專利名稱：突變霍亂全毒素佐劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫原性突變霍亂全毒素作為佐劑增強脊椎動物宿主對選定抗原的免疫應答的用途，該突變毒素的毒性比野生型霍亂毒素降低，且霍亂全毒素A亞基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。
背景技術：
免疫系統運用多種機制來攻擊病原體。然而，免疫后，并非所有這些機制都被激活。免疫誘導的保護性免疫力取決于疫苗激發適當免疫應答抵抗或消滅病原的能力。根據不同的病原，這可能需要細胞介導的免疫應答和/或體液免疫應答。
與免疫原或病原一起給予時能增強免疫應答的物質稱為佐劑。
革蘭氏陰性菌霍亂弧菌(V.cholerae)會引起胃腸道疾病霍亂。霍亂毒素(CT)的分泌會引起霍亂弧菌性腹瀉。
CT含有一個毒素酶活性所在的A亞基(CT-A)，和與毒素結合腸上皮細胞等表面具有神經節苷脂GM1的細胞有關的五個相同的B亞基(CT-B)。CT-A與CT-B共同構成一個全毒素。CT序列是已知的(目錄1)。
CT是一個六異聚復合物，由一條A多肽和5條相同的B多肽構成(2)。五聚體B是與細胞表面受體神經節苷脂GM1結合所必需的(3)。A亞基經蛋白酶消化切開其內部C187與C199之間的二硫環可產生具有酶活性的A1多肽(4)和連接片段A1與五聚體B的較小的多肽A2(5)。進入腸細胞后，CT-A1將調節性G蛋白(Gsα)ADP-核糖基化，導致腺苷酸環化酶組成性活化，提高細胞內cAMP濃度，液體及電解質分泌進入小腸腔(6)。在體外，輔助蛋白ARFs(7)，一種GTP結合性小蛋白(已知在真核細胞內參與囊泡轉運)的存在激發CT的ADP-核糖基轉移酶活性。
對于通過胃腸道、肺、鼻咽或泌尿生殖道表面進入體內而引起急性感染的感染性生物所需要的的有效免疫方法是主動免疫學方法。這些表面被粘液所覆蓋，其中含有免疫球蛋白，主要是分泌性IgA(8,9,10)。該抗體由許多滲透上述粘膜下固有層的產IgA漿細胞產生(11,12)。IgA通過分泌性組分的作用被特異性地運輸到內腔表面(13)。
然而，腸胃外免疫方法一般不能有效誘導分泌性IgA應答。分泌性免疫力主要是通過對粘膜相關淋巴組織直接免疫而獲得的。誘導產生于一個粘膜位置后，產IgA漿細胞前體滲出分散到多種粘膜組織，最終分化導致IgA的高速合成(14,15,16)。大量研究證明了粘膜免疫誘導該普遍粘膜免疫系統的可行性(17)，但大多需要大量抗原來獲得有效的免疫，因而使得該方法不適合純化的疫苗抗原。為了克服這一問題而研究的方案之一是采用粘膜佐劑。已知CT是最有效的佐劑之一，而且，當CT與一種無關抗原共給予時會同時誘導對該抗原的循環性和粘膜性抗體。因此，CT可以作為佐劑。
較好的是，采用減毒形式的CT全毒素作為佐劑，從而減少因野型生CT所致的腹瀉癥狀。因此，需要鑒定一種能夠增強免疫應答，同時降低CT全毒素毒性的突變CT全毒素。
發明概述因此，本發明目的是用毒性比野生型CT降低的突變CT全毒素作為抗原性組合物中的佐劑，從而增強脊椎動物宿主對來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原的免疫應答。
本發明的以上目的是用一種突變霍亂全毒素達到的，該突變全毒素的特征在于其A亞基的第29位氨基酸發生了點突變，即該處的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸所取代。具體實施例之一中，第29位的氨基酸是組氨酸。該突變CT(又稱CT-CRM)可用作抗原性組合物中的佐劑，增強脊椎動物宿主對來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原的免疫應答。該突變CT是用常規技術對編碼野生型CT的DNA進行定點誘變產生的。所述抗原性組合物還可以含有稀釋劑或載體。
本發明還涉及一種提高含來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原的抗原性組合物激發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，即在組合物中包含有效佐劑量的突變霍亂全毒素，其中全毒素的毒性比野生型CT降低，且A亞基的第29位氨基酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸特別是組氨酸取代。
本發明還涉及一種含分離并純化的DNA序列的質粒，該DNA序列含編碼免疫原性突變霍亂全毒素的DNA序列，所述突變霍亂全毒素A亞基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，而且，該DNA序列與阿糖誘導型啟動子操作性連接，還涉及以該質粒轉化、轉導或轉染的合適的宿主細胞。免疫原性突變霍亂全毒素的產生是通過用上述質粒轉化、轉導或轉染宿主細胞，并在允許宿主細胞表達重組免疫原性脫毒蛋白質的條件下培養宿主細胞。
附圖簡述
圖1顯示各種CT-CRM結合神經節苷脂GM1的能力。每種CT-CRM都稀釋3倍，初始濃度為3μg/ml，重復實驗2次。以各稀釋度的410nm平均吸光度表示結合能力。
圖2顯示用腦膜炎球菌重組菌毛蛋白(rpilin)單獨或與CT-CRME29H佐劑一起鼻內免疫的小鼠(每組10只)或原初(未免疫)小鼠鼻內菌落的減少，以log10CFU/鼻表示，各組在免疫后都接受相同腦膜炎球菌菌株的激發。
圖3顯示用腦膜炎球菌重組菌毛蛋白單獨或與CT-CRME29H佐劑一起、腦膜炎球菌1類外膜蛋白(ProA)與CT-CRME29H佐劑一起、KLH與CT-CRME29H佐劑一起鼻內免疫的小鼠(每組5只)或原初小鼠鼻內菌落的減少，以log10CFU/鼻表示，各組在免疫后都接受相同腦膜炎球菌菌株的攻擊。
圖4顯示以CT-CRME29H為佐劑用腦膜炎球菌重組菌毛蛋白、腦膜炎球菌H355的ProA、腦膜炎球菌870277的ProA、熱滅活腦膜炎球菌870277全細胞或KLH鼻內免疫的小鼠(每組10只)鼻內菌落的減少，以log10CFU/鼻表示，各組在免疫后都接受相同腦膜炎球菌菌株(870277)的攻擊。
圖5顯示用腦膜炎球菌H355的ProA和CT-CRME29H或MPLTM佐劑、KLH和MPLTM佐劑或熱滅活腦膜炎球菌870277全細胞和MPLTM佐劑皮下免疫的小鼠(每組10只)鼻內腦膜炎球菌870277菌落的減少，以log10CFU/鼻表示，各組在免疫后都接受相同腦膜炎球菌菌株(870277)的攻擊。
圖6顯示對呼吸道合胞病毒(RSV)所感染靶細胞的抗原依賴性溶胞活性第一次試驗，表示為細胞裂解百分比與效應物靶細胞之比的關系。
圖7顯示F蛋白加佐劑免疫賦予小鼠肺抗RSV攻擊保護作用的第一次試驗，肺內病毒的效價測定表示為Log10PFU/g。
圖8顯示對呼吸道合胞病毒(RSV)所感染靶細胞的抗原依賴性溶胞活性第二次試驗，表示為細胞裂解百分比與效應物靶細胞之比的關系。
圖9顯示F蛋白加佐劑免疫賦予小鼠肺抗RSV攻擊保護作用的第二次試驗，肺內病毒的效價測定表示為Log10PFU/g。
圖10顯示用2/6-VLP單獨或與CT-CRME29H佐劑一起鼻內免疫后，BALB/c小鼠體內的輪狀病毒特異性血清抗體應答。用2/6-VLP單獨(n=5)或與CT-CRME29H佐劑一起(n=4)鼻內免疫BALB/c小鼠，測定輪狀病毒特異性IgG(圖10A)、IgM(圖10B)和IgA(圖10C)的水平。顯示了標準方差。
圖11顯示BALB/c近交小鼠接受2/6-VLP免疫后的輪狀病毒特異性血清抗體應答。各組BALB/c小鼠在第0和第2周接受2/6-VLP加CT-CRME29H的口服(方塊，n=4)、鼻內(菱形，n=5)或鼻內和口服(圓圈，n=4)聯合免疫。在所示周收集各組各小鼠的血清樣品，用ELISA測定血清IgG(圖11A)、IgM(圖11B)和IgA(圖11C)的水平。計算各組的幾何平均效價(GMT)，對免疫后周數做圖。
圖12顯示BALB/c小鼠的IgG1和IgG2抗體亞類。用輪狀病毒2/6-病毒樣顆粒(VLP)加CT-CRME29H口服或鼻內免疫的BALB/c小鼠的攻擊前血清來測定IgG亞類。顯示標準方差。
圖13顯示2/6VLP免疫的近交BALB/c小鼠的輪狀病毒特異性小腸抗體應答反應。如圖11所述用2/6VLP加CT-CRME29H免疫各組BALB/c小鼠，測定輪狀病毒特異性小腸IgA(圖13A)和IgG(圖13B)。所有小鼠中都沒有測到輪狀病毒特異性小腸IgM。
圖14顯示以鼠輪狀病毒攻擊后2/6VLP免疫的BALB/c和CD-1小鼠的保護作用。圖14A顯示以2/6VLP單獨(n=4)或與CT-CRME29H一起(n=5)免疫的小鼠之間抗原排出減少百分比(PRAS)的比較。計算各小鼠(●)的PRAS和各組(-)的平均PRAS。圖14B顯示經不同途徑用2/6VLP加CT-CRME29H免疫的各組BALB/c小鼠，保護作用水平測定如前所述。圖14C顯示如前所述以2/6VLP加CT-CRME29H口服或鼻內免疫的遠交CD-1小鼠。在第26周，攻擊免疫和對照小鼠，如前所述測定PRAS。口服組(n=4)中，一只小鼠在攻擊前死亡(測定保護作用的n=3)。
本發明的詳細描述本發明描述的是突變CT作為抗原性組合物的佐劑的用途。本發明在大腸桿菌內產生了一組突變CT克隆(CT-CRM)。數據顯示，輔佐性能特別優良的CT-CRM是A亞基內第29位具有非保守性氨基酸取代(谷氨酸被組氨酸取代)的突變體(CT-CRME29H)。累積數據表明，CT-CRME29H是全毒素，但毒性低于野生型CT。重要的是，胃內(IG)或鼻內(IN)給予不同疫苗抗原時，CT-CRME29H都能夠增強粘膜和系統免疫應答反應。這些疫苗抗原來自細菌或病毒病原。幽門螺桿菌、輪狀病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)感染鼠模型中的結果顯示，以CT-CRME29H制備的疫苗胃內或鼻內免疫促進的免疫應答是保護性的。這些數據表明，CT-CRME29H作為佐劑的活性至少相當于野生型CT。即使在已有抗CT免疫應答存在下，CT-CRME29H仍能起到粘膜佐劑的作用。
突變CT-A保留了與CT-B組裝形成全毒素的能力，從而使輔佐性接近野生型CT，而毒性則比野生型CT降低。B亞基可能保留其天然序列，或自身發生突變。
毒性的降低提供了一種可用作佐劑的CT。本發明的免疫原性突變CT平衡了毒性的降低和輔佐性的保留，因此，該蛋白質在起佐劑作用的同時能夠被接受抗原性組合物免疫的脊椎動物安全地耐受。
本發明的抗原性組合物在給予該組合物后增強脊椎動物宿主的抗體應答和細胞介導的免疫，從而調節免疫應答，所述的抗原性組合物含有來自細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原和有效佐劑量的突變CT，其中CT的毒性比野生型CT降低，其A亞基內第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。在實施例之一中，第29位是組氨酸。
本發明中，“全毒素的毒性降低”表示與野生型CT相比，突變CT-CRM，例如CT-CRME29H突變體表現出的每單位純化毒素蛋白質毒性大大降低，這使得突變體能夠用作抗原性組合物中的佐劑而不會引起明顯的副作用。
本發明中，“有效佐劑量”表示CT-CRM突變體，例如CT-CRME29H突變體的劑量適合在脊椎動物宿主內引發增強的免疫應答。具體劑量將取決于宿主的年齡、體重和醫學情況，以及給藥的方法。本領域技術人員不難確定所述的合適劑量。
如后文實施例所述，產生了5種CT-CRM，其A亞基內具有如下突變氨基酸 天然 突變體 縮寫7 精氨酸 賴氨酸 CT-CRMR7K11 精氨酸 賴氨酸 CT-CRMR11K29 谷氨酸 組氨酸 CT-CRME29H110谷氨酸 天冬氨酸 CT-CRME110D112谷氨酸 天冬氨酸 CT-CRME112D本發明就這些突變對CT結構和功能的表型作用進行了評價。
根據神經節苷脂GM1結合試驗測定(圖1)，變異CT-A的R7K、E29H、E110D和E112D能夠組裝入免疫反應性的全毒素。然而，在實施例2中以多克隆抗體測試時，純化的R11K部分似乎不是全毒素。
各種全毒素變異體都在Y-1腎上腺腫瘤細胞試驗(19)中測定了其與野生型CT全毒素相比的殘留毒性。表2結果表明，CT-CRME29H和市售的CT-B(Sigma)具有1.2％的殘留毒性。市售CT-B的1.2％殘留毒性很可能來自污染性A亞基(約0.5％)。其余第7、11、110或112位氨基酸突變的CT-CRM的殘留毒性等于或低于0.4％。
對CT-CRME29H進行專利(patent)小鼠腸重試驗(20)，以估計體內腸液累積作為毒性指標。表3的結果表明，與野生型CT相比，CT-CRME29H刺激進入小腸的腸液累積增加的活性低得多。
還在ADP-核糖基轉移酶活性試驗中將各種CT-CRM與CT進行了比較。結果與Y-1腎上腺細胞試驗的結果大致相符，說明與野生型CT相比，A1亞基內的突變降低了各種CT-CRM的ADP-核糖基轉移酶活性。酶活性最高的突變體是CT-CRME29H。其活性約為野生型CT的10％。
根據Western印跡分析，37℃胰蛋白酶消化CT-CRME29H將CT-A剪切成了片段A1和A2，其方式與對野生型CT處理時的基本相同。這還證明CT-CRME29H的結構與野生型CT的相似。
CT-CRME29H活性在Y-1腎上腺腫瘤細胞和ADP-核糖基轉移酶活性試驗中的明顯差異是因為在后一試驗中突變全毒素被胰蛋白酶活化。因此，CT-A因為大腸桿菌內蛋白酶活性降低沒有剪切成A1和A2，所以造成大腸桿菌表達的CT-CRME29H減毒。總之，數據顯示，CT-CRME29H是結合神經節苷脂GM1的全毒素，但其毒性比野生型CT低得多。
