豬環狀病毒和細小病毒疫苗的制作方法

專利名稱：豬環狀病毒和細小病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及抵抗PMWS綜合癥(豬多系統萎縮綜合癥也稱斷奶后多系統萎縮綜合癥)的疫苗。
下文中引用了許多文獻，而且下文引用的各種文獻中又參考或引用了許多文獻。本文不承認任何這些文獻對于本發明來說是真正的先有技術。所有本文引用的文獻和本文引用文獻中參考或引用的文獻均以參考文獻并入本文。
PCV(即“豬環狀病毒”)最初是作為豬腎細胞系PK/15中非致細胞病變的污染物而被檢測到的。該病毒和雞貧血病毒(CAV)以及PBFDV病毒(Pscittacine Beak and Feather Disease Virus)一起分類為環狀病毒科(Circoviridae)。它是一個無包被小病毒(15-24nm)，其共同特點是含有一個1.76-2.31kb環狀單鏈DNA形式的基因組。最初認為該基因組編碼一個約30kDa的多肽(Todd等，Arch Virol 1991,117；129-135)。然而最近的工作顯示更為復雜的轉錄(Meehan B.M.等，1997,78；221-227)。而且，已知這3類環狀病毒之間在核苷酸序列或共同抗原決定族上沒有顯著的同源性。
來自PK/15細胞的PCV被認為是不致病的。其序列見B.M.Meehan等，普通病毒學雜志(J.Gen.Virol.)1997(78)221-227。只是最近一些作者才認為PCV株可能是致病性的，并與PMWS綜合癥有關(Gupi P.S.Nayar等，Can.Vet.J，第38卷，1997:385-387和Clark E.G.,Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997:499-501)。Nayar等使用PCR技術在患有PMWS綜合癥的豬中檢測到PCV DNA。
在加拿大、美國和法國檢測到的PMWS的臨床特征是體重逐漸減輕和呼吸急促、呼吸困難和黃疸等表現。從病理學角度看，其表現是淋巴細胞或肉芽腫浸潤、淋巴結病，更為罕見的是肝炎、淋巴細胞或肉芽腫腎炎(Clark E.G.,Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997；499-501；LaSemaine Vététinaire No.26,supplement to La Semaine Vététinaire1996(834)；獸醫周刊(La Semaine Vétérinaire)1997(857)；Gupi P.S.Nayar等，Can.Vet.J，第38卷，1997；385-387)。
本申請人已成功地從加拿大、美國(加利福尼亞)和法國(布列塔尼)的農場來源的肺或神經節樣品中分離了5個新的PCV株。在患有PMWS綜合癥的豬損傷處檢測到這些病毒，但在健康豬中沒有。
此外，本申請人還測定了這些株系中的4個即加拿大、美國和兩個法國株系的基因組序列。這些株系相互之間在核苷酸水平上顯示了非常強的超過97％的同源性，而與PK/15株的同源性則低得多，約76％。因此，這些新的株系可以認為是代表了豬環狀病毒的一種新類型即Ⅱ型，PK/15代表Ⅰ型。
這5個新株系根據布達佩斯條約分別于1997年10月2日星期4和1998年1月16日星期5保藏于ECACC(歐洲細胞培養物保藏所(EuropeanCollection of Cell Cultures)，應用微生物和研究中心(Centre forApplied Microbiology & Research),Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG，英國)，其中1997年10月2日星期4-保藏號V97100219(本文稱為Imp.1008PCV)-保藏號V97100218(本文稱為Imp.1010PCV)-保藏號V97100217(本文稱為Imp.999PCV)，1998年1月16日星期5-保藏號V98011608(本文稱為Imp.1011-48285)-保藏號V98011609(本文稱為Imp.1011-48121)。
本申請人在一項實驗室重現豬多系統萎縮綜合癥的實驗中發現，豬環狀病毒聯合豬細小病毒可導致該疾病的加重。
因此，本發明的主題是給豬接種豬環狀病毒(具體地是Ⅰ型或Ⅱ型，優選Ⅱ型)的疫苗，并聯合接種豬細小病毒疫苗。這理解為給豬接種二價疫苗或同時使用豬環狀病毒疫苗和豬細小病毒疫苗。
參考細小病毒株是NADL-2株，它可依據保藏號VR-742從ATCC保藏中心獲得。預防株細小病毒的疫苗接種是本領域技術人員熟知的，而且預防豬細小病毒的疫苗可從商業途徑購得。可提到的例子是Parvovax_(預防豬細小病毒的滅活疫苗，MERIAL銷售)。也見例如P.Vannier和A.Laval.,Point.Vét.1993,25(151)，53-60；G.Florent等，豬獸醫協會第9屆會議論文集(Proceedings of the Ninth Congress of PigVeterinary Society)，1986年7月15-18日，西班牙巴塞羅那。對于DNA疫苗，可參見例如WO-A-98 03658。
