氧血紅蛋白血液替代品的方法，包括將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在包括透明層壓物料的氧屏障膜初級包裝中，所說的膜在25℃及外界相對濕度約為50％條件下，單位大氣壓每24小時氧滲透量小于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米)。
本發明還涉及保存的脫氧血紅蛋白血液替代品。所說的保存的血液替代品包括脫氧血紅蛋白血液替代品和氧屏障膜初級包裝。所說的氧屏障膜初級包裝包括透明的層壓物料，在25℃及外界相對濕度約為50％時，單位大氣壓每24小時氧滲透量小于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米)，脫氧血紅蛋白血液替代品在其中密封，從而在基本上不含氧的環境中保存脫氧血紅蛋白血液替代品。
本發明的一個優勢是依據本發明的方法制備并儲存的血紅蛋白具有較高純度及較長存放期。具有高氧屏障的初級包裝使得初級包裝在使用高屏障透明外包裝前和除去透明外包裝后能保護產品的穩定性。此外，透明初級包裝可允許視覺檢測產品狀況。并且，本發明通過消除對保存血紅蛋白血液替代品的其他屏障膜的需要而降低塑料和醫療上的浪費，其他屏障膜如透明外包裝。
在室溫下血液替代品能保存多達兩年或更長時間，這是超過先有方法的顯著改善。并且，含有本發明的提純血紅蛋白的一種血紅蛋白可成功地在不同種受體中用作血液替代品，并且受體種類不會遭受顯著的副作用。本發明的詳細描述本發明方法的性質和其他細節現在進行更具體的描述并在權利要求書中列出。可以理解認為本發明的具體實施方案通過實施例方式演示，并且不作為對本發明的限制。本發明的主要性質可在不背離本發明范圍的不同實施方案中使用。
在一個實施方案中，本發明涉及一種保存脫氧血紅蛋白血液替代品穩定性的方法。這種方法包括將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在氧屏障膜初級包裝中。在一個實施方案中，氧屏障膜初級包裝包括在25℃及外界相對濕度約為50％條件下，單位大氣壓每24小時氧滲透量小于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米)的透明聚合物膜。較好地，初級包裝具有在25℃單位大氣壓每24小時氧滲透量小于約0.6cc每100平方英寸(或約0.093cc每100平方厘米)。在另一個實施方案中，聚合物膜是層壓的。
在另一個實施方案中，本發明涉及保存的脫氧血紅蛋白血液替代品，包括脫氧血液替代品和氧屏障膜初級包裝。在一個實施方案中，氧屏障膜初級包裝包括透明聚合物膜。初級包裝具有在25℃及外界相對濕度約為50％條件下，單位大氣壓每24小時氧滲透量小于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米)，脫氧血紅蛋白血液替代品在其中密封，從而在基本上不含氧的環境中保存脫氧血紅蛋白血液替代品。在另一個實施方案中，聚合物膜是層壓的。
氧屏障膜包括適當的氧屏障物料，這樣物料在25℃和環境濕度條件下，如50％濕度下具有適當的氧屏障特性。在本發明的一個實施方案中，氧屏障物料包括具有至少一層的透明聚合物膜。在更具體的實施方案中，膜包括外部聚烯烴層(如聚乙烯或聚丙烯)，氧屏障層和內部聚烯烴層的層壓物。其中內層與包裝的內容物接觸。本發明的聚烯烴可包括兩種或多種單體的共聚物，其中單體可以是，如，聚丙烯，聚乙烯，或聚丁烯。在另一個實施方案中，其他單體如乙烯乙酸乙烯酯可包括在共聚物中。根據氧屏障層的種類，層壓物可任意地包括支持層。當不受理論約束時，支持層便于使用自動裝置制備袋。在一個較好的實施方案中，支持層是雙軸取向物料如尼龍。在一個實施方案中，使用此領域中已知的方法，可將透明物料制成預防光降解的。
在一個實施方案中，外部聚烯烴層和氧屏障層是共同擠壓的。在一個較好的實施方案中，外部聚烯烴層是中密度聚乙烯，氧屏障層是乙烯乙烯基醇。
在本發明的另一個實施方案中，氧屏障膜包括共同擠壓的中密度聚乙烯/乙烯乙烯基醇層，厚度約為0.002英寸[或約56微米(μm)]；尼龍層厚度約為0.00048英寸(或約12.2微米)；低密度聚乙烯層厚度約為0.0020英寸(或約50.8微米)。
當不受理論約束時，內部和外部聚烯烴層是汽屏障層。每層的汽屏障屬性可通過增加層的厚度來增加。然而，在包裝的外邊沒有必要有汽屏障層，然而，為了自動制備無菌袋，需要具有外部聚烯烴層，如中密度聚乙烯層，因為這一層在滅菌過程中保護了氧屏障層的穩定性。如，這一層通過過氧化氫浴在拉膜過程中保護氧屏障層。其他適合的外層包括，如，線性低密度聚乙烯，低密度聚乙烯，高密度聚乙烯，或聚丙烯。可理解認為，如果不需要滅菌過程，外部聚烯烴層將不需要。此外，如果使用其他的滅菌技術，其中氧屏障層不受到影響，或其中使用經受住滅菌過程的氧屏障層，那么外部聚烯烴層也不需要。
在本發明的另一個實施方案中，氧屏障層包括基本上不滲透氧的聚合物，包括包膜支持物料。在一個實施方案中，支持物料可以是如聚酯或聚酰胺(如尼龍)，包膜可以是氧化硅(SiOx)或能沉積在支持物料上以使其不滲透氧的其他物料，如金屬氧化物。
任意地，可使用透明外包裝。透明外包裝可由適當的物料制備，如聚合物膜(如基本上不滲透氧的聚酯，聚丙烯，乙烯乙烯基醇(EVOH)，或尼龍)或層壓物，如金屬箔層壓物(如銀或鋁金屬箔層壓物)或其他氧屏障層壓物。其中透明外包裝是膜，如聚酯膜，通過多種適當的方法膜可使得膜不滲透氧。在一個實施方案中，制備的膜基本上不滲透氧。可替換地，其中聚合物物料的不滲透氧性不足以滿足所要求的規格，膜可進行層壓，或作其他處理與降低或消除氧滲透性。在一個較好的實施方案中，使用金屬箔層壓物，其中金屬箔是率，銀，金或其他金屬。較好地，金屬箔的厚度在約0.0001到0.001英寸之間(或在約2.54到25.4微米之間)，更好地，為約0.0003英寸(或為約7.62微米)。通常層壓物包括一個或多個聚合物層。聚合物可以是多種聚合物料，包括如聚酯層(如48規格聚酯，或約12.2微米)，尼龍，乙烯乙烯基醇，聚氯乙烯等。
如果存在，初級包裝和透明外包裝，可以是多種結構的，包括瓶，圓筒，盒等。在一個較好的實施方案中，初級包裝是袋狀的。制備適當的袋可通過如以薄片的周長粘結一個或多個(如兩個)薄片以形成牢固封閉的，不滲透氧的，具有可填充中心的結構。粘結可使用任何適合的物料實施。其中線性低密度，低密度，中密度或高密度聚乙烯用作物料的內層，在適當條件下通過加熱可密封薄片。此領域中眾所周知的是，在適當的條件下，加熱可使聚乙烯自身密封。此領域中眾所周知的是，變化參數可獲得膜聚烯烴表面的適當粘結，這些參數包括溫度，壓力和“停留時間”。其中停留時間是薄片置于壓力和溫度下的持續時間。一般，線性低密度聚乙烯需要較少的熱量，而逐漸增高密度的聚乙烯需要逐漸增多的熱量。如，將在兩片薄片的內表面上的含有1.5千分之一英寸(0.0015英寸或38.1微米)線性低密度聚乙烯的層壓物在50psi(34047牛頓/平方厘米)，300(149℃)下處理1秒，可產生適用在本發明的方法中的密封。此外，高密度聚烯烴一般在粘結過程中耐受較高的壓力。通常，如果壓力過高，加熱的物料可能會從接觸的區域壓走，產生較弱的密封。在聚酯/金屬箔層壓物的情況中，可使用聚酯粘合劑作為實施例。