進行一系列研究評價了CT-CRME29H作為粘膜佐劑用于含以下作為候選疫苗的細菌或病毒抗原的組合物的效力，這些抗原是(1)不可歸類流感嗜血桿菌重組P4蛋白，又稱蛋白質“e”(rP4)(21)，重組NTHiP6蛋白(rP6)(22)和純化天然流感嗜血桿菌粘附與穿透(Haps)蛋白(23)；(2)幽門螺桿菌重組脲酶蛋白(重組脲酶)(24)；(3)腦膜炎奈瑟氏球菌B群重組1類菌毛蛋白(25)和腦膜炎奈瑟氏球菌B群重組1類外膜蛋白(26)；(4)呼吸道合胞病毒純化天然融合蛋白(RSVF)(27)和(5)輪狀病毒的2/6-病毒樣顆粒(28)。
CT-CRME29H作為NTHi rP4和rP6的佐劑與其他4種突變CT和野生型CT進行了比較。結果表明，5種不同的CT-CRM都增強了rP4和rP6蛋白激發全身性體液免疫應答的能力(表5和6)。例如，在三次IN免疫后2周，以CT-CRME29H或CT-CRME110D配制的rP4和rP6蛋白免疫的小鼠其抗rP4IgG抗體的效價比單用上述重組蛋白的PBS溶液免疫的小鼠高40倍(表5)。以重組蛋白加野生型CT全毒素免疫的小鼠的抗體效價提高了20倍。用CT-CRMR11K免疫的小鼠抗rP4抗體效價提高10倍。
當檢測血清的抗天然P6抗體效價時觀察到了更明顯的差異(表6)。二次IN免疫后2周，接受以CT-CRME29H或CT-CRME110D配制的疫苗免疫的小鼠其血清抗天然P6抗體效價比用rP6加PBS制備的疫苗免疫的小鼠高30倍。比較中，以野生型CT制備的疫苗激發的抗天然P6抗體效價比疫苗PBS制劑產生的高90倍。以CT-CRME112D、CT-CRMR7K或CT-CRMR11K制劑免疫的小鼠其抗天然P6抗體的效價只比以rP4加rP6的PBS制劑所產生的高2-4倍。
三次免疫后2周對粘膜分泌中蛋白質特異性抗體的檢測進一步表明，CT-CRM促進抗rP4蛋白質的局部免疫應答的產生。而且，抗rP4抗體的效價與野生型CT所誘導的相當(表7)。沒有測定抗天然P6蛋白的局部抗體效價(未給出數據)。因此，綜合以上數據表明，同時產生抗rP4和rP6蛋白全身性和局部抗體應答的最好的突變CT是在第29位或110位突變的CT-CRM。
還研究確認了CT-CRME29H作為佐劑的潛力，并測定了IN免疫的合適劑量(表8)。結果表明，1μg CT-CRME29H可促進得到最強的抗rP4蛋白全身性和局部體液免疫應答。當CT-CRME29H的劑量從1升高到10或30μg時，數據顯示，全身和體液免疫應答都減弱。例如，10μgCT-CRME29H免疫小鼠第48天的血清抗P4IgG抗體效價是1μgCT-CRME29H免疫小鼠的1/7(表8)。而且，前一組小鼠第49天支氣管和陰道洗液內的局部抗P4 IgA抗體效價是后一組小鼠的1/34和1/16。數據表明，rP4加rP6/CT-CRME29H免疫小鼠的局部和全身性體液免疫應答與以野生型CT為佐劑的疫苗免疫所得的基本相同(表8)。
檢測了添加CT-CRME29H對Haps蛋白激發的血清抗體應答的作用。CT-CRME29H的加入協助誘導對Haps蛋白的血清抗體應答(表9)。免疫應答出現于第7周的血清；此前的血清中沒有測得抗體效價。表9列出了免疫小鼠血清的抗HapsELISA效價。應答以劑量依賴性方式增強，加入0.1μgCT-CRME29H使應答增強了約3倍。在兩個劑量水平都出現這種增強作用。
用小鼠模型研究了5種不同CT-CRM增強幽門螺桿菌重組脲酶胃內免疫后的全身性和局部體液免疫應答的潛力(29)。結果與用NTHi鼻內給予后所得的相似。數據表明，CT-CRME29H是增強IG免疫后全身和局部體液免疫遠大效力最強的突變體。在研究的第28天，CT-CRME29H配制的疫苗激發的抗重組脲酶IgG(表10)和IgA(表11)抗體血清效價幾何平均值比CT-CRME110D誘導所得的分別高6倍和3倍。而且，T-CRME29H配制的疫苗激發的血清IgG和IgA抗體效價與含野生型CT的疫苗所產生的相當。
最重要的是，以CT-CRME29H配制的重組脲酶疫苗IG免疫似乎產生了最強的局部體液免疫應答(表12)。這在檢測支氣管洗液后最明顯。支氣管洗液中的抗重組脲酶IgA抗體效價比以CT-CRME110D配制疫苗所激發高5倍。在與野生型CT制劑的比較中，抗重組脲酶IgA抗體效價的水平是其1/5。然而，CT-CRME29H配制的疫苗免疫組的陰道洗液中的蛋白質特異性IgA抗體效價與野生型CT制備的疫苗所激發的相當(表12)。
值得注意的是，數據暗示，與CT-CRME29H配制的疫苗IG免疫在小鼠中激發的相比，胃腸外免疫沒有在支氣管洗液中激發顯著的重組脲酶特異性IgA抗體(表12)。
所以，第二次研究測試了以CT-CRME29H配制的重組脲酶產生免疫應答的效力。數據顯示，CT-CRME29H支持誘導的抗幽門螺桿菌保護性免疫應答與野生型CT一樣強(表13)。前一組在研究第28天的血清抗重組脲酶IgA抗體效價與后一組的相當。重組脲酶加StimulonTMQS-21胃腸外免疫小鼠的蛋白質特異性血清IgA抗體效價比CT-CRME29H制備的疫苗IG免疫小鼠的強12倍。然而，CT-CRME29H免疫小鼠支氣管洗液內的蛋白質特異性IgA抗體效價比胃腸外免疫小鼠強10倍以上(表13)。
結果顯示IG免疫與小鼠從胃組織中清除幽門螺桿菌的能力有關。最后一次攻擊后10天，以CT或CT-CRME29H配制的疫苗IG免疫的小鼠中80％能夠清除胃組織內的含脲酶細菌。相反，原初對照小鼠(10％)，以重組脲酶加PBSIG免疫的小鼠(20％)或以重組脲酶混合StimulonTMQS-21皮下免疫的小鼠(30％)清除幽門螺桿菌的能力似乎較弱(表13)。值得注意的是，以上數據沒有顯示效力與支氣管洗液中蛋白質特異性IgA抗體效價之間的關聯。重組脲酶加野生型CT免疫小鼠的支氣管洗液內蛋白質特異性IgA抗體效價是CT-CRME29H免疫小鼠的1/10(表13)。但是，兩種疫苗都獲得了80％的保護作用。因此，對肺組織內局部體液免疫應答的監測與胃內的保護性免疫應答關聯性極小。
Jani O＇Rourke博士(新南威爾士大學)曾提出與BALB/c小鼠不同，在被幽門螺桿菌感染后，C57B1/6小鼠的發病過程與人相似。為了測試CT-CRME29H促進清除胃組織內幽門螺桿菌的抗重組脲酶免疫應答的效力，用C57B1/6小鼠進行了另一系列的研究。結果顯示，以CT-CRME29H配制的重組脲酶IG免疫產生的全身性和局部體液免疫應答與以野生型CT配制的重組脲酶所攻擊的相似(表14)。研究第28天，野生型CT或CT-CRME29H制備的疫苗免疫的小鼠的血清和支氣管及陰道洗液抗重組脲酶IgA抗體效價幾乎相同。唯一的區別是CT-CRME29H制備的疫苗免疫的小鼠其糞便提取物中測得的IgA抗體效價高3倍(表14)。值得注意的是，重組脲酶加明礬腸胃外免疫小鼠糞便中的蛋白質特異性IgA抗體效價比野生型CT或CT-CRME29H制劑IG免疫小鼠低得多(分別是后者的1/38和1/14)。因此，C57B1/6小鼠模型能夠評價CT-CRME29H輔佐IG免疫后產生的免疫應答的效力。而且，數據表明，該模型能用來確定局部和全身性免疫應答在保護粘膜表面抵抗幽門螺桿菌中的作用。
據報道，CT不適合作為粘膜免疫應答的佐劑(30,31)。其假設是CT易使疫苗激發過高的IgE抗體效價，這是不期望的。IgE與超敏和變應性反應有關。還暗示，熱不穩定性大腸桿菌毒素(LT)或LT-CRM激發過高IgE抗體效價的能力較弱。因此，LT或LT-CRM更適合作為產生粘膜免疫應答的疫苗佐劑。為了驗證這一假設，用CT、LT或CT-CRME29H配制含重組脲酶的疫苗，并測定它們在IG免疫后激發IgE抗體的能力(表15)。數據顯示，以CT-CRME29H或野生型CT制備的疫苗產生總的IgE或重組脲酶特異性IgE循環抗體的可能性低于野生型LT。實際上，以上結果的含義在于，以CT-CRME29H配制的疫苗不大可能產生高效價的IgE抗體。總IgE和重組脲酶特異性IgE抗體效價的終點都是以野生型LT制備的疫苗免疫的小鼠的1/4(表15)。因此，以上數據表明，至少在一種重組脲酶制劑中，CT-CRME29H作為佐劑優于LT。
在理論之外，最近van den Akker等最近提出的LT活性機制(32)更能夠解釋E29或其周圍改變所得CT變異體的毒性降低。在切開連接結構域A1和A2的二硫環并還原二硫鍵后，A1結構域內由30-33個殘基構成的環因為結構域A2長螺旋的移動而改變了位置。E29的取代可能改變環30-33的性能，結果減弱CT-A1的活化作用。CT-Y30WAH和CT-G34GGP的毒性降低也可以用對30-33環的作用削弱了CT-A1活化作用來解釋。所提出的活化路徑中的下一步是整個25-36環的移動，因此破壞了R25與Y55之間的相互作用。CT-R25G的毒性降低程度比CT-R25W更大，可能是因為R25和Y55的側鏈參與疏水性相互作用，CT-R25W可能保留這種相互作用，而CT-R25G則未保留。我們的變異體的表型與van denAkker等提出的熱不穩定性腸毒素活化模型相一致(32)。
以一系列實驗評價了CT-CRME29H作為兩種腦膜炎奈瑟氏球菌B群候選疫苗的粘膜和胃腸外佐劑的效力。第一種候選疫苗是重組1類菌毛蛋白(rpilin)(25)。第二種候選疫苗是1類外膜蛋白(PorA)，由不表達2/3類蛋白的突變腦膜炎球菌菌株表達。
第一個實驗證明了粘膜佐劑作用，其中，加CT-CRME29H組的重組菌毛蛋白特異性血清IgG抗體增多，比接受重組菌毛蛋白鹽水溶液小鼠的效價高3-19倍(表16)。重組菌毛蛋白CT-CRME29H(0.1和1.0μg)制劑免疫小鼠的特異性血清IgA也增加了2-5倍。值得注意的是，CT-CRME29H(1μg)使鼻、陰道和支氣管洗液內的重組菌毛蛋白特異性IgA增加了3-10倍。而且，重組菌毛蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫顯著降低腦膜炎奈瑟氏球菌B群菌株在鼻內的定居，降低至Swiss-Webster小鼠內測得的水平(圖2)。
第二個實驗表明CT-CRME29H增強抗同源腦膜炎球菌菌株的保護作用。如表17所示，重組菌毛蛋白加CT-CRME29H組內，腦膜炎球菌B群全細胞ELISA中對同源菌株以及異源菌株FAM18和M982的血清IgG效價比只接受重組菌毛蛋白的小鼠效價高至少4倍。作為對照，在全細胞ELISA中，KLH加CT-CRME29H免疫的小鼠沒有誘導對任何菌株的血清IgG。表18中，與無佐劑組相比，重組菌毛蛋白加CT-CRME29H組的重組菌毛蛋白特異性IgG和IgA抗體顯著增加。而且，CT-CRME29H作為重組菌毛蛋白的粘膜佐劑，保護小鼠抵抗同源B群腦膜炎球菌菌株在鼻內的定居(圖3)。
接著證明了PorA加CT-CRME29H在鼻內免疫中的免疫原性。接受PorA加CT-CRME29H佐劑的組對腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76全細胞的血清IgG抗體增高，并產生比無佐劑PorA組高7和14倍的PorA特異性抗體(表19)。然而，沒有測得抗PorA H44/76的血清IgA。而且，在收集的所有粘膜分泌物樣品中都沒有測到PorA特異性抗體。
第四個實驗表明CT-CRME29H增強重組菌毛蛋白或PorA的抗異源腦膜炎球菌保護作用。數據特別是表20的數據顯示用CT-CRME29H鼻內給予的1類重組菌毛蛋白或PorA不僅激發抗抗原和腦膜炎球菌全細胞的高血清抗體效價，而且還保護Swiss-Webster小鼠抵抗異源B群腦膜炎奈瑟氏球菌在鼻內的聚集。具體地說，與不用佐劑的組相比，CT-CRME29H增強對1類重組菌毛蛋白的血清抗體應答。同樣，用佐劑的1類重組菌毛蛋白增強鼻內細菌清除。
接著，測定了CT-CRME29H作為佐劑用于腦膜炎球菌胃腸外免疫的能力。如圖5所示，以MPLTM或CT-CRME29H為佐劑的PorAH355顯著減少B群腦膜炎球菌異源菌株870227在鼻內的聚集。具體地說，在攻擊后24小時，PorAH355加CT-CRME29H皮下免疫小鼠鼻內的菌落顯著少于PorAH355加MPLTM免疫的小鼠。然而，只有PorA和熱滅活全細胞加佐劑MPLTM免疫組的血清中檢測到滅菌活性(表22)，PorA加CT-CRME29H免疫的組則沒有。雖然PorA以CT-CRME29H為佐劑不能引發和MPLTM類似的同源滅菌活性，但減少異源B群腦膜炎球菌菌株的聚集則更有效。
用純化天然融合(F)蛋白測定了增強抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的全身性和粘膜免疫應答的能力。此外還研究了已有抗CT抗體對CT-CRME29H佐劑效力的影響。結果顯示，F蛋白以CT或CT-CRME29H為佐劑鼻內免疫的BALB/c小鼠產生了全身性和局部的抗CTIgG和IgA抗體效價(表23)。而且，數據還表明，CT-CRME29H制劑產生的抗體效價相當于野生型CT制劑。例如，F蛋白/CT-CRME29H二次免疫(1μg/次)后10天，血清抗CT IgA和IgG抗體效價只略低于F蛋白/CT(1μg/次)免疫的小鼠。檢測F蛋白/1μg或10μg CT-CRME29H免疫小鼠陰道洗液所得的結果相似(表23)。所以，以上數據說明CT-CRME29H和野生型CT具有同樣的免疫原性。
第二個實驗解答了抗CT免疫應答是否會危害F抗原的免疫原性這一問題，該實驗中，首先通過兩次單用野生型CT或CT-CRME29H的PBS溶液鼻內免疫引發Balb/c小鼠(表24)。然后，通過兩次F蛋白混合CT或CT-CRME29H免疫合適的小鼠。對最后一次免疫后2周收集的血清檢測顯示，已有抗CT抗體不影響局部或全身性抗F蛋白IgA和IgG抗體水平。實際上，數據顯示，已有抗CT抗體對增強抗F蛋白抗體應答有利。在比較粘膜表面激發產生的抗F蛋白抗體效價時，這一點尤其明顯(表24)。二次免疫后2周，以CT-CRME29H初次免疫然后以F蛋白/CT-CRME29H免疫小鼠支氣管和陰道洗液中的抗F蛋白IgA抗體效價分別比只用F蛋白/CT-CRME29H免疫的小鼠高7倍和17倍。