因此，本發明的主題是抵抗PMWS綜合癥的抗原制品，包括至少一種豬環狀病毒抗原(優選Ⅱ型環狀病毒)和至少一種豬細小病毒抗原。根據本發明，豬環狀病毒抗原(優選Ⅱ型環狀病毒)和豬細小病毒抗原各自獨立地包含選自減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞基抗原、重組活載體和DNA載體的抗原。應該理解，根據本發明的組合可涉及任何適當抗原或抗原制品形式，應當理解，對于給定組合，不一定使用相同形式。此外，正如人們所已知的，抗原制品可包含獸醫學上可接受的載體或賦形劑，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。
本發明的主題還涉及抵抗PMWS綜合癥的免疫原性組合物或疫苗，其包含處于獸醫學上可接受的載體或賦形劑之中的有效劑量的上述環狀病毒+細小病毒抗原制品，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。免疫原性組合物引起免疫應答，其可以但不必需具有有保護性。疫苗組合物引起保護性應答。因此，術語“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”(因為前一術語可以是保護性的組合物)。
本發明主題還涉及包含包裝上分開的抵抗豬環狀病毒的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗和抵抗豬細小病毒的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗的免疫或疫苗接種試劑盒。該試劑盒可具有上述定義抗原制品、免疫原性組合物和疫苗的各種特征。
本發明主題還有抵抗PMWS綜合癥的免疫或疫苗接種方法，包括施用抵抗豬環狀病毒的免疫原性組合物或疫苗和抵抗豬細小病毒的免疫原性組合物或疫苗，或施用在同一制劑中包含一種對兩種病毒均特異的抗原制品的二價免疫原性組合物或疫苗。具體地，該免疫或接種方法使用上述疫苗。
本發明的主題還在于抵抗特別是以上定義的抵抗細小病毒的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗，聯合抵抗豬環狀病毒的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗，在制備用于抵抗PMWS綜合癥的藥物組合物中的應用。
為了產生環狀病毒抗原制品，環狀病毒可在細胞特別是細胞系如PK/15細胞中傳代后獲得。培養物上清液或提取物，選擇性地用標準技術純化，可用作抗原制品。
對于減毒抗原制品和減毒免疫原性組合物或疫苗，減毒可根據常規方法來進行，例如在細胞上傳代，優選在豬細胞特別是細胞系如PK/15細胞上傳代(例如50-150代，特別是約100代)。通常，這些免疫原性組合物和疫苗包含從獸醫學觀點看可接受的載體或稀釋劑，并可選擇包含從獸醫學觀點看可接受的佐劑和可選擇的冷凍干燥穩定劑。
這些抗原制品、免疫原性組合物和疫苗優選包含103-107TCID50所述減毒病毒。
它們可是基于滅活全抗原的抗原制品、免疫原性組合物和疫苗。此外，滅活免疫原性組合物和疫苗還包含獸醫學上可接受的載體或稀釋劑，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。
根據本發明的環狀病毒和可能存在的成分根據本領域技術人員已知的技術滅活。滅活優選通過化學途徑進行，例如通過將抗原暴露于化學試劑如甲醛(福爾馬林)、多聚甲醛、β-丙內酯或乙烯亞胺或其衍生物中來進行。本文優選的滅活方法是暴露在化學試劑中，特別是乙烯亞胺或β-丙內酯。
優選地，可根據本領域技術人員熟知的技術，向本發明的滅活抗原制品和滅活免疫原性組合物和疫苗中添加佐劑，佐劑最好是以乳劑形式例如油包水或水包油的形式提供。佐劑的特性也可來自在活性成分中包含常規佐劑化合物。
在可使用的佐劑中，可提到的例子是氫氧化鋁、皂苷類(如Quillaja皂苷或Quil A；見疫苗設計，亞基和佐劑方法(Vaccine Design,TheSubunit and Adjuvant Approach),1995,Michael F.Powel和Mark J.Newman編，Plennum Press,New-York and London，第210頁)、阿夫立定(Avridine)_(疫苗設計，第148頁)、DDA(二甲基二(十八烷基)溴化銨，疫苗設計，第157頁)、聚磷腈(疫苗設計，第204頁)、或者是基于礦物油的水包油乳劑、角鯊烯(如SPT乳劑，疫苗設計，第147頁)、角鯊烯(如MF59，疫苗設計，第183頁)、或基于可代謝油的油包水乳劑(優選根據WO-A-94 20071)以及US-A-5,422,109中所描述的乳劑。也可選擇佐劑的組合，例如阿夫立定_或DDA與乳劑聯合。
這些抗原制品、免疫原性組合物和疫苗優選包含105到108TCID50的所述滅活全病毒。
用于上述活疫苗的佐劑可選自用于滅活疫苗的那些佐劑。優選乳劑。指明用于滅活疫苗的佐劑還有WO-A-9416681所述的佐劑。
作為冷凍干燥穩定劑，可提到的例子包括SPGA(Bovarnik等，細菌學雜志(J.Bacteriology)59,509,950)，碳水化合物如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白質如白蛋白或酪蛋白，這些化合物的衍生物，或緩沖液如堿金屬磷酸鹽。
根據本發明的抗原制品、免疫原性組合物和疫苗可包含根據本發明的一或多種環狀病毒和/或細小病毒的一或多種活性成分(抗原)。
此外，本申請人獲得了4個Ⅱ型豬環狀病毒分離物的基因組，見SEQID NO:1到4。PK-15株的序列見SEQ ID NO:5。自然，本發明自動涵蓋等價序列，也就是說不改變所述序列或該序列編碼的多肽的功能或株系特異性的序列。這當然包括由于密碼子的簡并性而不同的序列。
