使用酪氨酸激酶src調制血管生成的方法和組合物的制作方法

專利名稱：使用酪氨酸激酶src調制血管生成的方法和組合物的制作方法
相關申請的參考本申請要求1998年5月29日提交的美國臨時申請順序號60/087,220的利益，正如本文所引用的所有參考文獻一樣，將該文獻引入作為參考。
背景血管生成是一種包括新發育的血管生長成組織的組織血管化的過程并且還將它稱作新血管形成。該過程由內皮細胞和平滑肌細胞滲入介導。認為該過程以下列三種方式中任意一種進行血管從預先存在的血管中生長；血管的從新發育可能是由前體細胞導致的(血管發生)；或存在的小血管可以直徑擴大。參見Blood等《生物化學和生物物理學誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)。
血管生成是新生兒生長中的重要過程，而在傷口愈合過程中和大量不同的臨床疾病的發病機制中也是重要的，所述的臨床疾病包括組織炎癥、關節炎、腫瘤生長、糖尿病性視網膜病、由視網膜新血管形成導致的黃斑變性和類似疾病。將這些與血管生成有關的臨床表現稱作血管源性疾病。參見Folkman等《科學》(Science),235:442-447(1987)。一般在成年人或成熟組織中不存在血管生成，不過它確實在傷口愈合過程中和黃體生長周期中發生。參見例如Moses等《科學》(Science),248:1408-1410(1990)。
已經提出抑制血管生成是用于限制腫瘤生長的有用的療法。已經提出通過下列方法來抑制血管生成(1)抑制“血管源性分子”諸如bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的釋放；(2)諸如通過使用抗βbFGF抗體使血管源性分子失效；(3)應用玻連蛋白受體αvβ3的抑制劑；和(4)抑制內皮細胞對血管源性刺激物的反應。這后一種策略已經受到關注，且Folkman等在《癌癥生物學》(Cancer Biology)，3:89-96(1992)中已經描述了幾種內皮細胞反應抑制劑，包括可用于抑制血管生成的膠原酶抑制劑、基膜更新抑制劑、靜態血管類固醇、真菌產生的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板生成素、諸如D-青霉胺和硫羥蘋果酸金這樣的關節炎藥物、維生素D3類似物、α-干擾素等。對于另外提示的血管生成抑制劑來說，參見Blood等《生物化學和生物物理學誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)；Moses等《科學》(Science),248:1408-1410(1990)；Ingber等《實驗室研究》(Lab.Invest.)59:44-51(1988)；和美國專利5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352、5,753,230和5,766,591。在上述參考文獻中所述的血管生成抑制劑中沒有一種包括Src蛋白質。
為使血管生成發生，內皮細胞必須首先以腫瘤細胞發生侵害和轉移瘤形成過程中所用的類似方式降解并通過血管基膜。
目前已經有報導血管生成取決于血管整聯蛋白與胞外基質蛋白之間的相互作用。參見Brook等《科學》(Science),264:569-571(1994)。此外，據報導血管源性血管細胞的程序性細胞死亡(編程性細胞死亡)由這種相互作用引發，所述的相互作用由血管整聯蛋白αvβ3的某些拮抗劑來抑制。參見Brook等《細胞》(Cell),79:1157-1164(1994)。更進一步來說，已經報導使用αvβ5拮抗劑可以抑制基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)與玻連蛋白受體(αvβ5)的結合，且由此可抑制所述蛋白酶的酶功能。參見Brook等《細胞》(Cell),85:683-693(1996)。
發明概括本發明涉及用酪氨酸激酶Src、本文一般也稱作Src，在組織中調制血管生成的方法。
本發明關注的是用于在組織中調制與疾病相關的血管生成的組合物和方法。將含有調制血管生成量的Src蛋白質的組合物給予所治療的對調制血管生成有反應的疾病組織。提供Src蛋白質的該組合物可以含有純化的蛋白質、蛋白質的生物活性片段、重組生產的Src蛋白質或蛋白質片段或其融合蛋白或用于表達Src蛋白質的基因/核酸表達載體。
如果Src蛋白質失活或受到抑制，那么調制過程就是抑制血管生成。如果Src蛋白質是活性的或被激活，那么調制過程就是強化血管生成。
所治療的組織可以是需要調制血管生成的任意組織。對于血管生成抑制來說，將它用于治療發生有害的新血管形成的患病組織。例示的組織包括炎癥組織、實體腫瘤、轉移瘤、發生再狹窄的組織及類似組織。
對于強化來說，其用于治療具有局部缺血肢體的患者，其中因糖尿病或其它疾病使肢體中存在不良循環。同樣可以治療帶有不愈合且由此得益于血管細胞增殖增加和新血管形成的慢性傷口的患者。
特別優選的是含有本文所述的修飾的氨基酸序列的Src蛋白質的應用。本文描述了幾種特別有用修飾的Src蛋白質及其表達。
本發明還包括一種用于刺激靶哺乳動物組織中血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼src蛋白質的核酸片段，所述的src蛋白質在527位密碼子上帶有除酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸外的任意氨基酸殘基。
另外關注的是一種用于抑制靶哺乳動物組織中血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼不具有激酶活性的src蛋白質的核酸片段。
附圖2是附

圖1中所示編碼序列編碼的雞c-Src的氨基酸殘基序列。
附圖3是首先由Braeuninger等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),88:10411-10415(1991)中所述的人c-Src的cDNA序列。該序列可以通過基因庫登記號X59932X71157找到。該序列含有蛋白質編碼部分分別在相應的134和1486位核苷酸處開始和終止的2187個核苷酸。
附圖4是附圖3中所示編碼序列的編碼的人c-Src的氨基酸殘基序列。
附圖5解釋了如實施例4中所述由bFGF或VEGF激活內源性Src的情況。附圖上部表示使用由bFGF或VEGF倍增激活內源性c-Src的體外激酶試驗結果。附圖的下部是用抗-Src抗體作為等含量Src和IgG上樣對照品探測的激酶試驗印跡。
附圖6解釋了如實施例4中所述的逆轉錄病毒介導的c-SrcA的基因表達對雞尿囊絨膜(CAM)中血管生成的作用。使9日齡雞CAMs與RCAS-SrcA(活性突變的c-Src)或對照品RCAS-GFP(綠色熒光蛋白；一種熒光指示劑蛋白)逆轉錄病毒或緩沖液接觸72小時。如附圖6A中所示，使用相應于用立體顯微鏡記錄的各次處理結果的附圖6B中有代表性的顯微照片(4x)來對血管生成水平進行定量。
附圖7解釋了c-SrcA在激活血管MAP激酶磷酸化中的逆轉錄病毒表達。附圖7A表示已經與VEGF或PMA接觸30分鐘或用c-SrcA逆轉錄病毒感染48小時的10日齡雞CAMs的組織提取物。NT代表沒有經過處理。Src免疫沉淀自等量的總蛋白質提取物并使用FAK-GST融合蛋白作為底物進行了體外免疫復合激酶試驗、將其進行電泳并轉到硝化纖維上。還通過使用抗-磷酸-ERK抗體進行的免疫印跡測定了等份的上述完整組織裂解物的內源性ERK磷酸化作用。附圖7B表示用模擬物RCAS或含有SRCA的RCAS感染的10日齡CAMs。兩天后，解剖CAMs、將其在OCT中低溫儲藏并切成4μm的片。將切片用抗磷酸化ERK抗體(New England Biolabs)進行免疫染色、洗滌并用山羊抗家兔FITC接合的二級抗體檢測。在靜態CCD照相機(PrincetonInst.)上捕捉到了熒光圖象。
附圖8解釋了在VEGF而非bFGF-誘發的血管生成過程中對Src活性的選擇性需求。使9日齡雞CAMs與RCAS-Src251或對照品RCAS-GFP逆轉錄病毒或緩沖液接觸20小時且然后在有或沒有bFGF或VEGF存在的情況下再培養72小時。附圖8A如上所述對血管生成水平進行了定量并如附圖8B中所示用立體顯微鏡記錄下了有代表性的顯微照片(6x)。附圖8C表示用抗-Src抗體探測的印跡以便證明與模擬物處理相比Src251在轉染細胞中的表達。
附圖9解釋了RCAS-Src251的逆轉錄病毒轉運至人腫瘤的結果。附圖9A是表示根據光切面法檢測僅在腫瘤血管(箭頭)中表達GFP的RCAS-GFP(RCAS-綠色熒光蛋白)感染的人成神經管細胞瘤斷片的顯微照片，其中所述的光切面法使用Bio Rad激光聚焦掃描顯微鏡進行(光柵=500μm)。附圖9B描繪了來自通過局部施用逆轉錄病毒而治療的腫瘤的數據，使腫瘤在切下并測定濕重后生長3或6天。將數據表示為腫瘤重量(來自50mg腫瘤起始重量)的平均改變值+/-2次重復試驗的SEM。附圖9C描繪了手術取自胚胎的成神經管細胞瘤的有代表性的顯微照片(光柵=350μm)。下部照片組是具體表示各腫瘤血管系統的各腫瘤的高倍放大照片(光柵=350μm)。箭頭表示RCAS-Src251治療的腫瘤中血管的破裂情況。
附圖10是說明RCASBP(RGAS)載體構建體的限制酶圖譜的示意圖。
發明詳述A．定義氨基酸殘基多肽在其肽鍵化學消化(水解)時形成的氨基酸。本文所述的氨基酸殘基優選是“L”異構型。然而，可以用“D”異構型殘基取代任意的L-氨基酸殘基，條件是所述的多肽保持所需的功能特性。NH2指的是在多肽氨基末端上存在的游離氨基。COOH指的是在保持標準多肽名稱(在《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)243:3552-59(1969)中所述并在37CFR§1.822(b)(2)中采用)的多肽羧基末端上存在的游離羧基。
應注意在本文中所有的氨基酸殘基序列均由通式來代表，該通式的左和右側取向是氨基末端至羧基末端常規的取向。此外，氨基酸殘基序列的起始或終止端的虛線表示與一個或多個氨基酸殘基的另外的序列結合的肽鍵。
多肽指的是通過鄰接氨基酸殘基的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的氨基酸殘基的線性排列。
肽本文所用的這一術語指的是不超過大約50個作為多肽中彼此連接的氨基酸殘基的線性排列。
環肽指的是具有包括作為典型肽中幾個酰胺鍵的環結構的化合物。該環肽可以是一種“從頭至尾”的均鍵環肽；或它可以含有雜鍵環結構，其中所述的環由二硫橋、內酯橋、硫酯、硫代酰胺、胍基及類似鍵閉合。
蛋白質指的是超過50個作為多肽中彼此連接的氨基酸殘基的線性排列。
融合蛋白指的是含有可操作地通過典型肽鍵連接的(“融合的”)至少兩個不同多肽結構域的多肽，其中所述的兩個結構域相當于自然界中沒有發現融合的肽類。
合成肽指的是不含天然存在的蛋白質及其片段的以化學方式產生的通過肽鍵彼此連接的氨基酸殘基的鏈。B．一般討論本發明一般涉及由酪氨酸激酶Src蛋白質介導的血管生成和可以通過分別為強化或抑制血管生成提供活性或失活Src蛋白質來調制血管生成的發現。
這個發現是重要的，因為血管生成即新血管的形成在各疾病進程中起重要作用。如果與疾病相關的組織需要組織生長的血管生成，那么需要抑制血管生成且由此抑制患病組織的生長。如果受損傷的組織需要用于組織生長和愈合的血管生成，那么需要強化或促進血管生成且由此促進組織愈合和生長。
如果新血管生長是與患病組織相關的病理學原因或有助于與患病組織相關的病理情況出現，那么抑制血管生成可降低疾病的有害作用。通過抑制血管生成，可以干擾疾病、改善癥狀并在某些情況中治愈疾病。
得益于血管生成的抑制性調制的與疾病和新血管形成相關的組織的實例包括類風濕性關節炎、糖尿病性視網膜病、炎癥疾病、再狹窄等。如果有害組織生長需要新血管生長的支持，那么抑制血管生成可減少對所述組織的供血量并由此使以供血量為基礎的組織質量下降。實例包括腫瘤的生長，其中持續需要新血管形成以使腫瘤生長超過幾毫米的厚度并形成實體轉移瘤。
如果新血管生長導致組織愈合，那么強化血管生成有助于愈合。實例包括治療肢體局部缺血的患者，其中因糖尿病或其它疾病而導致肢體中的循環不良。另外對治療關注的是帶有某些傷口的患者，這些傷口不愈合且由此可以得益于血管細胞增殖和新血管形成的增加。
本發明的方法是有效的，在一定程度上是因為該療法對血管生成具有高度的選擇性并且沒有其它生物過程。