第三個實驗中，評價了RSVF蛋白加CT-CRME29H、CT-B或明礬鼻內免疫BALB/c小鼠的全身性和粘膜免疫應答。表25列出了三次免疫后9天時集得血清的體液免疫應答。F蛋白加1或10μgCT-CRME29H免疫的小鼠(分別為777和778組)與F/PBS、F/AlOH或RSV免疫小鼠(分別為784、785和907組)相比，表現出顯著提高的IgG、IgG1和IgG2a效價。此外，以含F/CT-CRME29H的疫苗免疫的小鼠(777和778組)產生的效價至少與F蛋白和CTB(779和780)所激發的相當。
在最后一次免疫后1周，收集免疫小鼠的支氣管、陰道和鼻液，用于進行IgG和IgA抗體的ELISA。表26的數據顯示了5鼠匯總的效價。CT-CRME29H免疫小鼠在陰道和鼻洗液中都激發可測水平的的IgA(777和778組)。CT-CRME29H免疫小鼠的BAL中沒有測到IgA，這與RSV免疫小鼠(907組)和F/CTB免疫小鼠(780)的BAL中情況相反。IgG可見于所有粘膜洗液，包括BAL。CT-CRME29H免疫小鼠洗液中的IgG水平與CTB(779和780組)和活RSV免疫小鼠的相當。
第四個實驗中，測定了免疫小鼠的刺激脾細胞體外誘導的溶胞(CTL)活性。數據見圖6。雖然RSV免疫小鼠表現出約60％的抗原特異性溶胞活性，但其余各小鼠的CTL活性仍低于20％。因此，雖然CT-CRME29H能夠誘導抗RSVF蛋白的全身性和粘膜體液免疫應答(表25和26)，但沒有檢測到對RSV感染靶細胞的細胞介導免疫應答。
第五個實驗中，為了研究鼻內給予F/CT-CRME29H是否增強抗活RSV攻擊的保護作用而進行了抗病毒保護試驗。數據見圖7。
對圖7結果的ANOVA統計學分析如下p＜0.05:F/PBS與F/CT-CRME29H(1μg和10μgCT-CRME29H),F/CTB(1μg和10μg),F/AlOH相比。
p＞0.05:PBS/CT-CRME29H與F/PBS相比p＞0.05:F/CT-CRME29H(1μg和10μgCT-CRME29H)與F/CTB(1μg和10μg)與F/AlOH相比。
含F/CT-CRME29H或F/CTB的疫苗鼻內免疫小鼠肺內的病毒效價與F/AlOH肌內免疫小鼠的相當(p＞0.05)。而且，F/CT-CRME29H鼻內免疫被發現，與F/PBS或PBS/CT-CRME29H鼻內免疫相比，能使肺內病毒效價降低log101.6和log101.4。F/CT-CRME29H與F/PBS或PBS/CT-CRME29H之間的差異具有統計學上的顯著性。
第六個實驗測定了RSVF蛋白加CT-CRME29H或明礬鼻內免疫BALB/c小鼠的全身性和粘膜免疫應答。表27列出了三次免疫后2周集得血清的體液免疫應答。接受F蛋白加1μgCT-CRME29H免疫的小鼠(256組)表現出比F/PBS或PBS/CT-CRME29H免疫小鼠(分別為組250和257)顯著提高的IgG、IgG1和IgG2a效價。F/CT-CRME29H(256)與F/AlOH(258)免疫小鼠的IgG1效價之間沒有顯著差異。然而，F/CT-CRME29H鼻內免疫(256)激發的IgG2a效價比F/AlOH免疫(258)高得多。總之，以上結果與表25一致。雖然在F/CT-CRME29H免疫小鼠中檢測到了血清IgA，但效價比先前觀察到的(777組的16,202±2,031和256組的444±1,458)低得多。這一明顯差異的原因尚不清楚。但是，鼻內給予誘導血清IgA的能力在兩項研究中是一致的，而且，所幸這方面與F/AlOH的能力相反。
最后一次免疫后2周收集支氣管洗液、陰道洗液和鼻洗液進行IgG和IgA抗體的ELISA。表28的數據顯示5鼠匯總的效價。與表26的結果相似，CT-CRME29H免疫小鼠在陰道和鼻洗液中都激發了可測水平的IgA(256組)。同樣，與表26的數據相似，在CT-CRME29H免疫小鼠的BAL中沒有測得IgA。F/CT-CRME29H免疫小鼠洗液中測得的IgG水平至少與活RSV免疫小鼠相當(表28,256組對259組)。
第七個實驗測定了免疫小鼠體外刺激的脾細胞引發的溶胞(CTL)活性。數據見圖8。雖然RSV免疫小鼠表現出約45％的抗原特異性細胞裂解，其余小鼠的CTL活性仍低于10％。以上數據證明F/CT-CRME29H鼻內免疫不能在脾淋巴細胞群中誘導細胞介導的免疫防御機制抵抗RSV感染靶細胞。這證實了先前的觀察(表8)。第八個實驗中，為了研究鼻內給予F/CT-CRME29H是否增強抗活性RSV攻擊的保護作用而進行抗病毒保護試驗。對圖9結果的ANOVA統計學分析如下p＜0.05:F/PBS與F/CT-CRME29H,F/AlOH,RSV相比。
p＜0.05原初與F/CT-CRME29H,F/AlOH,RSV相比。
p＞0.05:F/CT-CRME29H與F/AlOH,RSV相比。
與圖7結果相似，接受含F/CT-CRME29H疫苗鼻內免疫的小鼠能控制肺內病毒的復制，其程度在統計學上相當于F/AlOH肌內免疫或活RSV鼻內免疫(log101.87對log101.99和log101.94)(p＞0.05)。F/PBS鼻內免疫(第一柱)或原初小鼠表現出的肺內病毒效價分別為log104.5和log104.3。而且，這些組的肺內病毒效價比F/CT-CRME29H、F/AlOH或活RSV免疫小鼠所得的病毒效價有統計學上的提高(p＜0.05)。所以，以上數據支持這樣的結論:F/CT-CRME29H鼻內滴注可提供抗感染性RSV攻擊的保護作用。
第九個實驗測定抗F血清抗體應答。結果顯示，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠的抗F蛋白IgG比給予F蛋白加PBS的小鼠有顯著提高(表29)。此外，F蛋白以0.1或1.0μgCT-CRME29H為佐劑和F/AlOH9肌內)或實驗性RSV感染在激發抗F蛋白IgG應答方面至少同樣有效。抗F蛋白抗體效價取決于制劑中CT-CRME29H的劑量，因此，接受1.0μg CT-CRME29H的小鼠體內的效價顯著高于接受0.01μg的小鼠。與F/PBS相比，抗F蛋白的IgG1和IgG2a的效價都被0.1或1.0μg CT-CRME29H增強。CT-CRME29H既激發1型免疫腔室(immune compartment)也激發2型免疫腔室。F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻內免疫小鼠激發的血清抗F蛋白IgA應答顯著高于實驗性RSV感染。相反，沒有觀察到F/PBS(IN)或胃腸外給予F/AlOH引起血清IgA抗F蛋白抗體(表29)。
抗CT效價和抗F蛋白效價一樣呈現劑量依賴性(表29)。CT-CRME29H(1.0μg)或F/CT-CRME29H(1.0μg)免疫小鼠血清中的抗CT效價統計學上相當。然而，以上效價顯著高于F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)。此外，F/CT-CRME29H(0.1μg)免疫小鼠血清中的抗CT效價顯著高于F/CT-CRME29H(0.01μg)免疫小鼠。所以，CT-CRME29H對抗F蛋白抗體應答的佐劑效應與對突變霍亂全毒素的抗體應答相關(r=0.97)。
第九個實驗檢測粘膜免疫力。只在F/CT-CRME29H(1.0μg)或F/CT-CRME29H(0.1μg)免疫小鼠的合并鼻洗液(NW)中發現了粘膜IgA。此外，接受純化F蛋白加F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻內免疫的小鼠其陰道洗液(VW)中也有抗F蛋白IgA。接受F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)或F/AlOH小鼠的支氣管洗液(BAL)、VW和/或NW發現有F蛋白特異性IgG。相反，F/AlOH肌內免疫的小鼠中則沒有測到抗F蛋白IgA。
第十個實驗測定F蛋白CT-CRME29H制劑免疫小鼠的功能性免疫力。在補體存在下，在接受F蛋白加0.1或1.0μgCT-CRME29H、F/AlOH或RSVA2免疫小鼠的血清內測得統計學上高于接受F/PBS或CT-CRME29H單獨免疫小鼠的抗RSV中和抗體效價。沒有補體存在時，各組均沒有測得中和抗體效價(log10＜1.3)。和血清及粘膜抗體數據一致(表29和30)，F/0.01μgCT-CRME29H免疫不足以產生抗RSV中和抗體。
第十一個實驗中，在三次免疫后兩周攻擊小鼠以測定F/CT-CRME29H抗再次感染的保護能力。結果顯示，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫的小鼠得到保護(表32)。與原初小鼠或F/PBS或CT-CRME29H單獨免疫小鼠相比，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠肺內的病毒水平顯著降低。此外，與原初小鼠或F/PBS單獨免疫小鼠相比，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠的鼻組織內病毒水平也顯著降低。相比之下，F/AlOH胃腸外免疫小鼠與F/PBS免疫小鼠相比，肺組織內的病毒效價降低，但鼻組織內沒有顯著降低。總而言之，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻內免疫足以產生局部和全身性體液免疫應答，從而保護呼吸道組織抵御活RSV再次感染。
實施例10的數據說明了一種獲得RSVF蛋白鼻內疫苗的可行方法。數據表明，鼻內給予F/CT-CRME29H同時產生體液和粘膜IgG和IgA。有兩點證明觀察到的抗體效價具有顯著性首先，在數量上，F/CT-CRME29H免疫小鼠體液和粘膜的抗體效價相當，而且都比F/PBS免疫小鼠提高。其次，這種效價提高轉而引起生物學相關的免疫應答，如圖7和9所示的保護水平。F/CT-CRME29H免疫與F/PBS或PBS/F/CT-CRME29H相比，顯著增強抗活性RSV攻擊的保護作用。
總之，以上數據提示了一種通過F/CT-CRME29H鼻內免疫激發產生粘膜或體液免疫球蛋白，從而中和感染性病毒的機制。
用另一種病毒抗原(輪狀病毒)，即重組表達的VP2和VP6蛋白，免疫小鼠。按已知方法構建表達Sall輪狀病毒VP2和VP6的重組桿狀病毒載體；已知，重組表達的輪狀病毒結構蛋白會自身組裝成形態與病毒粒子極其相似的顆粒。所表達的蛋白共同組裝成2/6病毒樣顆粒(VLP)。
采用基因背景相同的近交BALB/c小鼠，它們可能都對免疫有應答，從而闡明應答VLP單獨或與CT-CRME29H佐劑聯合時的全身及粘膜免疫球蛋白情況。另用遺傳相異的遠交CD-1小鼠來測定遺傳差異對誘導免疫力和保護作用中諸因素的作用。
除兩只沒有應答的口服免疫CD-1小鼠之外，免疫BALB/c小鼠和CD-1小鼠的血清都含抗VP2和VP6的兩種抗體。預免疫血清和非免疫小鼠血清沒有在模擬或VP2-6桿狀病毒感染細胞內檢測到病毒抗原。2/6-VLP免疫的血清或VP6和VP2的特異性mAbs接觸未感染細胞也沒有顯示反應性(未給出數據)。用各小鼠抗2/6-VLP和輪狀病毒Sall的攻擊前免疫血清進行的Western印跡分析也證實了2/6-VLP的免疫原性(數據未顯示)。
2/6-VLP單獨免疫組的輪狀病毒特異性血清IgG、IgM和IgA模式與2/6-VLP加CT-CRME29H免疫組的相似(圖10)。然而，第13周時，接受2/6-VLP加CT-CRME29H免疫小鼠中這三種同型血清抗體的效價明顯較高(圖10)(IgG、IgM和IgA的p分別為0,0.004和0.02)。這說明，CT-CRME29H顯著增強對2/6-VLP的體液應答。選擇第13周體現兩次免疫之后攻擊前產生的抗體水平。
如圖11A所示，接受VLP的BALB/c小鼠產生的輪狀病毒特異性全身IgG應答強于口服免疫的小鼠。在第13周可看到這兩組血清IgG效價之間有統計學顯著差異(p=0)。同樣，攻擊前分析時(第13周)，鼻內組的血清IgM水平高于口服組(圖11B)。鼻內和混合組的血清IgM水平在第二周達到峰值，第四周下降，而口服組的血清IgM水平在實驗全過程中始終較低，但相對恒定。口服免疫和鼻內免疫動物的血清IgA最高水平出現在第四周。第13周時，三個實驗組的血清IgA之間水平沒有顯著差異(圖11C)。總之，鼻內免疫產生的全身性IgG和IgM應答高于口服免疫。鼻內免疫誘導明顯較高的IgG和IgM效價支持這一觀點鼻內免疫可作為將來候選疫苗的優選給藥途徑(33)。因此，引發全身性強中和應答的鼻內免疫可能能夠有效抵抗穿過粘膜屏障的病毒性病原。
鼻內和口服免疫BALB/c小鼠的血清內都發現了IgG1和IgG2(圖12)。鼻內組這兩種IgG亞類的水平顯著高于口服組(IgG1的p=0.005,IgG2的p=0.05)。然而，同組內亞類之間則沒有顯著差異。以上數據證明鼻內免疫對誘導兩種T輔助細胞路徑(TH-1和TH-2)都有效。
三實驗組的糞便IgA最高水平都出現在初次免疫后4周(圖13A)，這與口服和鼻內免疫動物血清IgA最高水平的出現時間(圖11C)相同。檢測攻擊前糞便IgA水平時，這3種免疫方法之間沒有統計學顯著差異(圖13A)。第4周糞便IgG也最高(圖13B)；然而，鼻內組第13周的IgG顯著多于口服組和混合組(p分別為0和0.002)。總之，2/6-VLP免疫小鼠都產生血清IgG、IgM和IgA，以及糞便IgG和IgA。在所有這些動物中都沒有測得糞便IgM。