本發明還涵蓋能在高嚴謹條件下與上述序列雜交和/或與本發明株系具有高同源性的等價序列。
借助適當載體，這些序列和它們的片段可方便地用于體外或體內表達多肽。
具體地，在Ⅱ型環狀病毒基因組序列中已鑒定了可用于該目的的開放閱讀框(ORF1-13)，它們形成了根據本發明的DNA片段。本發明涉及任何含有至少一個這些開放閱讀框(相應的氨基酸序列)的多肽。優選地，本發明涉及基本上由ORF4、ORF7、ORF10或ORF13組成的蛋白質。
為了體外表達亞基，作為一種表達方法，優選使用大腸桿菌(E.Coli)或桿狀病毒(US-A-4,745,051)。可將一或多個所述編碼序列或其片段整合至桿狀病毒基因組(如桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒，AcNPV)中，然后后者可在昆蟲細胞如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9(保藏號ATCC CRL 1711)中增殖。所述亞基也可在真核細胞如酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或哺乳動物細胞(如CHO、BHK)中生產。
本發明主題還在于通過這些表達方法體外產生、然后可選擇地按照傳統技術純化的多肽作為亞基的用途。亞基免疫原性組合物和疫苗包含至少一種按上述方法獲得的多肽或片段、獸醫學上可接受的載體或稀釋劑，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。
為了體內表達產生重組活型或DNA型免疫原性組合物和疫苗，在允許所述多肽表達的條件下將一或多個編碼序列或其片段插入適當表達載體中。作為合適的活載體，優選使用活病毒，該病毒優選能按照本領域技術人員熟知的技術在豬體內擴增，并且對豬無致病性(天然無致病性或人為致使其無致病性)。具體地，可使用豬皰疹病毒如Aujeszky氏病病毒、豬腺病毒、痘病毒，特別是痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、豬痘病毒。載體也可使用DNA載體(WO-1-9011092,WO-A-9319813,WO-A-9421797,WO-A-9520660)。
因此，本發明主題還在于由此制備的載體和重組活型或DNA(多核苷酸)型免疫原性組合物或疫苗、其制品和其用途、以及還包含獸醫學上可接受的賦形劑或稀釋劑的免疫原性組合物和疫苗。
根據定義，DNA免疫原性組合物或疫苗含有可是超螺旋或非超螺旋環狀疫苗質粒或線性DNA分子的DNA載體，該載體包含并體內表達編碼抗原性多肽的核苷酸序列。
DNA型重組免疫原性組合物和疫苗可包含佐劑。
在聯合免疫或疫苗接種計劃中，抵抗豬環狀病毒和豬細小病毒的免疫或疫苗接種也可聯合抵抗其它豬病原體特別是可能與PMWS綜合癥有關的病原體的免疫或疫苗接種。因此，根據本發明的免疫原性組合物或疫苗可包含與其它豬病原體相應的其它效價，這些豬病原體選自PRRS(豬繁殖和呼吸綜合癥，Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome)、和/或豬肺炎枝原體、和/或大腸桿菌、和/或萎縮性鼻炎、和/或假狂犬病(Aujeszky氏病)病毒、和/或豬流感病毒、和/或大葉性肺炎放線桿菌、和/或豬霍亂及其組合。優選地，根據本發明的免疫或疫苗接種計劃和疫苗將聯合抵抗環狀病毒和細小病毒、和PRRS(WO-A-93/07898,WO-A-94/18311,FR-A-2 709 966；C.Charreyre等，第15屆IPVS大會論文集(Proceedings of the 15th IPVS Congress)，伯明翰，英國，1998年7月5-9日，第139頁)、和/或豬肺炎枝原體(EP-A-597 852,EP-A-550 477,EP-A571 648；O.Martinon等，第157、284、285頁和G.Reynaud等，第150頁，均見上述引用的第15屆IPVS大會論文集)、和/或豬流感病毒。因此，可使用任何形式的免疫原性組合物或疫苗，特別是任何可獲得的商業疫苗，以便其與本文所述的抵抗豬環狀病毒和豬細小病毒的免疫原性組合物或疫苗聯合使用。
因此，本發明主題還在于多價免疫原性組合物和疫苗、多疫苗試劑盒、以及使得可采用這種聯合免疫或疫苗接種計劃的聯合免疫或疫苗接種方法。
下面本發明將借助非限制性典型實施方案并參考下列附圖作更詳細的描述

圖1:Imp.1011-48121株基因組的DNA序列圖2:Imp.1011-48285株基因組的DNA序列圖3:Imp.999株基因組的DNA序列圖4:Imp.1010株基因組的DNA序列圖5根據圖1-4的4個序列與PCV PK/15株的對比序列表SEQ ID(序列標識)SEQ ID No:1 Imp.1011-48121株基因組的DNA序列SEQ ID No:2 Imp.1011-48285株基因組的DNA序列SEQ ID No:3 Imp.999株基因組的DNA序列SEQ ID No:4 Imp.1010株基因組的DNA序列SEQ ID No:5 PK/15株的DNA序列實施例實施例1豬環狀病毒株的培養和分離在法國、加拿大和美國從小豬的肺和淋巴結收集組織樣品。這些小豬顯示斷奶后多系統萎縮綜合癥的典型臨床癥狀。為有利于分離病毒，尸體解剖后立即將組織樣品于-70℃冷凍。