如上所述，血管生成包括涉及組織的新血管形成的許多過程，組織的新血管形成包括“發芽”、血管發生或血管增大，所有的血管生成過程均通過Src蛋白質起作用。除創傷傷口愈合、黃體形成和胚胎發生外，認為大多數血管生成過程與疾病的進程有關。因此，本治療方法對所述疾病是選擇性的并且沒有有害的副作用。C．Src蛋白質用于本發明的酪氨酸激酶Src蛋白質可以隨應用的不同而改變。術語“Src蛋白質”或“Src”用以指本文所述的活性或失活形式的各種形式的酪氨酸激酶Src蛋白質。
“活性Src蛋白質”指的是強化血管生成的各種形式的src蛋白質。測定血管生成的強化程度的試驗如本文所述但不起限定作用。如果血管生成的水平高于試驗系統中未添加src的對照水平至少10％、優選25％且更優選50％，那么認為蛋白質是有活性的。用于測定強化程度的優選試驗是使用實施例中所述RCAS病毒載體的CAM試驗，其中生血管指數通過統計分支點來計算。優選的活性Src蛋白質也表現出酪氨酸激酶活性。例示的活性Src蛋白質在實施例中描述并包括Src-A。
“失活Src蛋白質”指的是抑制血管生成的各種形式的Src蛋白質。測定血管生成的抑制程度的試驗如本文所述但不起限定作用。如果血管生成的水平低于試驗系統中未添加外源性Src的對照水平至少10％、優選25％且更優選50％，那么認為蛋白質是失活的。用于測定抑制程度的優選試驗是使用實施例中所述RCAS病毒載體的CAM試驗，其中生血管指數通過統計分支點來計算。優選的失活Src蛋白質也表現出降低的酪氨酸激酶活性。例示的失活Src蛋白質在實施例中描述并包括Src-251。
可以用任意的各種方法來生產用于本發明的Src蛋白質，包括從包括組織在內的天然來源中的分離法、通過重組DNA表達和純化的生產法等。通過將基因療法系統引入所關注的組織且然后在該組織中表達所述的蛋白質也可以在“原位”產生Src蛋白質。
通過本領域中各種公知的方法可以制備編碼Src蛋白質的基因且本發明不以這方面起限定作用。例如，眾所周知Src的自然史包括來自哺乳動物、鳥類、病毒等物種的同系物，而使用來自表達該蛋白質的任意組織的cDNA克隆法可以方便地克隆其基因。用于本發明的優選Src是細胞蛋白質諸如命名為c-Src的哺乳動物或鳥類同系物。特別優選的是人c-Src。D．重組DNA分子和用于表達Src蛋白質的表達系統本發明描述了特別用于本發明的幾種核苷酸序列。這些序列包括編碼用于本發明的Src蛋白質的序列、以及各種DNA片段、重組DNA(rDNA)分子和為表達Src蛋白質所構建的載體。
本發明的DNA分子(片段)由此可以含有編碼完整結構基因的序列、結構基因片段和如本文進一步所述的轉錄單位。
優選的DNA片段是編碼本文所述的Src蛋白質或其生物活性片段的核苷酸序列。
優選的c-Src的氨基酸殘基序列和核苷酸序列在實施例中描述。
優選的DNA片段編碼與相應于本文所述的Src蛋白質的氨基酸殘基序列或其部分基本相同且優選主要由它們組成的氨基酸殘基序列。有代表性的和優選的DNA片段在實施例中進一步描述。
蛋白質或多肽的氨基酸殘基序列通過遺傳密碼直接與編碼所述蛋白質的結構基因的脫氧核酸(DNA)序列相關。因此，可以根據氨基酸殘基序列即其所編碼的蛋白質或多肽的氨基酸殘基序列來定義結構基因或DNA片段。
所述遺傳密碼的重要和眾所周知的特征在于其豐余性。這就是說，對于用于制備蛋白質的大多數氨基酸，一種以上的編碼核苷酸三聯體(密碼子)可以編碼或指定特定的氨基酸殘基。因此，大量不同的核苷酸序列可以編碼一個特定的氨基酸殘基序列。將這類核苷酸序列在功能上看作是等價的，因為它們可以導致在所有生物體中產生相同的氨基酸殘基序列。有時，可以將嘌呤或嘧啶的甲基化變體引入給定的核苷酸序列。然而，這類甲基化不會影響任何形式的編碼關系。
核酸是任意的多核苷酸或核酸片段，它可以是多脫氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸即RNA或DNA或其類似物。在優選的實施方案中，核酸分子是雙鏈體DNA片段即DNA片段的形式，不過，對于某些分子生物學方法來說，優選單鏈DNA或RNA。
通過大量方法包括化學合成法和重組手段、優選通過克隆或通過聚合酶鏈反應(PCR)來生產DNA片段。通過化學技術例如Matteucci等在《美國化學協會雜志》(J.Am.Chem.Soc.),103:3185-3191,1981中所述的磷酸三酯法或使用自動合成法可以方便地合成編碼Src蛋白質部分的DNA片段。此外，通過眾所周知的方法諸如合成一組定義DNA片段的寡核苷酸、隨后雜交并連接寡核苷酸構建完整片段的方法可以方便地制備較長的DNA片段。另一種方法包括通過使用一對寡核苷酸引物進行PCR來分離優選的DNA片段的步驟，所述的寡核苷酸引物用在認為含有編碼Src蛋白質的成分的cDNA文庫上。
當然，通過化學合成，可以經用合適的堿基置換那些編碼天然氨基酸殘基序列的堿基而簡便地進行任何所需的修飾。這種方法是眾所周知的且可以將該方法方便地用于生產本文所述的各種不同的“修飾的”Src蛋白質。
此外，隨后可以諸如通過定向誘變或隨機誘變來修飾主要由編碼Src蛋白質的結構基因組成的DNA片段以便引入任何所需的置換。1．克隆Src基因可以通過各種生物化學方法從合適來源的基因組DNA或信使RNA(mRNA)中克隆Src基因。按照實施例中所述和作為本領域中公知的一般方法可以進行這些基因的克隆。
用于克隆適用于本發明方法的8rc基因的核酸的來源可以包括cDNA文庫形式的基因組DNA或信使RNA(mRNA)，它們來自認為表達這些蛋白質的組織。優選的組織是人肺組織，不過可以使用任何其它合適的組織。
優選的克隆方法包括使用標準方法制備cDNA文庫和通過使用以本文所述核苷酸序列為基礎的配對寡核苷酸引物進行的PCR擴增來分離編碼Src的核苷酸序列的步驟。另一方面，可以鑒定所需的cDNA克隆并通過常規的核酸雜交法、使用以本文所述核酸序列為基礎的雜交探針而從cDNA或基因組文庫中分離它們。分離和克隆編碼核酸的src的其它方法對于本領域技術人員來說是顯而易見的。2．表達載體如本文所述可以生產含有編碼Src蛋白質的DNA片段的重組DNA分子(rDNA)。特別地，通過將載體可操作地(符合讀框的，可表達地)與編碼src的DNA片段連接可以生產可表達的rDNA。因此，重組DNA分子是一種含有至少兩種通常自然界中不在一起的核苷酸序列的核酸的雜交DNA分子。
正如本領域眾所周知的，對可操作地連接DNA片段的載體的選擇直接取決于所需的功能特性、例如蛋白質的表達和所轉化的宿主細胞。適用于實施本發明的載體是至少能夠引導復制且還優選表達包括在可操作地與之連接的載體DNA片段中的結構基因。
原核和真核表達載體是載體構建領域技術人員熟知的并且由Ausebel等在《分子生物學最新方案》(Current Protocols inMolecular Biology),Wiley和Sons,New York(1993)和由Sambrook等在《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)。冷泉巷實驗室(1989)中描述。這些參考文獻中還描述了本文參照的許多一般重組DNA方法。
在一個實施方案中，合適的載體包括原核復制子，即具有直接自主復制和在原核宿主細胞、諸如以此轉化的細菌宿主細胞內染色體外維持所述重組DNA分子的能力的DNA序列。這類復制子在本領域中是眾所周知的。此外，那些包括原核復制子的實施方案還包括基因表達使抗藥性轉遞給以此轉化的細菌宿主的基因。典型的細菌抗藥劑基因是對氨芐西林或四環素產生抗性的那些基因。
那些包括原核生物復制子的載體還可以包括能夠指導結構基因在以此轉化的細菌宿主細胞諸如大腸桿菌中的表達(轉錄和翻譯)的原核生物啟動子。啟動子是由允許結合RNA聚合酶并發生翻譯的DNA序列形成的表達控制元件。一般在含有用于插入本發明DNA片段的便利限制位點的質粒載體中載有與細菌宿主相容的啟動子序列。典型的這類質粒載體是商購自Biorad Laboratories,(Richmond,CA)的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329；商購自Invitrogen(San Diego,CA)的pRSET以及商購自Pharmacia,Piscataway,N.J.的pPL和pKK223。
還可以將與真核細胞相容、優選那些與脊椎動物細胞相容的表達載體用于形成本發明的重組DNA分子。真核細胞表達載體在本領域中是眾所周知的且它們可以從幾種商業來源得到。一般來說，提供這類含有便利限制位點的載體是用于插入所需的DNA片段。典型的這類載體是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(InternatinonalBiotechnologies,Inc.)、pTDT1(ATCC,#31255)、pRc/CMV(Invitrogen,Inc.)、實施例中所述的優選載體以及類似的真核生物表達載體。
本發明上下文中用于基因表達的特別優選的系統包括基因轉運成分，即有將基因轉運至所關注組織的能力的成分。合適的載體是基因工程改造成表達所需蛋白質并具有感染預選擇靶組織的特征的“感染性”載體諸如重組DNA病毒、腺病毒或逆轉錄病毒載體。特別優選的是本文所述的復制感受態禽類肉瘤病毒(RCAS)。
可以基因工程改造應用重組病毒或病毒元件指導表達的哺乳動物細胞系。例如，當使用腺病毒表達載體時，可以將多肽的編碼序列與腺病毒轉錄/翻譯控制復合物例如晚期啟動子和三聯前導序列連接。然后可以通過體外或體內重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區(例如E1或E3區)會導致重組病毒有存活力并能夠表達感染宿主中的多肽(例如，參見Logan等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:3655-3659(1984))。另一方面，可以使用牛痘病毒7.5K啟動子(例如，參見Mackett等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79:7415-7419(1982)；Mackett等《病毒學雜志》(J.Virol.),49:857-864(1984)；Panicali等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79:4927-4931(1982))。特別關注的是以牛乳頭瘤病毒為基礎的載體，它們具有作為染色體外元件復制的能力(Sarver等《細胞分子生物學》(Mol.Cell.Biol.),1:486(1981))。在這種DNA進入靶細胞后不久，質粒復制成約100-200個拷貝/細胞。插入的cDNA的轉錄不需將所述質粒整合入宿主染色體，由此產生高水平的表達。可以通過使所述質粒中包含選擇性標記諸如新基因而將這些載體用于穩定的表達。另一方面，可以修飾逆轉錄病毒基因組以便用作能夠引入并指導編碼多肽的核苷酸序列在宿主細胞中表達的載體(Cone等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:6349-6353(1984))。也可以使用包括但不限于金屬硫蛋白(metallothionine)IIA啟動子和熱激啟動子在內的誘導型啟動子來實現高水平的表達。
目前，已經研究了巨細胞病毒(CMV)啟動子與勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子驅動的胸苷激酶(TK)基因療法對具有人卵巢癌的無胸腺小鼠產生的長期存活率。發現腺病毒介導的CMV啟動子驅動的單純皰疹病毒TK基因療法的殺細胞功效的有效性超過RSV驅動的療法2-10倍。(Tong等，1999《雜交瘤》(Hybridoma)18(1):93-97)。還描述了用于實施要求低水平表達、隨后是誘導型高水平表達的基因療法的嵌合啟動子的設計。(Suzuki等，1996《人體基因療法》(HumanGene Therapy)7:1883-1893)。
為了長期高產率地生產重組蛋白質，優選穩定的表達。不使用含有病毒復制起點的表達載體，可以用由合適的表達控制元件(例如啟動子和增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)所控制的cDNA和選擇性標記轉化宿主細胞。如上所述，重組質粒中的選擇性標記可賦予選擇抗性并使細胞穩定地將所述質粒整合入其染色體并生長至形成可以依次克隆并擴展入細胞系中的病灶。