所有接受2/6-VLP鼻內免疫的CD-1小鼠和4只口服免疫小鼠中的2只都產生輪狀病毒特異性抗體應答(數據未顯示)。為了更精確地測定抗體應答情況，在26周內每周分析血清和糞便樣品。CD-1小鼠血清和糞便抗體的誘導方式與BALB/c小鼠(圖11和13)的相似。
在BALB/c小鼠中，與2/6-VLP單獨鼻內免疫(PRAS=39％)相比，用2/6-VLP加CT-CRME29H兩次鼻內免疫提供了保護(PRAS=98.7％)(圖14A)。混合免疫，即鼻內免疫后再口服免疫，提供小鼠的保護作用程度與口服組和鼻內組相近，這說明混合免疫在BALB/c小鼠內同樣有效。這證明CT-CRME29H顯著增強保護性免疫應答。三個實驗組的BALB/c小鼠都表現出近乎完全的抗攻擊保護作用。口服、鼻內和混合組的PRAS分別為99.6％、98.8％和98.8％(圖14B)。未免疫對照組的病毒抗原顯著多于三個免疫組(P=0)。3個免疫組的PRAS值之間沒有顯著差異。
鼻內免疫接種在所有免疫CD-1小鼠中同時誘導全身性和粘膜應答，并提供保護作用(PRAS=97.9％)(圖14C)。4只口服免疫CD-1小鼠中只有2只表現出全身性和粘膜抗體應答和保護作用(3只中有2只，PRAS65.8％)(圖14C)；相比之下，口服免疫的BALB/c小鼠都表現出粘膜和全身性應答，并被保護。值得注意的是，沒有產生免疫應答的CD-1小鼠未獲得抗攻擊保護，而有免疫應答的小鼠則獲得保護(圖14C)。口服組中1只免疫后沒有抗體應答的小鼠在攻擊前死亡。將兩只CD-1小鼠作為對照，以減少抗體應答分析中的樣品數量。然而，統計學分析清楚地顯示，保護作用結果具有顯著性(P=0，置信水平為95％)。在相同條件下用CD-1重復口服免疫實驗，但在第26周而不是第13周攻擊。用4只小鼠組成免疫組，5只作為對照，觀察到了相似的保護水平(PRAS=71.2％)(數據為顯示)。綜合起來，以上結果支持最近公開的O Neal等(34,35)的觀點在CD-1小鼠中，鼻內免疫比口服免疫更有效。
因為已證實CT-CRME29H可用作疫苗佐劑，所以最好能適量生產這種物質。用pIIB29H(實施例1)在大腸桿菌內進行了數次表達CT-CRME29H的嘗試。純化CT-CRME29H全毒素的得率約為50μ/L培養基。最初試圖通過對起始質粒pⅡB29H進行修飾形成質粒pPX2492(實施例1)來提高CT-CRME29H的得率，但幾乎沒有效果。用霍亂弧菌DsbA和大腸桿菌RpoH通過pIIB29H和衍生物的共表達獲得了得率的中等程度提高。共表達和純化改進將CT-CRME29H的得率提高到約2mg/L。
為了提高CT-CRME29H的表達，用阿糖誘導型啟動子代替乳糖誘導型啟動子(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，將其與編碼CT-CRME29H的DNA序列操作性連接。克隆時證明pIIB29H質粒含有霍亂弧菌569B的ctxA基因，它與霍亂弧菌2125的ctxB基因連接。這些基因的交叉排列對比表明，兩個ctxB基因之間有7處堿基取代，ctxA基因之間有1個堿基改變。以上堿基取代中有些引起成熟亞基內的氨基酸改變。特別值得注意的是ctxA基因之間的取代，它造成A亞基內A-2部分或全毒素組裝結構域內的氨基酸改變。尚不知道這些基因之間的異質性是否對毒素的表達或全毒素的組裝不利；然而，但從進化觀點考慮，兩個毒素亞基的基因具有相同來源。因此，用于構建阿糖誘導型系統的ctxA基因和ctxB基因都源自霍亂弧菌569B。實施例12描述了質粒pPX7490的構建。pPX7490的純CT-CRME29H產量約為30mg/L培養物。
本發明還涉及含分離純化DNA序列的質粒，該DNA序列包含編碼免疫原性突變霍亂全毒素的DNA序列，所述突變霍亂全毒素A亞基第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，而且，該編碼DNA序列與阿糖誘導型啟動子操作性連接，本發明還涉及用常規方法以上述質粒轉化、轉導或轉染的合適宿主細胞。
本發明用了許多宿主細胞-質粒載體系統來表達免疫原性突變霍亂全毒素。載體系統，最好含有阿糖誘導型啟動子，應與所用宿主細胞相容。合適的宿主細胞包括用質粒DNA、粘粒DNA或噬菌體DNA轉化的宿主細胞；病毒，例如痘病毒和腺病毒；酵母，例如Pichia細胞；昆蟲細胞，例如Sf9或Sf21細胞；或哺乳動物細胞系，例如中國倉鼠卵巢細胞；以及其他常用微生物。所述宿主細胞-載體系統中可采用多種常用轉錄和翻譯元件。將編碼CR-CRM的DNA插入表達系統，在載體的特定位點連入啟動子(以阿糖誘導型啟動子為佳)及其他調控元件，這樣，當質粒載體進入宿主細胞(根據所用宿主細胞-載體系統采用轉化、轉導或轉染)，宿主細胞表達編碼CT-CRM的DNA。
用前述質粒轉化、轉導或轉染宿主細胞，然后在允許所述重組免疫原性脫毒蛋白表達的條件下培養該宿主細胞，由此生產出免疫原性突變霍亂全毒素。
雖然本發明以第29位為組氨酸的CT-CRM為例，但范圍包括對野生型內谷氨酸的其他非保守性取代。谷氨酸是一種酸性(負電)分子。所以，非保守性取代不包括同是酸性分子的天冬氨酸取代。合適的其他氨基酸包括與組氨酸一樣是堿性(正電)分子的賴氨酸和精氨酸。合適的其他氨基酸還包括沒有極性官能團的氨基酸，例如丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和纈氨酸，以及具有不帶電極性官能團的氨基酸，例如天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。
將有效量突變霍亂全毒素與來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原混合，用來制備抗原性組合物，其中的突變全毒素與野生型相比毒性降低，且A亞基第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，可增強脊椎動物對選定抗原的免疫應答。
本發明的抗原性組合物還可包含除第29位氨基酸殘基以外至少有一處其他突變的CT-CRM。國際專利申請WO93/13202描述了可降低霍亂全毒素毒性的一系列A亞基內突變。這些突變發生在第7位的精氨酸，第9位天冬氨酸，第11位精氨酸，第44位組氨酸，第53位的纈氨酸，第54位的精氨酸，第61位的絲氨酸，第63位的絲氨酸，第70位的組氨酸，第97位的纈氨酸，第104位的酪氨酸，第106位的脯氨酸，第107位的組氨酸，第110位的谷氨酸，第112位的谷氨酸，第114位的絲氨酸，第127位的色氨酸，第146位的精氨酸和第192位的精氨酸。國際專利申請WO93/13202列出了霍亂全毒素A亞基的核苷酸序列。國際專利申請WO98/42375(37)描述了可降低霍亂全毒素毒性的A亞基第109位絲氨酸取代。所以，可用常規技術產生一處或多處這些其他位置上的突變。
可通過各種途徑將本發明抗原性組合物給予人或非人脊椎動物，途徑包括但不限于鼻內、口服、陰道、直腸、胃腸外、皮內、透皮(參見國際專利申請WO98/20734(38))、肌內、腹膜內、皮下、靜脈內和動脈內。抗原成分或抗原性組合物中各組分的含量根據抗原特性，宿主年齡、體重及醫學情況，以及給予方法而不同。同樣，本領域技術人員不難確定合適的劑量。雖然不要求，但較好的是抗原與突變CT同時給予。本領域技術人員能夠確定抗原性組合物的劑次和給藥程序。保護作用可能只需單劑的抗原性組合物，也可能需要多次給予，并在后幾次進行加強免疫以維持保護作用。有時，突變CT的佐劑特性可減少所需的劑次或給藥時間。
本發明的抗原性組合物可另含CT-CRME29H以外的其他佐劑。這樣的佐劑例如但不限于StimulonTMQS-21(Aqila Biopharmaceutical,Inc.,Framingham,MA),MPLTM(3-O-脫酰基一磷酰基脂質A；RIMI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT)，磷酸鋁，氫氧化鋁和IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)。抗原性組合物還可以與免疫學上認可的稀釋劑或載體以常規方式混合。
本發明的免疫原性突變霍亂全毒素適合用作含各種抗原的抗原性組合物的佐劑，所述抗原可來自多種感染人和非人動物的病原性微生物，例如但不限于細菌、病毒、真菌或寄生性微生物。抗原可以是完整的細胞或病毒，或是一種或多種多糖、蛋白質、蛋白質亞基或片段、聚或寡聚核苷酸或其他分子組分。如有必要，抗原性組合物可包含一種或多種來自相同或不同病原性微生物的抗原。
以CT-CRM突變株為佐劑的較好細菌疫苗可預防和/或治療以下(不限于)病原引起的疾病流感嗜血桿菌(包括已確定類型的和無法確定類型的)，睡眠嗜血桿菌，粘膜炎莫拉氏菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，無乳鏈球菌，糞鏈球菌，幽門螺桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，砂眼衣原體，肺炎衣原體，鸚鵡熱衣原體，百日咳博德特氏菌，傷寒沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，豬霍亂沙門氏菌，大腸桿菌，志賀氏菌，霍亂弧菌，白喉棒桿菌，結核分枝桿菌，鳥分枝桿菌-胞內分枝桿菌復合體，奇異變形菌，普通變形菌，金黃色葡萄球菌，破傷風梭菌，問號鉤端螺旋體，布氏疏螺旋體，溶血巴斯德氏菌，多殺巴斯德氏菌，大葉性肺炎放線桿菌和雉枝原體。
以CT-CRM突變株為佐劑的較好病毒疫苗可預防和/或治療以下(不限于)病原引起的疾病呼吸道合胞病毒，1-3型副流感病毒，單純性皰疹病毒，人巨細胞病毒，人免疫缺陷病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人乳頭瘤病毒，脊髓灰質炎病毒，輪狀病毒，萼狀病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，風疹病毒，腺病毒，狂犬病病毒，犬熱病病毒，冠狀病毒，細小病毒，傳染性鼻氣管炎病毒，貓白血病毒，貓傳染性腹膜炎病毒，禽傳染性囊疾病病毒，新城疫病毒，Marek病病毒，豬呼吸和生殖綜合征病毒，馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
以CT-CRM突變株為佐劑的較好抗病原性真菌疫苗可預防和/或治療以下(不限于)病原引起的疾病曲霉屬，裂球菌(Blasomyces)，念珠菌，球孢子菌和組織胞質菌。
以CT-CRM突變株為佐劑的較好抗寄生蟲疫苗可預防和/或治療以下(不限于)病原引起的疾病利什曼原蟲屬，蛔蟲屬，鞭蟲屬，賈第鞭毛蟲屬，裂體吸蟲屬，cryptosporidium，毛滴蟲屬，兔弓形蟲屬和卡氏肺囊蟲。
CT-CRM突變株還適合用作聚核苷酸疫苗(又稱DNA疫苗)中的佐劑。此類疫苗可另含布比卡因之類增效劑(參見美國專利5,593,972)。
比較了CT-CRME29H與野生型CT作為佐劑用于給予編碼全長2型單純性皰疹病毒(HSV)糖蛋白D(gD2)加布比卡因制劑(40)的作用。結果顯示，接受CT-CRME29H加HSV-2pDNA疫苗皮內免疫的Balb/c小鼠產生的平均細胞應答高于接受皮內給予pDNAHSVgD2疫苗的小鼠(表34)。此外，接受CT-CRME29H加pDNAHSV gD2疫苗小鼠的平均血清抗體應答與接受無佐劑pDNA HSV gD2疫苗的小鼠相當(表35)。
類似的，pDNA HSV gD2疫苗產生的陰道洗液內gD-2特異性抗體應答水平與皮內或肌內給予無佐劑疫苗時相當(表36)。
pDNA HSV gD2疫苗加CT-CRME29H或CT為佐劑皮內免疫小鼠產生的γ干擾素水平顯著高于接受無佐劑pDNA HSV gD2疫苗的小鼠(表37)。接受CT-CRME29H的小鼠還產生IL-5。
因此，在與抗HSV質粒pDNA疫苗一同給予時，CT-CRME29H增強增殖應答和γ干擾素應答。
為了更好地理解本發明，提供以下實施例。以下實施例僅以說明為目的，不限定本發明的范圍。
實施例實施例1突變CT的表達菌株、質粒和培養條件克隆重組質粒和表達突變蛋白質所用的宿主是大腸桿菌TG1(Amersham-Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)和TX1，后者是TG1的一種抗萘啶酸衍生株，帶有XL1 blue(Stratagene,LaJolla,CA；(41))和CJ236(FTc,lacIq)(Bio-Rad,Hercules,CA)的FTc,lacIq。將含質粒菌株維持在含有所需抗生素(氨芐青霉素50μg/ml；卡那霉素25μg/ml；四環素10μg/ml)的LB瓊脂培養板上。將霍亂弧菌0395的完整CT操縱子亞克隆到噬菌粒載體pSKⅡ-中，受lac啟動子的調控，形成IPTG誘導型質粒pMGJ67(42)。ctxA基因的誘變用Kunkel(43)法選擇質粒pMGJ67內產生的寡核苷酸衍生突變體。表1顯示了用來產生5種突變CT-CRM的寡核苷酸。
表1引入ctxA的寡核苷酸序列
a加下劃線的是被改變的堿基；N=任意堿基；K=T或G。