為分離病毒，用無菌研缽和棒將組織和無菌沙子一起研磨，在含有Earle氏鹽(EMEM,BioWhittaker UK Ltd.,Wokingham,英國)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100ug/ml)(MEM-SA培養基)的基本培養基中制備含約15％組織樣品的懸液。然后用MEM-SA回收該研磨制品并在3000g、4℃離心30分鐘以收獲上清液。
在接種細胞培養物之前，向2ml的每個上清液中加入100ul體積的氯仿并在室溫持續混合10分鐘。然后將混合物轉入一個微量離心管中，3000g離心10分鐘，然后收獲上清。該上清液用作病毒分離實驗的接種物。
所有病毒分離研究均在已知無豬環狀病毒(PCV)、瘟病毒(pestivirus)、豬腺病毒和豬細小病毒污染的PK/15細胞培養物中進行(Allan G.等，乏初乳小豬的豬環狀病毒實驗性感染的發病和豬胎兒材料的檢查(Pathogenesis of porcine circovirus experimentalinfections of colostrum-deprived piglets and examination of pigfoetal material),Vet.Microbiol.1995,44,49-64)。
豬環狀病毒的分離按照下列技術進行通過(用胰蛋白酶-versene混合物)胰蛋白酶消化從鋪滿培養物解離單層PK/15細胞，并用含15％無瘟病毒污染的胎牛血清的MEM-SA培養基(=MEM-G培養基)按約400,000細胞/ml的終濃度懸浮。然后取10ml該細胞懸液的等分試樣與2ml上述接種物等分試樣混合，最終的混合物以6ml體積分加至兩個25cm2的Falcon培養瓶中。然后將這些培養物在含10％CO2的空氣中37℃孵育18小時。
孵育后，用300mM D-氨基葡糖(Cat # G48175,Sigma-Aldrich有限公司，Poole，英國)處理該半鋪滿的單層細胞的培養基(Tischr I.等，Arch.Virol.,1987 96 39-57)，然后在37℃繼續孵育48-72小時。最后一次孵育后，每個接種物的兩個Falcon培養瓶取一個用于連續3次凍/融循環。剩下的Falcon培養瓶的PK/15細胞用胰蛋白酶-versene溶液處理，重懸于20ml MEM-G培養基中，然后以400,000細胞/ml的濃度接種至75cm2Falcon培養瓶。然后加入5ml凍/融循環后獲得的相應裂解物，對新接種的培養瓶進行“超感染”。實施例2制備用于通過免疫熒光或原位雜交檢測豬環狀病毒的細胞培養物樣品收集5ml“超感染”懸液，接種至含有一無菌無脂玻璃蓋片的55mm直徑的培養皿中。將培養瓶中的培養物和玻璃蓋片上的培養物于37℃孵育，并按實施例1所述用氨基葡糖處理。氨基葡糖處理后從第24到48小時之間收集玻璃蓋片上的培養物，用丙酮室溫固定10分鐘或用10％緩沖甲醛固定4小時。固定后，將所有玻璃蓋片置于硅膠上保存于-70℃，直到其用于原位雜交研究和免疫細胞化學標記研究。實施例3原位雜交檢測PCV序列的技術對收集自患病豬并用甲醛固定的組織和在玻璃蓋片上接種用于分離病毒(見實施例2)和固定的細胞培養物制品進行原位雜交。
使用與PK/15豬環狀病毒(PCV)和感染性雞貧血病毒(CAV)相應的完整基因組探針。使用含有復制型PCV基因組的質粒pPCV1作為PCV的特異病毒DNA來源，其中PCV基因組以單一1.7千堿基對(kbp)插入片段的形式克隆(Meehan B.等，豬環狀病毒DNA序列與植物環狀病毒的親和性(Sequence of porcine circovirus DNA:affinities with plantcircoviruses),J.Gen.Virol.1997,78,221-227)。陰性對照使用含有2.3kbp復制型鳥環狀病毒CAV的類似質粒pCAA1。按照堿裂解法分別使用這兩個質粒的甘油儲存物制備和純化該質粒(Sambrook J.等，分子克隆實驗手冊(Molecular cloning:A Laboratory Manual)。第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)，以便隨后可用作制備探針的模板。根據廠家的推薦使用商業非放射性標記試劑盒(“DIG DNAlabelling kit”,Boehringer Mannheim,Lewes，英國)，從上述純化質粒(每個探針1ug)和隨機六核苷酸引物制備代表PCV和CAV完整基因組的環狀病毒探針。
地高新配基標記探針溶于50-100ul體積的無菌水中，然后用于原位雜交。
根據下列技術制備石蠟包埋并用甲醛固定的患病豬組織樣本，以及甲醛固定的感染細胞培養物制品，用于檢測PCV核酸從石蠟包埋組織塊切出5um厚切片，除去石蠟，然后在遞減濃度的連續乙醇溶液中再水化。組織切片和甲醛固定的細胞培養物分別于37℃在含有5mM EDTA和0.5％蛋白酶K的0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)中孵育15和5分鐘。然后將載玻片置于無菌蒸餾水配制的1％甘氨酸溶液中30秒，用0.01M PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水)(pH7.2)洗滌兩次，最后在無菌蒸餾水中洗滌5分鐘。最后將其于空氣中干燥，之后與探針接觸。