例如，在引入外源DNA后，可以使工程細胞在富集的培養基中生長1-2天，且然后將它們轉換到選擇性培養基中。可以使用許多選擇系統，包括但不限于單純皰疹胸苷激酶(Wigler等《細胞》(Cell),11:223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),48:2026(1962))和腺嘌呤轉磷酸核糖基酶(Lowy等《細胞》(Cell),22:817(1980))基因，可以將它們分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞。此外，可以將提供抗代謝物抗性的基因用作選擇的基礎；例如使氨甲蝶呤產生抗性的dhfr(Wigler等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77:3567(1980)；O’Hare等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),78:1527(1981))、使霉酚酸產生抗性的gpt(Mulligan等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),78:2072(1981))、使氨基糖苷G-418產生抗性的neo(Colberre-Garapin等《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol),150:1(1981))和使潮霉素產生抗性hygro(Santerre等《基因》(Gene),30:147(1984))的基因。近來，已經描述了另外的選擇性基因，即可使細胞應用吲哚來取代色氨酸的trpB、使細胞應用組氨醇(histinol)取代組氨酸的hisD(Harman等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:804(1988))和使鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸DFMO產生抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogue L.在《分子生物學最新通訊》(Current Communications in Molecular Biology)，冷泉巷實驗室編輯(1987))。
為人基因療法所關注的主要載體來源于逆轉錄病毒(Wilson,1997《免疫學臨床實驗》(Clin.Exp.Immunol.),107(增刊1)31-32；Bank等，1996《生物試驗》(Bioessays)18(12):999-1007；Robbins等，1998《藥學療法》(Pharmacol.Ther.)80(1):35-47)。基因轉移和反義療法的治療潛能已經刺激了用于治療各種組織的許多載體系統的開發。(血管系統參見Stephan等，1997《臨床藥學基礎》(Fundam.Clin.Pharmacol.)11(2):97-110；Feldman等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):391-404；Vassalli等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):459-69；Baek等，1998《循環研究》(Circ.Res.)82(3):295-305；腎臟參見Lien等，1997《國際腎臟增刊》(Kidney Int.Suppl.)61:S85-8；肝臟參見Ferry等，1998《人體基因療法》(Hum.GeneTher.)9(14):1975-81；肌肉，參見Marshall等，1998《遺傳學發展最新觀點》(Curr.Opn.Genet.Dev.)8(3):360-5)。除這些組織外，用于人體基因療法的關鍵靶物還有癌，即腫瘤自身或相關組織。(Runnebaum,1997《抗癌研究》(Anticancer Res.)17(4B):2887-90；Spear等，1998《神經病毒學》(J.Neurovirol.)4(2):133-47)。
下面簡要地描述了易適用于本發明方法的病毒基因療法載體系統的具體實例。目前Federspiel和Hughes已經綜述了逆轉錄病毒的基因轉運(1998，《細胞生物學方法》(Methods in Cell Biol.)52:179-214)，他們特別描述了禽類白血病病毒(ALV)逆轉錄病毒族(Federspiel等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93:4931(1996)；Federspiel等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),91:11241(1994))。包括ALV和鼠白血病病毒(MLV)在內的逆轉錄病毒載體由Svoboda進一步描述(1998，《基因》(Gene)206:153-163)。
修飾的逆轉錄病毒/腺病毒表達系統可以方便地適用于實施本發明的方法。例如，Karavanas等在《腫瘤學/血液學邊緣研究》(Crit.Rev.in Oncology/Hematology)28:7-30中綜述了鼠白血病病毒(MLV)系統。Von Seggern和Nemerow在《基因表達系統》(GeneExpression Systems)(Fernandez&Hoeffler編輯，Academic Press,San Diego,CA,1999，第5章第112-157頁)中綜述了腺病毒表達系統。
已經證實蛋白質表達系統在體內和體外均具有有效的作用。例如，已經描述了由單純皰疹1型病毒(HSV)擴增子載體進行的至人鱗狀細胞癌的有效基因轉運。(Carew等，1998《美國外科學雜志》(Am.J.Surg.)176:404-408)。已經將單純皰疹病毒用于至神經系統的基因轉運。(Goins等，1997，《神經病毒學》(J.Neurovirol.)3(增刊1):S80-8)。已經在實體腫瘤上檢測了使用HSV-TK的靶向自殺載體。(Smiley等，1997《人體基因療法》(Hum.Gene Ther.)8(8):965-77)。已經將單純皰疹1型病毒載體用于對結腸癌細胞的癌癥基因療法。(Yoon等，1998《外科學年鑒》(Ann.Surg.)228(3):366-74)。已經開發了雜交載體用于延長轉染時間長度，包括用于治療肝細胞的HSV/AAV(與腺相關的病毒)雜種。(Fraefel等，1997《分子藥物》(Mol.Med.)3(12):813-825)。
痘苗病毒因其基因組較大而已經被開發用于人體基因療法。(Peplinski等《美國腫瘤外科學臨床標準》(Surg.Oncol.Clin.N.Am.)7(3):575-88)。已經描述將表達嘌呤核苷焦磷酸酶的胸苷激酶缺失的痘苗病毒用作腫瘤定向基因療法的載體。(Puhlman等，1999《人體基因療法》(Human Gene Therapy)10:649-657)。
已經描述將與腺相關的2型病毒(AAV)用于人體基因療法，然而，AAV需要輔助病毒(諸如腺病毒或皰疹病毒)用于在哺乳動物細胞內的最佳復制和包裝。(Snoeck等，1997《腎臟學實驗》(Exp.Nephrol.)5(6):514-20；Rabinowitz等，1998《生物技術最新觀點》(Curr.Opn.Biotechnol.)9(5):470-5)。不過，已經描述了在體外包裝感染重組AAV，使得該系統極有價值。(Ding等，1997《基因療法》(Gene Therapy)4:1167-1172)。已經證實親環境的逆轉錄病毒受體cDNA的AAV介導的轉移使得確定和主要的人體細胞發生親環境的逆轉錄病毒轉導。(Qing等，1997《病毒學雜志》(J.Virology)71(7):5663-5667)。已經論證了使用表達人野生型p53的AAV載體的癌癥基因療法。(Qazilbash等，1997《基因療法》(Gene Therapy)4:675-682)。還證實了使用AAV載體將基因轉入血管細胞的方法。(Maeda等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):514-521)。已經證實AAV可用作肝臟定向基因療法的合適的載體。(Xiao等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(12):10222-6)。已經證實AAV載體可用于大腦組織和中樞神經系統的基因療法。(Chamberlin等，1998《大腦研究》(Brain Res.)793:(1-2):169-75；During等，1998《基因療法》(Gene Therapy)5(6):820-7)。還將AAV載體與腺病毒載體(AdV)比較了它們的肺部基因療法和至人囊性纖維化上皮細胞的轉移。(Teramoto等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(11):8904-12)。
嵌合型AdV/逆轉錄病毒基因療法載體系統可引入有用量的各病毒以便生成非整合型AdV，使它通過逆轉錄病毒生產者細胞的中間體生成而在功能上成為整合型的。(Feng等，1997《國際生物技術》(Nat.Biotechnology)15(9):866-70；Bilbao等，1997《FASEB雜志》(FASEB J)11(8):624-34)。已經將這種新產生的有功效的基因療法載體用于靶向的癌癥基因療法。(Bibao等，1998《實驗藥物生物學進展》(Adv.Exp.Med.Biol.)451:365-74)。單一注射表達p53的AdV抑制人前列腺癌細胞皮下腫瘤結節的生長。(Asgari等，1997《國際癌癥雜志》(Int.J.Cancer)71(3):377-82)。已經描述了患晚期非小型細胞肺癌患者野生型p53的AdV介導的基因轉移。(Schuler等，1998《人體基因療法》(Human Gene Therapy)9:2075-2082)。這種相同的癌癥已經成為由AdV載體介導的p53基因替代療法的治療對象。(Roth等，1998《腫瘤學研討》(Semin.Oncol.)25(3增刊8):33-7)。AdV介導的p53的基因轉移可在體內抑制內皮細胞分化和血管生成。(Riccioni等，1998《基因療法》(Gene Ther.)5(6):747-54)。還描述了黑素瘤抗原gp75的腺病毒介導的表達作為轉移黑素瘤的免疫療法。(Hirschowitz等，1998《基因療法》(Gene Therapy)5:975-983)。AdV有助于用親環境的逆轉錄病毒感染人體細胞并提高逆轉錄病毒感染的功效。(Scott-Taylor等，1998《基因療法》(Gene Ther.)5(5):621-9)。已經將AdV載體用于至血管平滑肌細胞(Li等，1997《中國藥學雜志(英文版)》(Chin.Med.J.(Engl))110(12):950-4)、鱗狀細胞癌細胞(Goebel等，1998《耳鼻咽喉科頭頸部外科學》(Otolarynol Head Neck Surg)119(4):331-6)、食管癌細胞(Senmaru等，1998《國際癌癥雜志》(Int.J.Cancer)78(3):366-71)、腎小球系膜細胞(Nahman等，1998《藥物研究雜志》(J.Investig.Med.)46(5):204-9)、神經膠質細胞(Chen等，1998《癌癥研究》(Cancer Res.)58(16):3504-7)的基因轉移和至動物關節的基因轉移(Ikeda等，1998《風濕病學雜志》(J.Rheumatol.)25(9):1666-73)。最近，已經論證了由AcV載體介導的以導管為基礎的心包基因轉移。(March等，1999《臨床心臟病學》(Clin.Cardiol.)22(1增刊1):I23-9)。用適當控制的遺傳元件操作AdV系統要求在體內進行AdV介導的可調節的靶基因表達。(Burcin等，1999PNAS(USA)96(2):355-60)。
已經使用適合于用適用于新培斯(sindbis)病毒和SemlikiForest病毒衍生的載體的表達盒轉化的包裝細胞系開發了甲病毒屬載體用于實施人體基因療法。(Polo等，1999《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96:4598-4603)。還開發了以非細胞病變黃病毒復制子RNA為基礎的系統。(Varnavski等，1999《病毒學》(Virology)255(2):366-75)。已經將含有新培斯病毒載體的自殺HSV-TK基因用于定向進入腫瘤細胞的細胞特異性尋靶。(Iijima等，1998《國際癌癥雜志》(Int.J.Cancer)80(1):110-8)。