簡而言之，將各單鏈寡核苷酸磷酸化，用來在自大腸桿菌dut unq菌株CJ236(F＇Tc,pMGJ67)獲取的一段含尿嘧啶單鏈DNA模板上引導第二鏈的合成。連接并轉化unq+菌株TX1后，抽提AmpR轉化子的單鏈DNA，用雙脫氧鏈終止法測序(44)。編碼CT-CRME29H的質粒的構建編碼CT-CRME29H的質粒稱為pIIB29H。該質粒含有霍亂弧菌編碼CT的ctxA和ctxB基因的多順反子。該質粒內的ctxA基因經上述誘變而在CT-A的第29位氨基酸處編碼組氨酸。去除天然ToxR誘導型啟動子而代之以乳糖誘導型啟動子，對野生型多順反子進行了改變。此外，編碼ctxA和ctxB信號序列的區域代之以大腸桿菌LT的信號序列編碼編碼區(LTIIb-B前導序列)，以促進CT-CRME29H的分泌。然后，對質粒pIIB29H進行旨在提高CT-CRME29H表達的修飾。所得質粒稱為pPX2492，在ctxA和ctxB的上游各含有合成的SD序列。這兩個基因在pPX2492中是遺傳上分開的基因，而在霍亂弧菌中則是重疊的。這兩個基因還具有位于各自上游的LTIIb-B前導序列。突變ctxA等位基因的表達在125ml Erlenmeyer瓶內，5ml TB培養基(45)培養物37℃振蕩培養(200rpm)，如此測試各種突變全毒素的產生。加入IPTG至0.4mM誘導對數期細胞(A600=0.8-1.0)，然后培養過夜。加入多粘菌素B至1mg/ml，然后37℃培養10分鐘。離心去除細胞，取上清液如下所述測定全毒素和五聚體B的濃度。
具體地說，大腸桿菌內CT-CRME29H的產生包括大腸桿菌rpoH基因和霍亂弧菌dsbA基因的共表達。這些基因產物參與CTA亞基和B亞基的構相成熟。
實施例2完整全毒素的GM1結合試驗在神經節苷脂GM1-依賴性固相放射性免疫試驗(42)中測試CT-CRM，確定純化后是否存在完整的全毒素。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，其中ELISA板的微孔以神經節苷脂GM1(10μg/ml)4℃包被過夜。然后，依次加入以下試劑，間隔以1小時的室溫培養CT-CRM(濃度為3-0.00137μg/ml),100μl兔抗CT-A血清(1∶1000)和堿性磷酸酶偶聯的山羊抗兔抗體(1∶2000)。為了顯示反應，加入1μg/ml磷酸對硝基苯酯的二乙醇胺溶液100μl，培養30分鐘。加入100μl2NNaOH終止反應，立即用Microelisa自動讀數儀讀數。在與野生型CT比較時，數據顯示在第7、29、110或112位發生氨基酸取代的CT-CRM是完整全毒素(圖1)。然而，結果暗示，一部分純化CT-CRMR11K似乎不是全毒素。
實施例3CT-CRM殘留毒性的Y-1腎上腺細胞試驗多次以小鼠Y-1腎上腺細胞試驗比較突變CT-CRM與野生型全毒素的毒性。將Y-1腎上腺細胞(ATCCCCL-79)以104個細胞/孔的濃度接種在96孔平底板上。然后，向腫瘤細胞加入CT-CRM的3倍系列稀釋液，37℃培養18小時。然后用光學顯微鏡檢查細胞的毒性表現(細胞變圓)。終點滴定量即使50％以上細胞變圓所需的最低毒素濃度。用野生型CT的終點滴度除以CT-CRM的終點滴度然后乘以100，算得殘留毒性百分比。表2顯示了以Y-1腎上腺細胞試驗測定的幾種純化突變全毒素的殘留毒性。
表2對Y-1腎上腺細胞的毒性Y-1腎上腺細胞試驗CT-CRM％殘留毒性E112D 0.13E112D 0.13R11K 0.04R7K 0.04E110D 0.13E110D 0.40E29H 1.20CT-B 1.20CT100.0實施例4專利小鼠腸重試驗本試驗中，將10μg野生型CT或CT-CRME29H胃內給予各組BALB/c小鼠(3個/組)。3小時后，小心地取出小腸并稱重。表3顯示了結果。給出的數據是每組的平均腸重/體重比。
表3CT-CRME29H的毒性
a與野生型CT對照比較的p＜0.05，與PBS比較的p＞0.05。
實施例5ADP-核糖基轉移酶試驗測定放射性標記的NAD+釋放的[羰基-14C]煙酸酰胺，作為NAD+胍基丁胺ADP-核糖基轉移酶活性。簡而言之，用胰蛋白酶活化CT和CT-CRM，與50mM甘氨酸/20mM二硫蘇糖醇在TEAN緩沖液(TrisTM/EDTA/疊氮鈉/氯化鈉)(pH8.0)中30℃培養30分鐘。然后，在反應中加入以下物質0.1mg大豆胰蛋白酶抑制劑，50mM磷酸鉀，10mM胍基丁胺，20mM二硫蘇糖醇，10mM氯化鎂，100μMGTP，3mM雙肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿，0.2％膽鹽，0.03mg卵白蛋白，100μM[腺嘌呤-U-14C]NAD(DuPont NENTM,Boston,MA)，加水至300μl終體積。30℃培養90分鐘后，取100μl樣品加到AG1-X2柱(0.64×5cm)(Bio-Rad)上，用1.0ml去離子/蒸餾水洗柱5次。收集含[14C]ADP-核糖基胍基丁胺的洗脫液進行放射試驗。洗脫液中[14C]的平均回收率表示為與上樣量的百分比。結果見表4。
表4
實施例6以重組(r)不可歸類流感嗜血桿菌(NTHi)P4和P6外膜蛋白免疫的BALB/c小鼠的免疫應答反應第一個實驗中，每組5只BALB/c小鼠在第0、21和35天，接受含5μgrP4或10μgrP6加1μg表5和6所示佐劑(有一組不用佐劑)的10μl劑量鼻內免疫。以第0、21、35和48天收集的樣品，用ELISA測定抗rP4的IgG抗體的效價，結果見表5。另外以第0、21、35和48天收集的樣品，用ELISA測定抗rP6的IgG抗體的效價，結果見表6。還在最后一次免疫后第2周(第49天)，測定了對rP4的粘膜抗體應答。表7顯示鼻、支氣管和陰道洗液中的IgA和IgG效價。
第二個實驗中，每組5只BALB/c小鼠在第0、21和35天，接受含5μgrP4或10μg rP6加表8所示遞減劑量CT-CRME29H的30μl劑量鼻內免疫(其他組分別接受CT或CT-B；有一組不用佐劑)。以第21、35和48天收集的樣品通過ELISA測定抗rP4的IgA和IgG抗體的效價，結果見表8。還測定了第49天支氣管和陰道洗液中的IgA和IgG效價，結果見表8。
表5突變霍亂全毒素配制的重組P4和P6蛋白b免疫a的BALB/c小鼠的全身性體液免疫應答反應
a小鼠在第0、21和35天接受鼻內免疫(IN,10μl體積)。
b重組P4和P6的給予劑量分別是每劑5μg和10μg。
c抗重組P4IgG抗體效價是用ELISA對在所示時間收集的樣品測得的。每組5只小鼠。
dCT和CT突變體的給予劑量是每劑1μg。
表6以突變霍亂全毒素配制的重組P4和P6蛋白b免疫a的BALB/c小鼠的全身性體液免疫應答反應
a小鼠在第0、21和35天接受鼻內免疫(IN,10μl體積)。
b重組P4和P6的給予劑量分別是每劑5μg和10μg。
c抗重組P4IgG抗體效價是用ELISA對在所示時間收集的樣品測得的。每組5只小鼠。
dCT和CT突變體的給予劑量是每劑1μg。
表7以突變霍亂全毒素配制的重組P4和P6蛋白b免疫a的BALB/c小鼠的粘膜抗體應答反應
a小鼠在第0、21和35天接受鼻內免疫(IN,10μl體積)。
b重組P4和P6的給予劑量分別是每劑5μg和10μg。
c抗重組P4的IgG和IgA抗體的效價是用ELISA對最后依次免疫后第2周時(第49天)收集的樣品測得的。每組5只小鼠。
d:NW,BAW和VW表示鼻、支氣管和陰道洗液。
e:CT和CT突變體的給予劑量是每劑1μg。
表8CT-CRME29H遞減劑量對于抗重組流感嗜血桿菌P4和P6蛋白的局部和全身性免疫應答反應的影響抗重組P4抗體效價a
a小鼠在第0、21和35天接受重組P4(5μg)和P6(10μg)蛋白的鼻內免疫。抗重組P4 IgG和IgA抗體的效價是用ELISA對所示時間收集的樣品測得的。每組5只小鼠。
b:BAW和VW分別表示支氣管和陰道洗液。
實施例7以天然NTHiHaps蛋白免疫的BALB/c小鼠的免疫應答反應NTHi菌株P860295(46)由Pittsburgh大學的Charles Brinton博士提供。它獲自一名NTHi誘導的中耳炎患兒的鼻咽。NTHi菌株TN106(47)由Dallas的Texas大學西南醫學中心的Eric Hansen博士提供的。在含有100μg/ml鏈霉素(Sigma,St.Louis,MO)的BHI-XV培養板上選擇得到TN106的一種抗鏈霉素突變株。該突變株在Balb/c小鼠的鼻咽內傳代2次，冷凍保存，稱為菌株TN106.P2。
如下純化NTHi菌株P860295的Haps蛋白。NTHi菌株P860295在BHI-XV培養基中35℃通氣培養18小時。4℃10k×g離心沉淀細菌細胞，將其丟棄。上清液中加入固體(NH4)2SO4至60％飽和度，室溫下保持2-3小時，離心收集沉淀。將沉淀溶于緩沖液1(50mM磷酸鈉緩沖液pH5.8,1mM EDTA,50mM NaCl)中，在4℃用以上緩沖液透析。用緩沖液1平衡床體積為10ml的CMSepharoseTM柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)，以1ml/min的流速將以上溶解物質30ml上柱。用緩沖液1洗柱，直至OD280降至基線。棄去未能結合的物質。以3步從樹脂上梯度洗脫結合的蛋白質1)磷酸鈉緩沖液，pH7.0,1mM EDTA,50mM NaCl；2)磷酸鈉緩沖液，pH8.0,1mM EDTA,50mM NaCl；和3)磷酸鈉緩沖液，pH8.0,1mMEDTA,0.5M NaCl。
收集各梯度洗脫的蛋白質，保存以待分析。對樣品的SDS-PAGE(48)分析顯示，Haps蛋白在梯度2和3洗脫。將含有高純度Haps的這些洗脫液合并。
用純化自NTHi菌株P860295的Haps鼻內免疫6周齡的雌性Balb/c小鼠(每組10只)。Haps蛋白以D-PBS稀釋至5-15μg/40μl，其中含或不含CT-CRME29H。使用時，CT-CRME29H的用量是0.1μg/小鼠。同時，給予小鼠40μl的以下對照制劑溶于D-PBS的CT-CRME29H，單獨的D-PBS和福爾馬林固定的TN106.P2(NTHi攻擊株)。
鼻內(IN)免疫之前，將小鼠麻醉，然后用吸量管按20μl/鼻孔鼻內接種進行免疫。握住吸量管，使得管嘴碰到鼻口，制劑隨呼吸自動流入鼻孔。保持小鼠仰臥，不讓鼻孔在給予制劑或攻擊后接觸任何東西。在第0、1、3和5周免疫小鼠。在第7周抽取血清。結果見表9。
表9以Haps單獨或與CT-CRME29H混合鼻內免疫后Balb/c小鼠的全身性體液免疫應答
實施例8用重組幽門螺桿菌脲酶蛋白免疫的BALB/c和C57B1/6小鼠的免疫應答第一個實驗中，如下免疫5只一組的小鼠表10-12所示，7組小鼠在第0、2、14和16天用100μg重組脲酶加10μg表10-12所示的佐劑胃內免疫。在第0和16天，一組小鼠用10μg重組脲酶臀部皮下免疫；另一組用10μg重組脲酶頸部皮下免疫；兩組都接受20μg StimulonTMQS-21作為佐劑。用第28天收集的樣品通過ELISA測定抗重組脲酶抗體效價。IgG結果見表10,IgA見表11。而且在第29天測定了對重組脲酶的粘膜抗體應答反應。表12分別列出了支氣管洗液和陰道洗液中的IgA和IgG效價。
第二個實驗評價重組脲酶加佐劑保護小鼠抵抗幽門螺桿菌攻擊的能力。如下免疫10只一組的BALB/c小鼠2組在第0、2、14和16天用100μg重組脲酶加10μg表13所示的佐劑胃內免疫；1個對照組以PBS代替重組脲酶加上10μg佐劑。1組在第0天和第16天接受10μg重組脲酶加20μg StimulonTMQS-21皮下免疫。在第28天收集樣品，通過ELISA測定抗重組脲酶抗體效價。在第29、31和34天3次用108幽門螺桿菌攻擊小鼠，在第44天測定保護作用。以快速脲酶試驗評價保護作用。在快速脲酶試驗中，半個胃在0.5ml脲酶試驗培養基(2％尿素和酚紅，7μg/ml pH指示劑)中37℃培養5小時。脲酶活性由尿素產生氨氣和碳酸氫鹽，由此提高pH值，并誘導溶液變色，提高550nm的吸光度。通過分光光度法測定脲酶活性水平。如果平均吸光度比非感染小鼠胃組織所得高出2倍標準方差，則認為幽門螺桿菌陽性。接見表13。
第三個實驗中，2組C57BL/6小鼠(每組5只)在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶加10μg表14所示佐劑胃內免疫。第三組在第0和16天接受10μg重組脲酶加100μg明礬皮下免疫。第四組在第0、2、14和16天接受不加佐劑的100μg重組脲酶胃內免疫。在第28天收集樣品，用ELISA測定抗重組脲酶抗體效價。表14分別列出了血清、支氣管洗液、糞便提取物和陰道洗液中的IgA和IgG效價。
第四個實驗中，如下免疫6只一組的C57BL/6小鼠3組第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶加10μg表15所示佐劑的胃內免疫。第四組不用佐劑。用第29天的樣品ELISA測定抗重組脲酶抗體效價。IgA和IgG結果見表15。表15還列出IgE(PCA)和總IgE效價。PCA表示通過被動皮膚過敏性反應測得的IgE抗體效價。對雌性Sprague-Dawley大鼠進行PCA。用開他敏/甲苯噻嗪鎮靜大鼠，脫毛，皮內注射0.1ml以重組脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制劑免疫的C57Bl/6小鼠的血清(連續稀釋4倍)。48-60小時后，鎮靜大鼠，尾部靜脈內注射0.1ml2μg重組脲酶以含1％Evan＇s藍染料PBS配制的溶液。
表10CT-CRM對BALB/c小鼠產生全身性抗脲酶IgG抗體效價的作用
a第28天收集的血清樣品經ELISA測定的抗重組脲酶抗體幾何平均效價。每組5只小鼠。
b小鼠在第0和16天接受10μg重組脲酶臀部(R)或頸部(N)皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶胃內免疫。佐劑是StimulonTMQS-21(20μg),CT(10μg)或突變CT(10μg)。
表11CT-CRM對BALB/c小鼠產生全身性抗脲酶IgA抗體效價的作用
a第28天收集的血清樣品經ELISA測定的抗重組脲酶抗體幾何平均效價。每組5只小鼠。
b小鼠在第0和16天接受10μg重組脲酶臀部(R)或頸部(N)皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶胃內免疫。佐劑是StimulonTMQS-21(20μg),CT(10μg)或突變CT(10μg)。
