專利名稱：：逆轉錄病毒傳遞系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種傳遞系統，尤其是，本發明涉及到一種能傳遞目的核苷酸序列(下文縮寫成NOI)或者甚至是大量的NOI到目的位點的逆轉錄病毒載體。更具體而言，本發明涉及一種用于基因治療的逆轉錄病毒載體。基因治療包括以下任一種或多種在一個或多個靶位點如靶細胞中添加、取代、缺失、補充、操作一個或多個核苷酸序列。假如靶位點是靶細胞，那么這種細胞也許是組織或器官的一部分。關于基因治療的一般教導可參見《分子生物學》(EdRobertMeyersPubVCH，如556-558頁)。作為更進一步的例子，基因治療也提供一種手段來實現以下的任一種或多種效果一段核苷酸序列如一個基因能被應用到取代或補充一個缺陷基因；一個致病基因或基因產物能被除去；一個新的基因可以被添加以創造一個有利的表型；細胞能被在分子水平上操作以治療癌癥(Schmidt-WolfandSchmidt-Wolf,1994AnnalsofHematology69:273-279)或其它情況疾病--如免疫病，心血管病，神經性疾病，炎癥或感染疾患；抗原能被操作和/或導入以引起免疫應答反應--如遺傳接種。近年來，逆轉錄病毒已被建議用于基因治療。本質上逆轉錄病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。關于這一點，當一種逆轉錄病毒感染一種細胞時，它的基因組被轉變成DNA形式。換言之，逆轉錄病毒是一種感染實體，該感染實體通過DNA中間進行復制。有關逆轉錄病毒感染的更詳細描述見后。有許多逆轉錄病毒，其實例包括鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺損病毒(HIV)，馬感染性貧血病毒(EIAV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)，Rous氏肉瘤病毒(RSV)，藤浪氏肉瘤病毒(FUSV)，Moloney氏鼠白血病病毒(Mo-MSV),FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV),Moloney氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV),Abelson氏鼠白血病病毒(A-MLV)，禽髓細胞組織增生病毒-29(MC-29)和禽成紅細胞增多癥病毒(AEV)。逆轉錄病毒的詳細列表可以在Colfin等中找到(“逆轉錄病毒”1997冷泉港實驗室編輯出版JMColfin,SMHaghes,HEVarmus頁758-763)關于一些逆轉錄病毒的基因組結構的詳細描述可以在現有技術中找到，例如，關于HIV的詳細描述可以從NCBI基因庫中找到(即基因組入藏號Afo33819)。所有的逆轉錄病毒含有gag、pol、env三個主要的編碼域，它們編碼必需的病毒粒子蛋白。然而，逆轉錄病毒可被廣義地劃分為兩大類即“簡單的”和“復雜的”。通過它們的基因組結構可顯著地區分這些類別。簡單的逆轉錄病毒常常只攜帶這些基本的信息。相反，復雜的逆轉錄病毒也編碼來源于多樣化剪接信息的額外調節蛋白。逆轉錄病毒進一步可以細分為七個群。這些群中的5個是有致癌潛力的逆轉錄病毒。剩下的兩群是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉錄病毒的綜述發表于“逆轉錄病毒”(1997冷泉港實驗室出版社，編輯JMCoffinSMHughes,HEVarmus頁1-25)。除人類T細胞白血病病毒-牛白血病病毒(HIV-BLV)外，所有的致癌逆轉錄病毒都是簡單的逆轉錄病毒。HTLV,BLV和慢病毒及泡沫病毒是復雜逆轉錄病毒。一些研究最充分的逆轉錄病毒是Rous氏肉瘤病毒(RSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)和鼠白血病病毒(MLV)及人類T細胞白血病病毒(HTLV)。慢病毒群甚至可被細分為“靈長動物類”和“非靈長動物類”慢病毒。靈長動物類慢病毒的實例包括人類免疫缺損病毒(HIV)及猿免疫缺損病毒(SIV)，其中HIV為人類自身免疫缺損綜合征(AIDS)的病原因子。非靈長類動物慢病毒群包括原型“慢病毒”綿羊髓鞘脫落病毒(VMV)，以及相關的山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)，馬感染性貧血病毒(EIAV)和最近被描述的貓免疫缺損病毒(FIV)及牛免疫缺損病毒(BIV)。慢病毒家族與其它類型的逆轉錄病毒的關鍵區別在于慢病毒有能力感染分裂和非分裂細胞(Lewis等1992EMBOJ.11:3053-3058，LewisandEmerman1994“病毒學雜志”68:510-516)。相反，其它的逆轉錄病毒如MLV不能感染非分裂細胞如組成肌肉、大腦、肺和肝組織的細胞。在感染的過程中，逆轉錄病毒首先吸咐到特定細胞表面受體上。一旦進入可感病的宿主細胞，然后逆轉錄病毒的RNA基因組通過親本病毒攜帶進的病毒編碼的逆轉錄酶復制成DNA。這種DNA被轉運到宿主細胞核，隨即整合進宿主基因組。在這一時期，其一般被稱為前病毒。前病毒在細胞分裂期間在宿主染色體組中是穩定的并象其它細胞蛋白一樣被轉錄。前病毒編碼形成更多病毒所需要的蛋白和包裝機構，所形成的病毒能以有時稱為“出芽”的過程離開細胞。象已說明的一樣，每一種逆轉錄病毒基因組包括gag、pol、env基因，它們編碼病毒粒子蛋白和酶。這些基因位于長末端重復序列(LTR)的兩側。長末端重復序列(LTR)負責前病毒的整合和轉錄。它們也作為增強子-啟動子序列。換言之，長末端重復序列能控制病毒基因的表達。通過位于病毒基因組5’端的psi序列的效能使逆轉錄病毒RNA被包囊。長末端重復序列本身是能被劃分成三個元件的相同序列，它們分別叫做U3、R和U5。U3來自于RNA3’末端的獨特序列。R來自于RNA兩端的重復序列，U5來自于RNA5’末端的獨特序列。不同逆轉錄病毒之間的三個元件的大小可顯著不同。為了容易理解，一個簡單的顯示長末端重復序列、gag、pol和env的基本特征的逆轉錄病毒基因組的通用圖譜(不按比例)被顯示于圖6。對于病毒的基因組，轉錄起始位點在長末端重復序列左邊的U3與R之間的范圍(如圖6所示)，且Poly(A)添加的位點(終端)是在長末端重復序列右邊的R與U5之間的邊界(如圖6所示)。U3含有大多數前病毒轉錄控制元件，包括啟應答于細胞和在某些情況下應答于病毒轉錄激活代表的啟動子和多個增強子序列。一些逆轉錄病毒含tat,rev,tax和rex中的一種或多種基因，這些基因編碼涉及到基因表達的調控的蛋白。關于結構基因gag、pol和env、gag編碼病毒的內部結構蛋白。Gag蛋白水解成成熟的蛋白MA(基質)，CA(衣殼)，NC(核衣殼)。基因pol編碼逆轉錄酶(RT)，該酶包括兩種DNA聚合酶，和伴隨的RnaseH活性及整合酶(IN)，介導基因組的復制。基因env編碼病毒粒子的表面糖蛋白及跨膜蛋白，它們形成一種復合物，該復合物專一性地與細胞受體蛋白相互作用。這種作用最后導致病毒膜與細胞膜融合。逆轉錄病毒的被膜糖蛋白復合物包括兩種多肽一種外部的糖基化的親水多肽(SU)和一種跨膜蛋白(TM)。在病毒粒子的表面上它們一起形成一種寡聚物的“隆起”或“隆起的刺突”。這兩種多肽由env基因編碼并以多聚蛋白的前體形式合成，這種前體在轉運至細胞表面的過程中被水解切斷成兩部分。盡管末切斷的Env蛋白能結合到受體上，但這種自身的切斷事件對于激活蛋白的潛在的融合是必需的，這種融合對于病毒進入宿主細胞是必需的。典型的SU和TM蛋白都在多個位點被糖基化。但是在一些病毒中，以MLV為例，TM不被糖基化。盡管SU和TM蛋白對于被膜病毒粒子的裝配不一定是必需的，但它們在進入過程中起著重要作用。因而SU域結合至在靶細胞表面的受體分子--常是一種專一受體分子。這種結合事件被相信是激活了TM蛋白誘導膜融合的潛力，此后病毒和細胞膜融合。在一些病毒特別是MLV中，一種導致TM的胞質尾的較短部分的除去的斷裂事件被認為在揭示蛋白的完全融合活性中起著關鍵作用(Brody等1994，“病毒學雜志”68:4620-4627Rein等1994“病毒學雜志”68:1773-1781)。這種遠離TM跨膜部分的胞質“尾”保留在病毒膜內側，并且在不同的逆轉錄病毒中它的長度顯著不同。SU/受體相互作用的專一性能限定逆轉錄病毒的宿主范圍和組織趨性。在某些情況下，這種專一性可限制重組逆轉錄病毒載體的轉導潛力。由于這種原因，許多基因治療試驗已用MLV進行。已知一種含有叫做4070A的被膜蛋白的特定MLV是一種兼嗜性病毒，并且由于它的被膜蛋白“停靠”人和鼠之間保守的磷酸轉運蛋白使得它也能感染人類細胞。由于這種轉運蛋白是廣泛存在的，所以這些病毒能感染許多細胞類型。但在某種情況下，尤其是從安全的角度出發，專一性地靶向限制細胞也許是有益的。為此，幾個研究組已構建了一種小鼠親嗜性逆轉錄病毒以專一性地感染特定人細胞，該病毒不象它的兼嗜性近親，通常僅感染小鼠細胞。用促紅細胞生成素區段取代被膜蛋白的一個片段產生一種重組逆轉錄病毒，其能專一性地結合表面表達有促紅細胞生成素受體的人細胞，如紅細胞前體(MaulikandPatel1997MolecularBiotechnoloy:TherapeuficApplicationsandStrategies1997Wiley--LissInc頁45).除了gag、pol和env基因之外，復雜的逆轉錄病毒也含有編碼附屬或輔助蛋白的“附屬”基因。附屬或輔助蛋白被定義為除通常的復制或結構基因gagpol和env編碼的蛋白外由附屬基因編碼的那些蛋白。