以人泡沫(foamy)病毒(HFV)為基礎的逆轉錄病毒載體也顯示出作為基因療法載體的前景。(Trobridge等，1998《人體基因療法》(Human Gene Therapy)9:2517-2525)。已經將泡沫病毒載體設計成用于自殺基因療法。(Nestler等，1997《基因療法》(GeneTher.)4(11):1270-7)。還將重組鼠巨細胞病毒和啟動子系統用作高水平表達的載體。(Manning等，1998《病毒學方法雜志》(J.Viro1.Meth.)73(1):31-9；Tong等，1998《雜交瘤》(Hybridoma)18(1):93-7)。
通過生產以仙臺病毒為基礎的載體將基因轉運入未分裂細胞是可行的。(Nakanishi等，1998《控釋雜志》(J.Controlled Release)54(1):61-8)。
在為可能轉化未分裂體細胞進行的其它努力中，已經研究了慢病毒載體。已經描述了使用以復制缺陷的人免疫缺陷病毒(HIV)為基礎的載體進行的囊性纖維化基因療法。(Goldman等，1997《人體基因療法》(Human Gene Therapy)8:2261-2268)。還論證了通過慢病毒載體轉運入肝臟和肌肉的基因的持續表達。(Kafri等，1997《國際遺傳學》(Nat.Genet.)17(3):314-7)。不過，對安全性的關注是主要的且對改進載體的開發也在迅速進行中。(Kim等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(2):994-1004)。HIV LTR和Tat檢驗產生了有關開發載體基因組的結構的重要信息。(Sadaie等，1998《藥物病毒學雜志》(J.Med.Virol.)54(2):118-28)。因此，目前對以有效HIV為基礎的載體的遺傳需求得到了更好的理解。(Gasmi等，1999《病毒學雜志》(J.Virol.)73(3):1828-34)。已經描述了自失活載體或條件包裝細胞系。(例如，Zuffery等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(12):9873-80；Miyoshi等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(10):8150-7；Dull等，1998《病毒學雜志》(J.Virol.)72(11):8463-71；和Kaul等，1998《病毒學》(Virology)249(1):167-74)。已經證實了由HIV載體對人淋巴細胞和CD34+細胞的有效轉導。(Douglas等，1999《人體基因療法》(Human Gene Ther.)10(6):935-45；Miyoshi等，1999《科學》(Science)283(5402)；682-6)。已經證實了由貓免疫缺陷病毒(FIV)慢病毒載體對未分裂人細胞的有效轉導，這種轉導可將使用以HIV為基礎的載體所涉及到的安全性問題降到最低限度。(Poeschla等，1998《天然藥物》(Nature Medicine)4(3):354-357)。已經論證了人血單核細胞通過FIV載體的生產性感染。(Johnston等，1999《病毒學雜志》(J.Virol.)73(3):2491-8)。
盡管許多病毒載體難以控制且所插入的DNA的能力受到限制，但是已經研究了這些限制和缺陷。例如，除簡易病毒包裝細胞系外，還開發了來源于人皰疹病毒、單純皰疹1型病毒(HSV-1)和EB病毒(EBV)的微小病毒載體以便簡化遺傳物質的操作和病毒載體的生產。(Wang等，1996《病毒學雜志》(J.Virology)70(12):8422-8430)。已經預先證明了連接質粒可簡化外源DNA插入不依賴于輔助病毒的逆轉錄病毒載體的過程。(1987，《病毒學雜志》(J.Virology)61(10):3004-3012)。
盡管還描述了幾種非病毒載體，但是病毒載體并不是實施基因療法的唯一工具。已經證實以應用表皮生長因子/DNA polyplex(EGF/DNA)為基礎的靶向的非病毒基因轉運載體可產生有效的和特異性的基因轉運。(Cristiano,1998《抗癌研究》(Anticancer Res.)18:3241-3246)。已經使用陽離子型脂質體論證了血管系統和CNS的基因療法。(Yang等，1997《神經外傷雜志》(J.Neurotrauma)14(5):281-97)。還使用陽離子型脂質體完成了胰腺炎的瞬時基因療法。(Denham等，1998《外科學年鑒》(Ann.Surg.)227(6):812-20)。已經證實用于基因轉運的以脫乙酰殼多糖為基礎的載體/DNA復合物是有效的。(Erbacher等，1998《藥物研究》(Pharm.Res.)15(9):1332-9)。已經描述了以terplex系統為基礎的非病毒DNA轉運載體。(Kim等，1998,53(1-3):175-82)。還將病毒顆粒包被的脂質體復合物用于實現基因轉移。(Hirai等，1997《生物化學和生物物理學研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)241(1):112-8)。
已經論證了使用直接給腫瘤注射編碼胸苷激酶基因的非病毒T7載體的癌癥基因療法。(Chen等，1998《人體基因療法》(Human GeneTherapy)9:729-736)。質粒DNA的制備對直接注射的基因轉移來說是重要的。(Horn等，1995《人體基因療法》(Hum.Gene Ther.)6(5):656-73)。特別采用修飾的質粒載體用于直接注射。(Hartikka等，1996《人體基因療法》(Hum.Gene Ther.)7(10):1205-17)。
因此，各種基因轉移/基因療法載體和構建體在本領域中是公知的。可以將這些載體便利地用于本發明的方法。通過合適的操作、使用用于將可操作連接的src(活性或失活的)插入所選擇的表達/轉運載體的重組DNA/分子生物學技術，可以生產用于實施本發明的許多等價載體。E．用于調制血管生成的方法本發明提供了一種用于調制組織中與疾病進程或疾病狀況相關的血管生成且由此對依賴于血管生成的組織中的情況起作用的方法。一般來說，該方法包括對與疾病進程或疾病狀況相關的組織給予一種組合物的步驟，所述的組合物含有調制血管生成量的Src蛋白質或表達活性或失活Src的核酸載體。
正如本文所述，任意的不同組織或由器官化組織構成的器官可以維持包括皮膚、肌肉、腸、結締組織、關節、骨等組織疾病中的血管生成，在這些組織中血管可以在生血管刺激時侵入。
理想的情況是按照本發明在其很多實施方案中治療的患者是人患者，不過可以理解的是本發明的機理表明本發明對于所有哺乳動物均是有效的，所以術語“患者”的含義是包括所有的哺乳動物。在本發明的上下文中，將哺乳動物理解為包括需要對與涉及血管生成的疾病相關的組織進行治療的任何哺乳動物種類，特別是農業用和家養哺乳動物種類。
因此，該方法包括對患者給予治療有效量的藥理上可接受的組合物的步驟，所述的組合物含有Src蛋白質或用于在實施本發明方法中表達Src蛋白質的DNA載體。
正如本文進一步所述的，Src蛋白質的給藥劑量范圍取決于蛋白質的形式及其功效。該劑量大到足以產生所需的血管生成和由血管生成介導的疾病癥狀得到改善的作用。然而，該劑量不應大到導致不良的副作用，諸如高粘滯性綜合征、肺水腫、充血性心衰等。一般來說，所述的劑量隨患者的年齡、疾病情況、患者的性別以及患者體內疾病的發展程度而改變并且可以方便地由本領域技術人員來確定。還可以由各臨床醫師根據所有并發癥情況調整所述的劑量。
治療有效量是足以在受治療的組織中產生可檢測到的血管生成調制作用的Src蛋白質或編碼(活性或失活的)src蛋白質的核酸的用量，即調制血管生成的量。可以通過如本文所述的CAM檢測試驗或通過本領域技術人員所公知的其它方法來測定對血管生成的調制作用。
通過注射或通過在一段時間內連續輸注可以非腸道給予Src蛋白質或表達Src蛋白質的核酸載體。盡管一般可以通過全身給藥而在體內接觸要治療的組織，因此最常見的情況是通過靜脈內給予治療組合物來治療它們，但是其它組織和轉運方式也是所關注的。因此，可以通過靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、腔內、經皮來給予并可以通過蠕動方式來送遞本發明的組合物。
常規下可以通過靜脈內給予諸如例如通過注射單位劑量來給予含有Src蛋白質或表達Src蛋白質的核酸載體的治療組合物。術語“單位劑量”在指本發明的治療組合物使用時指的是適合作為用于治療對象單位劑量的物理分散單位，各單位含有預定量的計算為產生所需治療作用的活性物質以及所需稀釋劑即載體或賦形劑。
在一個優選的實施方案中，按照單一劑量方式通過靜脈內給予所述試劑。通過下列步驟可以完成局部給藥直接注射或通過利用解剖分離隔室、分離靶器官系統的微循環、循環系統中再灌注或與患病組織相關的血管系統靶區的以導管為基礎的暫時閉合。
按照與劑型匹配的方式和以治療有效量給予所述的組合物。所給予的量和計時取決于所治療的治療對象、利用活性組分的治療對象系統的容量和所需治療作用的程度。需要給予的活性組分的精確用量取決于醫師的判斷且對每一個個體來說均是特定的。然而，用于全身施用的合適劑量范圍在本文中公開并且取決于給藥途徑。合適的給藥方案也是可變的，不過一般是初次給藥之后通過接下來的注射或其它給藥方式在1小時或1小時以上的間隔給予重復劑量。另一方面，所關注的是足以維持體內療法特定范圍內血藥濃度的連續靜脈輸注方式。
1．血管生成的抑制血管生成的抑制在各種稱作生血管疾病的疾病中是重要的。這類疾病包括但不限于炎癥疾病，諸如免疫或非免疫炎癥；慢性關節風濕病和銀屑病；與不適當或不適宜的血管侵害相關的疾病，諸如糖尿病性視網膜病、新血管形成性青光眼、再狹窄、動脈粥樣硬化斑中的毛細管增生和骨質疏松；以及與癌癥相關的疾病，諸如需要新血管形成以維持腫瘤生長的實體腫瘤、實體轉移瘤、血管纖維瘤、晶體狀后纖維組織形成、血管瘤、卡波西肉瘤等癌癥。
因此，抑制組織中與疾病相關的血管生成的方法可改善所述疾病的癥狀，并且可以治愈疾病，這取決于疾病狀況。在一個實施方案中，本發明關注組織中本身與疾病狀況相關的血管生成的抑制。通過不同的方法可以評估組織中血管生成的程度和由此由本方法實現的抑制程度。
因此，在一個相關的實施方案中，所治療的組織是炎癥組織且所抑制的血管生成是其中存在炎癥組織新血管形成的炎癥組織的血管生成。在這類情況中，本方法關注關節炎組織(諸如在患有慢性關節風濕病的患者體內)、免疫或非免疫炎癥組織中、銀屑病組織等中的血管生成的抑制。
在另一個相關的實施方案中，所治療的組織是患有諸如糖尿病性視網膜病、黃斑變性或新血管性青光眼這樣的視網膜疾病患者的視網膜組織且所抑制的血管生成是其中存在視網膜組織新血管形成的視網膜組織的血管生成。
在另一個相關的實施方案中，所治療的組織是患有實體腫瘤、轉移瘤、皮膚癌、乳腺癌、血管瘤或血管纖維瘤和類似癌癥的患者的腫瘤組織且所抑制的血管生成是其中存在腫瘤組織新血管形成的腫瘤組織的血管生成。可以由本發明方法治療的典型實體腫瘤組織包括肺、胰、乳腺、結腸、喉、卵巢和類似組織。抑制腫瘤組織血管生成是一個特別優選的實施方案，因為新血管形成在腫瘤生長中起重要作用。在沒有腫瘤組織新血管生成的情況下，所述的腫瘤組織不會獲得所需的營養物、生長減慢、另外出現生長停止、退化并最終發生使腫瘤死亡的壞死。
換句話說，本發明提供了一種通過按照本方法抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤新血管形成的方法。類似地，本發明提供了一種通過實施抑制血管生成的方法來抑制腫瘤生長的方法。
本方法還對抗轉移瘤的形成特別有效，因為(1)轉移瘤的形成需要原始腫瘤的血管形成以便轉移的癌細胞可以離開原始腫瘤和(2)它們在次級部位中的建立需要新血管形成以便維持轉移瘤的生長。
在一個相關的實施方案中，本發明關注本方法與其它療法諸如常用的直接對實體腫瘤和用于控制轉移瘤建立的化療結合的實施。一般在化療過程中或之后進行血管生成抑制劑的給藥，不過，優選在腫瘤組織對通過誘發經對所述的腫瘤組織供血和營養物而恢復血管生成而對毒性侵害起反應時進行的化療方案后抑制血管生成。此外，優選在已經將實體腫瘤作為預防轉移瘤而切除的外科手術后施用血管生成抑制方法。
既然本方法用于抑制腫瘤的新血管形成，那么該方法也可以用于抑制腫瘤組織生長、抑制轉移瘤形成并使建立的腫瘤退化。