在一個較好的實施方案中，血液替代品在基本上不含氧的氛圍中包裝。適當的氛圍包括氮，氬和氦氛圍。
如本文中所描述的，血液替代品是使用在人類，哺乳動物和其他脊椎動物中的血紅蛋白基攜氧組合物，其能運輸并傳遞氧到重要的器官和組織，至少能保持足夠的血管內腫脹壓。脊椎動物是傳統定義的脊椎動物，包括人類，或在循環系統中使用血液傳遞氧到組織中的任何其他脊椎動物。此外，循環系統的定義是傳統上的定義，包括心臟，動脈，靜脈和包括較小脈管結構如毛細血管的微循環。
本發明的血液替代品較好地含有內毒素，磷脂，外源蛋白質和其他污染物的量不會產生顯著的免疫系統反應，并且對受體是非-毒性的。較好地，血液替代品是超純的。如本文所定義的超純的，意指含有少于0.5EU/毫升的內毒素，少于3.3毫微摩爾/毫升的磷脂，和少到不可檢測量的非-血紅蛋白蛋白質，如血清清蛋白或抗體。
“內毒素”是指細胞結合脂多糖，產生作為革蘭氏陰性細菌細胞壁外層的一部分，其在許多條件下是有毒的。當注射到動物中時，內毒素可引起發熱，腹瀉，出血性休克和其他組織損傷。內毒素單位(EU)已由1983年的美國藥典協定(3014頁)定義為包含在0.1毫微克美國參考標準批EC-5中的活性。一管形瓶EC-5含有10,000EU。適合在血液替代品中確定內毒素濃度的方法實施例包括由Associates of Cape Cod,WoodsHole,Massachusetts研制的“動力學/比濁 Limuus amebocyticlystate(LAL)5000法”。
穩定的聚合血紅蛋白，如本文所定義的，是血紅蛋白基攜氧組合物，其在適當的儲存溫度下在兩年或更長時間的儲存期間，基本上不增加或減少分子量分布和/或高鐵血紅蛋白的量，當儲存在低氧環境中時，較好地是兩年或更長的時間。適于儲存一年或更長時間的儲存溫度在約0℃到約40℃之間。較好的儲存溫度范圍在約0℃到約25℃之間。
適當的低氧環境，或基本上不含氧的環境，定義為在至少約兩個月的儲存期間，較好地在至少約1年的儲存期間，或更好地在至少約兩年的儲存期間，產生高鐵血紅蛋白濃度少于約15％重量百分比血液替代品的與血液替代品接觸的氧累積量。氧累積量包括滲入到血液替代品包裝中的氧和血液替代品和包裝的原始氧量。
貫穿這種方法，從紅血細胞(RBC)收集到血紅蛋白聚合，血液溶液，RBC和血紅蛋白都保持在足以最小化微生物生長，或生物負擔的情況下，如保持溫度為低于約20℃并高于0℃。較好地，溫度保持在約15℃或更低。更好地，溫度保持在10±2℃。
在這種方法中，用于制備穩定聚合血紅蛋白血液替代品過程中的部分組成是基本上清潔的以產生無菌的產品。無菌如此領域中所定義的，具體地，溶液滿足在USP ⅩⅫ第71部分，1483-1488頁中提供的美國藥典對無菌的要求。并且，暴露在過程物流中的部分組成通常用不與過程物流反應或污染過程物流的物料制備或覆蓋。這樣的物料包括不銹鋼和其他鋼合金，如因科鎳合金。
適當的RBC源包括人類血液，牛血液，綿羊血液，豬血液，從其他脊椎動物獲取的血液和轉基因制備血紅蛋白，如在生物技術，12:55-59(1994)中描述的轉基因Hb。
血液可從肝臟或新鮮宰殺的供體獲取。一種收集牛全血的方法在頒布給Rausch等人的美國專利No.5,084,558和5,296,465中描述。較好的是以清潔方式收集血液。
在收集時或其后不久，將血液與至少一種抗凝血劑混合以預防血液的顯著凝結。血液適當的抗凝血劑是此領域中傳統上已知的，包括如檸檬酸鈉，乙二胺四乙酸和肝磷脂。當與血液混合時，抗凝血劑可以是固態的，如粉末，或是水溶液。
可以理解認為，血液溶液源可來自新鮮收集的樣品或來自老樣品，如從血庫獲取的期滿人類血液。并且，血液溶液可以預先已被保持在冷凍狀態和/或液體狀態。較好地，使用在這種方法中的血液溶液不是冷凍的。
在另一個實施方案中，在將血液溶液引入到抗凝血劑中以前，測定血液溶液中的抗生素量，如青霉素的量。通過檢驗血液樣品的供體沒有進行抗生素治療，確定抗生素的量以提供血液樣品沒有負擔感染性生物體的確信程度。適當的測定抗生素的方法包括青霉素測定試劑盒(Difco,Detroit,MI)，使用名為“快速檢測奶中青霉素”的方法。較好地，血液溶液含有青霉素的量少于或等于約0.008單位/毫升。或者，可使用牧群管理程序來監測牲畜中的疾病或抗生素治療。
較好地，在抗凝血劑步驟期間或之前，將血液溶液粗濾，如通過粗濾除去大聚集體和顆粒。600目篩是適當的粗濾器實例。
然后用適當的方式沖洗血液溶液中的RBC，如通過透濾法或使用至少一種溶液，如等張溶液通過間斷稀釋和濃縮步驟的組合來從胞外血漿蛋白質，如血清清蛋白或抗體(免疫球蛋白(IgG))中分離RBC。可以理解認為，RBC可以間歇或連續進料方式沖洗。
可接受的等張溶液是此領域中已知的，包括溶液，如檸檬酸/鹽溶液，具有不會裂解RBC細胞膜的及取代全血血漿部分的pH和等滲容摩。較好的等張溶液具有中性pH及等滲容摩在約285-315mOsm之間。在一個較好的實施方案中，等張溶液由檸檬酸鈉二水合物(6.0克/升)和氯化鈉(8.0克/升)的水溶液組成。
可使用在本發明中的水包括蒸餾水，去離子水，注射用水(WFI)和/或低熱原水(LPW)。WFI是較好的，其是去離子蒸餾水，滿足注射用水的美國藥典規格。WFI進一步在藥學工程，11,15-23(1991)中描述。LPW是較好的，其是含有少于0.002EU/毫升的去離子水。
較好地，在加入到血液溶液中以前，將等張溶液過濾。適當的過濾器實例包括Millipore10,000道爾頓超過濾膜，如Millipore Cat#CDUF 050 G1過濾器或A/G技術空心過濾器，10,000道爾頓(Cat#UFP-10-C-85)。
在一個較好的實施方案中，通過透析過濾法沖洗血液溶液中的RBC。適當的透析過濾器包括孔大小能將RBC從顯著小的血液溶液組成中分離出的微孔膜，如0.1微米到0.5微米的過濾器(如0.2微米空心纖維過濾器，Microgon Krosflo Ⅱ微過濾藥液筒)。同時，過濾的等張溶液以與濾出液流出透析過濾器的速度(或體積)相同的速度連續地(或間歇地)作為補充加入。在RBC沖洗期間，直徑顯著小于RBC的血液溶液組成，或流體如血漿，在濾出液中穿過透析過濾器的壁。RBC，血小板和稀釋血液溶液的較大組成，如白細胞，保留在并與等張溶液混合，其連續地或間歇地進入以形成透析血液溶液。
在一個更好的實施方案中，在透析過濾容器中血液溶液的體積初始通過在透析過濾容器中加入一定體積的過濾的等張溶液來稀釋。較好地，加入等張溶液的體積約等于初始血液溶液的體積。
在可替換的實施方案中，RBC通過一系列連續(或逆向連續)稀釋和濃縮步驟沖洗，其中血液溶液通過加入至少一種等張溶液稀釋，通過流過過濾器，從而形成透析血液溶液來濃縮。
