用于治療腦腫瘤的藻酸鹽包囊的制作方法

專利名稱：用于治療腦腫瘤的藻酸鹽包囊的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤治療領域，所述腫瘤位于中樞神經系統(CNS)內部并且是原發性或繼發性(轉移性)的惡性腦-脊髓腫瘤，本發明提供了該治療方案中使用的新的組合物和給藥系統。
與其它轉移性腫瘤相比，原發性腦部治療(神經膠質瘤)具有數種獨特的生物學性質。它們局限于中樞神經系統，幾乎不存在擴散到其它器官的轉移性。即使這些腫瘤對腦表現出高度入侵性，治療后在其原發部位仍具有復發的傾向。腫瘤是高度異質的，它們由多種不同表型性質類型的細胞組成。
目前選擇的治療方案是進行手術，然后進行放療和化療。大多數惡性腦腫瘤(惡性膠質瘤)患者診斷后預測的存活期大約為10個月。因此對這些腫瘤患者，急需一種新的治療方案。由于腫瘤在其原發部位具有復發的傾向，因此需要新的局部治療方案。另外，由于這些腫瘤由多種不同表型性質類型的細胞組成，因此選擇不同的治療方案應能靶向不同類型的腫瘤細胞。
位于中樞神經系統內的、通常難以成功治療的其它腫瘤包括由星形神經膠質細胞和少突神經膠質細胞衍生的腫瘤，例如星形細胞瘤-低級星形細胞瘤(1級和2級星形細胞瘤)-間變星形細胞瘤(3級星形細胞瘤)-多形性成膠質細胞瘤(4級星形細胞瘤)-包括繼發性成膠質細胞瘤，即由較低級星形細胞瘤分化的腫瘤-原發性成膠質細胞瘤，即重新以原發性成膠質細胞瘤形式出現的腫瘤-巨細胞性成膠質細胞瘤
-神經膠質肉瘤-腦神經膠質瘤病少突神經膠質細胞瘤-包括少突神經膠質細胞瘤(WHO Ⅱ級)-間變少突神經膠質細胞瘤(WOH Ⅲ級)混合性神經膠質瘤-少突星形細胞瘤(WHO Ⅱ級)-間變少突星形細胞瘤(WHO Ⅲ級)室管膜瘤-室管膜細胞瘤(WHO Ⅱ級)-間變室管膜細胞瘤(WHO Ⅲ級)-室管膜下細胞瘤(WHO Ⅰ級)胚胎性瘤-中樞成神經細胞瘤-成室管膜細胞瘤-成神經管細胞瘤-幕上PNETs成神經細胞瘤-成嗅神經細胞瘤-腎上腺和交感神經系統的成神經細胞瘤對于這些腫瘤中的大部分，首選治療方案是進行手術，然后進行放療和/或化療。然而，通過外科手術通常難以完全除去腫瘤，同時接下來的放療和化療有時由于抗放射性和/或給予治療劑量的細胞毒性藥物存在困難也不能完全成功。
最近幾年，很多人關注著基因治療，嘗試了通過下調致癌基因的表達或者插入正常腫瘤抑制基因來逆轉惡性表型。也有人引入通過免疫系統用于促進腫瘤識別和排斥的免疫刺激因子，例如細胞因子。另外，也曾對細胞進行修飾以使其對腫瘤細胞直接釋放基因產物，增強了它們對藥物的敏感性。描述這些進展的論文包括(Ⅰ)當代腫瘤學觀點(Curr Opi Oncol),7,(1995),第94-100頁；(ⅱ)當代生物技術觀點(Curr Opin Biotechnol),5,(1994),第611-616頁；(ⅲ)癌癥研究(Cancer Res),53,(1993),第2330-7頁；(ⅳ)人類基因治療(Hum Gene Ther),4,(1993)，第451-60頁；(ⅴ)人類基因治療(Hum Gene Ther),5,(1994),第153-164頁；和(ⅵ)藥學趨勢(Trends Pharmacol.Sci),14,(1993)，第202-208頁。
盡管近幾年進行了這些廣泛的研究，但仍存在著妨礙惡性腦腫瘤的實驗研究向臨床治療過渡的主要障礙。一個問題是在顱內植入后，防止基因修飾的細胞的免疫排斥反應。這一問題可通過包囊生產細胞克服。
然而，為尋找特別適用于腦的材料，又帶來了其它問題。雖然，在免疫學上腦不同于機體的其它區域，例如它不存在B淋巴細胞，但它對生物活性化合物，例如內毒素的影響特別敏感。
根據本發明，我們發現免疫隔離性(immuno-isolating)藻酸鹽基質特別適于在CNS腫瘤的治療中包囊用于顱內植入的生產細胞。微球形式的免疫隔離性藻酸鹽基質是特別優選的。
因此，從廣義上說，本發明提供了包囊的能表達CNS腫瘤生長抑制劑分子的生產細胞，該生產細胞被包囊于免疫隔離性藻酸鹽基質中。這類分子優選是肽、蛋白質或多糖，最優選是單克隆抗體。
本發明還提供一種治療CNS腫瘤的方法，該方法包括在腫瘤部位植入包囊的生產細胞，所述生產細胞能表達所述腫瘤生長抑制劑分子。
再者，本發明提供了一種制備治療CNS腫瘤的藥物的方法，該方法包括將生產細胞包囊在免疫隔離性藻酸鹽基質內，所述生產細胞能表達所述腫瘤生長抑制劑分子。
本發明還提供免疫隔離性藻酸鹽基質在CNS腫瘤的腫瘤中用于包囊顱內植入用生產細胞的用途。
在本發明的實施方案中，本發明使用的生產細胞包括產生例如蛋白質、肽和多糖分子的基因工程化的細胞，所述分子直接相互作用于腫瘤細胞或者間接相互作用于腫瘤或宿主細胞通訊途徑。本發明可用的其它生產細胞是產生單克隆抗體的專門化細胞，例如雜交瘤細胞，或者甚至是自然存在的能表達腫瘤抑制分子的細胞。
眾所周知，腫瘤生長依賴于通過特異性生長因子介導的特定細胞與宿主間的作用，特異性生長因子以相當復雜的方式調節腫瘤細胞生長。在此，腫瘤依賴于宿主提供的通過新形成的血管輸送的營養物質。近幾年，已識別了數種腫瘤/宿主細胞作用途徑，它們已被記載于文獻中。
因此，本發明使用的一類生產細胞是能表達蛋白質或肽的生產細胞，所述蛋白質或肽將作用于腫瘤/宿主通訊途徑。例如，有用的生產細胞包括產生影響腫瘤新血管形成的蛋白質和肽，例如血小板反應蛋白、內皮他丁(endostatin)、制管張素(angiostatin)和催乳素；干擾腫瘤細胞與胞外基質關系的蛋白質，例如蛋白酶抑制劑，如金屬蛋白酶組織抑制劑；和影響免疫系統包括各類白介素的蛋白和肽。