這些附屬蛋白不同于那些涉及到基因表達調控的蛋白，如那些由tat、rev、tax和rex編碼的蛋白。附屬基因的實例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一個或多個，這些附屬基因能在例如HIV中找到(參見例如，頁802和803，RetrovirusesEdCoffinetalPubCSHL1997)。非必需附屬蛋白可在特殊的細胞類型中發揮功能，提供至少部分重復地由細胞蛋白提供的功能。一般，附屬基因位于pol和env之間，剛好位于env的下游，包括LTR的U3區或env的重疊部分或兩者。復雜的逆轉錄病毒已自然演進了調控機制，其利用病毒編碼的轉錄激活物以及細胞轉錄因子。這些反式作用的病毒蛋白可用作由LTR指導的RNA轉錄的激活物。慢病毒的轉錄反式激活物由病毒的tat基因編碼。Tat蛋白結合至一個穩定的RNA莖-環二級結構，該結構稱之TAR，它的一個功能是表觀上優化Tat蛋白定位于反式激活轉錄。如前所述，逆轉錄病毒已被建議作為一種傳遞系統(其它表達方式如傳遞工具或傳遞載體)用于轉移NOI或大量的NOI至一個或多個目的位點。這種轉移可發生在體外，來自體內或在體內或其組合。當用于這種方式時，逆轉錄病毒一般稱作逆轉錄病毒載體或重組逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體已被利用來研究逆轉錄病毒生活周期的不同方面，包括受體使用，逆轉錄及RNA包裝(有關綜述見Miller1992CurrTopMicrobielImmunol158:1-24)。在用于基因治療的一個典型的重組逆轉錄病毒載體中，至少部分的一個或多個gag、pol和env蛋白編碼區可以從病毒中除去。這使得逆轉錄病毒載體復制缺餡。為了使生成的病毒能整合它的基因組到宿主細胞的基因組去，除去的部分甚至可以用NOI取代，但是，其中這種修改過的病毒基因組由于結構蛋白的缺乏而不能自我復制。當整合進宿主基因組時，NOI的表達導致例如治療效應的產生。因此，轉移NOI至目標部位一般通過以下方式完成使NOI整合進重組病毒載體；將修飾過的病毒載體包裝進病毒粒子外殼；并且使其轉導目標部位如靶細胞或靶細胞群。通過用包裝或輔助細胞系和重組載體的結合，可以繁殖和分離大量的逆轉錄病毒載體(如制備適合的逆轉錄病毒載體的效價)，以用于隨后的目標部位轉導。在一些情況下，繁殖和分離可能需要逆轉錄病毒gag、pol和env基因的分離并使它們分別引入宿主細胞，以產生一種“包裝細胞系”。這種包裝細胞系產生包裝逆轉錄DNA所需要的蛋白，但由于psi區域的缺乏導致它不能引起衣殼化。但是，當攜帶NOI的重組載體和psi區域被引進包裝細胞系時，助蛋白能包裝psi-陽性重組載體以產重組病毒原種。這種重組病毒原種能被用于感染細胞以導入NOI進細胞的基因組。這種基因組缺乏所有形成病毒蛋白的必需基因的重組病毒只能感染而不能繁殖。因此NOI被導入宿主細胞基因組而沒有生成有潛在危害的逆轉錄病毒。可用的包裝系的摘要發表于“逆轉錄病毒”(1997冷泉港實驗室出版社，編輯JMCoffin,SMHughes,HEVarmus499頁)。但是這種技術在某種意義上說是有問題的，即效價水平不總是在滿意水平。然而，逆轉錄病毒包裝細胞系的設計已發展到解決了輔助病毒的早期設計中經常遇到的輔助病毒的自發產生的問題。由于同源重組極容易進行，所以減少或消除載體和輔助者基因組之間的同源性已減少了輔助病毒產生的問題。最近，包裝細胞已經得到發展，其中的gag,pol和env病毒基因的編碼區攜帶于單獨的表達質粒上被獨立轉染進包裝細胞系中，使得野生型病毒的產生需要三次重組。這個策略有時被稱為三質粒轉染法(Soneokaetal1995Nucl.AcidsRes.23-628)。當載體正在被改進時，瞬時轉染也可用來測量載體的產量。關于這一點，瞬時轉染避免了生成穩定生產載體的細胞系所需的較長時間，并且若載體或逆轉錄病毒的包裝成分對細胞有毒可以利用瞬時轉染。用于生產逆轉錄病毒載體的典型組成部分包括編碼Gag/Pol蛋白的質粒，編碼Env蛋白的質粒及含有一個NOI的質粒。載體的生產涉及瞬時轉染一個或更多的這些組成部分到含有其它所需成分的細胞中去。如果載體編碼毒素基因或者干擾宿主細胞復制的基因，如細胞周期的抑制劑或誘導細胞凋亡的基因，產生能穩定生產載體的細胞系可能會比較困難。但在細胞死亡之前，瞬時轉染可用于生產這種載體。同時，利用瞬時轉染，已經發展了一些細胞系，其所產生的載體的效價與從穩定的載體生產細胞系獲得的水平相當(Pearetal,1993PNAS90:8392-8396)。鑒于一些HIV蛋白的毒性使得產生穩定的基于HIV的包裝細胞相對困難，通常HIV載體通過載體和輔助病毒的瞬時轉染來制得。有些研究者甚至已經用水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白置換了HIV的Env蛋白。水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白的插入提高了載體的濃度，如具有5×105效價(濃縮后為108)的HIV/VSV-G載體已通過瞬時轉染得以生產(Naldinietal1996Science272:263-267)。因此HIV載體的瞬時轉染可能為高效價載體的生產提供了一個有用的策略(Yeee,etal1994,PNAS91:9564-9568)。然而，這種方法的一個缺陷就是VSV-G蛋白對細胞是相當有毒的。用異源的env基因取代env基因是一種叫作假型化(Psendotyping)技術或策略的實例。假型化不是一種新現象，在WO-A-98/05759,WO-A-98/05754,WO-A-97/17457,WO-A-96/09400,WO-A-91/00047及Mebatsionetal1997Cell90,841-847中均可找到許多實例。假型化具有一個或更多的優點。例如，就慢病毒載體來說，基于HIV的載體，其env基因產物會限制這些載體僅侵染表達CD4蛋白的細胞。但是如果這些載體中的env基因被其它RNA病毒的env序列取代，那么它們就有一個更廣的侵染譜(Verma和Somia1997Nature389:239-242)。如剛才所述并作為一個實例，研究者們已經用水泡性口炎病毒的糖蛋白假型化了一種基于HIV的載體(Verma和Somia1997同上)。同樣，作為一個例子，逆轉錄病毒Env蛋白的相對易破壞性可能限制了濃縮逆轉錄病毒載體的潛力，并且濃縮病毒可能會導致較低的病毒回收率。在某種程度上通過用更加穩定的VSV-G蛋白取代逆轉錄病毒Env蛋白可以克服這一問題，這種VSV-G蛋白允許更加有效的濃縮而得到更好的產率(Naldinietal1996,Science272:263-267)。然而，利用VSV-G蛋白的假型化并不總是理想的。這是因為VSV-G蛋白是細胞毒性的(Chenetal1996,Proc.Natl.Acad.Sci.1005及此文中的引用文獻)。因此，需要找到沒有毒性且能用于逆轉錄病毒假型化的其它蛋白。因此，本發明試圖提供一種改進的逆轉錄病毒載體。根據本發明的第一個方面，提供了一種能夠轉導靶位點的逆轉錄病毒傳遞系統，其中此逆轉錄病毒傳遞系統包括一段至少編碼部分被膜蛋白的第一核苷酸序列，及一個或更多其它從逆轉錄病毒衍生而來的核苷酸序列以確保通過逆轉病毒傳遞系統的靶位點的轉導；其中，第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列中的一個是異源的，并且第一核苷酸序列至少編碼部分的可以識別靶位點的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。本發明的逆轉錄病毒傳遞系統能包含一實體，或者說，本發明的逆轉錄病毒傳遞系統包含很多實體，它們共同組合提供了本發明的逆轉錄病毒傳遞系統。這些病毒傳遞系統包括但不限于在Savardetal1997，“病毒學雜志”71(5):4111-4117；Fengetal1997,NatBiotechnol15(9):866-870；及英國專利申請9720465.5中描述的皰疹病毒和腺病毒的實例。“可衍生的”一詞用其通常的意義，意思為此序列無需非得從逆轉錄病毒得來，而可從它衍生而來。作為一個例子，此序列可以通過合成或者重組DNA技術制備。根據本發明的第二個方面，提供了根據本發明的病毒粒子，此病毒粒子可從本發明的逆轉錄傳遞系統獲得。根據本發明的第三個方面，提供一種逆轉錄病毒載體，其中此逆轉錄病毒載體是根據本發明第一方面的逆轉錄病毒傳遞系統或可由它而得到。根據本發明的第四個方面，提供一種用根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子或者根據本發明的逆轉錄病毒載體轉導的細胞。根據本發明的第五個方面，提供一種用于藥物的根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子或者根據本發明的逆轉錄病毒載體。根據本發明的第六個方面，提供根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子或者根據本發明的病毒載體在制備傳遞NOI至所需靶位點的藥物組合物。根據本發明的第七個方面，提供一種方法，包括讓一種細胞與根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子或者根據本發明的逆轉錄病毒載體接觸。