當污染RBC血漿蛋白質的量已被顯著地減少(通常至少約90％)，RBC沖洗就完成了。一般，當從透析過濾器34排出的濾出液的體積等于約300％的，或更多的，在用過濾的等張溶液稀釋前包含在透析過濾容器中的血液溶液的體積時，RBC沖洗就完成了。另外的RBC沖洗可進一步從RBC中分離細胞外血漿蛋白質。如，用6倍體積的等張溶液透析過濾可從血液溶液中除去至少約99％的IgG。
然后將透析的血液溶液用將透析血液溶液中的RBC從白細胞和血小板中分離的裝置處理，如通過離心作用。
可以理解認為，也可使用此領域中通常已知的其他方法將RBC從其他血液組成中分離出來。如，沉降法，其中在將RBC從其他血液組成中分離之前，分離方法不裂解顯著量的RBC的細胞膜，如少于約30％的RBC。
分離RBC后，接著通過將RBC溶胞從RBC中釋放血紅蛋白以形成含血紅蛋白溶液的裝置將RBC溶胞。溶胞裝置可使用不同的溶胞方法，如機械溶胞，化學溶胞，低滲溶胞或其他已知的釋放血紅蛋白但不顯著損傷Hb運輸和釋放氧能力的溶胞方法。
在另一個實施方案中，重組制備的血紅蛋白，如在自然，356:258-260(1992)中描述的重組制備的血紅蛋白，可使用在本發明的方法中替換RBC。如上所述沖洗含有血紅蛋白的細菌細胞，并從污染物中分離。然后使用此領域中已知的方法，將這些細菌細胞機械溶胞，如球磨，以從細胞中釋放血紅蛋白并形成溶胞細胞相。然后將這個溶胞細胞相進行如溶胞RBC相一樣的處理。
溶胞后，對溶胞的RBC相進行超過濾以除去較大的細胞碎片，如分子量超過約100,000道爾頓的蛋白質。通常，細胞碎片包括所有全過部分細胞組成，除了Hb，較小細胞蛋白質，電解質，輔酶和有機代謝中間產物。可接受的超過濾器包括，如由Millipore(Cat#CDUF 050 H1)制備的100,000道爾頓的過濾器和由A/G技術(Needham,MA；型號No.UFP100E55)制備的過濾器。
較好地，連續超過濾，直到溶胞的RBC相中的Hb濃度小于8克/升(g/l)以最大化可用來聚合的血紅蛋白的產量。可以使用從裂解RBC相中分離Hb的其他方法，包括沉降法，離心分離或微過濾。
Hb超濾出液可進行超過濾以從Hb超濾出液中除去較小細胞碎片，如電解質，輔酶，新陳代謝中間產物和分子量小于約30,000道爾頓的蛋白質，和水。適當的超過濾器包括30,000道爾頓超過濾器(Millipore Cat#CDUF 050 T1和/或Armicon,#540430)。
然后，濃縮的Hb溶液可直接倒入一個或多個并聯的層析柱中以通過高效液相層析進一步從其他組成中如抗體，內毒素，磷脂和酶和病毒中分離血紅蛋白。適當的介質實例包括陰離子交換介質，陽離子交換介質，疏水作用介質和親和介質。在一個較好的實施方案中，層析柱包括適于從非-血紅蛋白蛋白質中分離血紅蛋白的陰離子交換介質。適當的陰離子交換介質包括，如硅膠，氧化鋁凝膠，二氧化鈦凝膠，交聯右旋糖苷，瓊脂糖或衍生組成，如聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸羥乙酯和苯乙烯二乙烯基苯，已被陽離子化學官能團，如二乙基氨乙基或季氨乙基基團。適當的陰離子交換介質和與可能存在于溶胞的RBC相中的其他蛋白質和污染物相比選擇性吸附和解吸附Hb的相應洗脫液，可方便地由此領域中的合理技術確定。
在一個更好的實施方案中，一種方法用來從硅膠制備陰離子交換介質，其進行熱液處理以增加孔大小，用γ-glycidoxy丙基硅烷處理以形成活性環氧化物基團，然后用C3H7(CH3)NCl處理以形成季銨陰離子交換介質。這種方法在層析法期刊，120:321-333(1976)中作了描述。
首先層析柱用促進Hb結合的第一洗脫液沖洗進行預處理。然后將濃縮的Hb溶液注入到柱中介質中。注入濃縮Hb溶液后，然后用不同的洗脫液連續地沖洗層析柱以產生分離的，提純的Hb洗脫物。
在一個較好的實施方案中，在層析柱中使用pH梯度以從Hb中分離蛋白質污染物，如酶碳酸酐酶，磷脂，抗體和內毒素。具有不同pH值的系列緩沖液中的每一種，順序地倒入以在層析柱中的介質內產生pH梯度。較好地，緩沖液進行了過濾，如用10,000道爾頓除熱原膜。用來分離Hb的緩沖液應具有小的離子強度，這樣Hb和非-血紅蛋白污染物的洗脫通常取決于pH并不顯著地取決于離子強度。一般，離子濃度約為50mM，或更低的緩沖液具有適當的小離子強度。
第一緩沖液將濃縮的Hb運輸到層析柱的介質中并促進Hb與介質的結合。然后用第二緩沖液調節柱內的PH以洗脫污染的非-血紅蛋白組成而保持Hb與介質結合。然后用第三緩沖液洗脫Hb。收集Hb洗脫物。較好地，Hb洗脫物流過滅菌過濾器。適當的滅菌過濾器包括0.22毫微米過濾器，如Sartorius SartobranCat#5232507 G1PH過濾器。
在一個較好的實施方案中，Hb洗脫物開始的3％-4％和Hb洗脫物最后的3％-4％倒入廢料中以保證Hb洗脫物的純度。
其中層析柱可重新使用，保留在柱中的污染的非-血紅蛋白蛋白質和內毒素，可通過第四緩沖液洗脫。
使用pH梯度從非-血紅蛋白污染物中分離Hb進一步在1995年6月7目的美國專利5,691，452中描述。在一個較好的實施方案中，第一緩沖液是三羥甲基甲胺(Tris)溶液(濃度約為20 mM；pH約為8.4到約9.4)。第二緩沖液是第一緩沖液和第三緩沖液的混合物，第二緩沖液的pH約為8.2到8.6。第三緩沖液是Tris溶液(濃度約為50mM；pH約為6.5到約7.5)。第四緩沖液是氯化鈉/Tris溶液(濃度約為1.0M氯化鈉和約20mMTris；pH約為8.4到約9.4，較好的約為8.9-9.1)。特別推薦的是第二緩沖液的pH在約8.2到約8.4之間。
一般，使用的緩沖液溫度在約0℃到約50℃之間。較好的，使用期間緩沖液的溫度在約12.4±1.0℃。此外，緩沖液一般保存在溫度約9℃到約11℃之間。
在聚合形成脫氧Hb溶液(本文后稱脫氧-Hb)之前，較好地Hb洗脫物進行脫氧，通過基本上對Hb脫氧但不顯著降低Hb在Hb洗脫物中運輸和釋放氧能力的方式，如會由于形成氧化血紅蛋白(metHb)變性而產生。
在一個實施方案中，Hb洗脫物通過惰性氣體流過相膜的氣體輸送來脫氧。這樣的惰性氣體包括，如氮氣，氬和氦。可以理解認為，其他此領域中已知的脫氧血紅蛋白溶液的方式，也可用來脫氧Hb洗脫物。這樣的其他方式可包括，如氮氣噴射Hb洗脫物，用還原試劑如N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)，半胱氨酸，連二亞硫酸鈉或抗壞血酸鈉化學吹掃，或通過光來光解。
從層析柱洗脫后，較好地濃縮Hb洗脫物以改善過程的效率。Hb洗脫物重新循環流過超過濾器以濃縮Hb洗脫物形成濃縮的Hb溶液。適當的超過濾器包括，如，30,000或更小道爾頓超過濾器(如Millipore Helicon,Cat#CDUF 050 G1或Amicon Cat#540430)。一般，當Hb的濃度在約100到約120克/升之間時，Hb洗脫物的濃縮完成。當濃縮Hb洗脫物時，Hb洗脫物溫度較好地保持在約8-12℃。