另一類優選的生產細胞包括表達直接作用于腫瘤細胞本身的蛋白質或肽的那些。例如這類有用的生產細胞包括產生單克隆抗體的雜交瘤細胞系，所述單克隆抗體是直接作用于腫瘤受體，例如影響腫瘤細胞的細胞生長因子受體，如表皮生長因子受體(EGFr)、血小板衍生的生長因子受體AA和BB、酸性和堿性成纖維細胞生長因子受體、α-和β轉化生長因子受體、不同類型的血管內皮生長因子受體(VEGFR-1和VEGFR-2)、具有免疫球蛋白和EGF-樣結構域，如TIE-1和TIE-2/tek的酪氨酸激酶受體，肝細胞生長因子(分散因子)的；或者是直接對抗各類整聯蛋白受體的單克隆抗體；直接對抗CD-44的單克隆抗體；直接對抗CDR/細胞周期蛋白復合物的單克隆抗體；直接對抗FAS的單克隆抗體；直接對抗細胞表面糖脂的單克隆抗體；直接對抗糖蛋白的單克隆抗體；和直接對抗由特異性致癌基因表達得到的蛋白質的單克隆抗體。
在某些情況下，特別引人注意的是可通過藥理學手段啟動或停止產生腫瘤生長抑制物質的生產細胞，例如可通過藥理學誘導的基因表達，如四環素激活的基因表達的生產細胞。
可轉染的任何細胞系均可用于本發明。細胞系應是永久的，即能進行無限細胞分裂的，并優選是非人的和非致瘤性的。
由美國典型培養物保藏中心，10350 Linden Lake Plaze,Manassas,Virginia 20109,USA自由出售的這類細胞系的例子是細胞系ATCC號 描述H528 HB 8509 小鼠B細胞骨髓瘤293 CRL 1573人轉化的初生胚胎腎NIH/3T3 CRL 1658NIH瑞士小鼠，胚胎COS-7 CRL 1651非洲綠猴，腎，SV40轉化BHK-21CCL 10 倉鼠腎，正常CV-1 CCL 70 非洲綠猴，腎，正常CHP-234 CRL-2272成神經細胞瘤，腦，人Rat2 CRL-1764胚胎，胸腺嘧啶核苷激酶突變體，大鼠Namalwa CL-1432 Burkitt淋巴瘤，人根據本發明，將生產細胞包囊于免疫隔離性藻酸鹽基質中，該基質能提供表達的能干擾腫瘤生長和漸進的蛋白質或其它分子而沒有的穩定的原位遞送系統，而沒有生產細胞的免疫排斥反應。
將細胞包囊于藻酸鹽顆粒是固定細胞和其它物質的熟知技術，據文獻記載，這種技術以前被用于治療糖尿病、生產單克隆抗體和其它醫學領域。
PCT/WO 97/44065中提出本藥物遞送技術通過在腦腫瘤部位采用釋放基因轉移載體的包囊細胞進行體內基因治療。用于包囊該細胞的囊包括兩個部分a)含活的封裝的細胞的核心和b)包圍所述核心的外套層。
本發明提供了簡單得多的包囊方法和產品，其中用一步法將生產細胞使用免疫隔離的藻酸鹽質量直接包囊。
藻酸鹽是一種主要存在于棕色海藻中的多糖。它由兩種類型的單糖組成L-古洛糖醛酸(G)和D-甘露糖醛酸(M)。這些多糖單位以交替順序的G和M嵌段(GM-嵌段)以及主要由G或M單位組成的嵌段(G-嵌段/M-嵌段)形式出現。
通過G-嵌段與多價陽離子，尤其是Ca2+的交聯可獲得膠凝特性。
為了使藻酸鹽不是免疫活化的，G含量須高于15％。然而，為確保藻酸鹽是免疫隔離性的，本發明更優選使用高G含量的藻酸鹽，即G含量為50％或高于50％。因為本領域公知G/M-嵌段比率和不同嵌段的分布是影響通過與多價陽離子交聯形成得到的凝膠的不同性質的關鍵因素。
另一個重要的因素是使用的藻酸鹽的純度。因此，本發明可使用的藻酸鹽基質的一個優點是它們可以高純質量生產，具有明確的組成和極低含量的雜質，例如內毒素。
本發明可使用的藻酸鹽基質的第二個優點是通過將包含活細胞的藻酸鹽溶液滴加到鈣溶液中制備的藻酸鹽微球中藻酸鹽濃度由微球的中心向外部邊緣逐漸升高。因此，在微球的中央產生了利于細胞存活、增殖和生產的最佳空間，其中有足夠的養料和氧可供細胞利用。藻酸鹽濃度較高的外部邊緣產生屏障，這樣微球內部的生產細胞不會從內部逃逸出來，免疫細胞也不能進入微球。
通常，作為細胞固定基質的藻酸鹽的使用包括將細胞的懸浮液與藻酸鈉(Na+alginate)溶液混合，之后將該混合物滴入含多價陽離子(一般是Ca2+)的溶液中。小液滴形成凝膠球的同時將細胞捕捉于離子交聯的藻酸鹽的三維點陣中。該固定方法可在非常溫和的條件下進行，因此適合于絕大部分活細胞。關于該技術在理論和實踐方面的描述，讀者可參見文獻“作為細胞固定基質的藻酸鹽”，Smidsrod和Skjak-Braek，生物技術趨勢(Trends in Biotechnology)，1990年三月，Vol.8,No.3，第71-78頁。
形成本發明的包囊生產細胞的藻酸鈣小球的目前優選方法如下。將藻酸鈉以1-2％的濃度溶于水或等滲鹽水中。該藻酸鹽溶液經膜過濾滅菌，然后加入生產細胞并調至等滲。通過手工，但優選用靜電小球生成儀(在藻酸鹽供料針和膠凝浴之間加載5-7 kV的靜電勢)將藻酸鈉-生產細胞溶液滴加到氯化鈣浴液(0.05-0.25M)中形成藻酸鈣小球。通過調節針的直徑(如從0.1mm-0.4mm)、流速(如從5 ml/小時-30 ml/小時)和加載電壓，可產生100-400μm的相當均勻直徑小球。通過調節膠凝浴中的鹽濃度(0-200 mM NaCl)可控制小球的均勻性，較高的鹽濃度得到的小球較高的均勻性。在膠凝浴中使小球硬化。
據認為，本發明的包囊的生產細胞在常規的外科手術切除大塊腫瘤后放入腫瘤腔中。手術后不久，由于腫瘤的負擔最小化，因此在復發之前許多患者進入無癥狀期。由于外科手術具有創傷性，因此殘留的腫瘤細胞會試圖與宿主建立新的生化作用途徑。這包括形成新血管和向殘留的腫瘤細胞重新提供肽生長因子。正是在當腫瘤的負荷處于最低時，通過本發明可進行最可能地有效的治療。
確實，按照一個實施方案，本發明的一個特別優點是可同時植入數種不同類型的生產細胞以靶向影響腦或其它腫瘤漸進性生長的不同表型特征和微環境因素。為此，可建立在液氮溫度下進行冷存的包括包囊的生產細胞的生產細胞庫。然后從庫中抽取與需治療的宿主腫瘤的基因表達相符合的生產細胞。
