專利名稱：誘導抗黑素瘤患者肺轉移的抗－腫瘤應答的方法
相關申請的交叉參考根據35 U.S.C.§119，本申請要求了1998年4月9日提交的臨時專利申請系列號No.60/081256的優先權，其全部公開內容引作參考。政府資金參考本文所描述的本發明是美國公共健康協會NIH資助號CA29348資助或授予的工作過程中完成的。美國政府對本發明享有一定權利。
Fujiwara等,J.Immunol.,1984,132,1571揭示結合半抗原三硝基苯(TNP)的小鼠腫瘤細胞將在鼠類系統中誘導抗未修飾腫瘤細胞的系統免疫性，前提是在沒有半抗原特異性抑制T細胞存在下小鼠首先對半抗原致敏。得自處理過的小鼠的脾細胞完全地特異性地抑制未處理受體動物體內腫瘤的生長。Hood等,I Immunol.,1987,138,3573揭示用結合TNP的紫外光誘導的“退化性”腫瘤免疫的小鼠能排斥非免疫性的結合了TNP的“進行性”腫瘤。此外，這些小鼠接著抵抗未結合的“進行性”腫瘤的攻擊。在另一個實驗體系中，Fujiwara等,J.Immunol.,1984,133,510證明環磷酰胺預處理后對三硝基氯苯(TNCB)敏感的小鼠通過腫瘤細胞的原位半抗原化作用可能會治愈大的腫瘤(10mm)；接著，這些動物特異性抵抗未結合的腫瘤細胞的攻擊。但是，這些結果不能證明從人自身性腫瘤分離到的半抗原化細胞在免疫治療中是否是有效的和是否能誘導腫瘤退化。
最近證實了與未修飾的組織起交叉反應的T細胞的存在。Weltzien和同事的揭示從用TNP-修飾的同源淋巴細胞免疫的小鼠產生的Ⅰ類MHC-限制的T細胞克隆對MHC-相關的，TNP-修飾的“自身”肽產生應答。Ortmann,B.,等,J.Immunol.,1992,148,1445。另外，已經確定了用TNP-修飾的淋巴細胞免疫小鼠導致脾T細胞的發育，其顯示體外對TNP-修飾的細胞第二增殖和細胞毒性響應。Shearer,G.M.Eur.J.Immunol.,1974,4,527。
這些實驗共同特性是用其中沒有誘導抑制細胞的介質中的半抗原致敏。來自環磷酰胺預處理的TNCB-致敏的小鼠的脾細胞表現出放射抗性“擴增的輔助細胞功能”，即它們特異性地擴大抗-TNP細胞毒性的體外產生。此外，一旦這些擴增的輔助細胞被體外暴露給TNP-結合的自身淋巴細胞激活，則它們能增加對不相關抗原(包括腫瘤抗原)的細胞毒性(Fujiwara等，1984)。Flood等(1987)，上文，證明這種增強的輔助細胞活性由具有Lyt-1+,Lyt-2-,L3T4+,I-J+表型的T細胞介導，并且推測這些細胞是抗抑制細胞，即一類新的免疫調節T細胞。
用黑素瘤對患者的免疫治療表明，用第一抗原匙孔血藍蛋白致敏之前三天，以高劑量(1000mg/M2)或低劑量(300mg/M2)給予環磷酰胺顯著增強了對該抗原的遲發型超敏反應的獲得(Berd等,Cancer Res.,1982,42,4862；Cancer Res.,1984,44,1275)。低劑量環磷酰胺預處理使轉移性黑素瘤患者對由于注射自身性黑素瘤疫苗應答的自身性黑素瘤細胞產生遲發型超敏反應(Berd等，Cancer Res.,1986,46,2572；Cancer Invest.,1988,6,335)。給予環磷酰胺導致外周血淋巴細胞非特異性T抑制細胞功能的減弱(Berd等.,CancerRes.,1984,44,5439；Cancer Res.,1987,47,3317)，可能是由于減少了CD4+，CD45R+抑制性誘導T細胞(Berd等，Cancer Res.,1988,48,1671)。該免疫治療方案的抗腫瘤效果顯示受到開始給予疫苗和對腫瘤細胞產生遲發型過敏反應之間過長的間隔的限制(Berd等，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,1988,29,408(#1626))。因此，對于提高這樣一種疫苗的治療效果使其更具免疫原性存在要求。