然后將緩沖液倒入Hb溶液，Hb溶液較好地是濃縮的，調節Hb溶液的離子強度以增強Hb的脫氧作用。較好地，將離子強度調節到約150meq/升到約200meq/升之間以減小Hb溶液總Hb的氧的親和力。適當的緩沖液包括具有不會對Hb蛋白質產生顯著的變性但有足夠高的離子強度以促進Hb脫氧的pH值的緩沖液。適當的緩沖液實例包括pH值范圍在約6.5到約8.9之間的鹽溶液。較好的緩沖液是水溶1.0M氯化鈉，20mM Tris溶液，pH約為8.9。
較好地，產生的緩沖Hb溶液重新循環流過超過濾器，再次濃縮Hb溶液以改善過程效率。在一個較好的實施方案中，當Hb的濃度約為100克/升到約120克/升之間時，濃縮完成。
在脫氧作用期間，Hb溶液循環流過適當的相轉移膜。適當的相轉移膜包括，如，0.05毫微米聚丙烯中空纖維微過濾器(如Hoechst-Celanese Cat# 5 PCM-107)。同時，惰性氣體逆向流過相轉移膜。適當的惰性氣體包括，如，氮氣，氬和氦。穿過相轉移膜的氣體交換，從而將氧從Hb溶液中剝離。
脫氧作用持續直到Hb溶液的pO2減少到其中在Hb溶液中氧化Hb(氧基血紅蛋白或HbO2)的量約為20％或更少的量。在一個較好的實施方案中，在Hb溶液中HbO2的量約為10％或更少。
在脫氧作用期間，Hb溶液的溫度通常保持在平衡脫氧速度和形成高鐵血紅蛋白速度的量上。保持溫度以抑制高鐵血紅蛋白的量少于約20％。當仍然在脫氧Hb溶液時，最優的溫度會產生高體血紅蛋白量少于約5％，較好的高鐵血紅蛋白量少于約2.5％。通常，在脫氧期間，Hb溶液的溫度保持在約19℃到約31℃之間。
在脫氧期間，和隨后的本發明的方法的剩余步驟中，Hb保持在低氧環境中以最少化Hb吸附氧并保持HbO2的量少于約20％，較好地少于約10％。
然后較好地用含有巰基化合物的低氧含量儲存緩沖液平衡脫氧-Hb，以形成氧化作用穩定性脫氧-Hb。適當的巰基化合物包括無-毒性還原試劑，如N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)D,L-半胱氨酸，γ-谷氨酰基-半胱氨酸，谷胱甘肽，2,3-二巰基-1-丙醇，1,4-丁二硫醇，硫代乙醇酸酯，和其他生物學上相容的巰基化合物。低氧含量儲存緩沖液的氧含量必須足夠低以不顯著地降低巰基化合物在緩沖液中的濃度，抑制在氧化作用穩定性脫氧-Hb中氧基血紅蛋白的含量到約20％或更少，較好地少于約10％。一般，儲存緩沖液含有pO2少于約50托。
在一個較好的實施方案中，儲存緩沖液應具有適于平衡Hb聚合和高鐵血紅蛋白形成的pH值，一般在約7.6到約7.9之間。
與脫氧-Hb混合的巰基化合物的量是足夠高以在聚合期間增加Hb分子間交聯并足夠低以不顯著降低Hb分子的分子間交聯的量，由于高離子強度會降低分子間交連。一般，需要約1摩爾巰基官能基團(-SH)氧化穩定約0.25摩爾到約5摩爾的脫氧-Hb。
在一個較好的實施方案中，儲存緩沖液含有約25-35mM磷酸鈉緩沖液(pH7.7-7.8)并含有在氧化作用穩定性脫氧Hb中NAC濃度在約0.003％到約0.3％重量比之間的一定量的NAC。更好地，在氧化作用穩定性脫氧Hb中NAC濃度在約0.05％到約0.2％重量比之間。
較好地，在與脫氧-Hb混合之前，過濾儲存緩沖液，如通過10,000道爾頓超過濾膜(Millipore Helicon Cat#CDUF 050 G1或A/G技術Maxcell Cat#UFP-10-C-75)。
在一個實施方案中，氧化作用穩定性脫氧-Hb流過任選過濾器。適當的過濾器包括0.2毫微米聚丙烯預濾器和0.5毫微米滅菌微過濾器(Pall Profile Ⅱ,Cat#ABIY005Z7或GelmanSupor)。脫氧-Hb保持在基本上不含氧的環境中。這可以通過在用氧化作用穩定性脫氧-Hb填充前或后，用惰性氣體如氮氣吹掃和覆蓋過程裝置來實施。
任意地，在將氧化作用穩定性脫氧-Hb轉移到聚合過程前，可在聚合反應器中加入適當量的水。在一個實施方案中，適當量的水是當氧化作用穩定性脫氧-Hb加入到聚合反應器中時產生的溶液濃度約為10到約100克/升的水量。較好地，水是貧氧的。
在聚合步驟中水的pO2減少到足以抑制HbO2含量到約20％后，通常少于約50托，聚合反應器用惰性氣體覆蓋，如氮氣。然后將氧化作用穩定性脫氧-Hb轉移到聚合反應器中，同時用適當流量的惰性氣體覆蓋。
當與交聯試劑接觸時，將在聚合反應器中的氧化作用穩定性脫氧-Hb溶液的溫度升高到最優化氧化作用穩定性脫氧-Hb聚合的溫度。通常，在聚合作用中，氧化作用穩定性脫氧-Hb的溫度在約25℃到約45℃，較好地約41℃到約43℃。可接受的加熱聚合反應器的熱傳遞裝置實例夾套加熱系統，其通過在夾套中直接加入熱1,2-亞乙基二醇加熱。
然后，在足以聚合氧化作用穩定性脫氧-Hb形成聚合血紅蛋白(聚(Hb))的溫度下，將氧化作用穩定性脫氧-Hb用適當的交聯試劑處理約2小時到約6小時的一段時間。
適當的交聯試劑的實例包括可交聯Hb蛋白質的多官能試劑，如戊二醛，琥珀醛，激活形式的聚氧化乙烯和右旋糖苷，α-羥基醛，如羥乙醛，N-馬來酰亞胺基-6-氨基己酰基-(2’-硝基，4’-磺酸)-苯基酯，m-馬來酰亞胺安息香酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯，琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯，磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯，N-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙酰基)氨基安息香酸酯，磺基琥珀酰亞胺基4-碘代乙酰基)氨基安息香酸酯，琥珀酰亞胺基4(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯，磺基琥珀酰亞胺基4(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯，鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，N,N’-亞苯基二馬來酰亞胺，和屬于bis-imidate類，酰基二嗪農類或酰基二鹵化物的化合物，亦在其中。
適當量的交聯試劑是允許分子間交聯以穩定Hb并允許分子間交聯以形成Hb聚合物，從而增加血管內停留時間的量。通常，適當量的交聯試劑是其中交聯試劑與Hb的摩爾比率超過2∶1的量。較好地，交聯試劑與Hb的摩爾比率在約20∶1到約40∶1之間。
較好地，聚合作用在pH在約7.6到約7.9之間，氯濃度少于或等于約35毫摩爾的緩沖液中實施。
在一個較好的實施方案中，適當量的交聯試劑加入到氧化作用穩定性脫氧-Hb中并通過低剪切混合裝置來混合。適當的低剪切裝置包括靜態混合器。適當的靜態混合器是如，Chemineer有限公司的“Kenics”靜態混合器。