例如，可采用下列方法確立需要何種生產細胞治療腫瘤。首先對活檢材料進行包括決定受體狀況和表型的腫瘤定性。然后在原發性腫瘤切除術后多達60天，定向地植入合適選擇的生產細胞，該生產細胞產生針對宿主腫瘤的受體狀態的物質，例如單克隆抗體。
或者，在原發性腫瘤切除術后可直接植入產生抗血管生成的物質的生產細胞。
植入的生產細胞的劑量取決于各個患者的情況，通常對于每位患者植入的細胞總數應在106-1012個。各藻酸鹽或其它包囊基質中的生產細胞數量取決于小球或其它包囊形式的大小。包囊的生產細胞一般通過外科手術放入原發性腫瘤切除術后的傷口部位。
正如下面詳細描述的實驗中所示，包囊的生產細胞存活、增殖并保持其特定的體外和體內表達期。該發現建立了用于腦腫瘤患者的新治療方案，由此對所選擇的靶向腦腫瘤生長和發育的所選特征的不同生產細胞進行包囊。在本文描述的實驗中，我們發現從藻酸鹽小球中釋放的特定的MAbs可抑制腫瘤細胞轉移，這通過干擾表皮生長因子受體得到了證實。我們還發現從腦內包囊的生產細胞中釋放的特異性產物滲透進入了腦實質并可沿CFS途徑分布。
下列實驗將有助于理解本發明及其優點。下面對附圖進行說明，其中附

圖1A-1C包囊于藻酸鹽的NIH 3T3細胞的光顯微成像。所有短線均表示250μm。附圖1A包囊的當天。附圖1B培養3周后的包囊細胞。附圖1C培養9周后的包囊細胞。附圖1D-1F包囊于藻酸鹽的NIH 3T3細胞的掃描共焦顯微激光照片。存活細胞發射出綠色熒光(圖中表現較亮的區域)，而死細胞發射出紅色熒光(圖中看不到)。所有短線均表示250 μm。附圖1D包囊的當天。附圖1E培養3周后的包囊細胞。附圖1F培養9周后的包囊細胞。附圖1G培養9周后，包囊于藻酸鹽的BT4CnVlacZ細胞的β-半乳糖苷酶活性。短線表示500μm。附圖2A-2D包囊于藻酸鹽小球的NIH 3T3細胞的流式細胞分析直方圖。橫軸表示流式細胞儀上的通道數量(相對DNA熒光)，縱軸表示各通道中細胞核的相對數量。附圖2A對照，單層培養。附圖2B包囊1周的細胞。附圖2C包囊3周的細胞。附圖2D包囊9周的細胞。附圖3從包囊于藻酸鹽的H528雜交瘤細胞中釋放的抗體(平均值±標準偏差)。橫軸表示培養的天數，縱軸表示釋放進入生長培養基中的抗體。通過第3級回歸分析評價曲線。附圖4自4天后、未處理(對照)、用10 ng/ml EGF(EGF)刺激或者在包囊的雜交瘤細胞(EGF/H528)的存在下用10 ng/ml EGF刺激的GaMg小球的細胞的轉移。附圖5A-5H植入大鼠腦部的包囊的H528雜交瘤細胞。附圖5A 大鼠腦的軸切片。H&E染色，短線表示5 mm。附圖5B 與附圖5A相同的切片，表現植入部位內的包囊的H528細胞。H&E染色，短線表示500μm。附圖5C-5H腦內的單克隆抗體的釋放和擴散的共焦激光掃描顯微照片。附圖5C、E和F在相同設置下拍攝。附圖5G和5H也在相同設置下拍攝。附圖5C 遠左側處具有包囊的H528細胞的腦實質切片。短線表示150μm。在腦實質左側看到強烈的熒光，其強度在進入腦至少1000μm處逐漸減弱。
在附圖5D中進一步可看到熒光強度沿水平線的逐漸變化，其中縱軸表示相對熒光強度(0-255)。從左側了看到強烈的熒光，進入腦實質后該熒光逐漸減弱。附圖5E 在蛛網膜下腔和下面的腦中發現了Mabs。短線表示75μm。附圖5F 對照中存在的弱熒光可能是由非特異性結合產生的。短線表示75μm。附圖5G MAbs擴散到了血管周隙。短線表示50μm。附圖5H 比較而言，對照在血管周隙顯示出較弱的免疫球蛋白結合。短線表示50μm。附圖6 放射免疫分析表明成功地建立了內皮他丁生產細胞。該附圖的第二、第三和第四條帶分別顯示了從條件培養基、細胞部分和未轉染的細胞的培養基中釋放的內皮他丁的放射免疫分析。附圖7 內皮他丁藻酸鹽療法對腫瘤生長的影響。A圖表示對照動物實例，其中植入了包囊在藻酸鹽小球中的模擬轉染細胞。腦部的較深色的區域是腫瘤區域。圖B表示用包囊的產生內皮他丁的細胞進行治療的動物實例。較深色區域表示腫瘤，在腫瘤的中央可見較大的壞死區域。
實驗材料和方法1．細胞系在實驗中，使用四種不同類型的細胞系細胞系 保藏信息1、NIH 3T3 ATCC CRL/16582、BT4CnVlacZ未保藏3、H528 ATCC HB 85094、GaMg 未保藏小鼠成纖維細胞NIH 3T3細胞代表潛在的生產細胞系，即它能被基因工程化以表達對抗腫瘤生長，進展和發育具有作用的物質。如下將NIH 3T3細胞包囊在藻酸鹽中并用于進行體外形態學、存活性和細胞動力學的研究。為研究包囊細胞的體內存活性，將包含NIH 3T3細胞的藻酸鹽小球植入大鼠腦中。
BT4CnVlacZ細胞系最初從乙基亞硝基脲誘導的大鼠神經膠質瘤中發展而來，用細菌lacZ基因穩定轉染并克隆到包含Moloney小鼠白血病病毒的長末端重復彈夾的質粒中，所述彈夾具有自魯斯氏肉瘤內病毒啟動子表達的新霉素耐藥的基因。參見國家癌癥研究雜志(J.Natl Cancer Inst),55(1975),第1177-87頁和國際癌癥雜志(Int.J.Cancer),71(1997),第874-80頁。將該細胞用藻酸鹽包囊并研究細菌的β-半乳糖苷酶的體外合成。
H528雜交瘤細胞系從美國典型培養物保藏中心(ATCC Rockville,MA)獲得。通過融合NS-1-Ag4-1骨髓瘤細胞與來自BALB/c小鼠的脾細胞產生該細胞系，且其產生結合和阻斷人表皮生長因子受體(EGFR)的EGF結合域的小鼠單克隆抗體(MAbs)(IgG2a)。用該細胞系研究藻酸鹽包囊的細胞中MAb的體外和體內釋放。