現在，大多數腫瘤免疫學家贊同T淋巴細胞浸潤腫瘤塊是通過免疫系統破壞腫瘤細胞的先決條件。結果，注意力主要放在什么變成已知為“TIL”治療，在這方面NCI的Dr.Stephen Rosen berg是先驅者。Dr.Rosen berg和其它人從人癌轉移灶提取出了幾種天然存在的T淋巴細胞，并且通過將其在體外與白細胞介素2(IL-2)(一種T淋巴細胞生長因子)一起培養而將其數量大大擴大。Topalian等，J.Clin.On Col.,1988,6,839。但是這種治療還不是非常有效的，因為注射的T細胞的局限性在于它們有“回到”腫瘤位點的能力。
據信人黑色素瘤表達獨特的為T淋巴細胞識別的表面抗原。Old,L.J.,Cancer Res.,1981,41,361；Van der Bruggen,P.,等，Science,1991,254,1643；Mu kherji,B.,等，J.Immunol.,1986,136,1888；和Anichini,A.,等，J.Immunol.,1989,142,3692。但是，本發明人所做工作之前的免疫治療方案的局限性在于難以體內誘導對于該抗原的有效的T細胞-介導的應答。
二十世紀六十年代末和七十年代初，英國St.Barthlomew’s醫院R.Powles研究小組對化療減輕癥狀之后的急性骨髓性白血病(AML)患者進行了一系列疫苗治療研究。他們使用了帶有BCG的異源AML細胞作為佐劑。進行了幾次試驗，都使用小的試樣規格(N=10-15)。與單獨的化療相比，使用化療和免疫治療的組合在某種程度上延長了存活時間，但是沒有延長不復發情況的存活時間。沒有發現嚴重的毒性；沒有發現自身免疫性(例如對正常骨髓的毒性。回顧起來這些試驗存在一些技術問題1)使用的是同種異體白血病細胞而不是自體白血病細胞；2)疫苗中白血病細胞的劑量是過量的(最多109個細胞/劑)；3)BCG劑量非常高并且BCG給藥的時間和部位與白血病細胞疫苗分離；和4)在患者接受細胞毒性藥物(保持或者鞏固化療)的同時給予疫苗。
治療人癌癥所使用的常規治療一般來說是不成功的。在本發明人工作之前，給予疫苗組合物也不能可靠地誘導細胞介導的免疫性的產生。因此，本領域仍然需求治療癌癥特別是癌轉移的新方法。現在，申請人發現了在轉移黑素瘤患者體內誘導抗腫瘤應答的有效方法，特別是誘導腫瘤消退的有效方法。
因此，一方面，本發明涉及通過對哺乳動物優選對人施用包括有效量的至少一種下述物質的組合物而誘導抗黑素瘤轉移的抗腫瘤應答的方法(ⅰ)基本上處于非生長期的半抗原修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞，(ⅱ)半抗原修飾的黑素瘤細胞膜，(ⅲ)從所述半抗原修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導抗腫瘤應答的T細胞。
本發明還涉及誘導至少一種下面的抗腫瘤應答腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過激活的T淋巴細胞的腫瘤浸潤，穩定疾病和患者存活時間的延長。
另一方面，本發明涉及誘導抗肺轉移的抗腫瘤應答的方法，優選完全或部分消退轉移和/或延長存活時間。
另一方面，本發明涉及分離的哺乳動物(優選人)的用半抗原修飾的黑素瘤細胞或膜，從這樣的細胞和膜分離的肽，和能介導抗腫瘤應答的T細胞，以及它們的組合物。
另一方面，本發明提供含有治療有效量的哺乳動物優選人的用半抗原修飾的黑素瘤細胞或膜，從這樣的細胞和膜分離的肽，T細胞，或者其適合對患有轉移黑素瘤優選肺轉移的哺乳動物施用的組合的疫苗組合物和劑型。
在本發明的另一方面，所述組合物含有一種佐劑，例如卡介菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCG),QS-21，去毒的內毒素和細胞因子，例如白細胞介素-2，白細胞介素-4,γ-干擾素，白細胞介素-12，白細胞介素-15和GM-CSF。
發明的詳細描述本文引述的所有專利，專利申請和參考文獻在這里引作參考。在不一致的情況下，以本公開內容為準。