根據本發明的第八個方面，提供一種載體以制備根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子或者根據本發明的逆轉錄病毒載體，其中此載體包含一段核苷酸序列，該序列至少編碼狂犬病毒G蛋白或者其突變體，變體，衍生物或片段的部分。根據本發明的第九個方面，提供一種質粒以制備根據本發明的逆轉錄病毒傳遞系統或者根據本發明的病毒粒子，或者根據本發明的逆轉錄病毒載體，其中此質粒包含一段核苷酸序列，至少編碼狂犬病毒G蛋白或者其突變體，變體，衍生物或片段的部分。根據本發明的第十個方面，提供許多種質粒，其中至少有一個質粒是根據本發明的質粒，并且其中至少有一個另外的質粒包含一個或更多的從一種逆轉錄病毒衍生而來的核苷酸序列。根據本發明的第十一個方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子的用途，從而影響此逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子的感染譜。根據本發明的第十二個方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子的用途，從而影響該逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉導病毒粒子的宿主范圍和/或細胞嗜性。根據本發明的第十三個方面，提供一種用狂犬病毒G蛋白假型化的一種逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子。根據本發明的第十四個方面，提供一種包括有異源env區域的逆轉錄病毒傳遞系統，其中此異源的env區域至少包含部分編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。根據本發明的第十五個方面，提供一種包括有異源env區域的逆轉錄病毒傳遞系統，其中此異源的env區域包含編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。優選，第一核苷酸序列編碼全部的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。優選，至少其它核苷酸序列之一是從一種慢病毒或一種致癌逆轉錄病毒衍生而來。優選，其它核苷酸序列是從一種慢病毒或一種致癌逆轉錄衍生而來。優選，其它核苷酸序列從MLV、HIV或EIAV衍生而來。優選，此逆轉錄病毒傳遞系統至少包括一個NOI。優選，此NOI有一種治療效應或者編碼一種有治療效應的蛋白。優選，靶位點是一個細胞。因此，本發明提供一種有異源被膜蛋白的逆轉錄病毒載體。此逆轉錄病毒載體在基因治療中是有用的。本發明的一個重要方面就是用一種編碼狂犬病毒蛋白，尤其是狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列來假型化一種逆轉錄病毒和/或者一種基于此病毒或由此病毒衍生的逆轉錄病毒載體。此處，“假型化”一詞的意思是將來源于其它病毒的一種蛋白整合進一部分env基因，或者取代一部分env基因，或者取代病毒基因組中或者病毒載體中全部的env基因。有關狂犬病毒G蛋白及它的突變體的教導可從以下文獻獲得Roseetal.,1982“病毒學雜志”43:361-364,Hanhametal.,1993“病毒學雜志”67,530-542,Tuffereauetal.,1998“病毒學雜志”72,1085-1091,Kuceraetal.,1985J.Virol55,158-162,Dietzscholdetal.,1983PNAS80,70-74,Seifetal.,1985“病毒學雜志”53,926-934,Coulonetal.,1998“病毒學雜志”72,273-278,Tuffereauetal.,1998“病毒學雜志”72,1085-10910,Burgeretal.,1991“普通病毒學雜志”72.359-367,Gaudinetal1995“病毒學雜志”69,5528-5534,Benmansouretal1991“病毒學雜志”65,4198-4203,Luoetal1998“微生物免疫學”42,187-193,Coll1997“病毒學紀事”142,2089-2097,Luoetal1997“病毒研究”51,35-41,Luoetal1998“微生物免疫學”42,187-193,Coll1995“病毒學紀事”140,827-851,Tuchiyaetal1992“病毒研究”25,1-13,Morimotoetal1992“病毒學”189,203-216,Gaudinetal1992“病毒學”187,627-632,Whittetal1991“病毒學”185,681-688,Dietzscholdetal1978“普通病毒學雜志”40,131-139,Dietzscholdetal1978DevBiolStand40,45-55,Dietzscholdetal1977“病毒學雜志”23,286-293,andOtvosetal1994“生物化學與生物物理學報”1224,68-76。一種狂犬病毒G蛋白也可參見EP-A-0445625.使用本發明的狂犬病毒G蛋白提供了載體，這些載體可在體內優先轉導狂犬病毒優先感染的靶細胞。這特別包括體內的神經元靶細胞。作為一種以神經元為靶的載體，從一種狂犬病病原毒株如ERA來的狂犬病毒G蛋白可能特別有效。另一方面，狂犬病毒G蛋白在體外具有很廣的靶細胞范圍，包括幾乎所有的已試驗過的哺乳動物及鳥的細胞類型(Segantietal.,1990“病毒學紀事”34,155-163；Fieldsetal.,1996FieldsVirology,ThirdEdition,Vol.2,Lippincott-RavenPublishersPhiladelphia,NewYork)。很可能將會發現其具有傳遞感染其它目的細胞類型的能力。因此，使用本發明的狂犬病毒G蛋白可以提供在體外及體內能轉導廣泛的不同細胞類型的載體。狂犬病毒在體內及體外的不同嗜性，被認為是緣于狂犬病毒結合一系列受體的能力，這些受體中的一些僅在體外有活性。另外，根據本發明的假型化載體粒子的嗜性可以通過一種胞外域修飾的突變狂犬病毒G蛋白來改變。狂犬病毒G蛋白具有可被突變以限制其靶細胞范圍的優點。在體內，靶細胞對狂犬病毒的吸收被認為是由乙酰膽堿受體(AchR)介導的，但也可能是其體內結合的其它受體所介導的(Hanhametal..,1993“病毒學雜志”67,530-542；Tuffereauetal.,1998“病毒學雜志”72,1085-1091)。狂犬病毒G蛋白抗原位點Ⅲ處的突變對病毒嗜性的影響已作了研究。這個區域被認為與病毒和乙酰膽堿受體的結合無關(Kuceraetal.,1985“病毒學雜志”55,158-162；Dietzscholdetal.,1983ProcNatlAcadSci80,70-74；Seifetal.,1985“病毒學雜志”53,926-934；Coulonetal.,1998“病毒學雜志”,72,273-278；Tuffereauetal.,1998“病毒學雜志”72,1085-10910)。例如成熟蛋白中第333位精氨酸(Arg)轉換為谷氨酰胺的突變可用來在體內將病毒的進入限制在嗅覺和外周神經元中，而減少了其向中樞神經系統的傳播。那些病毒原來是能夠象野生病毒那樣侵入運動神經元和感覺神經元的，然而跨神經元的傳遞沒有發生(Coclloinetal.,1989，“病毒學雜志”63,3550-3554)。第330位氨基酸突變的病毒能被進一步減毒，并且在肌內注射接種后，不能感染運動神經元或感覺神經元(Coulonetal.,1998“病毒學雜志”72,273-228)。另外，可以使用來源于實驗室傳代的狂犬病毒毒株的狂犬病毒G蛋白。這些能用于篩選嗜性的改變。這些毒株包括以下作為例子，ERA毒株是一種狂犬病的病原毒株并且來源于此毒株的狂犬病毒G蛋白能被用于轉導神經元細胞。來源于ERA毒株的狂犬病毒G蛋白的序列在GenBank數據庫中(進入號J02293)。此蛋白具有一種19個氨基酸的信號肽，并且成熟蛋白是從以翻譯起始點甲硫氨酸計第20位的賴氨酸殘基開始的。HEP-Flury毒株含有成熟蛋白第333位精氨酸轉換為谷氨酰胺的突變，此突變與其致病性的降低相關，并且可以用于限制其病毒被膜的嗜性。一種狂犬病毒G蛋白的實例如SEQIDNO.2所示，其編碼序列如SEQIDNO.1所提供。本發明包含這些序列的變體，同源體或衍生物。論及本發明優選酶的氨基酸序列時，“變體”、“同源體”或“片段”包括自序列或向序列取代、變異、修飾、置換、缺失或添加一個(或更多)氨基酸，使產生的蛋白具有G蛋白的活性和/或G蛋白的特征或輪廓，優選至少有如SEQIDNo.2所示G蛋白的相同生物活性。特別是“同源物”一詞包括結構和/或功能的同源性。至于序列的同源性，優選地至少75％，更優選至少85％，更優選至少90％同源于SEQIDNo.2所示序列。更優選至少95％，更優選至少98％同源于SEQIDNo.2所示序列。論及本發明優選酶的核苷酸序列時，“變體”、“同源體”或“片段”包括自序列或向序列取代、變異、修飾、置換、缺失或添加一個(或更多)核苷酸，使產生的核苷酸序列編碼或能夠編碼具有G蛋白活性和/或G蛋白特征或輪廓的蛋白，優選至少是與SEQIDNo.1所編碼的G蛋白有相同生物學活性的蛋白。尤其是，“同源體”一詞，包括結構和/或功能的同源性，使產生的核苷酸序列編碼或能夠編碼具有G蛋白活性和/或G蛋白特性或輪廓的蛋白。至于序列的同源性，優選地至少75％，更優選至少為85％，更優選至少90％同源于SEQIDNo.1所示的序列。更優選至少95％，更優選至少98％同源于SEQIDNo.1所示的序列。