再狹窄是平滑肌細胞(SMC)遷移和增殖入阻礙血管成形術成功的經皮跨腔冠狀血管成形術部位處的組織的過程。可以將這種再狹窄過程中SMC’s的遷移和增殖看作由本方法抑制的血管生成過程。因此，本發明還關注通過按照本方法抑制血管成形術后患者血管生成來抑制再狹窄的方法。為了抑制再狹窄，一般在血管成形術后給予失活的酪氨酸激酶，因為冠脈壁受到再狹窄的危害，給藥持續約2天至約28天，且更常見的情況是在該手術后的約前14天給藥。
用于在組織中抑制與疾病狀況相關的血管生成且由此還用于實施涉及血管生成的疾病的治療方法的本方法包括使發生血管生成或有發生血管生成危險的組織與一種組合物接觸的步驟，所述的組合物含有治療有效量的失活的Src蛋白質或表達該蛋白質的載體。
在與治療組合物開始接觸后的前7天發生血管生成的抑制和腫瘤退化。與失活的Src蛋白質的附加或延長接觸優選進行7天至6周，優選約14天至28天。
2．血管生成的強化在需要促進或強化血管生成的情況中，對組織給予活性Src蛋白質是有用的。給藥的途徑和計時可與上文所述用于抑制的方法相類似。
F．治療組合物本發明關注用于實施本文所述治療方法的治療組合物。本發明的治療組合物含有藥理上耐受的載體與溶于或分散于其中作為活性組分的Src蛋白質或能夠表達如本文所述Src蛋白質的載體。在一個優選的實施方案中，當為達到治療目的而對哺乳動物或人患者給藥時，所述的治療組合物不是免疫原性的。
本文所用的術語“藥物上可接受的”、“藥理上耐受的”及其語法上的變化形式在它們指的是組合物、載體、稀釋劑和試劑時可以互換使用并代表能夠給予或對哺乳動物給藥而不會產生諸如惡心、頭暈、胃腸不適等不期望的藥理作用的物質。
含有溶于或分散于其中的活性組分的藥物組合物制劑在本領域中是眾所周知的并且不基于制劑來限定。一般將這類組合物制備成注射用液體溶液或混懸液，不過，也可以制備適合于在應用前制成溶液或混懸液這樣液體形式的固體劑型。還可以將制劑乳化或制成脂質體組合物。
可以將活性組分與藥物上可接受和可與所述活性組分相容的賦形劑以適用于本文所述治療方法的用量混合。例如，合適的賦形劑是水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其混合物。此外，如果需要，所述的組合物可以含有少量提高所述活性組分有效性的輔助物質諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等。
本發明的治療組合物可以在其中包括任意成鹽成分的藥物上可接受的鹽。藥物上可接受的鹽包括與諸如例如鹽酸或磷酸這樣的無機酸或諸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等這樣的有機酸形成的酸加成的鹽(與多肽的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽也可以衍生于諸如例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵這樣的無機堿和諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等這樣的有機堿。
用于活性組分的藥理上耐受的載體在本領域中是眾所周知的。液體載體的例子是不含包括活性組分和水在內的物質或含有諸如生理pH值下的磷酸鈉、生理鹽水或兩者均含有(諸如磷酸緩沖鹽水)這樣的緩沖液的無菌水溶液。再進一步說，含水載體可以含有一種以上的緩沖鹽以及諸如氯化鈉和氯化鉀這樣的鹽、右旋糖、聚乙二醇和其它溶質。
液體組合物還可以含有包括水和不包括水在內的液相。例示的這類附加液相是甘油、諸如棉子油這樣的植物油和水-油乳劑。
治療組合物含有本發明調制血管生成量的Src蛋白質或表達有效量的Src蛋白質的充分重組DNA表達載體，一般將其配制成含有按總治療組分物重量計至少0.1重量百分比的Src蛋白質。重量百分比是Src蛋白質與總組合物的重量比。因此，例如，0.1重量百分比是每100g總組合物中含0.1g的Src蛋白質。對于DNA表達載體來說，給藥量取決于所述表達載體的特性、所治療的組織和類似考慮因素。G．制品本發明還關注一種用于提供本發明Src蛋白質的標記容器的制品。制品包括帶有用于所治療疾病的合適標記的包裝物質和包含在所述包裝物質內的藥劑。
制品中的藥劑是適合于提供Src蛋白質并配制成如本文根據公開的適應證所述的藥物上可接受的劑型的本發明組合物的任何一種。因此，該組合物可以含有Src蛋白質或能夠表達Src蛋白質的DNA分子。該制品中包含足以用于治療本文所述疾病的量的藥劑，可以是單位劑量或多重劑量。
包裝物質帶有指示其中所含的藥劑的應用的標記，例如用于通過抑制或強化血管生成而有助于治療疾病和本文公開的類似疾病。該標記可以進一步包括為銷售所需要的使用說明和相關信息。所述的包裝物質可以包括用于儲存藥劑的容器。
本文所用的術語包裝物質指的是諸如玻璃、塑料、紙、箔等能夠將藥劑保存在固定裝置中的物質。因此，例如，所述的包裝物質可以是塑料或玻璃小瓶、層狀包封物和用于包含包括藥劑在內的藥物組合物的容器。
在優選的實施方案中，所述的包裝物質包括一種標記，它是描述制品含量和其中所含藥劑用途的明確表示。
圖1給出編碼野生型(即內源性)雞c-Src的cDNA序列(SEQ IDNO.:2)，圖2給出編碼的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO.:3)。從cDNA的第112-1713位核苷酸翻譯編碼的蛋白質序列。相應于人c-Src cDNA的核酸序列(SEQ ID NO.:4)和編碼的氨基酸殘基(SEQ IDNO.:5)序列分別如附圖3和4中所示。對于人蛋白質序列來說，編碼序列開始于cDNA的第134-1486位核苷酸。
制備野生型以及大量突變型c-Src cDNA。使用Kaplan等在《歐洲分子生物學協會雜志》(EMBO J.)13:4745-4756(1994)中所述的定向誘變來制備突變型c-Src構建體。編碼用于本發明方法的突變型c-Src蛋白質的突變型c-Src構建體如Kaplan等在上述相同文獻中描述。Kaplan等描述了各種突變型c-Src構建體和用于實施本發明的編碼蛋白質。例如，Kaplan等在其附圖1中描繪了雞c-src等位基因的幾種產物，包括SrcA和Src251。
描述了起調制血管生成作用的兩類c-Src。如上所述，一類含有增加血管生成的Src分子且由此被看作是活性蛋白質。本發明中證實了誘發血管生成的野生型Src以及各種突變體。在本文中根據體內誘發血管生長且由此增加腫瘤重量的能力起作用的野生型c-src的一種優選突變是在527位酪氨酸改變成苯丙氨酸的527位氨基酸(aa)殘基上具有點突變的SrcA突變體。該位點通常是用于通過稱作激酶CSK的c-Src激酶負調節的位點。當CSK可使野生型src中的aa527磷酸化時，蛋白質是失活的。然而，在突變型SrcA中，調節的酪氨酸轉化成苯丙氨酸，由此不用使蛋白質通過磷酸化失活而賦予蛋白質在構成上(即永久地)的活性。
還證實src中的突變對血管生成具有反向調制作用，從而抑制血管生成而非剌激它。將這類突變稱作失活src突變。還將具有提供這種抑制活性的突變的蛋白質稱作顯性失活的Src蛋白質即，它們抑制新血管形成，包括由Src內源性活性所導致的以及由生長因子刺激產生的提高的Src活性所導致的。因此，本發明野生型c-src的某些突變體就其阻斷血管生長且例如由此降低體內腫瘤重量的能力來說還起顯性失活的作用。
這類優選的抑制性c-Src蛋白質包括僅表達Src前251個氨基酸的Src251。這種構建體缺乏完整的激酶結構域且由此稱作“激酶死亡”src蛋白質。第二種構建體是295位賴氨酸氨基酸殘基突變成甲硫氨酸的Src(K295M)突變體。這種激酶結構域中的點突變防止ATP結合并且還阻斷與血管細胞和腫瘤細胞信號傳輸和增殖相關的激酶依賴性Src功能。
例如，對于527位殘基上的突變來說，只要產生的突變氨基酸殘基不是酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，那么本發明關注的是在期望位點另一種氨基酸的存在將產生具有所需活性，促進血管生成調制活性的Src蛋白質。
就點突變而言，任何導致所需抑制或刺激活性的突變體均是本發明應用中所關注的。還關注的是將所需src蛋白質(突變體或其片段)與表達的氨基酸標記、抗原表位、熒光蛋白或其它這類蛋白質或肽類合并的融合蛋白構建體，條件是src蛋白質的所需調制作用是完整的。
表ⅠSrc/突變體Src功能對血管生成的作用c-Src + 活性刺激SrcA(T527F) + 活性刺激Src527(點) + 活性刺激Src251 - 失活抑制Src(截短物) - 失活抑制Src(K295M) - 失活抑制Src295(點) - 失活抑制用于本發明的一種優選表達構建體是RCASBP(A)構建體(SEQ IDNO.:1)。這種表達載體以一系列含有改善滴度的強化Bryan聚合酶(BP)的復制感受態禽類肉瘤病毒為基礎并且對在正常鳥細胞上表達的A型包膜糖蛋白具有特異性(《細胞生物學方法綜述》(Reviewedin Methods in Cell Biology),52:179-214(1997)；還參見Hughes等，1987《病毒學雜志》(J.Virol.)61:3004-3012；Fekete&Cepko,1993細胞分子生物學》(Mol.Cellular Biol.)13(4):2604-2613；Itoh等，1996《發展》(Development)122:291-300；和Stott等，1998《生物技術》(BioTechniques)24:660-666)。RCASBP(A)的全序列(SEQ ID NO.:1)在所附的序列表中給出且該構建體的限制酶圖譜描繪為附圖10，在本文中稱作RCAS。
原始Src251構建體由Dr.Pam Schwartzberg在Dr.HaroldVarmus’s實驗室中的NIH亞克隆。簡單地說，通過將含有NotⅠ-BstB1-NotⅠ限制位點的接頭插入Src251的5’末端中唯一NotⅠ位點來完成對src cDNA序列的克隆以便于表達它。Src帶有3’末端上的唯一ClaⅠ位點。用BstB1和ClaⅠ消化Src251產生BstB1-ClaⅠ片段，然后將該片段連入RCASBP(A)上的ClaⅠ位點。BstB1的突出端要求用沒有用ClaⅠ重新切割的ClaⅠ突出端連接。通過首先用NotⅠ和ClaⅠ消化含有Src251的RCAS載體(在DAM+背景中)在上述載體中方便地獲得適用于實施本發明的src構建體以便插入類似消化的Src cDNA。因此，將這種含有Src251的原始RCASBP(A)構建體進一步用于將如上述和Kaplan等(1994，《歐洲分子生物學協會雜志》(EMBO J.)13(20):4745-4756)所述的所有其它Src構建體通過經Src251構建產生的NotⅠ-ClaⅠ片段亞克隆入RCASBP(A)。為了在cDNA中產生所需的c-src突變，應用本領域技術人員所熟知的標準定向誘變過程。還將設計成引入所需突變的PCR引物用限制位點設計以便促進隨后的克隆步驟。通過以Src的雞、人和類似同系物的公知cDNA序列為基礎的PCR擴增技術和隨后形成新構建體從核酸構建體中刪除編碼Src的核酸序列的完整片段。
在本發明的一個實施方案中，用于擴增src核酸的3’PCR引物還編碼符合讀框的序列。應用這種引物將9E10-myc表位標記添加到隨后的Src構建體的羧基末端。
在Src的251位氨基酸后添加下列氨基酸以便產生含有9E10-myc表位標記的載體構建體VDMEQKLIAEEDLN(SEQ ID NO.:6)。對每一種構建體進行兩種獨立的PCRs并獲得類似的結果。還通過證實克隆的推定DNA序列的PCR來對由PCR構建的所有突變體構建體進行測序。用于本發明表達系統的野生型和突變型Src cDNAs還商購自銷售鳥以及人src和幾種激酶死亡和激活突變型的Upstate BiotechLaboratories,Lake Placid,NY。
另一種用于表達本發明Src蛋白質的表達載體還包括如美國專利號4,797,368、5,173,414、5,436,146、5,589,377和5,670,488中所述的腺病毒載體。用于轉運Src調制蛋白質的另一種方法包括用如美國專利號5,675,954中所述的非病毒載體系統轉運Src cDNA和如美國專利號5,589,466中所述的將cDNA本身作為裸DNA轉運。本發明的構建體的轉運也不限于局部施用如下CAM試驗系統中所述的病毒載體。例如，還將病毒載體制劑通過靜脈內注射以用于系統性轉運入血管床。這些載體還通過局部對腫瘤注射(作為一個實例)而可定向至血管形成增加的部位。