本發明涉及通過給予有效量的含有至少一種下述物質的組合物而誘導抗黑素瘤(優選肺轉移)的抗腫瘤應答的方法(ⅰ)基本上處于非生長期的半抗原-修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導例如轉移消退的抗腫瘤應答的T細胞。
本發明的細胞、膜、肽和T細胞具有誘導至少一種下述抗腫瘤應答的性質腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過激活的T淋巴細胞的浸潤，遲發型超敏反應，和患者生存時間的延長。所述細胞、膜，肽和它們的組合物能引發具有浸潤哺乳動物腫瘤性質的T淋巴細胞，引發對哺乳動物腫瘤的炎癥免疫應答，引發對哺乳動物腫瘤的延遲型超敏反應和/或體外刺激T淋巴細胞。
本發明的黑素瘤細胞、膜、肽和T細胞和它們的組合物可以用來治療哺乳動物優選人的黑素瘤，包括治療轉移性和原發性黑素瘤。轉移性黑素瘤可以包括淋巴結，肺和皮下轉移。用本發明的制劑、組合物和方法可以治療Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌癥，優選治療Ⅲ期和Ⅳ期。根據本發明治療的肺轉移優選是小的肺轉移。為了本發明的目的，“小的”肺轉移直徑小于大約2cm，優選直徑小于大約1.5cm，最優選直徑小于大約1cm。在本發明的一個優選的實施方案中，哺乳動物黑素瘤轉移局限于所述哺乳動物的肺部。根據本發明要治療的肺轉移可以是單個或多個小結。在一個實施方案中，本發明用來治療家畜，例如貓科、犬科、馬科和牛科的成員。
應該明白本說明書關于分離的黑素瘤細胞的使用的任何公開內容同樣適用于使用黑素瘤細胞、膜、肽、T細胞或者它們的組合。本發明的制劑和它們的組合物黑素瘤細胞、膜、肽和T細胞在本文中統稱為本發明的制劑。此外，術語“提取物”可以用來統指破碎的黑素瘤細胞，分離的黑素瘤細胞膜和黑素瘤細胞肽。
本發明的分離的黑素瘤細胞，膜或肽從哺乳動物優選人的黑素瘤細胞制備。黑素瘤細胞的來源可以是肺、淋巴結或皮下腫瘤塊，包括轉移塊。在本發明的一個實施方案中，這些材料從貓、犬、馬或牛科動物的黑素瘤分離。本發明的T細胞從腫瘤塊例如轉移的肺和淋巴結塊分離，并且可以體外擴增。
對于本發明目的，黑素瘤細胞意指包括全黑素瘤細胞和破壞的黑素瘤細胞兩者。在本發明疫苗組合物中使用的黑素瘤細胞以及從中分離膜和肽的那些黑素瘤細胞可以是活細胞、減毒細胞或死細胞。施與患者后不生長和分裂的黑素瘤細胞(即它所基本上處于不生長狀態)可以在本發明中使用。如果對患者施用，則這樣的細胞是優選的。如這里所使用的，術語“不生長狀態的細胞”指活細胞、減毒細胞或死細胞，GO期細胞，全細胞或破碎細胞(或者全細胞和破碎細胞兩者)，即在體內不分裂的細胞。懸浮不生長狀態細胞的常規方法是技術人員公知的并且可以在本發明中使用。例如，可以在使用前照射細胞使其不生長和分裂。可以以例如2500R照射黑素瘤細胞。可以從非生長狀態的黑素瘤細胞或者能體內生長和分裂的黑素瘤細胞分離黑素瘤細胞膜和肽。優選地，在后一種情況下，黑素瘤細胞膜或肽制劑沒有污染能體內分裂的黑素瘤細胞。
從可以是淋巴結、肺和皮下來源的黑素瘤細胞分離黑素瘤細胞、膜和肽。優選地，黑素瘤細胞源自要治療的同一患者。黑素瘤細胞優選是同源的(例如自體性的)。定義為“同源性的”黑素瘤細胞不需要與受治療患者的腫瘤細胞或非腫瘤，體細胞遺傳上完全相同(即100％)。腫瘤細胞和患者之間MHC分子的遺傳上的同一性一般就足夠了。另外，黑素瘤細胞上的特定抗原和患者腫瘤細胞上存在的抗原之間可能存在遺傳同一性。可以根據本領域公知的方法測定遺傳同一性。對于本發明的目的，經遺傳工程改變(例如使用重組DNA技術)而變得與例如患者的特殊的MHC分子和/或患者癌細胞上特定抗原遺傳相同的黑素瘤細胞也包含在術語“同源性”黑素瘤細胞的含義內。而且，這樣的細胞也可以稱之為“MHC-相同”或“MHC-相容”。來自遺傳不同的相同物種的哺乳動物的黑素瘤細胞，例如同種異體細胞也可以用于本發明黑素瘤細胞膜和肽的制備。黑素瘤細胞可以是，但不局限于自活組織檢查樣品或者組織培養解離的細胞。從同種異體細胞和干細胞分離的細胞膜也在本發明范圍內。