尤其是在此所用的“同源性”一詞可能等同于“同一性”。相對的序列同源性(也就是序列同一性)能通過可商購的計算機程序來確定，這些程序能計算兩個或更多個序列的百分同源性。這種計算機程序的一個典型的實例就是CLUSTAL。“變體”、“同源體”或“片段”與序列的等位變異是同義的。“變體”也包括與能與此處提供的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。優選“變體”包括與以下序列互補的序列，這些序列能在嚴緊條件(例如，65℃和0.1SSC(1×SCC=0.15MNaCl,0.015檸檬酸鈉pH7.0)下與此處所提供的核苷酸序列雜交。本發明也包括能與此處所提供的核苷酸序列雜交的序列(包括此處所提供核苷酸序列的互補序列)。優選，本發明包括能在嚴緊條件下(例如，65℃和0.1SSC)與本發明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，與此處所提供核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括此處所提供序列的互補序列)。與VSV糖蛋白相比較，應用狂犬病毒糖蛋白的一個主要的優點就是，由于狂犬病疫苗的廣泛應用，對狂犬病毒對人和其它動物的毒性有詳細的了解。尤其是有關應用從作為人類疫苗的金絲雀痘病毒重組體表達的糖蛋白的1期臨床實驗已經有報道(Frieseta1.,1996Vaccine14,428-434)。這些研究得出結論是此疫苗用于人類是安全的。本發明的逆轉錄病毒載體對于在體內或體外傳遞一個或更多NOI進入細胞是有用的，尤其是有治療性活性的NOI的傳遞。一個或更多所選的NOI可以整合到載體基因組中而在靶細胞中表達。此NOI可以有一個或更多的它們自己的表達控制序列，或者它們的表達可以被載體的LTR所控制。為了此NOI的合適表達，這些LTR中或之間可能包括一個啟動子，它在一定條件或一定細胞型中優先激活。此NOI可能是有義序列或反義序列。而且，如果有很多NOI，那么那些NOI可能是有義序列或反應序列或者是它們的組合體。本發明逆轉錄病毒載體的基因組可能通常包含有5’末端和3’末端LTR，一個或更多NOI，此NOI含有治療活性的基因和/或標記基因，或一個或多個NOI的適合的插入位點，以及能使基因組在生產細胞中包裝成載體粒子的包裝信號。其中甚至含有合適的引物結合位點和整合位點，以允許載體RNA到DNA的反轉錄，及原病毒DNA整合進入靶細胞基因組。在優選方案中，此逆轉錄病毒載體粒子具有一個逆轉錄系統(相容性逆轉錄和引物結合位點)和一個整合系統(相容性整合酶和整合位點)。因此，根據本發明，使控制病毒基因組或逆轉錄病毒載體的核苷酸序列成為可能，從而使病毒的基因由一個或更多的NOI來取代或補充。這些NOI也可以是任何一個或更多的選擇基因，標記基因及治療基因。許多不同的選擇性標記已經成功地應用于逆轉錄病毒載體。這些不同的標記在《逆轉錄病毒》(1997,ColdSpringHarbourLaboratoryPressEds:JMCoffinSMHughes,HE,Varmas頁444)一書中有綜述，包括以下(但不局限于這些)細菌的新霉素和潮霉素磷酸轉移酶基因，它們分別提供對G418和潮霉素的抗性；一種突變的小鼠二氫葉酸還原酶基因，其提供對氨甲蝶呤的抗性；細菌的gpt基因，此基因能使細胞在含有霉酚酸、黃嘌呤、氨基蝶呤的培養基上生長；細菌的hisD基因，此基因能使細胞在沒有組氨酸而含有組氨醇的培養基上生長；多藥物抗性基因(mdz)，此基因提供對許多藥物的抗性；以及嘌呤霉素或腐草霉素抗性的細菌基因。所有的這些標記都是顯性選擇標記，并允許對表達這些基因的細胞進行化學選擇。根據本發明，此NOI可以是一個治療基因--從這個意義上講此基因本身可能產生一種治療效應或者它編碼一個能產生治療效應的產物。治療性NOI的非限制性的實例包括編碼以下因子的基因腫瘤抑制子蛋白，細胞因子，抗病毒蛋白，免疫調節分子，抗體，工程免疫球蛋白類似分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，血管活性蛋白或多肽，生長因子，核酶，反義RNA，酶類，前體藥物，例如前體藥物激活酶類，細胞毒性物質及酶抑制劑。前體藥物的實例包括但不限于這些表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(與堿性磷酸酶共用)，5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶共用)；阿霉素-N-對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素V酰胺酶共用)，對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸(與羧肽酶G2共用)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸鹽(與β-內酰胺酶共用)，SR4233(與p450還原酶共用)；9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶共用)，芥子前體藥物和硝基還原酶及環磷酰胺或異環磷酰胺(與細胞色素P450)。可以治療的疾病包括但不僅限于這些癌癥，心臟病，中風，神經退行性疾病，關節炎，病毒感染，細菌感染，寄生蟲的感染，免疫系統疾病，病毒感染，腫瘤、血凝病，及遺傳性疾病--如慢性肉芽腫，自毀容貌綜合癥，帕金森氏癥，肺氣腫，苯丙酮尿癥，鐮刀狀細胞貧血，α-地中海貧血，β-地中海貧血，戈謝病。應用逆轉錄病毒載體進行基因治療的靶細胞包括但不僅限于這些造血細胞(包括單核細胞，巨噬細胞，淋巴細胞，粒細胞，或任何這些細胞的祖細胞)，內皮細胞，腫瘤細胞，基質細胞，星形細胞，或膠質細胞，肌肉細胞，上皮細胞，神經元，成纖維細胞，肝細胞，星形細胞和肺細胞。在本發明的逆轉錄病毒載體中，一個或更多的NOI能在病毒LTR的轉錄控制之下。或者，增強子-啟動子元件的組合能夠存在以實現表達的更高水平。這些啟動子-增強子元件優選是有很強的活性或能夠在靶細胞中被強烈誘導的。一種強活性啟動子-增強子組合的實例就是，人巨細胞病毒(HCMV)的主要中早期(MIE)啟動子/增強子組合。此啟動子-增強子組合在活性上可能是組織或時序限制的。合適的組織限制性啟動子-增強子組合的實例就是那些在腫瘤細胞中有高度活性的組合，象來自于MUCl基因或CEA基因的啟動子-增強子組合。組織缺氧或局部缺血可調節性表達可能在某些條件下也特別有用。在很大范圍的不同細胞類型中，組織缺氧是基因表達的一個強有力的調節因素，并且通過低氧可誘導轉錄因子活性的誘導來起作用，例如低氧可誘導因子-1(HIF-1)(Wang和Semenza1993PNAS(USA)90:430)，其結合到同源DNA識別位點上，也就是不同基因啟動子的低氧應答元件(HRES)上。來自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)基因HRE的多聚體形式已被用來控制人纖維肉瘤細胞應答于體外或實體瘤內的低氧的標記基因和治療基因的表達(Firthetal1994，PNAS91(14):6496-6500；Dachsetal1997NatureMed5:515)。或者，葡萄糖缺乏在腫瘤的局部缺血區域也存在，這種現象能被用來激活特別是在腫瘤細胞中異源基因的表達。一個已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動子截短的632堿基對的序列，已被研究表明在鼠體內腫瘤中能驅動一種報告基因的高水平表達(Gazitetal1995CancerRes.55:1660)。接下來用于基因治療的本發明逆轉錄病毒載體的基因組優選含有作為載體起到有效功能所必需的最小的逆轉錄病毒材料。這樣的目的是為NOI的整合提供空間，及為了安全的原因。逆轉錄病毒載體的基因組優選復制缺陷的，這種缺陷緣于編碼一個或更多結構(或包裝)成分的功能基因的缺失，這些成分由gag-pol和env基因編碼。這些病毒粒子生產所需的成分的缺乏，在生產細胞中通過反式方式來提供。基因組中病毒結構成分的缺乏同樣意味著針對在靶細胞中表達的病毒蛋白的不良免疫反應被降低或消除。而且，在渴望體內應用的條件下，可能的感染病毒粒子的重建優選被避免了。因此，病毒的結構成分優選盡最大可能地從基因中去除掉，以降低任何成功重組的可能。本發明中的逆轉錄病毒載體粒子一般在一種合適的生產細胞中產生。生產細胞通常是哺乳動物細胞但也可能是其它細胞如昆蟲細胞。一種生產細胞可能是含有一個通常整合于其基因組的病毒結構基因的包裝細胞。為了生產具感染性的，復制缺陷性的載體粒子，此包裝細胞然后被編碼載體基因組的核酸轉染。或者，生產細胞可用編碼載體基因組的核酸序列和結構成分共轉染，和/或用存在于一個或多個表達載體如質粒、腺病毒載體、皰疹病毒載體上的核酸序列共轉染，或使用任何其它已知的將功能DNA導入靶細胞的方法。根據本發明的高度優選的方案，我們驚奇地發現來自狂犬病毒的被膜蛋白，即狂犬病毒G蛋白，能有效地假型化很多不同的逆轉錄病毒載體。這些載體不僅包括構建自鼠致癌逆轉錄病毒的，例如MLV的載體，還包括構建自靈長類動物慢病毒例如HIV病毒的載體，及構建自非靈長類動物慢病毒例如馬傳染性貧血病毒(EIAV)的載體。在一個方案中，本發明的載體是從一個慢病毒構建或是衍生而來。這就有一個優點，就是此載體可能能夠轉導分裂細胞和非分裂細胞。因此，本發明優選的假型化逆轉錄病毒載體是慢病毒載體，如HIV或EIAV載體，這些載體有上面所提及的優點。