每個組織/探針制備物用一個干凈無脂玻璃蓋片覆蓋，之后置于烤箱中+90℃10分鐘，然后與冰塊接觸1分鐘，最后于37℃孵育18小時。然后將該制備物短暫地浸沒在2×檸檬酸鈉鹽(SSC)緩沖液(pH7.0)中，以除去保護性的玻璃蓋玻片，之后用2×SSC緩沖液洗滌兩次，每次5分鐘，最后用PBS緩沖液洗滌兩次，每次5分鐘。
上述洗滌后，將制備物浸沒在0.1M馬來酸和0.15M NaCl(pH7.5)(馬來酸緩沖液)溶液中10分鐘，然后在溶于馬來酸緩沖液的1％封閉試劑溶液(Cat#1096176,Boehringer Mannheim UK,Lewis,East Sussex,英國)中37℃孵育20分鐘。
然后該制備物與封閉緩沖液稀釋的1/250抗-地高新配基單克隆抗體(Boehringer Mannheim)溶液于37℃一起孵育1小時，之后用PBS洗滌，最后和生物素化抗鼠免疫球蛋白抗體于37℃孵育30分鐘。制備物用PBS洗滌，再用溶于PBS的0.5％過氧化氫溶液室溫處理20分鐘以封閉內源過氧化物酶活性。再次用PBS洗滌制備物，用臨用前新制備的3-氨-9-二乙基咔唑(AEC)底物(Cambridge Bioscience,Cambridge，英國)處理。
用自來水最后洗滌后，制備物用蘇木精復染，在自來水中顯藍色，之后用封固液(GVA Mount,Cambridge Bioscience,Cambridge，英國)以顯微鏡玻璃蓋片封片。實驗對照包括對獲自患病豬和非患病豬的樣品使用無關陰性探針(CAV)和陽性探針(PCV)。實施例4免疫熒光檢測PCV的技術通過間接免疫熒光技術(IIF)，使用成年豬血清庫1/100稀釋液對丙酮固定的所有細胞培養物制備物進行初步篩選。該血清庫包括25頭北愛爾蘭成年母豬的血清，已知含有抗多種豬病毒的抗體，所述豬病毒包括PCV豬細小病毒、豬腺病毒和PRRS病毒。IIF技術通過將(用PBS稀釋的)該血清與細胞培養物在37℃接觸1小時然后在PBS中洗滌兩次來進行。然后，將細胞培養物用1/80PBS稀釋的與異硫氰酸熒光素偶聯的兔抗豬免疫球蛋白抗體染色1小時，然后用PBS洗滌，并封裝在甘油緩沖液中，然后在紫外光下顯微觀察。實施例5患病豬組織的原位雜交結果采用PCV基因組探針，對從法國、加拿大和加州具有多系統萎縮損傷的小豬收集并用甲醛固定的組織進行原位雜交，結果顯示，研究的多個損傷組織中存在損傷相關的PCV核酸。當對從非患病豬收集的組織使用PCV基因組探針時，或對患病豬組織使用CAV探針時，均未觀察到信號。在加州小豬肺中浸潤損傷部位的很多單核細胞的細胞質和細胞核中鑒定到PCV核酸的存在。在肺細胞、支氣管和細支氣管的上皮細胞，以及小動脈、小靜脈和淋巴管的內皮細胞中也顯示了PCV核酸的存在。
在患病法國豬中，許多濾泡淋巴細胞的細胞質和淋巴結的內竇狀隙(intrasinusoidal)單核細胞中檢測到PCV核酸的存在。在個別合胞體中也檢測了到PCV核酸。依據這些檢測結果，選擇加州豬肺、法國豬腸系膜淋巴結和加拿大豬器官的樣品用于分離新的豬環狀病毒株。實施例6新豬環狀病毒株的細胞培養和免疫熒光檢測結果在以顯示多系統萎縮綜合癥臨床癥狀的法國小豬(Imp.1008株)、加州小豬(Imp.999株)和加拿大小豬(Imp.1010株)收集的樣品接種的細胞培養物中未觀察到致細胞病變效應(CPE)。然而，接種后的細胞培養物的制備物經丙酮固定后以豬多克隆血清庫進行免疫標記，顯示在以加州小豬(Imp.999株)肺、法國小豬(Imp.1008株)縱隔淋巴結和加拿大小豬(Imp.1010株)器官接種的培養物中許多細胞有細胞核熒光。實施例7豬環狀病毒基因組DNA的提取按用于克隆復制型CAV的所述方法(Todd.D.等，采用克隆的DNA探針點印跡雜交分析雞貧血因，J.Clin.Microbiol.1991,29,933-939)，采用孵育72-76小時后收獲并經氨基葡糖處理的感染PK/15細胞培養物(見實施例1)(75cm2的10個Falcons)，制備復制型豬環狀病毒(PCV)的新株系。根據改進的Hirt技術(Hirt B.從感染的細胞培養物中選擇性提取多瘤病毒DNA，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)1967,36,365-369)，按照Molitor所述方法(Molitor TM.等，豬環狀病毒DNA兩個病毒分離物的基因組和復制型DNA的鑒定，病毒學(Virology),1984,137,241-254)，提取這些復制型的雙鏈DNA。實施例8豬環狀病毒Imp.999株基因組復制型的限制性圖譜根據廠商推薦采用S1核酸酶(Amersham)處理經Hirt技術提取的DNA(1-5ug)，然后按Todd等所述方法(雞貧血因子的純化和生物化學鑒定，J.Gen.Virol.1990,71,819-823)，用各種限制性酶(BoehringerMannheim,Lewis,East Sussex，英國)消化該DNA，消化產物用含有溴化乙錠的1.5％瓊脂糖膠電泳分離。從Imp.999株的培養物中提取的DNA具有單一EcoRⅠ位點，兩個SacⅠ位點，無PstⅠ位點。因此，該限制圖譜不同于具有一個PstⅠ位點而無EcoRⅠ位點的PCV PK/15株所顯示的限制圖譜(Meehan B.等，豬環狀病毒DNA序列與植物環狀病毒的親和性，1997 78,221-227)。實施例9豬環狀病毒Imp.999株基因組的克隆用限制酶EcoRⅠ消化雙鏈復制型PCV Imp.999株，產生大約1.8kbp的限制性片段，在1.5％瓊脂糖膠上電泳(見實施例3)之后，采用Qiagen商業試劑盒(QIAEXII凝膠提取試劑盒，Cat#20021,QIAGEN Ltd.,Crawiey,West Sussex，英國)分離。