表12CT-CRM對BALB/c小鼠粘膜分泌物中產生的抗脲酶IgA抗體效價的作用
a第29天收集的血清樣品經ELISA測定的抗重組脲酶IgG和IgA抗體效價。每組5只小鼠。
bBAW和VW分別表示支氣管洗液和陰道洗液。
c小鼠在第0和16天接受10μg重組脲酶臀部(R)或頸部(N)皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶胃內免疫。佐劑是StimulonTMQS-21(20μg),CT(10μg)或突變CT(10μg)。
表13重組脲酶的CT或CT-CRME29H制劑在BALB/c小鼠內產生的保護性免疫應答
a第28天收集的樣品經ELISA測定的抗重組脲酶IgA抗體效價。每組10只小鼠。
b小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶/劑胃內(IG)免疫。對照小鼠在第0和16天皮下(SC)注射10μg重組脲酶/劑。
c重組脲酶以10μg/劑CT或CT-CRM配制，或與20μg/劑StimulonTMQS-21混合。
dBAW表示支氣管洗液。
e小鼠在第29、31和34天3次用108幽門螺桿菌攻擊，在第44天測定保護作用。保護作用用快速脲酶實驗測定。
表14CT-CRME29H對C57BL/6小鼠抗重組脲酶免疫應答的作用
a用第28天收集的血清樣品用ELISA測定抗重組脲酶抗體的終點效價。每組5只小鼠。
b:BAW、FP和VW分別表示支氣管洗液、糞便提取物和陰道洗液。
c小鼠在第0和16天用10μg重組脲酶皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重組脲酶胃內(IG)免疫。佐劑是明礬(100μg),CT(10μg)或CT-CRME29H(10μg)。
表15以重組脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制劑免疫C57BL/6小鼠循環系統內脲酶特異性IgE抗體的產生
a用ELISA測定第29天收集的血清樣品的IgA和IgG抗體終點效價。每組5只小鼠。
b小鼠在第0、2、14和16天以100μg重組脲酶胃內(IG)免疫。佐劑是10μgCT、CT-CRME29H或LT。
cPCA表示通過被動皮膚過敏性反應測得的IgE抗體效價。對雌性Sprague-Dawley大鼠進行PCA。用開他敏/甲苯噻嗪鎮靜大鼠，脫毛，皮內注射0.1ml以重組脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制劑免疫的C57B1/6小鼠的血清(連續稀釋4倍)。48-60小時后，鎮靜大鼠，尾部靜脈內注射0.1ml 2μg重組脲酶以含1％Evan＇s藍染料PBS配制的溶液。
d數值單位是ng/ml。ND表示沒有測定。
實施例9重組腦膜炎奈瑟氏球菌1類菌毛蛋白和1類外膜蛋白免疫Swiss-Webster小鼠的免疫應答第一個實驗中，6-8周齡Swiss-Webster小鼠(一組15只)在第0、2和3周以5μg純化重組1類菌毛蛋白的CT-CRME29H(0.1-1μg/鼠)制劑(10μl)鼻內免疫。第4周，收集各組中5只小鼠的血清樣品、支氣管洗液(BAW)、鼻洗液(NW)和陰道洗液(VW)，用ELISA法測定腦膜炎奈瑟氏球菌菌毛蛋白特異性血清和粘膜IgA和IgG抗體。結果見表16。各組同等免疫的其余10只小鼠在第4周接受同源腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H355P+.p2IR(由乳鼠傳代2次)2×107CFU的鼻內攻擊。攻擊后第24小時，通過定量培養測定鼻組織中B群腦膜炎奈瑟氏球菌的回收率，見圖2。
第二個實驗中，比較重組菌毛蛋白CT-CRME29H制劑和CT-CRME29H與無關蛋白KLH混合物的抗同源腦膜炎球菌保護作用。5只一組的Swiss-Webster小鼠(6周齡)在第0、2和3周，接受5μg重組菌毛蛋白單獨或加CT-CRME29H(0.1μg)，或PorAH355加CT-CRME29H(0.1μg)鼻內免疫(10μl)。對照組不免疫(不變異組)或以KLH(5μg)加CT-CRME29H(0.1μg)鼻內免疫。用全細胞和抗原特異性ELISA測定第四周攻擊前收集的血清樣品得到抗體終點效價，然后用1×107CFU腦膜炎球菌H355P+攻擊。結果見表17和18。
第三個實驗評價腦膜炎球菌PorA的CT-CRME29H制劑鼻內免疫的免疫原性。5只一組的Swiss-Webster小鼠在第0、2和3周接受20μg/次腦膜炎球菌H44/76的PorA單獨或加CT-CRME29H(0.1μg/次)鼻內免疫，見表19。用實驗第4周收集的血清和粘膜樣品測定抗PorAH44/76抗體效價和IgG的全細胞ELISA。結果見表19第四個實驗評價重組菌毛蛋白和PorA的CT-CRME29H制劑保護小鼠抵抗異源腦膜炎球菌攻擊的能力。10只一組的Swiss-Webster小鼠在第0、2和3周接受5μg重組菌毛蛋白、菌株H355的PorA或菌株870227的PorA的CT-CRME29H(0.1μg)制劑鼻內免疫(10μl)。對照組接受熱滅活腦膜炎球菌870227全細胞或KLH(5μg)加CT-CRME29H(0.1μg)免疫。在用870227菌株攻擊前的第四周收集血清樣品，通過全細胞和抗原特異性ELISA測定IgG和IgA終點效價。結果見表20和21。通過定量培養測定870227菌株攻擊后第24小時鼻組織內的細菌回收率，表示為Log10CFU±標準方差。本實驗結果見表22和圖4。
第五個試驗檢驗CT-CRME29H作為胃腸外免疫佐劑的潛力。用CT-CRME29H(10μg)或MPLTM(100μg)配制的PorA H355 5μg于第0和4周皮下免疫每組10只5-6周齡的Swiss-Webster雌鼠。對照組用熱滅活的腦膜炎球菌870227全細胞或KLH(5μg)加MPLTM(100μg)皮下免疫。第6周，用1.2×107CFO的腦膜炎球菌870227攻擊小鼠。攻擊后24小時，殺死小鼠，鼻組織制成勻漿，接種在選擇培養基上。37℃培養過夜，清點菌落數，表示為Log10CFU±標準方差。結果見表22和圖5。
表16CT-CRME29H對Swiss-Webster小鼠抗腦膜炎奈瑟氏球菌重組菌毛蛋白(Ⅰ類H44/76)全身性和粘膜免疫應答的佐劑效應
表17CT-CRME29H對Swiss-Webster小鼠抗腦膜炎球菌抗原免疫應答的作用B群腦膜炎球菌全細胞ELISA總血清IgG
*代表第0周所有組的合并樣品。
表18CT-CRME29H對Swiss-Webster小鼠抗腦膜炎球菌抗原免疫應答的作用匯總樣品的抗重組菌毛蛋白和抗PorA抗體ELISA效價
表19腦膜炎球菌PorA加CT-CRME29H鼻內免疫Swiss-Webster小鼠的免疫應答
ND=無數據WCE=對H44/76菌株的全細胞ELISAPorA=PorAH44/76特異性ELISA
表20異源和同源腦膜炎球菌PorA和重組菌毛蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫Swiss-Webster小鼠的免疫應答
#所有組合并樣品的第0周效價WC=全細胞HI=熱滅活的表21異源和同源腦膜炎球菌PorA和重組菌毛蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫Swiss-Webster小鼠的免疫應答
#所有組的合并樣品的第0周效價WC=全細胞HI=熱滅活的ND=無數據表22PorA加CT-CRME29H或MPLTM皮下免疫小鼠血清的抗腦膜炎奈瑟氏球菌活性
*nd=未試驗所用補體人UR4-97
實施例10以純化天然呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)糖蛋白免疫的BALB/c小鼠的免疫應答第一個實驗中，6-8周齡BALB/c小鼠(5只一組)在第0和14周接受3μg純化天然蛋白質與CT-CRME29H(1或10μg/鼠)、野生型CT(1μg/鼠)、CT-B(1或10μg/鼠)或無佐劑制劑鼻內免疫(10μl)。在實驗第24天，用ELISA法測定IgG和IgA抗體終點效價。測定血清、支氣管洗液和陰道洗液的效價。結果見表23。
第二個實驗中，6-8周齡BALB/c小鼠(5只一組)在第0和14周接受野生型CT(1μg/鼠)或CT-CRME29H(1μg/鼠)鼻內預免疫(50μl)。對照組不進行預免疫。然后，在第28和42天，所有小鼠都接受3μg融合蛋白等量CT或CT-CRME29H制劑鼻內免疫。用ELISA法測定第56天(血清)收集的樣品和第57天(支氣管和陰道洗液)收集的樣品的抗體終點效價。結果見表24。
第三個實驗中，未免疫過的雌性BALB/c小鼠(6-8周齡，5只一組)在第0、1和2周接受純化天然RSVA2融合蛋白鼻內免疫。免疫使用融合蛋白(3μg/鼠)的CT-CRME29H(1或10μg/鼠)，CT-B(1或10μg/鼠)或明礬(100μg/鼠)制劑。將小鼠麻醉，使其吸入放在鼻孔口的疫苗，如此鼻內給予疫苗。第0、1、2周每次的總體積是10μl/鼠(表25)。對照小鼠接受含F/ALOH的首次肌內免疫，或者接受首次和二次活RSVA2鼻內免疫。三次免疫后第9天(表25和26)，用ELISA分析全身性體液免疫應答。并且收集支氣管、陰道和鼻洗液，用于測定粘膜抗體應答。用免疫小鼠的脾臟測定對MHC-相容性RSV感染的靶細胞的抗原依賴性殺傷細胞活性。接受同樣免疫的第二組小鼠用活性RSV攻擊。然后，在攻擊后第4天，通過測定肺組織勻漿中的病毒空斑，分析該組小鼠內的肺腔室保護作用。用ANOVA進行統計學分析。結果見表25和26。
第四個實驗中，Balb/c小鼠在第0、1和2周接受純化RSVF蛋白(3μg/鼠)加CT-CRME29H(1或10μg/鼠)，CT-B(1或10μg/鼠)或PBS的鼻內免疫。對照小鼠接受RSV鼻內免疫或F/ALOH肌內免疫。最后一次免疫后第9天，分離出脾細胞，在體外用同源RSV感染的刺激細胞攻擊。培養6天后，通過測定RSV感染的靶細胞釋放的51鉻量來確定抗原依賴性殺傷細胞活性。結果見圖6。
第五個實驗是一個抗病毒保護試驗，在用活性RSV攻擊后第4天分離出免疫小鼠的肺腔室，勻漿化，測定感染性病毒的量。用含純化RSVF蛋白和CT-CRME29H、CTB或PBS的疫苗鼻內免疫Balb/c小鼠。對照組用F/ALOH肌內免疫。最后一次免疫后8天(F/ALOH免疫后3周)，用活性RSV攻擊小鼠。4天后，獲取肺組織，用來測定感染性病毒的量。結果見圖7。
第六個實驗中，未免疫過的雌性Balb/c小鼠(6-8周齡，5只一組)在第0、1和2周接受純化天然RSV A2融合蛋白鼻內免疫。免疫使用融合蛋白(3μg/鼠)的CT-CRME29H(1μg/鼠)或明礬(100μg/鼠)制劑。將小鼠麻醉，使其吸入放在鼻孔口的疫苗，如此鼻內給予疫苗。第0、1和2周每次的總量是5μl/鼠(表27)。對照小鼠接受含F/ALOH的首次肌內免疫，或者接受首次和二次活RSVA2鼻內免疫。三次免疫后2周(表27和28)，用ELISA分析全身性體液免疫應答。收集支氣管、陰道和鼻洗液，用于測定粘膜抗體應答。用免疫小鼠的脾臟研究對MHC-相容性RSV感染的靶細胞的抗原依賴性殺傷細胞活性。接受同樣免疫的第二組小鼠用活性RSV攻擊。然后，在攻擊后第4天，通過測定肺組織勻漿中的病毒空斑，分析該組小鼠內的肺腔室保護作用。用ANOVA進行統計學分析。結果見表27和28。
第七個實驗中，使用第四個實驗中的方法來測定對RSV感染的靶細胞的抗原依賴性CTL活性。結果見圖8。
第八個實驗是另一個抗病毒保護試驗，Balb/c小鼠(5只一組)接受純化RSVF蛋白單獨或加CT-CRME29H的鼻內免疫。對照組接受F/ALOH肌內免疫或不免疫(原初)。最后一次免疫后2周(給予F/ALOH后4周)，用活性RSV攻擊各組小鼠。4天后，獲取肺組織，用來測定感染性病毒的量。結果見圖9。
第九個實驗中，用3次免疫方案更詳細地研究CT-CRME29H的佐劑應答。5只一組的BALB/c小鼠在第0、1和2周接受融合蛋白(3μg)混合0.01、0.1或1.0μgCT-CRME29H的鼻內免疫(5μl)。對照鼠在第0天用F/ALOH(肌內)或RSVA2(鼻內)初次免疫。三次免疫后2周，測定血清抗體效價。結果見表29。數據顯示為log10抗體效價幾何平均值(±SD)。在另兩次實驗中得到相近的結果。
F/CT-CRME29H鼻內免疫后，還測定實驗9中小鼠的抗F蛋白局部抗體應答。最后一次免疫后2周，殺死小鼠，獲取粘膜洗液樣品，用ELISA分析抗F蛋白特異性IgG和IgA。結果見表30。數據顯示為log10(令OD410為0.03)終點效價幾何平均值(±SD)。在另兩次實驗中得到相近的結果。
第十個實驗中，為了研究F/CT-CRME29H免疫誘導體液免疫應答的功能，用空斑減少試驗測定血清抗RSVA2中和抗體效價。結果見表31。以5％豚鼠血清為補體來源，在其存在(+C＇)和不存在(-C＇)下，測定各小鼠(5只一組)血清的中和抗體效價幾何平均值(log10)。在另兩次實驗中得到相近的結果。
第十一個實驗中，小鼠(5只一組)在第0、7和14天接受F蛋白加0.01、0.1或1μgCT-CRME29H制劑鼻內免疫。對照鼠用F/ALOH(肌內)或RSVA2(鼻內)免疫。為了測定F/CT-CRME29H抗再次感染的保護能力，三次免疫后2周攻擊小鼠。感染后4天，測定各小鼠肺組織勻漿和鼻組織勻漿中的病毒水平。結果見表32。數據顯示為病毒效價/g組織的幾何平均值(±SD)。
表23用CT、CT-B或CT-CRME29H鼻內免疫后BALB/c小鼠抗霍亂毒素抗體的產生