特別是假型化的狂犬病毒G蛋白慢病毒載體具有狂犬病毒靶細胞范圍，能夠轉導中樞神經系統的非分裂細胞如神經元。本發明的發現是令人驚訝的。在這個方面，盡管狂犬病和VSV都屬于桿狀病毒科(這是一個包含5個不同種類亞群的科)，但它們(也就是VSV和狂犬病毒)是在不同的亞群。而且，狂犬病毒G蛋白與VSV-G只有很小的同源性(Roseetal.,1982“病毒學雜志”43:361-364)。狂犬病毒G蛋白的胞質區為大約44氨基酸，較VSV-G的胞質區長得多，VSV-G的胞質區為28至31個氨基酸。因此，發現狂犬病毒G蛋白能假型化MLV是出乎意料的。而且還表明切短HIV-1144個氨基酸的胞質尾是MLV粒子有效假型化所必需的(Mammanoetal.,1997“病毒學雜志”71:3341-3345)。狂犬病毒G蛋白另外還能假型化其它逆轉錄病毒如慢病毒群中的病毒也同樣使人驚訝。因此，一方面本發明提供了用狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉錄病毒載體粒子。另一方面，本發明提供了一個逆轉錄病毒載體的生產系統，這個系統包含編碼狂犬病毒G蛋白的核酸序列，編碼逆轉錄病毒載體基因組的核酸序列，和可選的一個或更多編碼產生含有有此基因組的感染性逆轉錄病毒粒子所需包裝成分的核酸序列。第三方面，本發明提供了狂犬病毒G蛋白改變逆轉錄病毒載體靶細胞范圍的用途。另一方面，本發明提供了一種生產逆轉錄病毒載體顆粒的方法，此載體粒子的被膜含有狂犬病毒G蛋白，此方法包括提供如此處所述，存在于一種生產細胞中的逆轉錄病毒載體生產系統，置生產細胞于適合載體粒子成分表達及載體粒子生產的條件下，以及從上清液中收獲載體粒子。又一方面，本發明提供一種用NOI轉導靶細胞的方法，此方法包含按其中所述將細胞與逆轉錄病毒載體粒子接觸，在允許載體吸附并進入到細胞的條件下，用NOI轉導靶細胞使得NOI進入靶細胞的基因組。根據本發明，在載體的被膜中除了狂犬病毒的G蛋白外，還可能有一種或更多的其它被膜蛋白。例如這可能包括一種逆轉錄病毒本身的被膜蛋白。除了假型化蛋白外，還利用一個本病本身的被膜蛋白能夠有利于被膜的穩定和/或功能，甚至還可以擴大此載體的感染范圍。本發明還為個體的基因治療提供了藥物組合物，其中此組合物包含治療有效量的逆轉錄病毒載體。此藥物組合物可以作為人用或獸用。一般，醫生將確定最適合某一個體的實際劑量，并且此實際劑量將隨年齡、體重及具體病人的反應來確定。這種組合物可以可選地包括一種可藥用的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。藥物載體、賦形劑或稀釋劑可以根據希望的用藥途徑和標準的制藥實踐來選擇。此藥物組合物除了含有載體、賦形劑或稀釋劑之外，也可以含有任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑及輔助或增加病毒進入靶位點的其它載體物質(如脂質傳遞系統)。合適時，此藥物組合物能通過以下任何一種或更多的方式來給藥吸入，以栓劑或陰道藥栓的形式，以洗劑、溶液、乳劑、藥膏或撒粉的形式局部用藥，使用皮膚用貼片，以含如淀粉或乳糖等賦形劑的片劑形式，或以含香味劑或生色劑的酏劑、溶液或懸浮液的形式口服，或者可用不經腸道的注射，如海綿竇內注射、靜脈注射、肌肉注射或皮下注射。不經腸道給藥時，此組合物最好以無菌水溶液的形式使用，此水溶液可以含有其它的物質，如足夠的鹽類或單糖類，以便此水溶液與血液等滲。用經口或舌下的給藥方式，此藥物組合物可以以片劑或錠劑來給藥，這些片劑或錠劑可以按常規方式配制。因此，總言之，本發明涉及的是具有異源被膜蛋白的一種逆轉錄病毒載體，尤其是一種狂犬病毒G蛋白。本發明還涉及生產其被膜含有狂犬病毒G蛋白的逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒載體生產系統，以及載體和系統的生產方法，以及有關載體和系統使用的方法。現在僅用實例的方式并參照附圖敘述本發明，其中圖1顯示一個質粒圖譜；圖2顯示一個凝膠照片；圖3顯示一組圖解示意圖；圖4顯示一個圖5顯示兩個圖；及圖6顯示一個圖解示意圖。實施例1表達狂犬病毒G蛋白載體的生產和使用的其它載體的詳細說明。通過將來源于pSG5rabgp(Burgeretal1991“普通病毒學雜志”72:359-367)的1.7kbBglⅡ狂犬病毒G片段克隆至pSA91(圖1)來構建狂犬病毒G的表達載體，pSA91是pGW1HG(Soneokaetal1995NuelAcidsRes23:628-633)的衍生質粒，通過BamHⅠ消化除去gpt基因并重新連接而獲得。這種構建體pSA91RbG允許狂犬病毒G從人巨細胞病毒(HCMV)即時早期基因啟動子-增強子表達。該質粒與pONY3(詳細構建見后)和pONY2.1nlsLacZ(詳細構建見后)一起轉染進293T細胞，使用Soneokaetal1995(ibid)描述的方法，用Western印跡證實在轉染細胞中狂犬病毒G的表達。一個VSV-G表達質粒被用作負對照，該質粒中用VSV-G基因代替pSA91中的狂犬病毒G基因在HCMV的控制下表達。用PBS洗轉染細胞，在含1mM新配制的PMSF的RIPA緩沖液中裂解，并用BCA蛋白測定試劑盒，按其詳細操作說明測定總蛋白濃度。50ug的細胞裂解物在10％的SDS/PAGE上電泳。凝膠被電轉印到immobilon膜上(Millipore公司)。用1∶3000稀釋的抗狂犬病毒G蛋白的小鼠單克隆抗體17D2和1∶1000稀釋的連接有抗小鼠IgG的兔過氧化物酶(VectorLaboratories,PeterborougUK)進行Western印跡分析。用ECL試劑盒(AmershamInternational,UK)通過化學發光法進行測定。在用pSA91RbG轉染的細胞中明顯存在一個與報道的狂犬病毒G蛋白大小相當的64KD帶(圖2)。在所有的以下的實例中，如前描述的(Soneokeetal1995,ibid)三質粒轉染方法被用作生成假型化載體。在這些實驗中使用的質粒如下pHITⅢ和pHIT60分別表示含有大腸大菌LacZ標記基因和MLVgag-pol基因的MLV載體(Soneokaetal,1995)。pH32和pGP-RRE3是相應的HIV載體成分(Kimetal1998“病毒學雜志”72:811-816)。pONY2.1nlsLacZ和pONY3是相應的EIAV載體成分(英國專利申請9727135.7)。這些載體的重要特征，包括EIAV載體的特征顯示于圖3。在圖3中使用的縮寫和標記描述如下<tablesid="table2"num="002"><table>CMVSV40LTRRU3ΔU3U5ψtatrevRREenvΔenvgagΔgagpolvifpAlacZneo人類巨細胞病毒即時-早期增強子/啟動子區域猿病毒40增強子和早期啟動子區域長末端重復LTR的重復區域LTR的3’主要獨有序列一種不完全的U3序列LTR的5’主要獨有序列基因組包裝信號調節蛋白調節蛋白rev應答元件編碼被膜蛋白的基因含有缺失的env基因，使得一種平截蛋白被產生衣殼蛋白的編碼區域含有缺失的gag區域，使得一系列不完全的衣殼蛋白被產生編碼酶蛋白的區域病毒感染因子聚腺苷化信號編碼β-半乳糖苷酶的基因編碼新霉素磷酸轉移酶的基因</table></tables>EIAV載體的構建如下。由如Payneetal(1994,J.Gen.Virol.75:425-9)描述的一個感染性前病毒克隆pSPEIAV19被用作開始點。通過從編碼被膜蛋白的質粒區域的5835-6571HindⅢ片段的缺失構建質粒pSPEIAVΔH。通過插入EIAVLTR至pBluescriptⅡKS+(Stratagene)構建一個基因組質粒載體，EIAVLTR是用PCR從pSPEIAV19擴增的。然后將pSPEIAVΔH的MluⅠ/MluⅠ(216/814)片段插入LTR/Bluescript質粒中形成pONY2。此外，缺失掉pol(1901/4949)內的BglⅡ/NcoⅠ片段，并在該位置插入由HCMVIE增強子/啟動子驅動的核內定位的β-半乳糖苷酶基因。該質粒稱為pONY2.1nlsLacZ.。通過插入來源于pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片段到哺乳動物表達質粒pCI-neo(Promego)中形成一個編碼gagpol基因的EIAV質粒(pONY3)，使gag-pol蛋白從HCMVIE增強子/啟動子表達。實施例2用狂犬病毒G蛋白假型化逆轉錄病毒載體如前描述的(Soneokaetal1995)三種質粒的轉染方法被用作生成假型化載體。在開始的實驗中，在6孔的組織培養皿的孔中，10μgpSA91RbG與10μggag-pol表達質粒和表達大腸桿菌lacZ基因的逆轉錄病毒載體進行共轉染。用VSV-G假型化的實驗被用作這些實驗的正對照，其中10μg的pRY67代替pSA91中的狂犬病毒G,pRY67是一種VSV-G表達質粒，其中VSV-G在人巨細胞病毒啟動子/增強子的控制下表達。在人腎細胞系293T中(如在Soneokaetal1995中描述的)中進行轉染，以生產載體病毒粒子。轉染后36小時收獲培養上清液，并用0.45mm孔徑的過濾器(Millipore)過濾。與狂犬病在體內的神經元專一性相比，狂犬病毒的實驗室毒株在體外能與廣泛的細胞系相互作用(ReaganandWunner1985“病毒學紀事”84:277-282)。因此對兩個細胞系作為以狂犬病毒G假型化的逆轉錄病毒載體的靶細胞進行了評價，它們分別是幼倉鼠腎細胞系BHK21細胞和狗黑素瘤細胞系D17細胞。細胞在感染前一天接種至6孔組織培養皿中，接種量為3×105Cells/孔。