然后，根據標準克隆技術(SambrookJ.等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)，將該EcoRⅠ-EcoRⅠ限制性片段與預先以同樣的限制酶消化并脫磷酸化的載體pGEM-7(Promega,Medical Supply Company,Dublin,Ireland)連接。獲得的質粒根據標準技術轉化大腸桿菌JM109宿主菌(Stratagene,La Jolla，美國)。還將PCV Imp.999株的該EcoRⅠ-EcoRⅠ限制性片段克隆在pBlueScript SK+載體(Stratagene Inc.La Jolla，美國)的EcoRⅠ位點。對于每個宿主菌獲得的克隆，篩選至少2個含有期望大小片段的克隆。然后培養獲得的克隆，并根據標準質粒制備和純化技術小量(2ml)或大量(250ml)純化含有Imp.999株完整基因組的質粒。實施例10:PCV Imp.999株基因組DNA(雙鏈復制型)的測序根據Sanger雙脫氧核苷酸技術，按廠商推薦采用測序試劑盒“AmpliTaq DNA聚合酶FS”(Cat#402079 PE Applied Biosystems,Warrington，英國)以及Applied BioSystems AB1373A自動測序裝置，測定2個EcoRⅠ Imp.999克隆(克隆pGEM-7/2和pGEM-7/8)的核酸序列。用M13“正向”和“反向”通用引物進行初始測序反應。之后的測序反應根據“DNA步行”技術進行。這些隨后的測序所必需的寡核苷酸由LifeTechnologies(Inchinnan Business Park,Paisley，英國)合成。
產生的序列通過MacDNASIS軟件3.2版本(Cat # 22020101,Appligene,Durham，英國)進行組裝和分析。利用“國家生物技術信息中心”(NCBI,Bethesda,MD，美國)服務器的BLAST算法分析各種開放閱讀框。
完整序列(EcoRⅠ-EcoRⅠ片段)見SEQ ID No:3(圖3)。其給出了該株的全部序列，隨意以EcoRⅠ位點的開端為起始，即G是第一個核苷酸。
按相同的方式進行該程序，獲得另外三個分離株的序列(見SEQ ID No:1,2和4以及圖1,2和4)。
這四個株系的基因組大小為Imp.1011-481211767核苷酸Imp.1011-482851767核苷酸Imp.999 1768核苷酸Imp.1010 1768核苷酸實施例11:PCV Imp.999株序列的分析當檢測Imp.999株產生的序列與GenBank數據庫中的序列的同源性時，檢測到的唯一顯著同源性是與PK/15株(保藏號Y09921和U49186)序列的大約76％的同源性(在核酸水平上)(見圖5)。
在氨基酸水平上，在6讀框的序列翻譯中與數據庫(NABI服務器上的BLAST X運算法則)的同源性檢測顯示與GenBank U49186序列編碼的類似于植物環狀病毒的BBTV病毒的推測復制酶(GenBank識別號1841515)相應的開放閱讀框94％同源。
數據庫中沒有其它序列顯示與PCV Imp.999株產生的序列顯著同源。
分析采用從具有多系統萎縮綜合癥臨床癥狀的加州小豬收集的損傷部位培養的Imp.999株的序列，清楚地顯示該病毒分離物是一種新的豬環狀病毒株。實施例12序列的比較分析這4種新的PCV株的核苷酸序列與PCV PK/15株的序列進行對比(圖5)。建立了考慮這4種新株和以前的PK/15株的同源矩陣。結果如下1:Imp.1011-481212:Imp.1011-482853:Imp.9994:Imp.10105:PK/l512 3 4 5
兩個法國株Imp.1011-48121和Imp.1011-48285間的同源性大于99％(0.9977)。
兩個北美株Imp.999和Imp.1010間的同源性也大于99％(0.9949)。法國株和北美株間的同源性稍大于96％。
所有這些株與PK/15間的同源性均介于75％和76％之間。
由此推論，根據本發明的這些病毒株代表豬環狀病毒的新類型，不同于PK/15株所代表的類型。從表現PMWS癥狀的豬分離的該新類型稱作Ⅱ型豬環狀病毒，而PK/15為Ⅰ型。屬于該Ⅱ型的病毒株表現出顯著的核苷酸序列同源性，盡管實際上它們分離自距離非常遠的地理區域。實施例13新PCV株基因組編碼的蛋白的分析Imp.1010分離株的核苷酸序列被作為其它與多系統萎縮綜合癥相關的環狀病毒株的代表。利用BLASTX算法(Altschul等，分子生物學雜志，1990.215.403-410)和MacVector6.0軟件包(Oxford Molecular Group,Oxford OX4 4GA，英國)的一組程序對該序列進行更為詳細的分析。在該序列(環狀基因組)上可檢測到13個長度大于20個氨基酸的開放閱讀框(或ORF)。這13個ORF如下
每個ORF的起始和終止位置參見圖4(SEQ ID No.4)所示之1010株基因組的序列。ORF1至13的界限與999株一致。它們還與1011-48121株及1011-48285株一致，除了ORF3和13ORF3 1432-1539，有義鏈，108nt,35aaORF13 314-1377，反義鏈，705nt,234aa。
在這13個ORF中，4個與位于克隆病毒PCV PK-15基因組上的類似ORF顯著同源。分析多系統萎縮綜合癥相關的所有環狀病毒分離株的基因組上存在的每個開放閱讀框。這4個ORF如下