人神經膠質瘤細胞系GaMg已記述于抗癌研究(Anticancer Res),8(1988)第874-80頁，以前已顯示出可表達EGFR(柏林神經病理學報(Acta Neuropathol Berl),84(1992)，第190-197頁)。在GaMg多細胞球和包囊的H528細胞間的共同培養體系中研究了GaMg細胞轉移的特異性抑制。2、細胞培養在80cm2培養燒瓶(Nunc,Roskilde,Denmark)中，用由補加下列成分的Dulbecco改進的Eagles培養基(DMEM)組成的完全生長培養基培養NIH 3T3和BT4CnVlacZ細胞系10％加熱滅活的新生小牛血清、四倍規定濃度的非必需氨基酸、2％L-谷氨酰胺、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)(所有生物制品購自BioWhittaker,Verviers,Belgium)。在80 cm2培養燒瓶(Nunc)中，在補加10％馬血清的RPMI 1640生長培養基(BioWhittaker)中培養H528雜交瘤和GaMg細胞系。將GaMg單層細胞與3 ml 0.025％胰蛋白酶(BioWhittaker)混合進行胰蛋白酶化，并向基底包被有完全RPMI培養基中的0.5％純凈瓊脂(Difco,Detroit,MI)(30)的80cm2培養燒瓶(Nunc)接種在20 ml完全RPMI培養基中的5*106個細胞引發小球體。在37℃、100％相對濕度、95％空氣和5％CO2的條件下，使所有細胞系保持在標準組織培養箱中。3、藻酸鹽的結構和性質在這些實驗中，用從棕色海藻北極昆布(Laminaria hyperborea)(LF 10/60)(Protanal,Drammen,Norway)得到的藻酸鈉使生產細胞微囊化。該藻酸鹽由兩種單糖組成α-L-古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)。G-單位和M-單位以三種不同的嵌段類型GG、MM和MG連接在一起，并且這些嵌段的比例和分布決定藻酸鹽分子的化學和物理性質。某些二價陰離子，如Ca2+可強烈地連接兩個獨立的G-嵌段，這形成更廣泛的藻酸鹽骨架，其中G-嵌段形成強烈的連接。我們使用的藻酸鹽藻酸鹽具有含量高于60％的G-嵌段，導致高力學穩定性和高孔隙率，使其適于包囊產生次級代謝產物的細胞(參見生物技術趨勢(Trends in Biotechnology),8(1990)，第71-78頁)。電子掃描顯微鏡顯示藻酸鹽小球中的孔徑為5-200 nm(33,34)。小球的力學強度、體積穩定性和孔隙率與古洛糖醛酸的含量有關。4、細胞的包囊包囊的詳細方法記載于“作為細胞固定基質的藻酸鹽”，Smidsrod和Skjak-Braek，生物技術趨勢(Trends inBiotechnology),1990年3月，Vol.8,No.3，第71-78頁。
簡單地說，是將分散在1.5％藻酸鈉中的細胞小滴放入0.1 M Ca2+溶液中。聚合反應后，藻酸鹽小球用DulbeccoPBS(DPBS；Sigma,St.Louis,MO)洗滌三次并用生長培養基洗滌一次。將包囊的細胞在盛有50 ml生長培養基的175cm2培養瓶(Nunc)中培養。生長培養基每三天更換一次，培養瓶每周替換一次。在37℃、100％濕度、95％空氣和5％CO2條件下，使所有藻酸鹽包囊的細胞保持于標準組織培養容器中。對于NIH 3T3和BT4CnVlacZ細胞系的所有實驗，使用的細胞密度為6*106個細胞/毫升藻酸鹽，小球大小為0.8-1.2mm。對于用H528細胞系進行的體外實驗，使用的細胞密度為3*105個細胞/毫升藻酸鹽，小球直徑為2.3-2.5mm。對于用H528細胞系進行的體內實驗，使用的細胞密度為3*105個細胞/毫升藻酸鹽，小球直徑為0.8-1.2mm。體外實驗1、藻酸鹽包囊的細胞的形態學和存活性將6個小球轉移到覆蓋1.0 ml DPBS的6孔培養皿(Nunc)中，在包囊的當天、3天后和9周后，觀察包囊于藻酸鹽的NIH 3T3細胞的形態。用Nikon Diaphot光學顯微鏡觀測小球并用Nikon F-301照相機拍照。將形態學實驗進行兩次。
通過兩色熒光存活力分析儀(Live/DeadTM生活力/細胞毒性試驗，Molecular Probes,Eugene,OR)，在包囊當天、3天后和9周后，觀察藻酸鹽小球內的細胞存活性。在完全生長培養基中，用2μM鈣黃綠素-AM和4μM乙錠二均聚物制備標記溶液。在室溫下，將藻酸鹽小球分別放入覆蓋有0.5 ml標記溶液的16mm多孔培養皿(Nunc)中并保持30分鐘。之后，將它們轉移到DPBS并立即檢測。用Texas Red和FITC濾器光學，使用用氬-氪激光的激光共焦掃描顯微鏡(BioradMRC-1000,Hemel Hempstead,England)測定通過藻酸鹽光學切面的熒光。在藻酸鹽小球內120μm的平面處讀取熒光。存活實驗進行三次。
經過1、3和9周，研究包囊于藻酸鹽中的BT4CnVlacZ細胞中β-半乳糖苷酶的產生。將小球用DPBS(pH=8.4)洗滌1分鐘后，在DPBS中用0.2％戊二醛和2％甲醛固定10分鐘。之后，用DPBS洗滌3次，每次5分鐘，并用5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(x-gal；sigma)染色β-半乳糖苷酶活性。將溶于100μl二甲基甲酰胺中的1 mg/mlx-gal底物溶液與溶于DPBS的5 mM鐵氰化鉀(potassiumferricyanite)、5 mM亞鐵氰酸鉀和2 mM MgCl2(所有有生化試劑均購自E.Merck,Darmstadt,Germany)。在4℃保溫至少24小時，檢測β-半乳糖苷酶活性，以藍色細胞質表示。2、藻酸鹽包囊細胞的細胞動力學通過流式細胞術DNA分析測定包囊的NIH 3T3細胞的體外細胞周期分布。