對體外表達的蛋白質所關注的是它在通過用于轉運蛋白質或多肽類的方法表達和純化選擇的Src蛋白質后的轉運。一種這樣的方法包括諸如美國專利號4,356,167、5,580,575、5,542,935和5,643,599中所述的脂質體轉運系統。用于表達和/或轉運本發明Src蛋白質的其它載體和蛋白質轉運系統對于本領域技術人員來說是眾所周知的。2．未處理的雞尿囊絨膜(CAM)的特征記述A．CAM的制備在正常胚胎血管生成導致成熟血管形成后可以在雞尿囊絨膜(CAM)上誘發血管生成。已經證實所誘發的血管生成對由Leibovich等在《自然》(Nature)329:630(1987)和Ausprunk等在《美國病理學雜志》(Am.J.Pathol.)79:597(1975)中所述的特異性細胞因子或腫瘤斷片有反應。由隨后用于誘發血管生成及其抑制的雞胚胎制備CAMs。10日齡的雞胚胎獲自McIntyre Poultry(Lakeside,CA)并將其在37℃和60％濕度下進行培養。使用小型工具鉆(Dremel,Division of Emerson Electric Co.Racine WI)通過直接置于氣囊上的卵邊緣上的卵殼打一個小孔。在沒有預先通過對卵透光檢驗確定的胚胎血管的區內的卵寬側面上鉆第二個孔。將負壓施于原始孔，產生從卵殼膜中拉出并在CAM上生成假氣囊的CAM(尿囊絨膜)。使用小型砂輪(Dremel)在滴落的CAM上的卵殼上打入一個1.0厘米(cm)×1.0cm的正方形開孔。該小開孔使得可以直接進入下面的CAM。
然后將所得的CAM制備物在胚胎發生6日時使用，該階段由活性新血管形成來標注，對反映出用于評估對胚胎血管形成的作用或在血管生成已經減退的10日胚脂血管生成時使用的模式的CAM沒有進行附加的處理。由此將后一種制備物在本發明中用于誘發對細胞因子處理或如下所述的腫瘤接觸起反應的重新開始的血管生成。3．CAM血管生成的檢測試驗A．由生長因子誘發的血管生成已經證實通過細胞因子或生長因子可以誘發血管生成。
通過在沒有血管區中的9或10日齡雞胚胎的CAM上放置用含有2微克/毫升(μg/ml)重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)(Genzyme,Cambridge,MA)的Hanks平衡鹽溶液(HBSS,GIBCO,Grand Island,NY)飽和的5毫米(mm)×5mm Whatman濾片(Whatman1號濾紙)來誘發血管生成且隨后將開孔用膠帶密封。其它濃度的生長因子對誘發血管生長也有效。對于通過靜脈注射拮抗劑評估血管生成抑制情況的試驗來說，首先在成纖維細胞生長培養基中用1-2μg/ml bFGF或VEGF誘發血管生成。在72小時后通過顯微照相術監測血管生成。
B．胚胎血管生成用于評估血管生成抑制劑對天然形成的胚胎新血管形成的作用的CAM制備物是如上所述的6日齡胚胎雞的胚胎。在這一發育階段，使血管重新生長且由此提供用于評估由本發明Src蛋白質的血管生成調制作用的有用系統。除在第6天胚胎而不是第9或10天胚胎時進行該試驗外，如上所述制備CAM系統。4．根據CAM檢測試驗測定的血管生成調制作用為了評估Src蛋白質對血管生成的作用，對10日齡雞CAM制備物進行下列檢測試驗。將如實施例1中所述制備的5μg的RCAS構建體轉染入雞無限增殖化成纖維細胞系DF-1(Doug Foster的贈品，U.of Minn.)。該細胞系以及初級雞胚胎成纖維細胞系能夠產生病毒，不過DF-1細胞系產生較高滴度。在無血清CLM培養基[組成用DMSO、葉酸、谷氨酸和MEM維生素溶液補充的F-10培養基基質]中從分會合DF-1生產者細胞系中收集病毒上清液。通過在4℃下以22,000rpm超離心2小時來濃縮35ml的病毒上清液。將這些濃縮的病毒沉淀重新懸浮于不含血清的CLM培養基中的1/100原始體積中、分成等分并在-80℃下保存。通過順序稀釋具有編碼綠色熒光蛋白(GFP)稱作RCAS-GFP的核苷酸序列的對照病毒載體、在培養48-72小時的初級雞胚胎成纖維細胞上感染來估計滴度。在濃縮后獲得的病毒原種溶液的滴度通常超過108I.u./ml。為了使用病毒原種溶液進行CAM檢測試驗，在95％乙醇中用3mg/ml醋酸可的松制備醋酸可的松浸泡持續30分鐘的6mm直徑的Whatman濾片。將該濾片在層流罩超靜臺中干燥且然后用20μl的病毒原種溶液/片浸泡10分鐘。將這些片置于9或10日齡雞胚胎的CAM上并用賽璐玢膠帶密封并在37℃下培養18-24小時。接著以5μg/ml的濃度將模擬物PBS或生長因子加入到20μl體積合適病毒原種溶液中的CAM上作為對CAM組織的附加病毒強化。72小時后，收集CAMs并檢驗通過對片下CAM中分支點數量的雙盲計數所測定的生血管指數的改變。為了進行激酶檢測試驗，在RIPA中收集片下的組織、用自動研磨機將其勻化并從等量的總蛋白質中Src免疫沉淀且使用FAK-GST融合蛋白作為底物進行體外激酶檢測試驗。為了進行免疫熒光研究，用冷藏劑OCT冷凍片下的CAM組織、切成4μm的片、在丙酮中固定1分鐘、在3％正常山羊血清中培養1小時、隨后在如上所述的初級家兔抗磷酸化ERK抗體中培養(Eliceiri等《細胞生物學雜志》(J.Cell.Biol.)140:1255-1263(1998))、在PBS中洗滌并用熒光二級抗體進行檢測。
A．通過bFGF或VEGF激活內源性Src為了評估生長因子在調制血管生成的Src活性的作用，進行下列檢測試驗。裂解已經與bFGF或VEGF(2μg/ml)接觸2小時的10日齡雞CAMs的組織提取物。從等量的總蛋白質中免疫沉淀內源性Src且使用FAK-GST融合蛋白作為底物使其進行體外免疫復合激酶檢測試驗、電泳并轉到硝化纖維上。
試驗結果如附圖5中所示，其中與在CAM檢測試驗中表現出基線Src活性的未處理(模擬物)樣品相比，在用bFGF或VEGF處理增加凝膠密度的過程中Src活性增加明顯。導致內源性Src活性增加約2倍的bFGF和VEGF存在于CAM中。還用抗-Src抗體作為Src和IgG含量相等的加樣對照來探測上述激酶試驗印跡。
B．逆轉錄病毒介導的SrcA的基因表達對雞CAM中血管生成的作用進行下列試驗以便評估突變型Src蛋白質對CAM制備物中血管生成的作用。為了進行該試驗，在實施上述方案后使9日齡雞CAMs與表達逆轉錄病毒的RCAS-SrcA或RCAS-GFP或緩沖液接觸72小時。
試驗結果如附圖6中所示，其中如上所述對血管生成的水平進行定量。如附圖6B中所示用立體顯微鏡記錄有代表性的顯微照片(4x)。基線內源性Src活性具有的生血管指數約為50。相反，用在527位氨基酸殘基上具有從酪氨酸至苯丙氨酸的點突變的逆轉錄病毒載體表達的RCAS-SrcA處理的CAMs導致提高(誘發)的血管生成的生血管指數約為90。Src-A介導的血管生成的增加在附圖6B中所示的照片中是明顯的。
C．SrcA的逆轉錄病毒表達激活血管MAP激酶磷酸化在上述和本文所述的試驗過程后還評估了SrcA與生長因子VEGF和PMA相比較對血管MAP激酶磷酸化的作用。將與VEGF或PMA(另一種可比擬濃度的促分裂原)接觸30分鐘的10日齡的雞CAMs的組織提取物與用表達SrcA的逆轉錄病毒感染48小時的那些組織提取物進行比較。然后(than)從等量的總蛋白質提取物中免疫沉淀Src且使用FAK-GST融合蛋白作為底物使其進行體外免疫復合激酶檢測試驗、電泳并轉到硝化纖維上。
試驗結果如附圖7A中所示，其中未處理的CAMs(NT)表現出基線內源性Src介導的血管MAP激酶磷酸化。VEGF和PMA導致比基線增加約2倍。相反，SrcA比用未處理樣品觀察到的活性提高約5-10倍。
還通過用如附圖7B中所示的抗-磷酸-ERK抗體進行的免疫印跡對上述完整組織裂解物的等分試樣測定了內源性ERK磷酸化程度。為了進行這種評估，用模擬物RCAS或表達SRCA的RCAS感染10日齡的CAMs。2天后，將CAMs解剖、在OCT中低溫冷藏并切成4μm的片。將切片用抗磷酸化ERK抗體(New England Biolabs)免疫染色、洗滌并用山羊抗家兔FITC接合的二級抗體檢測。在穩定的CCD照相機(Princeton Inst.)上捕捉熒光影象。顯微照片顯示出用SrcA處理的制備物的免疫熒光比模擬物對照增強。
D．在VEGF而非bFGF誘發的血管生成過程中對Src活性的選擇性需求為了評估Src調制活性對生長因子誘發的血管生成的作用，進行下列試驗。使9日齡雞CAMs與表達稱作如上所述的Src251或SrcK295M的顯性失活Src突變體的逆轉錄病毒制備物接觸。將RCAS-Src251或對照品RCAS-GFP逆轉錄病毒或緩沖液CAMS處理20小時且然后在有或沒有bFGF或VEGF存在的情況下再培養72小時。
如上所述定量的血管生成的水平如附圖8A中所示。用立體顯微鏡記錄附圖8B中所示的有代表性的顯微照片(6x)。附圖8C解釋了用抗-Src抗體探測的印跡以便證實與模擬物處理相比Src251在轉染細胞中的表達。
上述試驗結果表明在有RCAS-GFP對照品存在的情況下bFGF和VEGF處理的CAMS誘發的血管生成超過使用模擬物或未處理CAM制備物觀察到的Src介導的基線血管生成。所表達的顯性失活突變體Src251在抑制VEGF誘發的血管生成恢復至基線水平方面是有效的，而在抑制bFGF介導的血管生成方面無效。附圖8B中所示的顯微照片以圖的方式證實了附圖8A中所示的數據。因此，當用VEGF誘發血管生成時，逆轉錄病毒表達的Src251是一種有效的血管生成抑制劑。
在本發明中關注與下面實施例中所述的其它血管生成模型一起施用本發明的Src蛋白質。5．用由體內家兔眼模型試驗確定的Src調制劑使腫瘤組織生長退化在以眼角膜為典型實例的天然透明結構中可以觀察到Src調制劑對生長因子誘發的血管生成的作用。新血管從供血豐富的角膜邊緣生長至正常情況下無法供血的角膜中心。血管生成刺激物諸如bFGF在施用于角膜時可誘發新血管從角膜的邊緣生長。施用于角膜的血管生成拮抗劑抑制新血管從角膜邊緣生長。因此，角膜通過從角膜邊緣進入易觀察的堅韌膠原包裹的角膜組織的內皮細胞侵害而經受了血管生成。家兔眼模型試驗由此提供了用于直接觀察在直接將化合物植入眼角膜后的刺激情況和抑制血管生成的體內模型。
A．體內家兔眼模型試驗1)由生長因子誘發的血管生成在體內家兔眼模型試驗中用生長因子bFGF或VEGF誘發血管生成并如下部分中所述。
a．含有生長因子和單克隆抗體的Hydron顆粒的制備如D’Amato等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),91:4082-4085(1994)中所述制備含有生長因子的Hydron聚合物顆粒。各顆粒含有650ng的單獨與硫糖鋁(Carafet,MarionMerrell Dow Corporation)結合以穩定生長因子并確保其緩慢釋放入周圍組織中的生長因子。此外，制備含有如上所述所需的表達Src的逆轉錄病毒的hydron顆粒。所述顆粒在具有穿入表面2.5mm芯的特殊制備的特氟隆梭芯中澆鑄。將約12μl澆鑄物質放入各梭芯并在無菌通風櫥中聚合過夜。然后通過紫外線照射對顆粒滅菌。接著如上所述評估Src蛋白質的作用。6．由嵌合鼠人體試驗測定的用Src調制劑的體內使腫瘤組織生長退化通過用人新生兒包皮取代來自SCID鼠的部分皮膚來生成體內嵌合鼠人模型。主要如Yan等在《臨床研究雜志》(J.Clim.Invest.)91:986-996(1993)中所述制備體內嵌合鼠人模型。概括地說，通過手術從SCID小鼠(6-8周齡)中取出2cm2的正方形面積的皮膚并用人包皮替換。麻醉小鼠并通過刮削從外側腹部區的每一側上的5cm2面積中取下毛發。通過將全厚度的皮膚向下取至筋膜來制備2cm2的兩個環狀移植物床。將來源于人新生兒包皮的相同大小的全厚度人皮膚移植物放在傷口床上并在該位置上縫合。用與皮膚縫合的Band-Aid覆蓋移植物。還將微孔布帶用于覆蓋傷口。
將M21-L人黑素瘤細胞系或MDA23.1乳腺癌細胞系(ATCC HTB26；使用mAb LM609的組織切片的免疫反應性為αvβ3陰性)用于在SCID小鼠上的人皮膚移植物上形成人實體腫瘤。將5×106M21-L或MDA23.1細胞的單細胞懸浮液經皮內注入人皮膚移植物。然后觀察小鼠2-4周以便使人腫瘤生長至可測量。
在建立可測量的腫瘤后，將本發明的逆轉錄病毒制劑或PBS注入小鼠尾靜脈。2-3周的期限后，切下腫瘤并通過重量和組織學進行分析。然后評估本發明表達的Src蛋白質對該腫瘤的作用。7．由CAM試驗測定的用Src調制劑的人腫瘤組織生長的體外退化腫瘤生長取決于血管生成(Folkman,1992；Weidner等，1991；Brooks等，1994b)。實際上，近期的報導提示腫瘤生長對VEGF受體拮抗劑的抗生血管作用敏感(Kim等，1993)。因此，我們檢驗了通過轉運激酶缺失的Src251而產生的血管生成抑制作用是否會影響人成神經管細胞瘤(DAOY)即一種公知可產生VEGF和極少bFGF的高度生血管的腫瘤的生長(數據未顯示)。