在一個實施方案中，將氧化作用穩定性脫氧-Hb和交聯試劑重新循環流過靜態混合器產生湍流狀況，均勻混合交聯試劑和氧化作用穩定性脫氧-Hb，從而減少形成含高濃度交聯試劑的脫氧-Hb窩的可能性。均勻混合交聯試劑和氧化作用穩定性脫氧-Hb可減少形成大分子量Hb聚合物，即聚合物重超過500,000道爾頓，并可允許聚合期間交聯試劑和脫氧-Hb的快速混合。并且，在Hb聚合期間由于存在巰基化合物，較好地是NAC，會產生顯著的Hb分子間交聯。雖然巰基化合物與戊二醛和/或Hb間相互作用的確切機理尚不了解，但可以推定，巰基化合物以至少部分抑制高分子量Hb聚合物形成并擇優地形成穩定四聚體Hb的方式影響Hb/交聯試劑的化學鍵合。
聚(Hb)定義為具有顯著的分子間交聯的，如果Hb分子的主要部分(如至少約50％)化學鍵合在聚(Hb)中，并只有小部分Hb分子，如少于約15％保留在高分子量聚合血紅蛋白鏈中。高分子量聚(Hb)分子是，如分子量超過約500,000道爾頓的分子。
在一個較好的實施方案中，戊二醛用作交聯試劑。通常每公斤氧化作用穩定性脫氧-Hb使用約10到約70克戊二醛。更好地，戊二醛經5小時加入直到每公斤氧化作用穩定性脫氧-Hb有約29-31克戊二醛加入。
聚合作用后，聚合反應器中的聚(Hb)溶液的溫度一般降低到約15℃到約25℃。
使用的交聯試劑不是醛的情況中，形成的聚(Hb)通常是穩定的聚(Hb)。使用的交聯試劑是醛的情況中，形成的聚(Hb)通常是不穩定的，直到與適當的還原試劑混合以減少聚(Hb)中穩定性差的鍵形成更穩定的鍵。適當的還原試劑實例包括硼氫化鈉，氰基硼氫化鈉，連二亞硫酸鈉，三甲基胺，t-丁基胺，嗎啉硼烷，嘧啶硼烷。在加入還原試劑之前，聚(Hb)溶液任意地通過超過濾作用濃縮，直到聚(Hb)溶液的濃度增加到約75到約85克/升之間。適當的超過濾器的一個實例是30,000道爾頓過濾器(如Millipore Helicon,Car#CDUF 050 LT和Amicon,Cat#540430)。
然后將聚(Hb)溶液的pH到堿性pH范圍以保存還原試劑并預防氫氣形成。其在隨后的還原反應中能使Hb變性。在一個實施方案中，pH調節到大于10。pH可以通過在聚合期間或之后在聚(Hb)溶液中加入緩沖溶液調節。通常除去非-聚合血紅蛋白提純聚(Hb)。這個過程可通過透析過濾或羥磷灰石層析來實施(參看如，美國專利5,691,453)。
調節pH之后，至少一種還原試劑，較好的是硼氫化鈉溶液，一般通過脫氧作用循環加入到聚合步驟中。一般，每摩爾Hb四聚體(每64,000道爾頓Hb)加入約5到約8摩爾的還原試劑。在一個較好的實施方案中，對于在聚合亞系統98中的每九升聚(Hb)溶液，以0.1到0.12lpm的速度加入1升0.25mM硼氫化鈉溶液。
然后可將穩定聚(Hb)的pH和電解質恢復到生理量，通過使用具有適當pH和生理量的電解質的透析過濾溶液透析過濾穩定聚(Hb)，以形成穩定的聚合血紅蛋白血液溶液。較好地，透析過濾溶液是緩沖溶液。
在聚(Hb)被還原試劑還原的情況中，透析過濾溶液具有酸性pH，較好地在約4到約6之間。
無毒性巰基化合物也可加入到穩定聚(Hb)溶液中作為氧清除劑，以增強最終聚合血紅蛋白血液溶液的穩定性。巰基化合物可作為部分透析過濾溶液加入，和/或獨立加入。加入一定量的巰基化合物，確立一個清除氧在儲存期間保持高鐵血紅蛋白含量少于約15％的巰基濃度。較好地，巰基化合物是NAC。一般，加入巰基化合物的量是足以確立巰基濃度在約0.05％到約0.2％重量比之間的量。
在一個較好的實施方案中，當用惰性氣體維持壓力，在基本上不含氧的環境中，在聚合反應器和保持運輸裝置中時，血液溶液在無菌操作狀況下包裝。
通過本發明的方法制備的適當的穩定聚合血紅蛋白血液替代品的規格在表Ⅰ中提供。
表Ⅰ
a-聚合前在Hb中測定的然后將血液替代品儲存在短期儲存容器中或儲存在無菌容器中，如上面詳細描述的，每種容器具有低氧環境。儲存容器還應充分地不可滲透水汽以預防通過儲存期間的蒸發顯著濃縮血液替代品。顯著濃縮血液替代品是導致血液替代品的一種或多種參數高于規格的濃縮。
依據本發明的方法制備的，穩定聚合血紅蛋白血液替代品的合成在美國專利5,296,465中進一步描述。
能接受依據本發明的方法制備的血液替代品的脊椎動物包括，哺乳動物，如人類，非人類靈長類，狗，貓，田鼠，馬或綿羊。并且，能接受所說的血液替代品的脊椎動物，包括胎兒(出生前脊椎動物)，出生后脊椎動物，或出生時的脊椎動物。
本發明的血液替代品可通過直接和/或非直接注射血液替代品到脊椎動物的循環系統中給循環系統服用，通過一種或導致注射方法。直接注射方法實例包括血管內注射，如靜脈內注射和動脈內注射，和心臟內注射。非直接注射方法實例包括腹腔內注射，皮下注射，這樣血液替代品通過淋巴系統運輸到循環系統中，或通過套管針或導管注射到骨髓中。較好地，血液替代品靜脈內服用。
在注入血液替代品前，期間，和/或后，要治療的脊椎動物可以是正常血量，血量過高或血量過低的。通過如局部裝載法或通過交換法，血液替代品可直接進入到循環系統中。
血液替代品可治療服用，治療由于多種不同病因導致的脊椎動物體內組織低氧，不同病因包括部分，或整個循環系統中RBC流動的減少，貧血癥和休克。并且，血液替代品可預防服用，以預防脊椎動物體內組織氧-耗竭，其可能是由于脊椎動物整個循環系統或組織的RBC流動可能的或預期的減少。進一步討論服用血紅蛋白治療上或預防上治療低氧癥，特別是由于局部動脈阻塞和由于局部微循環阻塞引起的，以及其服用劑量，在1995年3月23日提交的共同待審的美國專利申請系列No.08/409,337，現在美國專利5,854,209中提供。
通常，血液替代品的適當劑量或劑量組合是，當包含在血液血漿中時，會在脊椎動物血液中產生血紅蛋白濃度在約0.1到約10克Hb/dl之間，或更高濃度的血紅蛋白濃度的量，如果需要補充大量的血液損失。
本發明通過下列實施例進行進一步具體地描述。
實施例1合成穩定聚合Hb血液替代品如在美國專利No.5,296,465中所描述的，收集牛全血樣品，與檸檬酸鈉抗凝血劑混合形成血液溶液。
收集后每種血液溶液樣品保持在溫度約2℃下，然后用600目篩粗濾除去大聚集體和顆粒。
集中前，使用命為“快速檢測奶中的青霉素”的方法，使用從Difco,Detroit,Michigan購得的測試試劑盒測定每種血液溶液樣品中青霉素的量，以確保在血液溶液樣品中的青霉素的量＜0.008單位/毫升。
然后將血液溶液樣品集中并與除熱原的水溶檸檬酸鈉溶液混合形成牛全血的0.2％重量比的檸檬酸鈉溶液(本文后稱“0.25檸檬酸鈉血液溶液”)。
然后將0.2％檸檬酸鈉血液溶液順序流過800毫微米和50毫微米的聚變性過濾器，除去直徑約為50毫微米或更大的大型血液溶液碎片。
然后沖洗RBC以從RBC中分離細胞外血漿蛋白質，如BSA或IgG。為了沖洗血液溶液中的RBC，透析過濾容器中的血液溶液體積初始通過在透析過濾容器中加入等體積的過濾的等張溶液來稀釋。等張溶液用Millipore(Cat#CDUF 050 G1)10,000道爾頓超過濾膜來過濾。等張溶液由6.0克/升檸檬酸鈉二水化物和8.0克/升的氯化鈉的注射用水(WFI)溶液組成。