通過將小球溶于含1.5％二水合檸檬酸三鈉(E.Merck)的完全生長培養基中，使包囊的細胞從藻酸鹽中釋放15分鐘，然后在140g離心4分鐘，和除去上清液。將細胞再在完全生長培養基中懸浮兩次，于140g離心4分鐘，在冰冷的96％乙醇中固定并貯藏于4℃。在進行流式細胞分析前，將細胞在37℃用在0.9％生理鹽水中0.5％胃蛋白酶(Sigma)保溫15分鐘(pH=1.5)，然后將分離的細胞核用0.9％生理鹽水洗滌，再用核糖核酸酶(Sigma)(0.9％生理鹽水中的1 mg/ml溶液)處理1分鐘。將碘化丙錠(Sigma)(0.9％生理鹽水中的50 μg/ml溶液)加到細胞核中進行DNA染色。用Becton Dickinson FACSort流式細胞分析儀(Becton Dickinson,Palo Alto,CA)測定細胞的DNA含量。通過將兩種參數的前散和側散細胞圖門控(gating)到一種參數的DNA直方圖得到DNA直方圖。通過計數5000門控的細胞核總數得到各直方圖。將流式細胞分析實驗重復三次，如Radiat EnvironBiophys,12(1975)，第31-39頁中所述測定細胞周期的分布。3、由包囊的雜交瘤細胞釋放抗體如上所述，制備直徑為2.3-2.5mm的藻酸鹽小球，在包囊當天每個小球包含1.5*103個H528細胞。分別在包囊后0、1、5、12、19、23和33天，從儲備培養液中取出10個小球，檢測釋放到RPMI中的Mab。在0.5 ml完全RPMI培養基中(37℃)，將小球轉移到24孔培養皿(Nunc)中。保溫6小時后，收集4份樣品，每份100μl，放入1.5 ml離心試管(Treff AG,Degersheim,Switzerland)中并冷凍于-20℃。
用流式細胞分析測定樣品中的Mab濃度。在DPBS中，單層GaMg細胞培養物用2 mM EDTA胰蛋白酶消化。然后將細胞在140g離心4分鐘，除去上清液，將該細胞在DPBS中用2％多聚甲醛溶液固定1分鐘。之后，使細胞在140g離心4分鐘，除去上清液。然后將細胞再懸浮于含2mM EDTA、1％牛血清白蛋白和1 g/l葡萄糖的DPBS中，并以1.7*105個細胞/孔的密度分配到圓錐形96孔培養板(Nunc)中。將細胞在340g離心4分鐘，除去上清液。之后，將細胞渦旋并在4℃用得到的MAbRPMI培養基(未稀釋的，以及用DPBS以1∶5、1∶20和1∶100比例稀釋的稀釋液)保溫2小時。用已知MAb濃度(濃度為20、5、0.2、0.1和0.05μg/ml)的EGFR MAb(528)抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)作為參考。將細胞用DPBS中的2 mM EDTA、1％BSA和1 g/l葡萄糖洗滌兩次，然后在4℃與FITC結合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako A/S,Glostrup,Denmark)(1∶20稀釋液)保溫30分鐘。用Becton Dickinson FACSort流式細胞儀進行流式細胞分析。通過兩種參數的前散和側散細胞圖觀測單細胞并選通一種參數的FITC直方圖，其中測定熒光強度。通過采用針對GaMg細胞的已知濃度的EGFRMAb的不同滴度，獲得GaMg細胞的參照抗體結合曲線。通過比較用從包含雜交瘤的藻酸鹽小球中得到的培養基獲得的結果，得到MAb濃度曲線。4、細胞轉移在1.0ml含10 ng/ml EGF(Sigma)的完全RPMI培養基中，將GaMg球分別轉移到16mm多孔培養皿(Nunc)中。之后，使腫瘤細胞與包含H528細胞的藻酸鹽小球接觸(每孔中三個藻酸鹽小球)。作為對照，使小球與含或不含10 ng/ml EGF的完全RPMI培養基接觸。用具有肉眼校準標線的光學顯微鏡每天測定每個集落的正交直徑，連測4天。然后測定從小球轉移出來的細胞覆蓋的環形面積并將其用作細胞轉移的指數。該實驗進行兩次，每次實驗使用6個小球。5、內皮他丁生產細胞的建立和證明從小球中釋放內皮他丁5A、內皮他丁生產細胞的建立方法細胞系和培養條件將表達Epstein-Barr病毒核心抗原(EBNA)-1的人腎胚胎腎293細胞(293-EBNA)作為生產細胞系。
通過脂質體(liposomal)并用0.5％μg/ml嘌呤霉素選擇，用包含編碼人內皮他丁的基因的游離型表達載體pCEP-Pu轉染該細胞。
使轉染后的細胞(293-endo)在含由補加有下列成分的Dulbecco改良Eagles培養基組成的生長培養基的175 cm2培養燒瓶(Nunc,Roskilde,Denmark)中生長至輔滿10％加熱滅活的胎牛血清、4.5 g/l D-葡萄糖、青霉素(100 IU/ml)和鏈霉素(100μl/ml)、205 μg/ml遺傳霉素(G-418)和0.5μg/ml嘌呤霉素。通過用不含內皮他丁基因的pCEP-Pu載體轉染293細胞產生模擬轉染細胞并使其在相同條件下生長，除了嘌呤霉素(所有生物制品購自Biowhitaker,Verviers,Belgium)。
為這些實驗選擇的腫瘤細胞系(BT4C)來自乙基亞硝基脲誘導的大鼠膠質肉瘤(傳代數26)并在DBIX具有同基因。在80 cm2培養燒瓶中，用由補加下列成分的Dulbecco改良的Eagles培養基組成的完全生長培養基使該細胞系生長至輔滿10％加熱滅活的胎牛血清、四倍規定濃度的非必需氨基酸、2％L-谷氨酰胺、青霉素(100 IU/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)。5b、由小球釋放內皮他丁的評價免疫印跡收集包囊的endo-293293-EBNA的條件培養基并用于標準SDS/PAGE蛋白質印跡，以測定小球是否釋放了內皮他丁。