在主要如上所述的雞CAM中進行3和6日DAOY成神經管細胞瘤生長試驗(Brooks等，1994)。洗滌在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培養的5×106DAOY細胞并將其接種在10日胚胎的CAM上以便產生DAOY腫瘤斷片。7天后，將50mg的腫瘤斷片解剖并重新接種在另一個10日胚胎上并通過局部施用(25μl)的對照品RCAS-GFP逆轉錄病毒，RCAS-Src251或模擬物處理再培養3或6天。使用作為指導的感染腫瘤的完整組織聚焦成象，我們能夠使用這種局部手段測定腫瘤斷片周圍和內部存在的對RCAS構建體的顯著表達。以雙盲方式進行腫瘤的切除和稱重，從而僅除去易于確定的實體腫瘤塊(Brooks等，1994)。將3或6天后的濕腫瘤重量與原始重量進行比較并測定每組腫瘤重量改變的百分比。
這些腫瘤易于在CAM上生長并產生活性血管生成(附圖9)，使得我們通過使用鳥特異性RCAS逆轉錄病毒選擇性地靶向鳥衍生的腫瘤血管系統。
附圖9描繪了表示RCAS-Src 251至在雞CAM上生長的人腫瘤的逆轉錄病毒轉運這一過程使腫瘤生長退化的結果。附圖9A表示在如上所述的雞胚胎CAM上生長的人成神經管細胞瘤。將含有RCAS-GFP或RCAS-Src251的逆轉錄病毒表面施用于預先建立的大于50mg的腫瘤。用表達GFP的RCAS-GFP感染的成神經管細胞瘤斷片的有代表性的顯微照片顯示了通過使用Bio Rad激光聚焦掃描顯微鏡(光柵=500μm)的光學切片檢測的腫瘤血管(箭頭)中的確限表達。附圖9B表示來自如上述處理的腫瘤的結果，所述的上述處理是指在將腫瘤切除并測定濕重后使它們生長3或6天。將數據表示為腫瘤重量的平均改變值(來自50mg腫瘤的原始重量)+/-2次重復試驗的SEM。RCAS-Src251對腫瘤生長在3天后具有顯著的影響(*,P＜0.002)且在6天后也有顯著影響(**,P＜0.05)。附圖9C表示用Olympus立體顯微鏡(光柵=350μm)記錄的手術取自胚胎的成神經管細胞瘤的有代表性的立體顯微照片。(下面的組)各腫瘤的高放大倍數的顯微照片具體表示各腫瘤的血管系統(光柵=350μm)。箭頭表示在RCAS-Src251處理的腫瘤中血管的破裂情況。
結果表明將含有Src 251的RCAS轉運至預先建立的成神經管細胞瘤可在與腫瘤相關的血管內產生選擇性病毒表達(附圖9A)且這最終會導致這些腫瘤在6天的間隔內退化(附圖9B)。重要的是，用含有Src251的病毒處理的動物體內與腫瘤相關的血管嚴重破裂且與對照組動物體內的腫瘤血管相比數量較少(附圖9C)。RCAS-GFP感染的腫瘤表明GFP僅局限在腫瘤血管系統中這一事實提示采用逆轉錄病毒轉運的Src251觀察到的抗腫瘤作用是由于其抗生血管特性導致的。
上述實施例和附加說明是解釋性的且并不看作起限定作用。本發明也不限于保藏的細胞系的范圍，因為保藏的實施方案用來作為本發明一個方面的解釋。任何功能上等價的細胞系均屬于本發明的范圍內。物質的保藏并不使得本文包含的撰寫說明不足以能夠實施本發明的任何方面、包括最佳實施方式，也不用來將權利要求的范圍限定到它所代表的特定解釋。實際上，可以根據上述描述對包括本文所證明和描述的那些技術方案在內的本發明作各種修改，這對本領域技術人員來說是顯而易見的，并且這些修改也屬于所附權利要求的范圍內。
序列表<110>scripps研究院等<120>使用酪氨酸激酶SRC調制血管生成的方法和組合物<130>TSRI 651.1<140>仍然未知<141>待確定<150>60/087,220<151>1998-05-29<160>6<170>PatentIn2.0版<210>1<211>11627<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述以禽類肉瘤病毒為基礎的RCASBP(A)<220><221>misc_特征<222>(7649)..(11258)<223>pBR322序列<220><221>LTR<222>(7166)..(7494)<223>上游<220><221>LTR<222>(1)..(101)<223>上游(在上游R處開始編碼)<220><221>misc特征<222>(11394)..(11623)<223>U3<220><221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>R<220><221>misc特征<222>(22)..(101)<223>U5<220><221>misc_特征<222>(102)..(119)<220><221>LTR<222>(7166)..(7494)<223>下游<220><221>misc_特征<222>(7166)..(7393)<223>U3<220><221>misc_特征<222>(7394)..(7414)<223>R<220><221>misc特征<222>(7415 )..(7494)<223>U5<220><221>misc_特征<222>(7154)..(7165)<223>PPT<220><221>misc_特征<222>(388)..(391)<223>剪接供體(AGGT)<220><221>misc_特征<222>(5074)..(5077)<223>env剪接受體(AGGC)<220><221>misc_特征<222>(6982)..(6985)<223>Clal剪接受體 (AGGA)<220><221>基因<222>(372)..(902)<223>gag p19<220><221>基因<222>(909)..(1094)<223>gag p10<220><221>基因<222>(1095)..(1814)<223>gag 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gtccctgtta caaaaggaag 480ggttgcttat gtctccctca gatttatatt ctccggggtc ctgggatccc atcactgcgg 540cgctctccca gcgggcaatg gtacttggaa aatcgggaga gttaaaaacc tggggattgg 600ttttgggggc attgaaggcg gctcgagagg aacaggttac atctgagcaa gcaaagtttt 660ggttgggatt agggggaggg agggtctctc ccccaggtcc ggagtgcatc gagaaaccag 720ctacggagcg gcgaatcgac aaaggggagg aggtgggaga aacaactgtg cagcgagatg 780cgaagatggc gccagaggaa gcggccacac ctaaaaccgt tggcacatcc tgctatcatt 840gcggaacagc tgttggctgc aattgcgcca ccgccacagc ctcggcccct cctccccctt 900atgtggggag tggtttgtat ccttccctgg cgggggtggg agagcagcag ggccagggag 960ataacacgtc tcggggggcg gagcagccaa gggaggagcc agggcacgcg ggtcaggccc 1020ctgggccggc cctgactgac tgggcaaggg taagggagga gcttgcgagt actggtccgc 1080ccgtggtggc catgcctgta gtgattaaga cagagggacc cgcctggacc cctctggagc 1140caaaattgat cacaagactg gctgatacgg tcaggaccaa gggcttacga tccccgatca 1200ctatggcaga agtggaagcg ctcatgtcct ccccgttgct gccgcatgac gtcacgaatc 1260taatgagagt gattttagga cctgccccat atgccttatg gatggacgct tggggagtcc 1320aactccagac ggttatagcg gcagccactc gcgacccccg acacccagcg aacggtcaag 1380ggcgggggga acggactaac ttggatcgat taaagggctt agctgatggg atggtgggca 1440acccacaggg tcaggccgca ttattaagac cgggggaatt ggttgctatt acggcgtcgg 1500ctctccaggc gtttagagaa gttgcccggc tggcggaacc tgcaggtcca tgggcggaca 1560tcacgcaggg accatctgag tcctttgttg attttgccaa tcggcttata aaggcggttg 1620aggggtcaga tctcccgcct tccgcgcggg ctccggtgat cattgactgc tttaggcaga 1680agtcacagcc agatattcag cagcttatac gggcagcacc ctccacgctg accaccccag 1740gagagataat caaatatgtg ctagacaggc agaagattgc ccctcttacg gatcaaggca 1800tagccgcggc catgtcgtct gctatccagc ccttagttat ggcagtagtc aatagagaga 1860gggatggaca aactgggtcg ggtggtcgtg cccgagggct ctgctacact tgtggatccc 1920cgggacatta tcaggcacag tgcccgaaaa aacgaaagtc aggaaacagc cgtgagcgat 1980gtcagctgtg tgacgggatg ggacacaacg ctaaacagtg taggaagcgg gatggcaacc 2040agggccaacg cccaggaaga ggtctctctt cggggccgtg gcccggccct gagcagcctg 2100ccgtctcgtt agcgatgaca atggaacata aagatcgccc cttggttagg gtcattctga 2160ctaacactgg gagtcatcca gtcaaacaac gttcggtgta tatcaccgcg ctgttggact 2220ccggagcgga catcactatt atttcggagg aggattggcc tactgattgg ccggtggtgg 2280acaccgcgaa cccacagatc catggcatag gagggggaat tcccatgcga aaatcccggg 2340atatgataga ggtgggggtt attaaccgag acgggtcgtt ggagcgaccc ctgctcctct 2400tccccgcagt cgctatggtt agagggagta tcctaggaag agattgtctg cagggcctag 2460ggctccgctt gacaaattta tagggagggc cactgttctc actgttgcgc tacatctggc 2520tattccgctc aaatggaagc cagaccgcac gcctgtgtgg attgaccagt ggcccctccc 2580tgaaggtaaa cttgtaggcc taacgcaatt agtggaaaaa gaattacagt taggacatat 2640agagccctca cttagttgtt ggaacacacc tgtttttcgt gatccggaag gcttccgggt 2700cttatcgctt attgcatgat ttgcgcgctg ttaacgccaa gcttgtccct tttggggccg 2760tccaacaggg ggcgccagtt ctctccgcgc tcccgcgtgg ctggcccctg atggtcctag 2820acctcaagga ttgcttcttt tctatccctc ttgcggaaca agatcgcgaa gcttttgcat 2880ttacgctccc ctctgtgaat