然后通過0.2毫微米中空纖維(Microgon Krosflo Ⅱ微過濾藥液筒)透析過濾器的透析過濾，將稀釋的血液溶液濃縮到其原來體積。同時，過濾的等張溶液以與濾出液流出0.2毫微米透析過濾器的速度相同的速度連續地作為補充加入。在透析過濾期間，直徑顯著小于RBC的稀釋血液溶液組成，或流體如血漿，隨濾出液穿過0.2毫微米透析過濾器的壁。RBC，血小板和稀釋血液溶液的較大組成，如白細胞，與連續加入的等張溶液一起保留，形成透析血液溶液。
在RBC沖洗期間，稀釋的血液溶液保持在溫度在約10到25℃之間，透析過濾器的入口處的液體壓力在約25psi到約30psi之間以改善過程效率。
當從透析過濾器排出的濾出液的體積等于約600％用過濾的等張溶液稀釋前血液溶液體積時，RBC沖洗完成。
然后將透析的血液溶液連續地以約4lpm的速度泵送到型號#AS-16，裝有#28 ringdam的Sharples Super離心分離器中。離心分離器操作同時加料透析血液溶液，以從白細胞和血小板中分離RBC。操作期間，離心分離器以足夠將RBC分離到重RBC相中，并將相當大部分的白細胞(WBC)和血小板分離到輕WBC相中的速度旋轉，具體約為15,000rpm。在操作期間，RBC相部分和WBC相部分分別地并連續地從離心分離器中流出。
分離RBC后，溶胞RBC形成含血紅蛋白溶液。當從離心分離器中流出時相當大部分的RBC被機械溶胞。由于流出離心分離器的RBC相流體以一定角度撞擊RBC相流出管壁，RBC的細胞膜破裂，從而將血紅蛋白(Hb)從RBC中釋放到RBC相中。
溶胞的RBC相流經RBC相流出管進入到靜態混合器(Kenics1/2英寸帶有6個部件，Chemineer有限公司)中。與轉移RBC相到靜態混合器中同時，等量WFI也注入到靜態混合器中，其中WFI與RBC相混合。RBC相和WFI流入到靜態混合器中的流速每種在約0.25lpm。
在靜態混合器中混合RBC相和WFI產生溶胞的RBC膠體。將溶胞的RBC膠體從靜態混合器中轉移到Sharples Super離心分離器(型號#AS-16,Sharples Division of Alfa-Laval Separation有限公司)中，其適于從非-血紅蛋白RBC組成中分離Hb。離心分離器以足以將溶胞的RBC膠體分離成輕Hb相和重相的速度旋轉。輕相含有Hb并含有密度約等于或小于Hb密度的非-血紅蛋白組成。
Hb相連續地從連續分離器中排出，通過0.45毫微米MilliporePellicon Cassette,Cat#HVLP 000 C5微過濾器，進入到儲存容器中以備Hb提純。然后細胞基質和滯留物從微過濾器返回到儲存容器中。在微過濾期間，儲存容器內的溫度保持在約10℃或更低。為了改善效率，當微過濾器入口出液體壓力從初始壓力約10psi增加到約25psi時，微過濾完成。Hb微濾出液從微過濾器轉移微濾出液容器中。
隨后，Hb微濾出液泵送流過100,000Millipore Cat#CDUF 050H1超過濾器。包含在Hb微濾出液中的相當大部分Hb和水，滲透過100,000道爾頓超過濾器形成Hb超濾出液，而大型細胞碎片，如分子量超過約100,000道爾頓的蛋白質被保留并重新循環返回到微濾出液容器中。同時，WFI連續地加入到為濾出液容器中補充留在超濾出液中的水。通常，細胞碎片包括所有完整的和片段的細胞組成，除了Hb，較小的細胞蛋白質，電解質，輔酶和有機代謝中間產物。持續超過濾直到在微濾出液中的Hb濃度少于8克/升(g/l)。當超過濾Hb時，微濾出液容器內的溫度保持在約10℃。
將超濾出液轉移到超濾出液容器中，其中Hb超濾出液重新循環流過30,000道爾頓Millipore Cat#CDUF 050 T1超過濾器，以從Hb超濾出液中除去較小的分子蛋白質，如電解質，輔酶，代謝中間產物和分子量小于約30,000道爾頓的蛋白質，和水，從而形成含量約100克Hb/升的濃縮Hb溶液。
然后將濃縮的Hb溶液直接從超濾出液容器中倒入到并聯層析柱(2英尺長8英寸內徑)中的介質中，通過高效液相層析法分離Hb。層析柱含有適于從非血紅蛋白蛋白質中分離Hb的陰離子交換介質。陰離子交換介質從硅膠制備。將硅膠用γ-glycidoxy丙基硅烷處理以形成活性環氧化物基團，然后用C3H7(CH3)NCl處理以形成季銨陰離子交換介質。這種方法在層析法期刊，120:321-333(1976)中作了描述。
用促進Hb結合的第一洗脫液沖洗層析柱對每個柱進行預處理。然后將4.52升濃縮的Hb溶液注入到每個層析柱中。注入濃縮Hb溶液后，通過在柱內制備pH梯度，然后用三種不同的洗脫液連續地沖洗流經層析柱以產生Hb洗脫物。在使用期間每種緩沖液的溫度約為12.4℃。在注入到層析柱前，將緩沖液流過10,000道爾頓超過濾膜預過濾。
第一緩沖液，20mM Tris-羥甲基甲胺(Tris)(pH約8.4到約9.4)，將濃縮的Hb運輸到層析柱的介質中并結合Hb。用第二緩沖液，第一緩沖液和第三緩沖液的混合物，第二緩沖液pH約為8.3，調節層析柱內的pH以從層析柱上洗脫污染的非-血紅蛋白組成，而保留Hb。用第二緩沖液以約3.56lpm每個柱的流速平衡持續約30分鐘。將第二緩沖液的洗脫液排到廢料中。然后用第三緩沖液，50mM Tris(pH約為6.5到約7.5)，從層析柱上洗脫Hb。
Hb洗脫物流經滅菌Sartobran Cat#5232507 G1PH過濾器流到收集Hb洗脫物的容器中。Hb洗脫物開始的3％-4％和Hb洗脫物最后的3％-4％倒入廢料中。
如果洗脫物含有少于0.05EU/毫升的內毒素并含有少于3.3毫微摩爾/毫升磷脂，Hb可作進一步使用。在六升超純洗脫物中，其具有100克Hb/升濃度，加入9升1.0M氯化鈉，20mM Tris(pH8.9)，從而形成離子強度為160mM的Hb溶液，以降低Hb溶液中Hb對氧的親和力。然后將Hb溶液在10℃濃縮，通過重新循環流過超過濾器，具體地是10,000道爾頓MilliporeHelicon,Cat#CDUF 050 G1過濾器，直到Hb的濃度為110克/升。
然后，通過以12lpm重新循環Hb溶液流過0.05毫微米Hoechst-Celanese公司Cat#G-240/40聚丙烯微過濾器相轉移膜，以形成脫氧Hb溶液(本文后面稱“脫氧-Hb”)，將Hb溶液脫氧，直到Hb溶液的PO2減少到其中在Hb溶液中HbO2的量約為10％。同時，用60lpm氮氣流過相轉移膜的反面。在脫氧期間，Hb溶液的溫度保持在約19℃到約31℃之間。
同樣在脫氧期間，和隨后的整個過程中，Hb保持在低氧環境中以最少化Hb對氧的吸附并保持在脫氧-Hb中氧化Hb(氧基血紅蛋白或HbO2)的量少于約10％。
然后，將60升脫氧-Hb和180升儲存緩沖液透析過濾流過超過濾器，儲存緩沖液是含有0.2％重量比的N-乙酰基半胱氨酸的33mM磷酸鈉緩沖液(pH7.8)，含有pO2少于約50托，以制備氧化作用穩定性脫氧-Hb。在與脫氧-Hb混合之前，儲存緩沖液用10,000道爾頓Millipore Helicon,Cat#CDUF 050 G1除熱原過濾器除熱原。
儲存緩沖液以與從超過濾器流出液體的速度近似相同的速度連續加入。透析過濾持續直到流出超過濾器的透析過濾液體的體積約為三倍的脫氧-Hb初始體積。