簡單地說，經12％SDS凝膠分離樣品并印跡于PVDP硝酸纖維素膜上。將印跡用100％甲醇洗滌5分鐘，蒸餾水洗滌1分鐘，封閉溶液(0.05 M Tris/HCl,0.45 M NaCl,2％土溫，pH 10.2)洗滌4分鐘，最后用洗滌緩沖液(0.05 M Tris/HCl,0.15 M NaCl,0.5％土溫，pH 10.2)洗滌15分鐘。然后將印跡與兔抗人抗血清(洗滌緩沖液中的1∶1000稀釋液)保溫過夜，然后印跡以DPBS洗滌并與豬抗兔堿性磷酸酶結合的IgG(DAKO,Denmark)保溫。通過與底物染色的溶液保溫(2-4分鐘)形成可見的條帶。體內實驗1、顱內植入使重160g-250g的雄性同系繁殖BD-IX大鼠(36)保持標準顆粒食物，對其飲用水沒有限制，分開圈養于溫度是濕度恒定的以12小時白晝和黑夜間隔的環境中。以0.4 ml/100g體重的濃度腹膜內給予戊巴比妥使大鼠麻醉。通過中等前后向切口，在前囟后4.2mm和前后向縫線右側2.5mm用3.5mm鉆鉆一個孔。吸取皮層和白質組織達2.0mm深度，將包含NIH 3T3或H528細胞的8-14個藻酸鹽小球(制得一天的小球)放入該組織腔。用骨蠟封閉該孔并用聚酰胺縫線縫合皮膚。用加熱燈使其恢復1小時。按照慣例指導進行動物互護理。每天觀察一次大鼠，并隔天稱重。在植入后所有動物都恢復很快，在觀察期間沒有顯示出任何病癥或者神經學缺陷。2、大鼠腦內免疫球蛋白的釋放和播散在3和9周后，通過CO2吸入法處死大鼠。除去腦組織，包埋在Tissue Tek(Miles Laboratories Inc.,Naperville,IL)并冷凍在用液氮冷卻的2-甲基丁烷(E.Merck)中。在Reichert-Jung1800低溫切片機(Leica,Wetzlar,Germany)上切取軸向切片(14μm)，并貯存于-20℃。在室溫下，將由植入包囊的H528細胞并在3周后處死的大鼠得到的低溫切片在丙酮中固定5分鐘，然后用DPBS洗滌兩次，每次5分鐘。在室溫下，將該切片與FITC-結合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako A/S；1∶20稀釋液)保溫1小時，之后用DPBS洗滌5分鐘。該切片用核糖核酸酶(Sigma,0.5 mg/ml在0.9％生理鹽水中)處理30秒，通過將碘丙錠(Sigma,50μg/ml在0.9％生理鹽水中)加到切片中對核進行染色。再將切片用DPBS洗滌5分鐘，然后用Vectashield(Vector Laboratories Inc.,Burlingame,CA)封固。使用用氬-氪激光和FITC濾器光學的Leica TCS NT激光同焦掃描顯微鏡測定熒光。觀察從實驗動物腦內相同深度取出的切片，研究兩組中最大熒光強度的區域。將由植入NIH 3T3細胞并在9周后處死的大鼠得到的低溫切片用蘇木精和曙紅染色以進行組織學檢查。3、對包囊于藻酸鹽中的生產細胞的免疫反應方法在植入后1、3和9周，評價在BD-IX大鼠的腦與藻酸鹽小球的邊界區域免疫陽性細胞的百分數。將殘留腦組織進行封固、包埋于tissue-tek并冷凍在液氮中。在Reichert Jung Cryostat(Leica,Wetzlar,Germany)制備一系列5-10μm軸向切片并封固于載波片上，用于免疫組織學分析。將切片在冷丙酮中固定5分鐘，并在室溫下與用PBS稀釋的10％正常兔血清保溫30分鐘，之后在4℃的潮濕環境中與在10％兔血清中稀釋的小鼠單克隆抗體(mAbs)保溫過夜。使用下列mAbs:OX42、ED1和ED2抗大鼠巨噬細胞mAbs、OX19抗CD5陽性T細胞和與CD45RA陽性B細胞反應的OX33。mAbs得自Serotec,Oxford,UK。加入以1∶300稀釋的生物素標記的兔抗小鼠免疫球蛋白并保持30分鐘。按照制造商推薦的方法制備抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物(ABCcomplex/HRP,Dakopatts,Glostrup,Denmark)，并使其與切片反應30分鐘。最后，切片用含3-氨基-9-乙基-咔唑的緩沖液處理，以形成有色反應產物。在所有保溫之后，用PBS洗滌。將所有制品用蘇木精復染，封固于Glycergel(Dakopatts)并用光學顯微鏡進行分析。4、內皮他丁-藻酸鹽療法對腫瘤生長的影響以0.4 ml/100 g體重的劑量腹膜內注射Equithesine麻醉兩種性別的低齡成年大鼠(總計8只，加20只對照)。將大鼠固定在定向架上(David Kopf Instruments,Tujunga,USA)，在前囟后1mm和右側3.0mm切開皮膚形成2mm的洞并插入至2.5mm深度。用注射器注射到腦內。然后在深度為2mm的藻酸鹽小球邊1mm處注射1x104 BT4C膠質肉瘤細胞。藻酸鹽小球含有生產內皮他丁的293細胞或293-模擬轉染細胞(作為對照)。接受植入的8只動物形成了各種細胞系。另外，作為正常周發育的對照，對8只動物僅注射BT4C細胞。
最后，作為小球內細胞體內存活的對照，剩余的4只對照動物僅接受含293-endo細胞的藻酸鹽小球。用3分鐘將注射器緩慢抽回(對所有注射都是如此)并用骨蠟和縫線進行封閉縫合。使動物進行術后恢復并觀察。在實驗期間，所有動物在配對圈養在溫度和濕度恒定的條件下，給予標準顆粒食物并提供自由進水。