aaccaggccc ccgctcgaag attccaatgg aaggtcttgc 2940cccaagggat gacctgttct cccactatct gtcagttggt agtgggtcag gtgctcgagc 3000ccttgcgact caagcaccca 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1573tgaactgagc cccagcgggc tggcgggcct ttttcctgcg tcccagcctg cacccctccg 1633gccccgtctc tcttggaccc acctgtgggg cctggggagc ccactgaggg gccagggagg 1693aaggaggcca cggagcggga ggcagcgccc caccacgtcg ggcttccctg gcctcccgcc 1753actcgccttc ttagagtttt attcctttcc ttttttgaga ttttttttcc gtgtgtttat 1813tttttattat ttttcaagat aaggagaaag aaagtaccca gcaaatgggc attttacaag 1873aagtacgaat cttatttttc ctgtcctgcc cgtgagggtg ggggggaccg ggcccctctc 1933tagggacccc tcgccccagc ctcattcccc attctgtgtc ccatgtcccg tgtctcctcg 1993gtcgccccgt gtttgcgctt gaccatgttg cactgtttgc atgcgcccga ggcagacgtc 2053tgtcaggggc ttggatttcg tgtgccgctg ccacccgccc acccgccttg tgagatggaa 2113ttgtaataaa ccacgccatg aggacaccgc cgcccgcctc ggcgcttcct ccaccgaaaa 2173aaaaaaaaaa aaaa 2187<210>5<211>450<212>PRT<213>人<400>5Met Ser Ala Ile Gln Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Cys Ile Ala1 5 10 15Lys Tyr Asn Phe His Gly Thr Ala Glu Gln Aap Leu Pro Phe Cys Lys20 25 30Gly Asp Val Leu Thr Ile Val Ala Val Thr Lys Asp Pro Asn Trp Tyr35 40 45Lys Ala Lys Asn Lys Val Gly 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180 185 190Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gln Thr Ile Gly Lys Gly Glu Phe Gly Asp195 200 205Val Met Leu Gly Asp Tyr Arg Gly Asn Lys Val Ala Val Lys Cys Ile210 215 220Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gln Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Net225 230 235 240Thr Gln Leu Arg His Ser Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val Ile Val245 250 255Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met Ala Lys Gly260 265 270Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser Arg Gly Arg Ser Val Leu Gly Gly275 280 285Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr290 295 300Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val305 310 315 320Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Thr325 330 335Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gln Asp Thr Gly Lys Leu Pro Val Lys Trp340 345 350Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu Lys Lys Phe Ser Thr Lys Ser Asp355 360 365Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Tyr Ser Phe Gly Arg370 375 380Val Pro Tyr Pro Arg Ile Pro Leu Lys Asp Val Val Pro Arg Val Glu385 390 395 400Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro Asp Gly Cys Pro Pro Ala Val Tyr405 410 415Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His Leu Asp Ala Ala Met Arg Pro Ser420 425 430Phe Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu GLu His Ile Lys Thr His Glu Leu435 440 445His Leu450<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述9E10-myc表位標記<400>6Val Asp Met Glu Gln Lys Leu Ile Ala Glu Glu Asp Leu Asn1 5 10
權利要求
1．一種包括包裝物質和所述包裝物質中含有的藥物組合物的制品，其中所述的藥物組合物能夠在組織中調制與疾病狀況相關的血管生成；其中所述的包裝物質帶有一種可指示將所述的藥物組合物通過調制血管生成用于治療疾病的標記；且其中所述的藥物組合物含有Src蛋白質或具有能夠表達所述蛋白質的核苷酸序列的寡核苷酸。
2．權利要求1的制品，其中所述的Src蛋白質是一種活性Src蛋白質且所述的調制強化血管生成。
3．權利要求2的制品，其中所述的活性Src蛋白質是SrcA。
4．權利要求2的制品，其中所述的組織具有不良的循環。
5．權利要求1的制品，其中所述的酪氨酸激酶Src蛋白質是一種失活的Src蛋白質且所述的調制抑制血管生成。
6．權利要求5的制品，其中所述的失活的Src蛋白質是Src251或Src K295M。
7．權利要求5的制品，其中所述的組織是炎癥組織且所述的疾病是關節炎或類風濕性關節炎。
8．權利要求5的制品，其中所述的組織是一種實體腫瘤或實體轉移瘤。
9．權利要求8的制品，其中將所述的給藥步驟與化療共同進行。
10．權利要求5的制品，其中所述的組織是視網膜組織且所述的疾病是視網膜病、糖尿病性視網膜病或黃斑變性。
11．權利要求5的制品，其中所述的組織位于冠狀血管成形術的部位且所述的疾病是再狹窄。
12．權利要求1的制品，其中所述的給藥包括靜脈內、經皮、滑膜內、肌內或口服給藥。
13．權利要求1的制品，其中所述的給藥包括靜脈內給予單一劑量。
14．權利要求1的制品，其中所述的藥物組合物進一步含有一種脂質體。
15．權利要求1的制品，其中所述的藥物組合物含有能夠表達所述核苷酸序列的病毒表達載體。
16．權利要求1的制品，其中所述的藥物組合物含有能夠表達所述核苷酸序列的非病毒表達載體。
17．一種用于在組織中調制與疾病狀況相關的血管生成的方法，該方法包括對所述的組織給予藥物組合物的步驟，該組合物含有Src蛋白質或能夠表達所述蛋白質的核苷酸序列。
18．權利要求17的方法，其中所述的Src蛋白質是活性Src蛋白質且所述的調制強化血管生成。
19．權利要求18的方法，其中所述的活性Src蛋白質是SrcA。
20．權利要求18的方法，其中所述的組織具有不良的循環。
21．權利要求17的方法，其中所述的Src蛋白質是失活的Src蛋白質且所述的調制抑制血管生成。
22．權利要求21的方法，其中所述的失活的Src蛋白質是Src251或Src K295M。
23．權利要求21的方法，其中所述的組織是炎癥組織且所述的疾病是關節炎或類風濕性關節炎。
24．權利要求21的方法，其中所述的組織是一種實體腫瘤或實體轉移瘤。
25．權利要求24的方法，其中將所述的給藥步驟與化療共同進行。
26．權利要求21的方法，其中所述的組織是視網膜組織且所述的疾病是視網膜病、糖尿病性視網膜病或黃斑變性。
27．權利要求21的方法，其中所述的組織位于冠狀血管成形術的部位且所述的組織有再狹窄的危險。
28．權利要求17的方法，其中所述的給藥包括靜脈內、經皮、滑膜內、肌內或口服給藥。
29．權利要求17的方法，其中所述的給藥包括靜脈內給予單一劑量。
30．權利要求17的方法，其中所述的藥物組合物進一步含有一種脂質體。
31．權利要求17的方法，其中所述的藥物組合物含有能夠表達所述核苷酸序列的逆轉錄病毒表達載體。
32．權利要求17的方法，其中所述的藥物組合物含有能夠表達所述核苷酸序列的非病毒表達載體。
33．一種用于在靶哺乳動物組織中刺激血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼src蛋白質的核酸片段，所述的src蛋白質在527位密碼子上帶有除酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸外的任意氨基酸殘基。
34．一種用于在靶哺乳動物組織中刺激血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的非病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼src蛋白質的核酸片段且所述的src蛋白質在527位密碼子上帶有除酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸外的任意氨基酸殘基。
35．一種用于在靶哺乳動物組織中抑制血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼不具有激活性的src蛋白質的核酸片段。
36．一種用于在靶哺乳動物組織中抑制血管生成的藥物組合物，它包括含有核酸的非病毒基因轉移載體和藥物上可接受的載體或賦形劑；所述的核酸具有編碼src蛋白質的核酸片段，所述的src蛋白質不具有激酶活性。
37．一種用于在靶哺乳動物組織中刺激血管生成的藥物組合物，它在藥物上可接受的載體或賦形劑中含有治療量的src蛋白質；所述的src蛋白質在527位密碼子上帶有除酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸外的任意氨基酸殘基。
38．一種用于在靶哺乳動物組織中抑制血管生成的藥物組合物，它在藥物上可接受的載體或賦形劑中含有src蛋白質；所述的src蛋白質不具有激酶活性。
全文摘要
本發明描述了使用Src蛋白質、修飾的Src蛋白質和編碼這類蛋白質的核酸在組織中調制血管生成的方法。本發明特別描述了用于使用失活的Src蛋白質或編碼它們的核酸抑制血管生成或用于使用活性Src蛋白質或編碼它們的核酸強化血管生成的方法。本發明還描述了基因轉運系統用于提供編碼Src蛋白質或其修飾形式的核酸的用途。
文檔編號A61P19/02GK1319131SQ99809073
公開日2001年10月24日 申請日期1999年5月28日 優先權日1998年5月29日
發明者D·A·徹雷斯, B·埃利賽里, P·L·施瓦茨博格 申請人:斯克里普斯研究學院, 美國政府