每個ORF的起始和終止的位置參見圖4所示之序列(SEQ ID No.4)。ORF的長度(以核苷酸=nt表示)包括終止密碼子。
比較PCV Imp.1010和PCVPK-15分離株的基因組結構，可鑒定2個病毒基因組中存在的4個ORF。下表顯示了觀察到的同源程度
在ORF4 Imp.1010和ORF1 PK-15之間觀察到最大序列一致性(86％同源)。這是可預測到的，因為該蛋白可能參與病毒DNA的復制并為病毒復制所必需(Meehan等，J.Gen.Virol.1997.78.221-227；Mankertz等，J.Gen.Virol.1998.79.381-384)。
ORF13 Imp.1010和ORF2 PK-15之間的序列一致性較低(66.4％同源)，但這兩個ORF均真正顯示了與CAV鳥環狀病毒的主要結構蛋白的N-端區域一致的高度保守N-端堿基區域(Meehan等。Arch.Virol.1992.124.301-319)。而且，在ORF7 Imp.1010和ORF3 PK-15之間以及ORF10 Imp.1010和ORF4 PK-15之間觀察到很大的差異。在兩種情況下，當它們與PCVPK-15的ORF3和ORF4比較時，Imp.1010分離株的ORF7和ORF10的C-端區域存在一個缺失。在ORF7/ORF3(重疊區水平61.5％同源性)和ORF10/ORF4(重疊區水平83％同源性)的N-端區域觀察到最大的序列同源性。
由于其基因組極為致密，豬環狀病毒的基因組結構顯得很復雜。主要結構蛋白可能來自位于豬環狀病毒基因組相同鏈上的幾個閱讀框之間的拼接。因此，可認為上表所述的任何開放閱讀框(ORF1-13)可代表Ⅱ型環狀病毒編碼的抗原蛋白的全部或部分，因此是可用于特異診斷和/或疫苗接種的潛在抗原。因此，本發明涉及至少包含上述一個ORF的任何蛋白質。優選地，本發明涉及基本由ORF4、ORF7、ORF10或ORF13組成的蛋白質。實施例14從新株系克隆的PCV基因組的感染特性根據Meehan B.等所描述的技術(來自雞貧血因子感染細胞的病毒的鑒定克隆復制型的序列分析和克隆基因組片段的轉染能力，Arch.Virol.1992,124,301-319)，將含有Imp.999分離物(復制型)完整基因組的質粒pGEM-7/8轉染至PK/15細胞中。對在無污染的PK/15細胞中感染后的第一代進行免疫熒光分析(見實施例4)顯示，克隆pGEM7/8的質粒能誘導感染性PCV病毒的產生。含有感染性PCV遺傳物質的克隆的獲得允許對病毒基因組進行任何有用操作，以獲得能用于產生減毒或重組疫苗或用于產生作為診斷試劑盒的抗原的(在豬中為減毒的或缺陷的)修飾PCV病毒。實施例15通過體外培養產生PCV抗原根據實施例1中相同的方法進行無污染PK/15細胞的培養和病毒的增殖。37℃孵育4天后進行胰蛋白酶消化，收獲感染細胞并計數。以400,000感染細胞/ml接種第二代。實施例16病毒抗原的滅活病毒培養結束時收獲感染細胞，并用超聲波(Branson Sonifier)或利用轉子-定子型(rotor-stator type)膠體磨(UltraTurrax,IKA)裂解。然后將懸液以3700g離心30分鐘。該病毒懸液用0.1％乙烯亞胺37℃處理12小時或用0.5％β-丙內酯28℃處理24小時滅活。如果滅活前病毒滴度不足，則通過使用300kDa截斷值的膜(Miliipore PTMK300)進行超濾濃縮病毒懸液。滅活的病毒懸液保存在5℃。實施例17制備基于礦物油的乳劑形式的疫苗根據下列配方制備疫苗-滅活豬環狀病毒懸液250ml-Montanide_ISA70(SEPPIC): 750ml水相和油相分別過濾除菌。通過利用Silverson渦輪乳化器將這些成分混合和攪勻來制備乳劑。
一個疫苗劑量含有約107.5TCID50。一個疫苗劑量的體積對于通過真皮內途徑給藥為0.5ml，對于通過肌內途徑給藥則為2ml。
該疫苗與Parvovax_疫苗聯合用于抵抗多系統萎縮綜合癥的疫苗接種計劃。實施例18制備基于可代謝油的乳劑形式的疫苗根據下列配方制備疫苗-滅活豬環狀病毒懸液 200ml-Dehymuls HRE 7(Henkel):60ml-Radia 7204(Oleofina): 740ml水相和油相分別過濾除菌。通過利用Silverson渦輪乳化器將這些成分混合和攪勻來制備乳劑。
一個疫苗劑量含有約107.5TCID50。一個疫苗劑量的體積對于通過肌內途徑給藥為2ml。
該疫苗與Parvovax_疫苗聯合用于抵抗多系統萎縮綜合癥的疫苗接種計劃。實施例19采用超免疫血清(PCV-T)、一組從PK/15制備的單克隆抗體F99和從加拿大株(PCV-C)制備的超免疫血清獲得的與美國和法國PCV病毒株以及PK/15污染物有關的間接免疫熒光結果
*在間接免疫熒光分析中給出陽性反應的血清或單克隆抗體最后稀釋的倒數。實施例20豬多系統萎縮綜合癥的試驗產生-程序1用PCV病毒溶液接種剖腹產獲得并放置在隔離裝置中的3天齡無菌小豬。所用的Ⅱ型PCV病毒是Imp1010分離物和從患病豬淋巴結勻漿獲得的病毒。分成5組。所有小豬均在3天齡通過口鼻途徑根據下列方案接種1.5ml病毒溶液
試驗攻擊的結果
在5周的觀察期間，除了B組一只動物顯示實質衰竭外，其它小豬均沒有出現臨床病癥。在解剖中，A、B和C組的豬顯示淋巴結增生(比D和E組動物大2到10倍)，特別是下顎、支氣管、腸系膜、回腸和股神經節的淋巴結。該增生通過單核細胞和巨噬細胞浸潤與皮質區相當大的膨脹相連。A、B和C組中的豬還顯示支氣管淋巴樣組織增生。