通過用適當的質粒轉染293T細胞制備病毒上清液，即將上述的假型化EIAV,HIV-1和MLV載體加入到這些細胞中。在轉導時，Polybrene(8ug/ml)被加入到每孔1ml的培養上清液中。感染12小時后，用新鮮培養基置換培養上清液。為了測定病毒效價，在感染后48小時，洗滌、固定和染色細胞。用pSA91RbG和pRV67與所有三種逆轉錄病毒載體構建體轉染時，我們能觀察到D17細胞的β-半乳糖苷酶陽性克隆。不用pSA91RbG或pRV67轉染則沒有β-半乳糖苷酶陽性克隆，說明被膜對轉導發生是必需的。若用BHK21細胞感染，僅能在MLV假型體中觀察到β-半乳糖苷酶陽性克隆，而在EIAV和HIV假型體中觀察不到。這種不能產生β-半乳糖苷酶陽性克隆的原因可能是因為在這種細胞類型中結合后封閉EIAV和HIV-1。這些結果證實狂犬病毒G能假型化EIAV,HIV和MLV載體。通過比較這些假型化載體的病毒效價研究了假型化的效率。從β-半乳糖苷酶陽性克隆的數目來估計病毒的效價(表1)。表1含有狂犬病毒G蛋白的假型化逆轉錄病毒載體的相對效率<tablesid="table4"num="004"><table>病毒成分基于以下細胞估計每ml中轉導粒子的數目D17BHK-21逆轉錄病毒載體相應的質粒構建體Gag-pol表達質粒被膜表達質粒產生的假型化載體1EIAVpONY2.1nlsLacZpONY3pRV67EIAV-VSVG8.4×104＜1012EIAVpONY2.1nlsLacZpONY3pSA91RbGEIAV-RbG3.2×104＜1013HIVpH4ZpGP-RRE1pRV67HIV-VSVG3.0×104＜1014HIVpH4ZPGP-RRE1pSA91RbGHIV-RbG6.4×103＜1015MLVpHIT111pHIT60pRV67MLV-VSVG6.3×1064.8×1066MLVpHIT111pHIT60pSA91RbGMLV-RbG1.6×1067.8×106</table></tables><tablesid="table5"num="005"><table>7Mock＜101＜101</table></tables>在兩個試驗細胞系中用狂犬病毒G假型化的MLV的病毒效價與觀察到的VSV-G假型體相當(在BHK21中，VSV-G與狂犬病毒G各自為4.8×106和7.8×106；在D17細胞中VSV-G和狂犬病毒G各自為6.3×106和1.6×106)。在D17細胞中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化EIAV和HIV-1得到相似結果。用VSV-G和狂犬病毒G假型化的載體的EIAV病毒效價分別為8.4×104和3.2×104。在HIV-1中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化的病毒效價分別為3.4×104和6.4×103。這些結果說明狂犬病毒G在用三種逆轉錄病毒載體假型化中如VSV-G一樣有效。我們的結果說明狂犬病毒G能假型化逆轉錄載體EIAV,HIV-1和MLV，產生與用VSV-G假型化相當的高效價。實施例3-含有改變氨基酸333的狂犬病毒G蛋白的生產和表征在pSA91RbG中，狂犬病毒糖蛋白基因的編碼序列被用重疊PCR改造，使得所產生的蛋白在333位具有谷氨酰胺而不是精氨酸。這一改變被報導在狂犬病毒中引起減毒作用和改變細胞嗜性。用作誘變的引物如下正向引物5’GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGA3TCCTCCC反向引物5’GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGT3GAGCATC這一改造片段作為SphⅠBglⅡ片段被重新引入pSA91Rg中，產生的質粒是pSA91RM。從這種載體產生的改造的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力被測試。如Soneokaetal1995描述的將該質粒與pHIT60和pHI111一起轉染進293T細胞，pSA91Rg被用作正對照。如前所述收集這些轉染的上清液，且通過其轉導BHK-21或鼠成神經細胞瘤細胞系C-1300克隆NA的能力來評估兩種被膜假型化MLV粒子的能力(表2)。表2含有改變的氨基酸333的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力的表正盡管用改造的狂犬病毒G蛋白在一般用于生產狂犬病毒疫苗的BHK-21細胞上獲得的效價低于野生型的，但是在C-1300細胞上兩種被膜蛋白獲得的效價相當。這些結果說明改造的蛋白能有效地假型化MLV粒子。實施例4-狂犬病毒G假型化的逆轉錄病毒載體的效價優化對其他兩種成分滴定了添加到3質粒轉染系統中的pSA91RbGDNA的量以便測定最佳病毒效價。在該實驗中，使用CaPO4沉淀法用質粒pSA91RbG,pHIT111和pHIT60轉染COS-1細胞。后兩種質粒等量(8ug/轉染/35mm皿)，而pSA91RbG的量依次減少。轉染36小時后收獲轉染上清液，且在HT1080細胞上測定存在的轉導粒子數目。結果顯示于圖4。與其它質粒相比pSA91RbGDNA的量減少8倍產生了最高效價。總效價比在例1中從293T細胞獲得的低。對產生基于EIAV的載體需要的兩種成分也進行了pSA91RbG的滴定。在這種情況中，用含有8ug編碼gag/pol(pONY3)質粒和8ug表達編碼β-半乳糖苷酶(pONY2.1inLacZ)的EIAV載體的質粒通過CaPO4沉淀轉染293T細胞。如上添加不同量的pSA91RbG或pRY67以分別提供用狂犬病毒G或VSV-G假型化的載體。轉染36小時后收獲轉染上清液，并在D17細胞上測定存在的轉導粒子數目。結果顯示于圖5。與其他質粒相比pSA91RbGDNA的量減少2-4倍產生了最高效價。當用和其他兩種質粒等量的pRV67時，沒有觀察到效價的明顯減少。這些結果表明，通過調整狂犬病毒G和在生產細胞中表達的載體成分的相對量來獲得狂犬病毒G假型化的逆轉錄病毒載體的較高效價是可能的。實施例5-狂犬病毒G假型化的逆轉錄病毒載體的濃縮我們更進一步研究了用超速離心的方法(Burnsetal1993PNAS90:8033-8037)濃縮病毒上清液是否能增加病毒的效價，超速離心時，用VSV-G假型化的基于MLV的載體得到了每ml含有109轉導粒子的病毒效價。如前所述(Soneokaetal.,1995)的三質粒轉染方法被用來生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。轉染36小時后收獲轉導粒子，超速離心濃縮并在D17細胞上滴定。48小時后，這些細胞進行β-半乳糖苷酶染色。取三次獨立試驗的效價的平均值并計算作為每ml半乳糖苷酶的生產單位。試驗間的變異不超過10％。已經證明可以降低收獲體積至130倍，而用兩種被膜之一假型化的EIAV和MLV粒子的轉導粒子沒有明顯降低。表3濃縮對狂犬病毒G假型化逆轉錄病毒載體的影響這些結果表明用狂犬病毒G假型化的載體能用超速離心濃縮，使載體效價增加到與用VSV-G假型化的載體相當的效價。這些特性和狂犬病毒G在體內對神經元細胞的專一性使得用狂犬病毒G假型化非常有吸引力，因為攜帶任何治療基因的逆轉錄病毒載體容易靶向神經系統。實施例6-狂犬病毒G假型體轉導培養的人類靶細胞的能力的選擇性用人類神經和非神經源細胞系測定了用狂犬病毒G假型化的載體的細胞專一性。用VSV-G假型化的實驗被用作陽性對照。由三種質粒轉染制備的病毒上清液用來感染人類成神經細胞瘤細胞系IMR-32和人類T細胞系CEM-A。從β-半乳糖苷酶陽性克隆估計病毒效價(表4)。表4狂犬病假型化轉導培養的人類靶細胞能力的選擇性用狂犬病毒G和VSV-G假型化的MLV載體能感染IMR-32細胞。但用狂犬病毒G假型化的MLV載體產生的效價(3.1×105)是用VSV-G假型化的MLV載體(4.9×103)的100倍。在CEM-A細胞中，用狂犬病毒G假型化的MLV載體產生了1.7×101的低效價。這種低效率不是由于MLV沒有能力轉導這些細胞。證明這點的證據是當用VSV-G假型化的同樣載體有比較高的效價(7.3×102)。我們的結果說明不象VSV-G，狂犬病毒G假型體顯示了它們轉導人類靶細胞能力的選擇性，在神經細胞系中的轉導效率高于在T細胞系中的轉導效率。實施例7-狂犬病毒G假型體在體外(原代培養)和體內(大鼠/小鼠模式系統)轉導腦細胞的能力。有證據認為在體內狂犬病毒至少使用了兩種不同的受體(Hanhametal,1993“病毒學雜志”67:530-542；Tuffereauetal，“病毒學雜志”72:1085-1091)，這些受體中的一種可能是煙堿乙酰膽堿受體。在小鼠模式系統中，用野生型狂犬病毒(CVS毒株)和這種毒株的雙突變(氨基酸330和333改變)詳細地研究了它們感染的神經細胞的類型和在整個神經系統中病毒的傳播(Coulouetal；1989“病毒學雜志”63:3550-3554；Lafayetal,1991“病毒學”183:320-330)。這些研究結果表明突變病毒的傳播和范圍與野生型相比較受到重大限制。為了測定用狂犬病毒G蛋白假型化的EIAV載體的趨性，采用了以下分析。成年雌性AO大鼠被麻醉并在紋狀體或其它大腦區域趨觸性地注射2×1μl的病毒原種。注射7或30天后，麻醉大鼠，并用4％的多聚甲醛灌流心臟。取出大腦，固定24小時，用30％的蔗糖飽和，并在冷凍切片機上切片(50μm)。切片用X-gal溶液染色3小時至過夜，固定標本在載玻片上并用光學顯微鏡分析。