結果體外實驗1、藻酸鹽包囊細胞的形態學和存活率直徑為1.0mm的藻酸鹽小球，在包囊當天包含約6.5*102個NIH3T3細胞(附圖1A)。細胞均勻地分布于藻酸鹽小球內，具有無細胞的外部邊緣25-50μm。培養期間，在藻酸鹽內觀察到細胞增殖，3周后，細胞的密度增高了(附圖1B)。培養9周后，在藻酸鹽小球內觀察到了多細胞體球(附圖1C)。通過光學顯微鏡檢查，培養9周后，90％的藻酸鹽小球仍保持完好。在培養約1周后，少量單細胞從藻酸鹽中轉移出來進入生長培養基中，這限制了單細胞在接下來的8周培養期間的運動。
激光共焦掃描顯微鏡研究表明在包囊的當天，約90％包囊的細胞仍是存活的(附圖1D)。培養3周后，約50％最初包囊的細胞是存活的(附圖1E)。在9周后，可清楚地觀察到一些適應于藻酸鹽并形成了多細胞體球的存活細胞(附圖1F)。此時，由于多細胞體球的形成，使小球內的存活細胞總數難以估計。然而，從附圖1F可以看出，位于球體中的絕大部分細胞是存活的。
在整個9周的觀察期間，包囊的BT4CnVlacZ細胞表達了恒定的和均勻分布的β-半乳糖苷酶活性。2、藻酸鹽包囊細胞的細胞動力學NIH 3T3細胞的流式細胞分析直方圖顯示了包囊1周后的藻酸鹽小球內細胞倍性的變化(附圖2B)。與二倍體對照相比(附圖2A)，這可能表示著多倍體化。然而在3和9周后，分別都觀察到了倍性的正常化(附圖2C、2D)，具有與對照類似的二倍體分布。在S和G2M期的對照的增殖細胞的分數是50％，相比之下，在體外3周和9周后，該分數分別是55％和60％。3、由包囊的雜交瘤細胞釋放抗體在包囊的第一天結束時，已釋放到生長培養基中的MAb為13ng/(ml*hr)(附圖3)。在第二天培養期間，從小球中釋放出來進入培養基中的免疫球蛋白也穩定地增加了，在12天后，其濃度達到457ng/(ml*hr)。在最后3周觀察期間，產生的MAb也穩定在約400ng/(ml*hr)。4、細胞轉移自用EGF刺激的GaMg球出來的細胞轉移是廣泛的，細胞平均向外生長的區域是對照的兩倍(附圖4)。然而，當將含H528細胞的藻酸鹽小球加到有EGF存在的環境中時，大大地抑制了細胞的轉移，這表明該包囊的H528生產細胞有效地表達了抗EGF受體的抗體。5、小球釋放內皮他丁的評價從小球得到的條件培養基的蛋白質印跡可以看出，從小球釋放出了顯著量的內皮他丁(附圖6)。放射免疫分析表明10個具有25000包囊細胞的產生內皮他丁的藻酸鹽小球(400μm)分泌2.5μg/ml/24hr。體內實驗1、顱內植入大鼠腦的軸向切片顯示相鄰于帶有藻酸鹽包囊的NIH 3T3細胞的植入部位的腦實質基本沒有變化或沒有變化(附圖5A)。9周后，基本上沒有觀察到顱內水腫或腫脹。藻酸鹽小球不存在任何的細胞過度生長，它同時包含單細胞和多細胞體球(附圖5B)。存活的細胞同時分布在小球的中央和邊緣，在細胞之間也存在沒有細胞的藻酸鹽區域。還觀察到在植入孔和腦實質之間的邊界區域附近聚集的細胞最少。2、大鼠腦內免疫球蛋白的釋放和播散通過強烈綠色熒光很容易看到3周后的包囊雜交瘤細胞的植入小球(附圖5C)。在距離藻酸鹽小球至少1 mm的距離處可檢測到免疫球蛋白(附圖5C、5D)，從植入部位的邊界向腦，熒光強度逐漸降低。對于兩組實驗動物，檢測了存在移植體的整個腦半球的MAb(未顯示數據)。發現MAb還存在于大腦兩個半球的柔腦膜中(附圖5E)，在右半球蛛網膜下可看到強烈的熒光。陰性對照在柔腦膜中顯示出弱熒光，這可能是由免疫球蛋白與柔腦膜中細胞的表位之間的非特異性結合產生的(附圖5F)。但腦實質是陰性的。MAb還存在于腦內血管的血管腔隙，兩個半球間的熒光強度沒有明顯差別(附圖5G)。對照中存在的弱熒光還可能是由非特異性結合產生的(附圖5H)。3、對包囊于藻酸鹽的生產細胞的免疫反應觀察了相鄰于藻酸鹽小球的腦中的單核細胞浸潤。浸潤的細胞量從第1周至第9周降低。植入1周后，在實質中看到了OX42陽性的樹枝狀小膠質細胞，反應性小膠質細胞和侵入性單核細胞出現在朝向藻酸鹽小球的邊界區域。ED1和ED2染色的單核細胞接近該邊界區域，但在腦實質中別處沒有什么細胞通過這些mAb染色。在小球的邊界區域還觀察到了有限的T細胞和B細胞(表Ⅰ)。該邊界區域的OX42陽性細胞的數量從第1周的62％降低到第9周的20％，而ED1陽性細胞從第1周的34％降低到第9周的7％。ED2陽性細胞(5％)、T細胞(14％)和B細胞(1％)的數量在觀察期間僅有一定程度的變化(表Ⅰ)。
表Ⅰ植入藻酸鹽中的NIH 3T3細胞9周后大鼠腦組織中的細胞免疫反應
4、內皮他丁藻酸鹽-療法對腫瘤生長的影響用藻酸鹽中產生內皮他丁的細胞處理的動物生存期較用模擬轉染細胞處理的動物延長20％±4％。詳細的組織學觀察揭示了接受內皮他丁-藻酸鹽療法的腫瘤中出現大面積壞死區域(參見附圖7，圖B)。但在對照組中從未觀察到這類壞死區域(包囊于藻酸鹽的模擬轉染細胞；附圖7，圖A)。討論上述實驗結果清楚地證明微囊化細胞在延長的時間段內存活、增殖和保持其表型表達。還表明從藻酸鹽小球中釋放的MAb通過干擾EGFR具有體外抑制腫瘤細胞轉移的能力，并且該MAb釋放和播散到大鼠腦內。
通過光學顯微鏡可以看出，NIH 3T3細胞體外適應藻酸鹽并在包囊后數天內開始增殖。CLSM研究表明在包囊當天的細胞存活率約為90％。在培養的頭3周期間，起初包囊細胞的約50％死于小球內。但是，9周后，藻酸鹽小球內剩余的細胞顯示出形成多細胞球體的能力。其它人也有關于在藻酸鹽內觀察到細胞死亡的報告，這可能是由于氧、營養物和廢物擴散的減少，最終異致增殖和死亡細胞的數量達到了平衡。通過降低小球直徑、提高G-單位含量，其將增加孔徑，或改變藻酸鹽濃度，可獲得更有利的擴散率。此外，擴散依賴于起初小球中包囊細胞的數量。藻酸鹽本身是無毒的，因此觀察的小球內細胞死亡不應歸因于藻酸鹽。
在9周培養期間，BT4CnVlacZ細胞表現出強烈和均勻分布的β-半乳糖苷酶活性。這些結果表明在延長期間的藻酸鹽小球內還可產生特異性基因產物。