a用第24天收集的合并樣品測定抗體終點效價。BAW和VW分別表示支氣管洗液和陰道洗液。每組5只小鼠。
b小鼠在第0和14天接受F蛋白混合所示量野生型CT、市售CT-B或CT-CRME29H的鼻內免疫(10μl)。
c:ND=無數據。
表24已有抗霍亂毒素抗體對呼吸道合胞病毒融合蛋白加CT或CT-CRME29H制劑的免疫原性的作用
a用第56天(血清)和第57天(支氣管洗液(BAW)和陰道洗液(VW))收集的樣品以ELSIA法測定的抗體終點效價。每組5只小鼠。
b小鼠在第0和14天接受野生型CT(1μg)或CT-CRME29H(1μg)鼻內預免疫(50μl)。然后在第28天和第42天，所有小鼠都接受3μg融合蛋白的同樣量(1μg)野生型CT或CT-CRME29H制劑鼻內免疫(50μl)。野生型CT或CT-CRME29H預免疫后再用F蛋白免疫的小鼠其第42天時的抗CT抗體終點效價超過1,000,000。
表25RSV融合蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫BALB/c小鼠的全身性免疫應答抗融合蛋白抗體效價
總IgGp＜0.05:777-780與784相比；780與779相比；777-780與785相比；777,780與907相比(779與907相比p=0.7)p＞0.05:778與777相比(p=0.125)IgG1:
p＜0.05:777-780與784相比；777-780與907相比；777-780與785相比p＞0.05:781-780與907相比IgG2a:
p＜0.05:777-780與784相比表26RSV融合蛋白(F)加CT-CRME29H鼻內免疫BALB/c小鼠的粘膜免疫應答抗融合蛋白抗體效價
表27RSV融合蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫BALB/c小鼠的全身性免疫應答抗融合蛋白抗體效價
總IgGp＜0.05:256與250和257相比p＞0.05:256與258和259相比IgG1:
p＜0.05:256與250和257相比p＞0.05:256與258相比IgG2ap＜0.05:256與250相比，257與258相比表28RSVF蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫BALB/c小鼠的粘膜免疫應答抗F抗體效價免疫原 合并BAL合并VW合并NW組IgGIgAIgGIgAIgGIgA3μgF250＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25PBS3μgF256826＜25 1,195 3,730 5548751μgE29H257 1μgE29H ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜253μgF258706＜25 577108148＜25100μgAlOH259 RSV A2 347＜25 1721,449 305＜25表29F蛋白加CT-CRME29H免疫誘導的抗F血清抗體應答
ap＜0.05與F/PBS或F/CT-E29H(0.01μg)相比，bp＞0.05與F/CT-E29H(0.1μg)或F/AlOH相比cp＜0.05與F/CT-E29H(0.1和0.01μg)并F/PBS相比；p＞0.05與CT-E29H相比(1.0μg)dp＜0.05與F/PBS和F/CT-E29H(0.01μg)相比ep＞0.05與F/PBS相比fp＜0.05與F/CT-E29H(0.1和1.0μg)相比gND未進行。
表30F蛋白CT-CRME29H制劑免疫小鼠粘膜液中的抗F蛋白抗體
表31F蛋白CT-CRME29H制劑鼻內免疫后全身性抗RSV中和抗體的產生
ap＜0.05與F/PBS或F/CT-CRME29H(0.01μg)相比p＞0.05與F/CT-CRME29H(0.1μg),F/AlOH或RSVA2相比bp＜0.05與F/PBS或F/CT-CRME29H(0.01μg)相比
p＞0.05與F/CT-CRME29H(1μg),F/AlOH或RSVA2相比表32F蛋白加CT-CRME29H鼻內免疫后肺和鼻組織內的病毒感染度
ap＜0.05與F/PBS,F/CT-CRME29H(0.01μg),CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05與F/AlOH或RSVA2相比bp＞0.05與F/CT-CRME29H(0.1μg)。
cp＜0.05與F/CT-CRME29H(0.01μg),F/PBS,CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05與F/CT-CRME29H(0.1μg),F/AlOH或RSV A2相比相比dp＜0.05與F/PBS,F/CT-CRME29H(0.01μg),CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05與F/CT-CRME29H(1μg),F/AlOH或RSVA2相比實施例11輪狀病毒重組病毒樣顆粒免疫小鼠的免疫應答草地夜蛾(sf-9)細胞(美國典型培養物保藏中心，Manassas,VA)維持在SF-900Ⅱ無血清培養基(Gibco-BRL,Grand Island,NY)中。用表達猿輪狀病毒Sall株(32)的VP2和VP6基因的重組桿狀病毒構建物共轉染sf-9細胞。
如下從被感染Sf9細胞的生長培養基中純化釋放出的2/6VLP室溫下830×g離心細胞30分鐘進行澄清。進一步8000×g離心30分鐘澄清上清液。用35％的蔗糖TNC緩沖液(10mM Tris,140mM NaCl,10mM CaCl2,pH8.0)溶液96500×g離心2小時，共2次，如此從上清液中純化得到VLP，然后懸浮在TNC緩沖液中，4℃保存。用SDS-PAGE分析純化的VLP，然后通過銀和考馬斯亮藍染色來確定純度，用Western印跡法分析蛋白質組成，用電子顯微鏡檢查顆粒的完整性，用BSC蛋白試驗測定總蛋白濃度。
對純化2/6-VLP的考馬斯亮藍、銀染色和Western印跡證明有VP2和VP6蛋白存在，以及它們的純度和與特異性單克隆抗體的免疫反應活性。
根據凝膠上的條帶強度估計，VLP的純度約為95％。此外，對純化2/6-VLP的電子顯微鏡分析證實它們形態完整(數據未顯示)。
如下免疫小鼠。本試驗所用BALB/c和CD-1小鼠購自CharlesRiverLaboratoreis(Storeridge,NY)，培養在無輪狀病毒的環境中。在第0和2周，分別用100和10μg2/6-VLP對4周齡的BALB/c小鼠進行口服(n=4)或鼻內(n=5,n=4)免疫；每次都用10μgCT-CRME29H制劑。第三組BALB/c小鼠(n=4)接受2/6-VLP加CT-CRME29H鼻內免疫，然后以口服免疫增強(即，混合組)。該實驗中的對照小鼠接受CT-CRME29H(n=10),1×TNC緩沖液(n=5)或2/6-VLP加1×TNC緩沖液(n=5)免疫。各小鼠用20μl接種物鼻內免疫，每次2μl，每隔1分鐘輪換滴入另一鼻孔。在第0、l、2、4、6、8、10、13周收集各鼠的血清和糞便樣品，通過ELISA測定產生的輪狀病毒特異性血清IgG、IgM和IgA抗體水平，以及糞便IgG和IgA水平。血清抗體的結果見圖10和11；糞便抗體的結果見圖13。用第13周的血清來測定IgGl和IgG2a亞類。抗體亞類結果見圖12。
免疫前血清的1∶100稀釋液和1∶2稀釋的糞便樣品在ELISA中顯示沒有反應活性。平行分析只接受TNC緩沖液或CT-CRME29H的對照小鼠的血清和糞便。對照組在實驗中顯示血清無輪狀病毒特異性，糞便內也沒有抗體。
在第0、2和13周以CT-CRME29H為佐劑口服(n=4)或鼻內(n=4)免疫4周齡的CD-1小鼠。對照組(n=2)只接受CT-CRME29H。收集0-9,11-14,26-28周的血清和糞便樣品，測定血清和糞便內輪狀病毒特異性抗體的水平。
為了檢測和定量糞便和血清樣品中的IgG、IgM和IgA，在96孔聚氯乙烯微滴板(Dynex Technologies,Chantilly,VA)上涂以超免疫豚鼠抗Sall輪狀病毒血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，37℃培養4小時，或室溫培養過夜。微滴板然后用5％BLOTTO(5％脫脂奶粉的PBS溶液)37℃封閉2小時。糞便樣品的懸浮液用1％BLOTTO按1∶1稀釋，加到板上。微滴板然后在4℃培養過夜，然后用加有0.05％TweenTM20(TNC-T)的TNC緩沖液洗板3次。用加有2.5％普通豚鼠血清(NGPS)的1％BLOTTO稀釋兔抗獼猴輪狀病毒超免疫血清，加到板上，37℃培養1小時。然后用TNC-T洗板3次。用加有2.5％NGPS的1％BLOTTO稀釋辣根過氧化物偶聯的山羊抗兔IgG、IgM和IgA(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)，加到板上，37℃培養1小時。然后用TNC-T洗板4次。加入TMB底物(Kirkegaard and Perry Laboratories)，室溫下進行7分鐘的顯色反應。加入1M磷酸終止反應。用微滴板讀數儀(BIO-TEK Instrument,Winooski,VT)測定450nm的OD。如果比空白高出0.1，則認為是顯著。用1％BLOTTO稀釋Sall病毒原液，加到板上，4℃培養過夜。用TNC-T洗板3次；然后將1％BLOTTO 1∶1稀釋的糞便樣品或1％BLOTTO連續稀釋的血清樣品加到板上。將一式兩份的糞便樣品加到沒有抗Sall抗體包被的孔中作為陰性對照。微滴板在37℃培養2小時，然后用TNC-T洗滌3次，以1％BLOTTO加2.5％NGPS稀釋過氧化物酶偶聯的羊抗小鼠IgG、IgM和IgA加入孔中。以相同方式稀釋過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgA+IgG+IgM(H+L)抗體，加到孔中，測定免疫前抗體。微滴板在37℃培養1小時，然后用TNC-T洗滌4次。如前所述進行顯色進行ELISA抗原檢測。用于測定IgG亞類的ELISA法對使用HRP標記的大鼠抗(單克隆)抗小鼠IgG1和IgG2a作為第二抗體(Biosource International,Camarillo,CA)的方法進行了修改。
對Ishida等所述的免疫組織化學實驗(49)進行修改，用于檢測2/6-VLP免疫小鼠血清中的抗輪狀病毒VP2和VP6抗體。簡而言之，將振蕩燒瓶中的對數早期的Sf9細胞接種到96孔組織培養板上，接種密度為2.5×104細胞/孔，然后室溫(RT)培養1小時。接著，用編碼VP2和VP6基因的重組桿狀病毒感染細胞，感染復數為10，感染在28℃持續3天。然后將培養基丟棄，培養板室溫下真空干燥1小時，用10％福爾馬林(37％甲醛溶液，含10-15％甲醇，Sigma)PBS溶液室溫下固定30分鐘。然后，細胞在1％Triton X-100(Sigma)的TNC緩沖液溶液中室溫下透化5分鐘。
使表達指定輪狀病毒蛋白的各組感染細胞接觸每只BALB/c或CD-1小鼠攻擊前或免疫后血清，然后免疫染色。用含5％FCS的PBS連續稀釋小鼠血清樣品。將樣品加到孔中，培養板在37℃培養2小時。然后以PBS洗板4次。加入含5％FCS的PBS配制的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、IgM或IgA抗體，37℃培養1小時。用PBS洗孔2次，用3-氨基-9-乙基-咔唑底物(AEC)(Sigma)檢測著色細胞。用非感染Sf9細胞，非免疫小鼠血清和免疫小鼠的免疫前血清作為陰性對照。用抗VP6的單克隆抗體(7D9,5E6)和抗VP2單克隆抗體(BP2)作為陽性對照(50)。
在第26周(CD-1小鼠)或第13周(BALB/c小鼠)管飼以10SD50的野生型鼠EDIM輪狀病毒(51)攻擊非免疫小鼠和2/6-VLP免疫小鼠。測定排出劑量50作為EDIM菌株滴度，即誘導50％成年鼠在糞便中排除病毒所需的劑量。先口服給予100μl4％碳酸氫鈉溶液中和胃酸，然后給予胰蛋白酶活化的攻擊病毒(100μl)。將病毒以M199培養基(Irvine Scientific,SantaAna,CA)稀釋，每ml病毒儲備液中加10μl胰蛋白酶儲備液(1mg/ml)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)以活化病毒。攻擊后，收集9天時所有動物的糞便樣品。
通過ELISA測定糞便樣品中的輪狀病毒抗原排出，以凈光密度值(OD)表示，即攻擊后糞便樣品的OD減去同一小鼠攻擊前樣品的OD。測定各動物排出曲線下的面積，將各動物曲線下的面積與對照組的平均面積比較，由此計算出各動物的抗原排出減少百分比(PRAS)。然后計算各免疫組的平均PRAS。只有PRAS超過50％時才認為受到保護。結果見圖14。
用SPSS Windows 8.0版(SPSS,Inc.,Chicago,IL)進行統計學分析。用獨立的T檢驗比較各組之間的攻擊前效價幾何平均值和PRAS。在計算P值時，保留到小數點之后3位(0.000=0)。
實施例12用阿糖誘導型啟動子提高CT-CRME29H的表達如下構建阿糖誘導系統合成PCR引物用于擴增pIIB29H中編碼毒素的雙順反子。引物1:CT29正向NheⅠ:5＇-TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATGAGC-3＇(SEQ ID NO:6)；引物2:CT29反向HindⅢ:5＇-GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3＇(SEQ ID NO:7)。用內切核酸酶NheⅠ和HindⅢ位點將CT-CRME29HctxA和ctxB編碼PCR片段克隆到pBAD18-Cm中，形成pCT18。用ClaⅠ和HindⅢ去除pCT18的ctxB基因(霍亂弧菌2125)，用pMGJ142的相同片段取代，后者編碼霍亂弧菌569B的ctxB基因。所得的pPX7490編碼CT-CRME29HctxA和霍亂弧菌569B的ctxB，它們處于阿糖啟動子的控制下，并具有LTIIb-B前導序列。