用三重標記免疫熒光法鑒定轉導的具體細胞類型，使用對神經細胞元(NeuN或其它的)、星形細胞(GFAP)或少突細胞(Galc)特異性的抗體和β-半乳糖苷酶以及種特異性的第二抗體。用共聚焦顯微鏡分析轉導的大腦區域的成像。用于體外轉導試驗的原代神經元被置于大鼠胚胎培養物中，生長至完全分化為止。用4μg/ml的polybrene添加病毒載體5小時。兩天后更換培養基并用X-gal染色或抗體進行表達的分析。實施例8-狂犬病毒G假型化HIV-1載體的濃縮和用VSV-G和狂犬病毒被膜生產這種載體的比較。實施例5說明，狂犬病毒G假型化EIAV載體能用如已報導的VSV-G假型化載體相同的方式通過超速離心進行有效濃縮。我們已經延長了這些觀察，表明狂犬病毒G能被用于假型化HIV-1載體，這些粒子能通過超速離心進行有效濃縮，在D17細胞上獲得的效價與用VSV-G假型化載體獲得的效價相當。如前所述(Soneokaetal.,1995)的三質粒轉染方法被用于生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。用于該試驗的HIV-1質粒pH4Z和pGP-RRE3已被Kim等描述(1998“病毒學雜志”72:811-816)。用于這種試驗的成分比率，對于狂犬病毒G是gag/pol基因組被膜為1∶1∶1，對于VSV-G是gag/pol基因組被膜為1∶1∶0.5；這是用于COS1細胞的變化比率，因為我們發現293T細胞比COS細胞更抗狂犬病毒G蛋白的表達。轉染后48小時收獲轉導粒子，通過超速離心濃縮并在D17細胞上滴定。48小時后，這些細胞進行β-半乳糖苷酶染色。這證實用兩種被膜中的任一種假型化的HIV-1粒子收獲物的效價可以增加大約100倍(表5)。用任一種被膜假型化的載體獲得的效價并無明顯差別。這些結果說明用狂犬病毒G假型化的載體能通過超速離心濃縮，使載體效價增加到與VSV-G假型化載體相當，并且在D17細胞上這兩種被膜同樣有效。表5討論及概述如前所述，逆轉錄病毒和來源于逆轉錄病毒的載體需要一種特殊的被膜蛋白，以有效地轉導靶細胞。被膜蛋白在生產病毒或載體的細胞中表達并整合進病毒或載體粒子。逆轉錄病毒粒子由來源于gag基因的蛋白核心組成，該蛋白核心中包圍有病毒RNA。然后該核心被包圍在一種細胞膜部分中，其中含有來源于病毒env基因的一種被膜蛋白。被膜蛋白以前體的方式被生產，該前體能被加工成2個或3個單位。這些單位分別是表面蛋白(SU)，跨膜蛋白(TM)和胞質尾(Coffin1992inTheRetroviridae,PleumPress,edLevy)，表面蛋白完全在被膜的外部，跨膜蛋白與表面蛋白相互作用，包含有膜跨區域。在一些逆轉錄病毒中，一個小肽從跨膜蛋白中被除去。為了充當一種有效的被膜蛋白，有能力與靶細胞表面結合并介導病毒的進入，被膜蛋白不得不用精確的方式與靶細胞表面適當的受體作用，使得病毒粒子以適當的方式內化，以傳遞基因組至細胞的正確區域，在該區域進行生產性感染。已經多次嘗試用來源于一種病毒的被膜去包裝不同的病毒，這一過程被稱之為假型化。假型化的效率是高度可變的，似乎被被膜的胞質尾和病毒粒子的核心蛋白間的相互作用強烈地影響。被膜蛋白被吸收進出芽病毒粒子的過程現在所知甚少，但已知道這一過程是選擇性的，因為大多數的細胞蛋白被逆轉錄病毒粒子排除(Hunter1994SeminVirol5:71-83)，并且在一些逆轉錄病毒中，已經記錄到在缺乏被膜蛋白的情況下發生的出芽(Einfeld1996CurrTopMicrobiolImmunel214:133-176；KrausslichandWelker1996CurrTopMicrobiolImmunel214:25-63)。在一些逆轉錄病毒中，有證據表明被膜蛋白的胞質域與病毒核心間進行精確的分子間相互作用。Januszesk；等(1997“病毒學雜志”71:3613-3619)已表明，鼠白細胞瘤病毒(MLV)的胞質尾少量的缺失或取代就強烈地抑制被膜蛋白進入病毒粒子。對HIV-1,Casson(1996EMBOJ15:5783-5788)表明，HIV-1的基質蛋白與它的被膜蛋白的胞質域間直接相互作用。這種基質與被膜蛋白間的相互作用在被膜蛋白進入出芽的HIV病毒粒子中起著關鍵作用。這是由以下事實證實的，即如果綿羊髓鞘脫落病毒的gag多聚蛋白的基質域的氨基酸末端被等量的HIV-1基質域代替，綿羊髓鞘脫落病毒只能用HIV-1的被膜蛋白有效地假型化(Dorfmanetal.,1994“病毒學雜志”68:1689-1696)。然而這種情況是復雜的，因為HIV-1Env的截斷對于Molony氏白血病病毒的有效假型化是必需的(Mammanoetal1997“病毒學雜志”71:334-3345)，而人類泡沫病毒被膜蛋白的截斷會降低它假型化鼠白血病毒的能力(Lindemametal.,1997“病毒學雜志”71:4815-4820)。也有環境因素作用于逆轉錄病毒核心和它的被膜蛋白的胞質尾部間的相互作用。在一些細胞系中，EIAV的傳代延長導致糖蛋白的截斷，表明宿主細胞因素可根據被膜蛋白的C-末端域對病毒進行選擇(Riceetal.,199064:3770-3778)。這些研究和許多其它工作者的研究表明，即使密切相關的逆轉錄病毒是否能相互假型化也是不可能預言的。此外，如果一種所給的被膜對一種特定病毒的假型化失敗了，也不可能預測可能賦予假型化能力的分子改變。盡管假型化已經取得了一些成功，但顯然受到病毒成分和異源被膜蛋白間的相容性要求的限制。在逆轉錄病毒載體的構建中，需要改造天然病毒成具有不同靶細胞特異性的載體，以便能傳遞遺傳物質至更廣泛的或改變的細胞類型中去。完成這一方案的一種方式是通過改造病毒被膜蛋白以改變它的專一性。另一種方法是引進異源被膜蛋白至載體以代替或添加到病毒的天然被膜蛋白中。MLV被膜蛋白具有假型化多種不同逆轉錄病毒的能力。來源于一種兼嗜性病毒的MLV被膜蛋白能轉導廣泛的細胞類型，包括人類細胞。但有時候可能不希望逆轉錄病毒載體能感染大量的細胞類型。棒狀病毒水泡性口炎病毒(VSV)的被膜糖蛋白(G)是另一種已經證實有能力假型化某些逆轉錄病毒的被膜蛋白。逆轉錄病毒MLV已被成功地假型化(Burnsetal1993ProcNatlAcadSciUSA90:8033-7)，并形成了一種與MLV的天然形式相比含有改變的宿主范圍的載體。VSV-G假型化的載體已經證實不僅能感染哺乳動物細胞，而且能感染來源于魚、爬行類動物和昆蟲的細胞系(Burnsetal1993)。VSV-G蛋白也能假型化某些逆轉錄病毒是因為它的胞質尾能與逆轉錄病毒核心相互作用。VSV-G和MLV被膜蛋白都有短的胞質尾部，分別為28到31和32個氨基酸，長度非常相似。提供非逆轉錄病毒假型化被膜如VSV-G蛋白的優點是載體粒子能被濃縮至高效價而不喪失感染性(Akkinaetal；1996“病毒學雜志”.70:2581-5)。逆轉錄病毒被膜蛋白明顯地不能抵抗超速離心過程中的剪切力，可能是因為它們是由兩個非共價連接地亞單位組成的。通過離心亞單位間的相互作用也許被破壞。相比較而言，VSV糖蛋白是由單個單位組成。因而假型化VSV-G蛋白提供了潛在的優點。但是，可能也需要與使用VSV-G蛋白獲得的靶細胞專一性不同的靶細胞專一性。已經嘗試通過改造蛋白中的靶位點而改變VSV-G的靶細胞范圍。在1997年關于傳遞治療基因的靶載體策略會議上(ColdSpringHarbor,USA)報導這些嘗試是不成功的。因此需要改變逆轉錄病毒載體靶細胞范圍的其它方法。已經嘗試用其它棒狀病毒的被膜有效地假型化逆轉錄病毒。在1997年關于傳遞治療基因的靶載體策略會議上(ColdSpringHarbor,USA)僅有的一篇報導(Reiseretal)聲稱狂犬病毒和Mokola氏病毒的糖蛋白能假型化HIV-1粒子，但是獲得的效價遠低于用VSV-G蛋白獲得的效價。本發明通過提供一種已經用狂犬病毒蛋白特別是狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉錄病毒傳遞系統，希望克服這些問題。以上說明書中提及的所有出版物在此引用作為參考。本發明所描述的方法和系統的不同修改和變化對于本領域技術人員來說是顯而易見的，而不會偏離本發明的范圍和精神。盡管結合了具體的優選實施方案描述了本發明，但應該理解本發明不限于這些具體方案。實際上，本發明的權利要求書旨在包括本文所述的實施本發明的各種方式的修正，其對分子生物學及相關領域的技術人員來說顯而易見的。