在將氧化作用穩定性脫氧-Hb轉移到聚合裝置中前，將貧氧WFI加入到聚合反應器中以吹掃聚合裝置中的氧，預防氧化作用穩定性脫氧-Hb氧化。加入到聚合反應器中WFI的量是，當氧化作用穩定性脫氧-Hb加入到聚合反應器中時能形成濃度為約40克Hb/升的Hb溶液的量。然后將WFI重新循環流過聚合裝置，通過流過有逆流加壓氮氣的0.05毫微米聚丙烯微過濾器相轉移膜(Hoechst-Celanese公司Cat#5PCM-108,80平方英尺)來脫氧。流過相轉移膜的WFI和氮氣的流速分別為約18到20lpm和40到60lpm。
在聚合反應器中的WFI的pO2降低到少于約2脫pO2后，通過流速約為20lpm的氮氣加入到聚合反應器的頂部空間，用氮氣覆蓋聚合反應器。然后將氧化作用穩定性脫氧-Hb轉移到聚合反應器中。
聚合反應在12 M磷酸緩沖液中實施，緩沖液pH為7.8，氯濃度少于或等于約35毫摩爾。
當在40℃加熱并將Hb溶液重新循環流過有六個部件的Kenicsl-1/英寸靜態混合器(Chemineer有限公司)時，氧化作用穩定性脫氧-Hb和N-乙酰基半胱氨酸隨后緩慢地與交聯試劑戊二醛混合，具體地每公斤Hb用29.4克戊二醛，混合5個小時，形成聚合Hb(聚(Hb))溶液。
將氧化作用穩定性脫氧-Hb和戊二醛重新循環流過靜態混合器產生湍流狀況，均勻混合戊二醛和氧化作用穩定性脫氧-Hb，從而減少形成含高濃度戊二醛的脫氧-Hb凹陷的可能性。均勻混合戊二醛和氧化作用穩定性脫氧-Hb可減少形成大分子量聚(Hb)(即聚合物重超過500,000道爾頓)，并可允許聚合期間戊二醛和脫氧-Hb的快速混合。
此外，在聚合期間，產生顯著的Hb分子間交聯，這是作為存在N-乙酰基半胱氨酸對Hb聚合的影響。
聚合后，在聚合反應器中聚合(Hb)溶液的溫度降低到約15℃到約25℃中間的溫度。
然后，濃縮聚(Hb)溶液，通過重新循環聚(Hb)溶液流過超過濾器直到聚(Hb)增加到約85克/升。適當的超過濾器是30,000道爾頓過濾器(如Millipore Helicon,Cat#CDUF 050 LT)。
隨后，將聚(Hb)溶液與66.75克硼氫化鈉混合并重新循環流過靜態混合器。具體地，對于每9升聚(Hb)溶液，以0.1到0.12lpm速度加入1升0.25M硼氫化鈉。
在將硼氫化鈉加入到聚(Hb)溶液中前，堿性化聚(Hb)溶液的pH，通過調節pH到約10來保存硼氫化鈉和預防氫氣形成。通過用約215升的除熱原，脫氧12mM的pH約為10.4到約10.6的硼酸鈉緩沖液透析過濾聚(Hb)溶液來調節聚(Hb)溶液的pH。通過重新循環聚(Hb)溶液從聚合反應器流過30,000道爾頓超過濾器進行透析過濾聚(Hb)溶液。硼酸鈉緩沖液以與從超過濾器透析過濾中流出的液體的速度相同的速度加入到聚(Hb)溶液中。透析過濾持續直到從超過濾器透析過濾中流出的液體體積是約三倍的聚合反應器中聚(Hb)溶液的初始體積。
在pH調節后，將硼氫化鈉加入到聚合反應器中以還原聚(Hb)溶液中的鍵并在溶液中鍵合和形成穩定的聚(Hb)。在硼氫化鈉加料期間，在聚合反應器中的聚(Hb)溶液連續地重新循環流過靜態混合器和0.05毫微米的聚丙烯微過濾器相轉移膜，以除去溶解的氧和氫。流過靜態混合器還提供湍流硼氫化鈉流動狀態，快速并有效地混合硼氫化鈉和聚(Hb)溶液。流過0.05毫微米相轉移膜的聚(Hb)溶液和氮氣的速度分別約為2.0到4.0lpm和約12到18lpm。完成硼氫化鈉加料后，當聚合反應器中的攪拌器以約75轉每分鐘的速度旋轉時，聚合反應器中還原反應在繼續。
在硼氫化鈉加料后約1小時，穩定聚(Hb)溶液從聚合反應器流過30,000道爾頓超過濾器，直到穩定聚(Hb)溶液濃度為110克/升。濃縮后，通過流過30,000道爾頓超過濾器使用含有27mM乳酸鈉，12mM NAC,115mM氯化鈉，4mM氯化鉀和1.36mM氯化鈣和WFI(pH5.0)的過濾脫氧的低pH緩沖液透析過濾穩定聚(Hb)溶液，穩定聚(Hb)溶液的pH和電解質恢復到生理水平以形成穩定聚合Hb血液替代品。透析過濾持續直到從超過濾器透析過濾流出的液體的體積約為6倍的濃度Hb產品的透析過濾前體積。
在pH和電解質恢復到生理水平后，通過在聚合反應器中加入過濾脫氧的低pH緩沖液，將聚合Hb血液替代品稀釋到濃度為5.0克/升。通過從聚合反應器重新循環流過靜態混合器和100,000道爾頓提純過濾器，逆向流過含有27mM乳酸鈉，12mMNAC,115mM氯化鈉，4mM氯化鉀和1.36mM氯化鈣和WFI(pH 7.8)的過濾脫氧的緩沖液透析過濾稀釋的血液替代品。透析過濾持續，直到通過凝膠滲透層析在解離條件下操作時，血液替代品含有少于或等于約10％修飾的四聚體和未修飾的四聚體種類。
提純過濾器在低跨膜壓條件下使用限制性滲透管操作。除去大量修飾四聚體Hb和未修飾四聚體Hb后，持續流過30,000道爾頓超過濾器重新循環血液替代品，直到血液替代品的濃度為約130克/升。
然后將穩定血液替代品儲存在適當的具有低氧環境及低氧滲入的容器中。
實施例3血紅蛋白血液替代品的儲存初級包裝血紅蛋白血液替代品，如實施例1中所制備的包裝在氧屏障初級包裝(E-13135和E-13242，美國國家罐裝)中。初級包裝的結構已在上面詳細描述。初級包裝是厚度為約0.005英寸(或約127毫微米)的層壓物質，包括中密度聚乙烯/乙烯乙烯基醇層，尼龍層，和線性低密度聚乙烯密封劑層。層壓物的氧滲透量為0.0084cc/atm-天(25℃,100％/50％相對濕度)或1.3×10-3cc/平方厘米/atm-天(25℃,100％/50％相對濕度)。水汽滲透量為25.0毫克/100平方英寸/atm-天(25℃,100％/50％相對濕度)或3.87毫克/100平方厘米/atm-天(25℃,100％/50％相對濕度)。
將包裝的血液替代品在沒有透明包裝加速穩定性的條件下保持90天，接著取樣分析N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)，雙-N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC2)，總量Hb(THb)，氧化血紅蛋白(HbO2)和高鐵血紅蛋白(metHb)的濃度和/或量。加速穩定性條件是40℃和75％的相對濕度(RH)。因為在較高溫度和相對濕度下包裝物料的屏障性質會降低，這些加速穩定性條件與在環境條件(25℃,50％相對濕度)下測定的穩定性比較至少1年。結果在表Ⅱ中列出。
表Ⅱ加速穩定性數據
實施例4分析聚合血紅蛋白血紅蛋白產品中的內毒素濃度可通過由Associations of CapeCod,Woods Hole,Massachusetts,J.Levin等人，實驗室臨床醫學期刊，75:903-911(1970)研究的方法“動力學/比濁LAL5000法”確定。對于此領域中的技術人員已知的具體細胞膜蛋白質或糖酯類，多種方法可用來檢測基質的任何微量，如沉淀測定法，免疫印跡法，酶-結合免疫吸附測定法(ELISA)。