CT-CRME29H的大規模表達及純化方法如下用3L的槽紋費氏燒瓶，內有1L的Hy-Soy生長培養基(每升中Hy-Soy10g；酵母提取物12.5g；氯化鈉5g；磷酸二氫鈉3.3g；磷酸氫鈉13.1g)。為了制備起始物儲備液，在一燒瓶中加入20μg/ml氯霉素和20ml無菌的50％葡萄糖溶液(葡萄糖的最終濃度為1％)。然后在燒瓶內接種以300μl pPX7490轉化的DH5α-70℃冷凍儲備液。燒瓶在37℃以200rpm振蕩培養過夜。第二天使用的所有生長培養基在37℃以200rpm振蕩預熱。第二天，將通宵培養物的1∶40稀釋液加入Hy-Soy生長培養基，補充以20μg/ml氯霉素和10ml作為碳源的無菌甘油(甘油的終濃度為1％)。37℃培養過夜，直至費氏燒瓶內的OD600達到4.5-5.5(在生物反應器中則更高)。然后，用20mlL-阿糖(終濃度為0.5％)誘導培養物，繼續培養3小時。3小時誘導期后，大多數毒素都與細胞結合著。離心收獲細胞，將沉淀重懸于10mM NaPO4、1mM EDTA(pH7.0)緩沖液中，體積為最初培養物體積的9％。用顯微流化儀機械攪拌細胞懸液，以8500×g離心10分鐘，去除細胞碎片。在-45Ti轉頭，160,000×gAV離心機中42,000rpm離心1小時，進一步澄清細胞裂解液(上清液)。將澄清后的細胞裂解液上樣到經10mMNaPO4(pH7.0)平衡的羧甲基(CM)-SepharoseTM柱(Pharmacia)上。每10L培養物用約300ml CM-SepharoseTM。以0.102cm/min(2ml/min)的速度將細胞裂解液上柱。用10-25倍柱體積的10mM NaPO4(pH7.0)以0.255cm/min(5ml/min)的速度徹底洗柱，以去除污染物。用4倍柱體積的10mM NaPO4(pH7.0)以0.255cm/min的速度洗脫CT-CRME29H全毒素。通過過濾或用PBS透析對CT-CRME29H的洗脫液進行緩沖液交換，然后保存于4℃。
實施例13編碼2型單純性皰疹病毒全長糖蛋白D的質粒DNA免疫BALB/c小鼠的免疫應答編碼2型單純性皰疹病毒全長糖蛋白D的質粒DNA(pDNA)以0.25％布比卡因配制，以野生型CT、CT-CRME29H為佐劑，或不含佐劑，用它免疫6-8周齡的雌性BALB/c小鼠(含gD2基因的質粒參見Pachuk等的(40))。3周后，進行第二次免疫，末次注射2周后，殺死動物。免疫方案如下。
表33
024-含gD2基因的pDNA；023=未插入gD2基因的pDNA骨架。
ID=真皮內；IM=肌內第四組為陽性對照；第5組為陰性對照。
如下進行增殖試驗將1×105個脾細胞培養在不含或含200ng/mlgD2蛋白的含10％FCS完全RPMI培養基中。37℃,5％CO2存在下培養4天后，用3[H]脈沖處理培養物過夜。在β計數儀上測定3[H]的摻入量。計數報告為SI(刺激指數=有抗原刺激時的數值除以沒有抗原刺激時的數值)。結果見表34。
進行ELISA，測定血清和陰道洗液中的抗原特異性體液應答。簡而言之，96孔圓底板(Maxisorb,Nunc)涂以0.4μg/ml純化gD2蛋白，4℃過夜。用PBS洗板3次，然后用4％BSA室溫下封閉1小時。將50μl(1∶100稀釋的)血清樣品或50μl陰道洗液加到板上。血清培養1小時，陰道洗液4℃培養過夜后，用PBS洗板5次，加入過氧化物酶偶聯的抗小鼠Ig(Sigma,St.Louis,MO)1∶3000稀釋液，培養1小時。用PBS洗板，然后加入底物3,3＇,5,5＇-四甲基二氨基聯苯(TMB)-H2O2(Biotecx,Houston,TX)。顯色30分鐘后，在Emax微滴板讀數儀(Molecular Device,Sunnyvale,CA)上在450nm處讀數。結果見表35(血清)和表36(陰道洗液)。
用前文所述的標準ELISA檢測細胞因子。適當包被微滴板以捕捉gD2刺激24小時或72小時的培養物上清液中的IL5-或γ干擾素。結果見表37。
表34給予HSV gD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后的gD2特異性細胞增殖應答(SI)
表35給予HSVgD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后陰道洗液內的gD2-特異性體液應答(ng/ml)
表36給予HSVgD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后血清內的gD2-特異性體液應答(ng/ml)
表37gD2特異性細胞因子ELISA結果(gp/ml)
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序列表<110>美國氰胺公司<120>突變霍亂全毒素佐劑<130>33383-00PCT<140>60/102,430<141>1998-09-30<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>1aagttatataaggcagattc 20<210>2<211>18<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>2cagattctaa acctcctg 18<210>3<211>22<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>3gacagagtna gtactttgac cg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>4cagatgakca agakgtttct gc22<210>5<211>22<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>5cagatgakca agakgtttct gc22<210>6<211>32<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>6ttttttgggc tagcatggag gaaaagatga gc 32<210>7<211>26<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>7gcaggtcgaa gcttgcatgt ttgggc2權利要求
1．一種抗原性組合物，含有來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原和有效佐劑量的突變霍亂全毒素，其中的霍亂全毒素與野生型霍亂全毒素相比毒性降低，且霍亂全毒素A亞基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，所述的全毒素增強脊椎動物宿主對所述抗原的免疫應答。
2．根據權利要求1所述的抗原性組合物，含有1種以上抗原。
3．根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中第29位的氨基酸是組氨酸。
4．根據權利要求1所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是流感嗜血桿菌P4外膜蛋白，流感嗜血桿菌P6外膜蛋白，流感嗜血桿菌粘附及穿透蛋白(Haps)，幽門螺桿菌脲酶蛋白，腦膜炎奈瑟氏球菌B群1類重組菌毛蛋白(重組菌毛蛋白)，腦膜炎奈瑟氏球菌B群1類外膜蛋白(PorA)，呼吸道合胞病毒融合蛋白，輪狀病毒病毒樣顆粒或2型單純性皰疹病毒(HSV)糖蛋白D(gD2)。
5．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是流感嗜血桿菌P4外膜蛋白，流感嗜血桿菌P6外膜蛋白，流感嗜血桿菌Haps蛋白或它們的組合。
6．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是幽門螺桿菌脲酶蛋白。
7．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是腦膜炎奈瑟氏球菌重組菌毛蛋白，腦膜炎奈瑟氏球菌PorA蛋白或它們的組合。
8．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是呼吸道合胞病毒融合蛋白。
9．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是輪狀病毒病毒樣顆粒。
10．根據權利要求9所述的抗原性組合物，所述的病毒樣顆粒是輪狀病毒2/6-病毒樣顆粒。
11．根據權利要求4所述的抗原性組合物，所述的選定抗原是HSV gD2。
12．根據權利要求11所述的抗原性組合物，所述的抗原性組合物是含有編碼HSV gD2的質粒DNA的聚核苷酸疫苗。
13．根據權利要求1所述的抗原性組合物，還含有稀釋劑或載體。
14．根據權利要求1所述的抗原性組合物，還含有突變霍亂全毒素之外的第二種佐劑。
15．根據權利要求1所述的抗原性組合物，對霍亂全毒素A亞基在氨基酸29之外進行了至少一處其他突變。
16．根據權利要求15所述的抗原性組合物，所進行的至少另一處突變是對第7位精氨酸、第9位天冬氨酸、第11位精氨酸、第44位組氨酸、第53位纈氨酸、第54位精氨酸、第61位絲氨酸、第63位絲氨酸、第70位組氨酸、第97位纈氨酸、第104位酪氨酸、第106位脯氨酸、第107位組氨酸、第109位絲氨酸、第110位谷氨酸、第112位谷氨酸、第114位絲氨酸、第127位色氨酸、第146位精氨酸和第192位精氨酸的取代。
17．一種增強抗原性組合物激發脊椎動物宿主免疫應答的方法，所述的組合物含有來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原，所述方法包括將權利要求1所述的抗原性組合物給予所述宿主。
18．一種增強含流感嗜血桿菌抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求5所述的抗原性組合物給予所述宿主。
19．一種增強含幽門螺桿菌抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求6所述的抗原性組合物給予所述宿主。
20．一種增強含腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求7所述的抗原性組合物給予所述宿主。
21．一種增強含呼吸道合胞病毒抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求8所述的抗原性組合物給予所述宿主。
22．一種增強含輪狀病毒抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求9所述的抗原性組合物給予所述宿主。
23．一種增強含單純性皰疹病毒抗原的抗原性組合物激發脊椎動物免疫應答的方法，包括將權利要求11所述的抗原性組合物給予所述宿主。
24．一種含分離和純化的DNA序列的質粒，所述序列含有編碼免疫原性突變霍亂全毒素的DNA序列，所述突變毒素的霍亂全毒素A亞基谷氨酸29被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，該DNA序列與阿拉伯糖誘導型啟動子操作性連接。
25．一種以權利要求24所述質粒轉化、轉導或轉染的宿主細胞。
26．一種制備免疫原性突變霍亂全毒素的方法，其中的霍亂全毒素與野生型霍亂全毒素相比毒性降低，且霍亂全毒素A亞基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，該方法包括用權利要求24所述的質粒轉化、轉導或轉染宿主細胞，并在允許宿主細胞表達所述重組免疫原性脫毒蛋白質的條件下培養該宿主細胞。
27．有效佐劑量突變霍亂全毒素的用途，其中的霍亂全毒素與野生型霍亂全毒素相比毒性降低，且霍亂全毒素A亞基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，它與來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原組合以制備抗原性組合物，所述全毒素增強脊椎動物對所述抗原的免疫應答。
全文摘要
一種突變霍亂全毒素可以作為佐劑用在抗原性組合物中,從而增強脊椎動物宿主對來自病原性細菌、病毒、真菌或寄生蟲的選定抗原的免疫應答,該突變毒素的特征在于其A亞基的第29位氨基酸發生點突變,該處的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。在具體實施例中,氨基酸29是組氨酸。該突變霍亂全毒素還可以在A亞基內氨基酸29以外位置具有至少一處其他突變。所述抗原性組合物可以另含除突變霍亂全毒素之外的第二佐劑。
文檔編號A61K39/00GK1320043SQ99811557
公開日2001年10月31日 申請日期1999年9月30日 優先權日1998年9月30日
發明者R·K·霍姆斯, M·G·喬布林, J·H·埃爾德里奇, B·A·格林, G·E·漢考克, J·A·皮克 申請人:美國氰胺公司, 美國聯邦政府由健康科學軍政大學代表