序列表SEQIDNO.1狂犬病毒毒株ERA的核苷酸序列Genbank位置RAVGPLS，入藏號M384521aggaaagatggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttccattgtgttt61tgggaaattccctatttacacgatactagacaagcttggtccctggagcccgattgacat121acatcacctcagctgcccaaacaatttggtagtggaggacgaaggatgcaccaacctgtc181agggttctcctacatggaacttaaagttggatacatcttagccataaaaatgaacgggtt241cacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttggttatgtcac301aaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagccgcgtacaa361ctggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgtaccctgacta421ccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatctccaagtgt481agcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctagcgggaagtg541ctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccacgattacaccatttggat601gcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttaccaatagtagagggaagag661agcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctatataagtcttt721aaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttatggatggaac781atgggtcgcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgatcagttggtgaa841cctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagttggtcaggaa901gagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatgacaaccaagtcagtgagtttcag961acgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatataccatattcaa1021caagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcagaacttggaatgagatcct1081cccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaacggggtgtt1141tttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagatgcaatcatc1201cctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgtgcaccccct1261ggcagacccgtctaccgttttcaaggacggtgacgaggctgaggattttgttgaagttca1321ccttcccgatgtgcacaatcaggtctcaggagttgacttgggtctcccgaactgggggaa1381gtatgtattactgagtgcaggggccctgactgccttgatgttgataattttcctgatgac1441atgttgtagaagagtcaatcgatcagaacctacgcaacacaatctcagagggacagggag1501ggaggtgtcagtcactccccaaagcgggaagatcatatcttcatgggaatcacacaagag1561tgggggtgagaccagactgtgaggactggccgtcctttcaacgatccaagtcctgaagat1621cacctccccttggggggttctttttaaaaaaSEQIDNO.2狂犬病毒毒株ERA的氨基酸序列Genbank位置RAVGPLS，入藏號M38452PID:g333574MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTILDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKFSLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL權利要求1．一種能轉導一個靶位點的逆轉錄病毒傳遞系統，其中該逆轉錄病毒傳遞系統包括編碼至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列；和一個或多個可來源于逆轉錄病毒、保證逆轉錄病毒傳遞系統對靶位點的轉導的其它核苷酸序列；其中第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列之一是異源的；并且第一核苷酸序列編碼能夠識別靶位點的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。2．根據權利要求1的逆轉錄病毒傳遞系統，其中第一核苷酸序列編碼全部的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。3．根據權利要求1或2的逆轉錄病毒傳遞系統，其中至少其它核苷酸序列之一可來源于一種慢病毒或一種致癌逆轉錄病毒。4．根據前述任一權利要求的逆轉錄病毒傳遞系統，其中其它核苷酸序列可來源于一種慢病毒或一種致癌逆轉錄病毒。5．根據前述任一權利要求的逆轉錄病毒傳遞系統，其中其它核苷酸序列可來源于MLV、HIV或EIAV。6．根據前述任一權利要求的逆轉錄病毒傳遞系統，其中該逆轉錄病毒傳遞系統包括至少一個NOI。7．根據權利要求6的逆轉錄病毒傳遞系統，其中NOI具有治療效應或編碼一種具有治療效應的蛋白。8．根據前述任一權利要求的逆轉錄病毒傳遞系統，其中靶位點是一種細胞。9．根據前述任一權利要求的逆轉錄病毒傳遞系統可獲得的病毒粒子。10．一種逆轉錄病毒載體，其中逆轉錄病毒載體是權利要求1到8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或可由其獲得。11．用權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體轉導的細胞。12．權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體在醫藥中的用途。13．權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體在制造一種藥物組合物中的用途，所述組合物用以傳遞一種NOI至需要其的靶位點。14．一種方法，包括讓一種細胞與權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體接觸。15．一種載體，用以制備權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體，其中該載體包括一個核苷酸序列，其編碼狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。16．一種質粒，用以制備權利要求1-8任一項的逆轉錄病毒傳遞系統或權利要求9的病毒粒子或權利要求10的逆轉錄病毒載體，其中該質粒包括一個核苷酸序列，其編碼狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。17．多種質粒，其中至少一種質粒是權利要求16的質粒，且至少一種其他質粒包括一個或多個可來源于逆轉錄病毒的核苷酸序列。18．狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子以影響該逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病粒子的感染譜的用途。19．狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子以影響該逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病粒子的宿主范圍和/或細胞嗜性的用途。20．用狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子。21．一種逆轉錄病毒傳遞系統，包括一個異源env區，其中該異源env區包括編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列的至少一部分。22．一種逆轉錄病毒傳遞系統，包括一段異源env區，其中該異源env區包括一個編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。23．基本上如本文所述的假型化逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體或逆轉錄病毒粒子。全文摘要描述了一種能夠轉導靶位點的逆轉錄病毒傳遞系統。此該逆轉錄病毒傳遞系統包括編碼至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列;和一個或多個可來源于逆轉錄病毒、保證逆轉錄病毒傳遞系統對靶位點的轉導的核苷酸序列;其中第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列之一是異源的;并且第一核苷酸序列編碼能夠識別靶位點的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體,變體,衍生物或片段。文檔編號A61K48/00GK1302334SQ99806500公開日2001年7月4日申請日期1999年5月21日優先權日1998年5月22日發明者K·A·米特拉法諾斯,D·帕蒂爾,A·J·金斯曼,S·M·金斯曼,F·M·埃拉德申請人:牛津生物醫學(英國)有限公司