微粒計數可通過美國藥典22:1596,1990年“注射物中的微粒物質單一劑量注入用的大體積注射物”法來確定。
為了確定戊二醛的濃度，將400毫微升代表性血紅蛋白產品樣品用二硝基苯肼衍生，然后，在27℃，以1毫升/分鐘與梯度緩沖液一起將100毫微升等分衍生溶液注射到YMC AQ-303ODS柱中。梯度緩沖液包括兩個移動相，0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液和0.08％TFA甲基氰溶液。梯度緩沖液流動包括均勻的60％0.08％TFA甲基氰溶液流動60分鐘，85％0.08％TFA甲基氰溶液線性梯度12分鐘，100％0.08％TFA甲基氰溶液線性梯度4分鐘，保持在100％0.08％TFA甲基氰中2分鐘，并在45％0.01％TFA水溶液中重新平衡。在@360納米測定紫外線探測。
為了確定NAC濃度，將血紅蛋白產品的等分份用除氣的磷酸鈉水溶液稀釋，并將50微升與梯度緩沖液一起注射到YMC AQ-303 ODS柱中。梯度緩沖液包括磷酸鈉水溶液和80％甲基氰水溶液和0.05％TFA的混合物。梯度緩沖液流動包括100％磷酸鈉水溶液流動15分鐘，100％80％甲基氰和0.05％TFA混合物線性梯度5分鐘，保持5分鐘。然后系統在100％磷酸鈉中重新平衡20分鐘。
通過以在下列兩篇論文中的方法為依據的方法，實施對磷脂的分析Kolarovic等人的“從生物源分離磷脂的提取方法比較”，Anal.Biochem.156:244-250,1986和Duck-Chong,C.G.的“使用硝酸鎂確定涉及消化作用的磷脂磷的快速靈敏方法”，脂質，14:492-497,1979。
通過在Advanced Cryomatic滲壓計上分析確定等滲容摩，滲壓計型號#3C2，先進儀器有限公司，Needham,Massachusetts。
總量血紅蛋白，高鐵血紅蛋白和氧基血紅蛋白濃度在Co-血氧定量計上確定，血氧定量計型號#484，來自MassachusettsLexington，儀器實驗室。
Na+,K+,Cl-,Ca++,pO2濃度可通過Novastat Profile 4確定，來自Massachusetts Waltham,Nova生物醫學公司。
氧結合系數，P500通過Hemox-分析儀確定，來自Pennsylvania Southhampton,TCS公司。
溫度和pH可通過此領域中技術人員已知的方法確定。
分子量(M.W)可通過在解離條件下對血紅蛋白產品實施凝膠滲透層析(GPC)來確定。對血紅蛋白產品的代表性樣品分析分子量分布。在50mM Bis-Tris(pH6.5),750mM氯化鎂，和0.1mM EDTA的移動相中將血紅蛋白產品稀釋到4毫克/毫升。這種緩沖液用作將Hb四聚體從聚(Hb)解離成二聚體，Hb二聚體沒有通過分子內或分子間交聯與其他Hb二聚體交量。將稀釋的樣品注射到TosoHaas G3000SW柱中。流速為0.5毫升/分鐘。在280納米記錄紫外線探測。
對依據本發明的方法制備的脊椎動物(OXYGLOBINTM)和人類Hb血液替代品進行上述測定，結果分別在表Ⅲ,Ⅳ中列出。
表Ⅲ
a-聚合前在Hb中測定的表Ⅵ
a-聚合前在Hb中測定的此領域中的技術人員僅使用常規試驗會認識到，或能確定本文所描述發明的具體實施方案的許多等同物。這些和所有其他這樣的等同物包括在下列權利要求書的范圍內。
權利要求
1．一種保存脫氧血紅蛋白血液替代品的方法，包括將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在包括有至少一層透明聚合物物料的氧屏障膜初級包裝中，所說的初級包裝在約25℃和外界相對濕度約50％條件下每24小時氧滲透量少于1.0cc每100平方英寸。
2．依據權利要求1的方法，其中透明聚合物物料包括氧屏障層。
3．依據權利要求2的方法，其中氧屏障層包括乙烯乙烯基醇。
4．依據權利要求2的方法，其中聚合物物料包括含有聚烯烴的外層。
5．依據權利要求4的方法，其中所說的外層包括中密度聚乙烯。
6．依據權利要求5的方法，其中外層和氧屏障層是共同擠壓的。
7．依據權利要求2的方法，其中氧屏障層包括硅氧化物包膜的聚酯層。
8．依據權利要求1的方法，其中聚合物物料包括含有聚烯烴的內層。
9．依據權利要求8的方法，其中內層包括線性低密度聚乙烯。
10．依據權利要求1的方法，其中血紅蛋白血液替代品是保存在氮，氬或氦氛圍下的。
11．一種保存的脫氧血紅蛋白血液替代品，包括a)脫氧血紅蛋白血液替代品；b)包括有至少一層透明聚合物物料的氧屏障膜初級包裝，所說的初級包裝在約25℃和外界相對濕度約50％條件下每24小時氧滲透量少于1.0cc每100平方英寸，包裝內脫氧血紅蛋白血液替代品是密封的，從而將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在基本上不含氧的環境中。
12．依據權利要求11的保存的脫氧血液替代品，其中其中透明聚合物物料包括氧屏障層。
13．依據權利要求12的保存的脫氧血液替代品，其中氧屏障層包括乙烯乙烯基醇。
14．依據權利要求12的保存的脫氧血液替代品，其中聚合物物料包括含有聚烯烴的外層。
15．依據權利要求14的保存的脫氧血液替代品，其中所說的外層包括中密度聚乙烯。
16．依據權利要求15的保存的脫氧血液替代品，其中中密度聚乙烯層和氧屏障層是共同擠壓的。
17．依據權利要求11的保存的脫氧血液替代品，其中氧屏障層包括硅氧化物包膜的聚酯層。
18．依據權利要求11的保存的脫氧血液替代品，其中聚合物物料包括含有聚烯烴的內層。
19．依據權利要求18的保存的脫氧血液替代品，其中內層包括線性低密度聚乙烯。
20．依據權利要求11的保存的脫氧血液替代品，其中血紅蛋白血液替代品是保存在氮，氬或氦氛圍下的。
全文摘要
本發明涉及一種保存脫氧血紅蛋白血液替代品的方法,涉及保存的脫氧血液替代品。本發明涉及一種保存脫氧血紅蛋白血液替代品的方法,包括將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在包括透明層壓物料的氧屏障膜初級包裝中,所說的膜在約25℃及外界相對濕度約50%的條件下每24小時單位大氣壓氧滲透量少于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米)。本發明還涉及保存的脫氧血紅蛋白血液替代品。所說的保存的血液替代品包括脫氧血紅蛋白血液替代品和氧屏障膜初級包裝。所說的氧屏障膜初級包裝包括透明層壓物料,在約25℃及外界相對濕度約50%的條件下每24小時單位大氣壓氧滲透量少于約1.0cc每100平方英寸(或約0.155cc每100平方厘米),初級包裝內脫氧血紅蛋白血液替代品是密封的,從而將脫氧血紅蛋白血液替代品保存在基本上不含氧的環境中。
文檔編號A61K38/00GK1323159SQ99812070
公開日2001年11月21日 申請日期1999年10月13日 優先權日1998年10月14日
發明者瑪麗亞·S·蓋瑞爾, 羅伯特·A·胡特陳斯, 威廉·R·賴特 申請人:柏爾純公司