A、B和C組各有一頭小豬患肺炎。顯示實質衰竭的B組小豬和A組一頭小豬有胃潰瘍。
而且，A、B和C組所有動物的胃和腸的肌膜均患有肌炎。
A、B和C組動物大部分有心肌炎、伴有淋巴細胞、巨噬細胞和嗜曙紅細胞浸潤的多病灶肝炎、以及皮質和髓質間質性腎炎。
C組中一頭小豬的肝大小比正常的大，其表面散布明顯的病灶。
D和E組小豬沒有觀察到損傷。
從A、B和C組的豬器官分離了環狀病毒。實施例21豬多系統萎縮綜合癥的試驗重現—程序2和3用Ⅱ型PCV、豬細小病毒的病毒溶液或兩種病毒混合物接種出生后與母豬分開的常規小豬。
所用的Ⅱ型PCV病毒是Imp.1010和Imp.1011分離株(48121株)。
所用PPV病毒是加拿大來源的Imp.1005分離株。該病毒序列(所測序基因組的1/3)與其它已知細小病毒株(PPV株NADL-2和Kresse株)一致。
進行了兩個實驗程序。程序2將3天齡小豬分成三組。所有小豬均通過口鼻途徑按照下列方案接種1ml病毒溶液
實驗攻擊的結果A組接種后21天兩只小豬死亡，接種后24天人為殺死一只小豬。
B組接種后23天一只小豬死亡，接種后24天人為殺死一只小豬。
對感染后死亡的小豬進行解剖，顯示存在相當大肉眼可見的損傷胸膜腔中液體的存在、肺水腫、腎出血、腎針頭狀的發白損傷、肝壞死。這些損傷與野外病例所觀察到的相同。
對殺死的小豬進行解剖，未觀察到肉眼可見的損傷。
對感染后死亡的A和B組小豬以及這兩組中所殺死的小豬的器官進行組織學檢查，顯示野外動物觀察到的豬多系統萎縮綜合癥損傷的典型和全部情況肝壞死、淋巴結壞死、胰腺壞死、腎的灶性壞死和嚴重出血、肺中存在合胞體、肝細胞嚴重壞死并存在核包含體。
應當注意在所有這些損傷(死亡的或殺死的豬)中發現大量PCV抗原，但在這些相同損傷中檢測不到PPV抗原的存在。
在C組對照小豬中，沒有檢測到損傷。程序3將4周齡小豬分成4組。所有小豬均通過口鼻途徑按照下列方案接種1ml病毒溶液
試驗攻擊的結果接種后兩周人為殺死1只對照小豬和實驗組(B、C和D)每組2只小豬，并進行解剖。在D組(PCV+PPV共感染)中的兩只小豬觀察到顯著免疫組織損傷。應當注意，盡管D組所有豬均觀察到豬細小病毒有關的血清轉化，但在這些損傷中未檢測到豬細小病毒的存在。
在對照小豬和其它組小豬中未觀察到肉眼可見的或組織學的損傷。
因此，似乎PCV+PPV組合可重現豬多系統萎縮綜合癥典型的組織學損傷。
這兩個實驗程序之后，可觀察到單獨接種PCV，和PCV+PPV混合物接種一樣，導致豬多系統萎縮綜合癥或多或少的重現，但在損傷中僅可檢查到豬環狀病毒。相反，僅實驗感染PPV(程序3的B組)不能誘導肉眼可見的或組織學的損傷；但是存在PCV時，在4周齡豬中(程序3的D組)觀察到損傷的出現。
權利要求
1．抵抗PMWS綜合癥的抗原制品，其含有豬環狀病毒抗原和豬細小病毒抗原。
2．根據權利要求1的制品，其含有Ⅱ型豬環狀病毒抗原。
3．根據權利要求2的制品，其中Ⅱ型豬環狀病毒抗原是選自保藏于ECACC、具有如下保藏號的制備物的環狀病毒抗原-保藏號V97100219-保藏號V97100218-保藏號V971002l7-保藏號V980l1608-保藏號V980l1609。
4．根據權利要求1-3之任一項的制品，其中豬環狀病毒和豬細小病毒抗原相互獨立地包含選自減毒活全抗原、滅活全抗原、亞基抗原、重組活載體和DNA載體的抗原。
5．根據權利要求1-4之任一項的制品，其還包含與另一種豬病原體相應的其它效價。
6．根據權利要求5的制品，其包含的其它效價選自PRRS、豬肺炎枝原體、大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌、萎縮性鼻炎、假狂犬病、豬霍亂、豬流感病毒和它們的組合。
7．根據權利要求5的制品，其含有的其它效價是PRRS。
8．抵抗PMWS綜合癥的疫苗，其包含處于獸醫學上可接受的載體或賦形劑中的有效量的根據權利要求1-7任一項的抗原制品。
9．根據權利要求8的疫苗，其中它含有獸醫學上可接受的佐劑。
10．根據權利要求8或9的疫苗，其中它還含有多種豬環狀病毒的抗原。
11．根據權利要求8-10之任一項的疫苗，其中它包含選自ORF1-13的環狀病毒開放閱讀框編碼的環狀病毒抗原。
12．根據權利要求11的疫苗，其中它含有選自ORF4、7、10和13的環狀病毒開放閱讀框編碼的環狀病毒抗原。
13．根據權利要求8-12之任一項的疫苗，其中它含有選自能在豬中擴增而又對豬無致病性的活病毒和DNA載體的表達載體，該表達載體包含并表達所述ORF。
14．根據權利要求13的疫苗，其中病毒載體是選自豬皰疹病毒、豬腺病毒和痘病毒的病毒。
15．根據權利要求14的疫苗，其中，病毒載體是選自Aujesky氏病病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒的病毒。
16．疫苗接種試劑盒，其包含包裝上分開的抵抗根據權利要求8-15之任一項的豬環狀病毒的疫苗，和抗豬細小病毒的疫苗。
全文摘要
本發明涉及抵抗豬多系統萎縮綜合癥(PMWS)的抗原制品和疫苗,其包括至少一種豬環狀病毒,優選Ⅱ型豬環狀病毒,和至少一種豬細小病毒。
文檔編號A61P43/00GK1311690SQ99809131
公開日2001年9月5日 申請日期1999年6月28日 優先權日1998年7月6日
發明者G·M·埃倫, B·M·密漢, J·A·艾利斯, G·S·克拉考卡, J－C·F·奧登奈特, F·麥克內利 申請人:梅瑞爾公司, 貝爾法斯特皇后大學, 薩斯喀徹溫大學