流式細胞分析研究顯示在藻酸鹽中1周后，NIH 3T3細胞由二倍體變為多倍體。這表明細胞核分裂了，但由于牢固的藻酸鹽骨架有限的空間，最初細胞不能進行胞質分裂。由此形成了具有兩個或三個細胞核的單細胞(附圖2B)。但在3周后，細胞周期的分布與對照相似。這表明在藻酸鹽內細胞需要適應周期，具有兩個三個細胞核的單細胞或完成其胞質分裂或死亡。9周后的直方圖與3周后的直方圖類似，但表明增殖期的細胞增多了。細胞周期分布分析表明增殖細胞的數量自對照的50％增加至9周后的約60％。這可能是由于在NIH 3T3細胞的延長培養期間藻酸鹽小球內選擇的細胞具有較高增殖能力。
在13-22天，從包囊的H528雜交瘤細胞中釋放的抗體基本上恒定在約400 ng/ml*hr，這表明在培養12天后，建立了穩定密度的分泌的MAb的雜交瘤細胞。該發現對臨床具有重要意義，因為這表明穩定地產生了高水平的單克隆抗體。
在EGF存在下刺激細胞從GaMg球向外轉移。通過向EGF洗滌的球中加入包囊的H528細胞，轉移被抑制了，并且向外的生長區域與對照類似。這暗示了旁分泌細胞增殖機制受到這些Mab的抑制，這可能是由于阻斷了EGFR的EGF-結合區域。
在中樞神經系統(CNS)以外的其它器官植入藻酸鹽包囊的生產細胞顯示藻酸鹽小球的成纖維細胞的過度生長，導致細胞死亡和移植失敗(移植(Transplantation),54(1992)，第769-774頁)。由于獨特的部位，CNS中不存在成纖維細胞，因此在本發明的研究中沒有觀察到相同的細胞過度生長(附圖5A、5B)。根據其組成，在某些情況下，已表明藻酸鹽在體內通過刺激單核細胞產生高水平的細胞因子引發免疫反應。藻酸鹽的細胞因子刺激的部分是M-單位。因此為使腦內免疫反應降到最低，選擇具有高含量G-單位的藻酸鹽進行我們的實驗。在進一步的實驗中，我們發現藻酸鹽包囊的細胞在腦內產生低的免疫反應，僅在接近植入小球的腦組織中集合一些小膠質細胞。這些觀察結果還表明藻酸鹽包囊的生產細胞對于腦內是具有吸引力的治療。在植入部位和腦實質間的邊界區域周圍觀察到最少的細胞聚集。這可能是因為從藻酸鹽小球中逃逸出的NIH 3T3細胞，因為對上述植入物的溫和免疫反應，和/或因為組織創傷愈合過程。但認為從藻酸鹽中逃逸出少量生產細胞不存在問題，因為這些細胞由正常移植物-宿主排斥反應機制對付。然而，如果需要，也可加入防止細胞從小球中逃逸的步驟，例如通過用聚L-賴氨酸層覆蓋該小珠或通過在包囊前進行輻射，由此抑制其增殖能力。免疫球蛋白從藻酸鹽小球中釋放出來并播散到腦實質距植入部位的邊界處至少1mm遠處。在兩組實驗動物中，檢測了存在植入物的整個腦半球的MAb。這種播散可能是由于被動擴散的過程。MAb還存在于柔腦膜中和Virchov-Robin的血管周隙。這種擴散很可能是通過CNS內恒定流動的腦脊液介導的。有趣的是，腫瘤細胞在腦內也沿著該相同播散途徑，這使它們易于接近藻酸鹽包囊的細胞產生的成分。
總之，上面公開的實驗顯示包囊于藻酸鹽內的生產細胞在延長的時間內體外和體內存活和增殖。在培養的數周期間，包囊的BT4CnVlacZ細胞的胞漿內產生了基因產物，例如β-半乳糖苷酶。包囊的雜交瘤細胞還在體外和體內生產和釋放高水平的MAb。GaMg腫瘤細胞的轉移在包囊H528細胞的存在下受到抑制。植入大鼠腦內的包囊的H528細胞還產生和釋放MAb，并且MAb播散到腦實質內以及蛛網膜下腔和血管周隙。因此，本發明代表了一種有前景的CNS腫瘤治療手段。
權利要求
1.一種包囊的生產細胞，該細胞能表達CNS腫瘤生長抑制劑分子，其中包囊基質是免疫隔離性藻酸鹽。
2.權利要求1的包囊的生產細胞，其中所述分子是能作用于腫瘤/宿主通訊途徑的蛋白質或肽。
3.權利要求2的包囊的生產細胞，其中所述蛋白質或肽能影響腫瘤新血管形成。
4.權利要求2的包囊的生產細胞，其中所述蛋白質或肽能干擾腫瘤細胞與胞外基質之間的關系。
5.權利要求1的包囊的生產細胞，其中所述分子是能直接作用于腫瘤細胞的蛋白質或肽。
6.權利要求5的包囊的生產細胞，其中所述生產細胞是能表達單克隆抗體的雜交瘤細胞，所述抗體能直接作用于腫瘤的受體。
7.前述任一項權利要求的包囊的生產細胞，其中所述分子的表達能通過外部藥理劑啟動或停止。
8.權利要求1的包囊的生產細胞，其中藻酸鹽的G-單位含量高于15％，更優選高于約50％。
9.權利要求8的包囊的生產細胞，其中藻酸鹽的G含量為60％-80％。
10.權利要求1的包囊的生產細胞，其中藻酸鹽的G含量為80％-100％。
11.權利要求1任一的包囊的生產細胞，是小球或微球形式的。
12.前述任一項權利要求的包囊的生產細胞，其中所述腫瘤是腦腫瘤。
13.一種治療CNS腫瘤的方法，包括在腫瘤部位植入免疫隔離性藻酸鹽包囊的生產細胞，該生產細胞能表達所述腫瘤生長抑制劑分子。
14.權利要求13的方法，其中所述包囊的生產細胞如權利要求1-12任一項中所定義。
15.權利要求13或14的方法，其中在所述腫瘤外科切除術后植入所述生產細胞。
16.一種治療CNS腫瘤的藥物的制備方法，包括將能表達所述腫瘤生長抑制劑分子的生產細胞包囊于免疫隔離性基質中。
17.一種免疫隔離性藻酸鹽用于制備包囊的生產細胞的用途，所述包囊的生產細胞在腦腫瘤外科切除術后植入腦內，所述生產細胞能表達所述腫瘤生長抑制劑分子。
18.權利要求17的用途，其中的藻酸鹽是高純度的，不含內毒素的質量的。
19.權利要求17的用途，其中所述藻酸鹽的G含量至少為15％，更優選為高于50％。
全文摘要
本發明涉及包囊的生產細胞,該細胞能表達CNS腫瘤生長抑制劑分子,提供了腫瘤,例如位于中樞神經系統內的腦腫瘤的新治療方法。
文檔編號A61K48/00GK1320032SQ99811433
公開日2001年10月31日 申請日期1999年8月25日 優先權日1998年8月26日
發明者R·畢爾克維格 申請人:諾爾斯海德公司