黑素瘤細胞膜可以包括所有細胞膜，例如外膜、核膜、線粒體膜、液泡膜、內質網膜、高爾基復合體膜和溶酶體膜。在本發明的一個實施方案中，大于大約50％的膜是黑素瘤細胞質膜。優選地，大于大約60％的膜由黑素瘤細胞質膜組成，大于大約70％是更優選的，80％是更優選的，90％是更加優選的，95％是更加優選的，99％是最優選的。
優選地，分離后的膜基本上沒有核和細胞。例如，如果在大約2×108細胞當量(c.e.)的膜材料中含有少于大約100個細胞和/或細胞核，則認為膜制劑基本上不含有細胞核或細胞。細胞當量是從指定數目的細胞分離的膜的量。分離的基本上沒有細胞和/或細胞核的黑素瘤細胞膜可以含有淋巴細胞和/或淋巴細胞膜。
優選地，分離的黑素瘤細胞膜是外細胞膜，即黑素瘤細胞質膜。本發明的膜制劑可以含有全部的外膜或者其部分。含有一部分外膜的本發明分離的膜含有外膜的至少一種MHC分子部分和/或熱激蛋白部分。膜片段的大小并不是關鍵的。
可以例如用半抗原修飾分離的黑素瘤細胞以及黑素瘤細胞膜。這樣修飾的黑素瘤細胞和膜具有至少一種下列性質(ⅰ)引發浸潤受治療哺乳動物的腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發抗哺乳動物腫瘤的炎癥免疫應答，和(ⅲ)引發對哺乳動物腫瘤的遲發型超敏反應應答。經修飾的腫瘤細胞膜和細胞也具有體外刺激T細胞的性質。
本發明的肽可以從半抗原修飾的黑素瘤細胞或膜中分離。本發明的肽可以是半抗原修飾的。對于本發明的目的，肽是兩個或多個氨基酸的化合物。肽優選具有低分子量，大約1000kD至大約10000kD，更優選大約1000至大約5000。肽優選可以是大約8至大約20個氨基酸，另外肽可以被半抗原化。可以從細胞表面、細胞內部或者這兩處的任何組合分離到肽。提取物對于癌細胞類型可能是特定的(對于正常細胞來說)。本發明的肽包括但不限于結合主要組織相容性復合體或者細胞表面相關蛋白(例如熱激蛋白)的肽。這種肽可以是癌基因或突變的抗癌基因編碼的蛋白質。各種肽或者含有小肽的黑素瘤細胞或膜的級分也在本發明的范圍內。含有小肽的級分是具有刺激T細胞的能力并且含有在特定的純化步驟中一起分離的肽的黑素瘤肽的級分。例如，從HPLC柱洗脫出的樣品集合體可以代表這樣一種含有小肽的級分。
本發明所使用的肽具有刺激T淋巴細胞的性質。可以通過使用標準測定來鑒定肽刺激T細胞的能力，例如通過測定T細胞攝入的標記的核苷酸或者通過測定細胞因子的產生，所述細胞因子例如但不限于γ-干擾素，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2。
從同種異體黑素瘤細胞分離的同種異體黑素瘤細胞膜和肽也可以在使用同源(例如自體性的)抗原呈遞細胞的本發明的方法中使用。該方法允許用來自不是患者本身黑素瘤來源的黑素瘤細胞膜或肽免疫患者。同源性抗原呈遞細胞處理同種異體膜或肽，使得患者的細胞介導的免疫系統可以對它們產生應答。
本說明書中提到的黑素瘤細胞、膜或肽(修飾的或未修飾的)包括可以貯存或給藥的該制劑的任何形式，例如懸浮于稀釋劑、作為片劑、冷凍或者凍干。
能介導腫瘤消退或者另外的抗腫瘤的特異性免疫應答(根據所證實的，例如通過T細胞體外擴增，或者T細胞細胞毒性)的哺乳動物T細胞也在本發明的范圍內。T細胞可以通過用含有相同腫瘤類型的半抗原化細胞的組合物對患者免疫而體內引發或者可以通過體外克隆從這樣的T細胞產生。在一個實施方案中，分離的人T細胞表達Vβ受體，其可以是Vβ1,Vβ5,Vβ13或Vβ14。本發明方法中使用的T細胞可以是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，或者更通常地，是腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，即與細胞介導的抗腫瘤的免疫性相關的效應淋巴細胞的一種類型。從患者分離到的T細胞可以是CD8+T細胞和Ⅰ類MHC特異性的。
本發明的細胞、膜、肽和T細胞可以單獨地或者與其它化合物結合在本發明的方法中使用，包括但不限于本發明的其它組合物。因此，細胞、膜、肽或T細胞可以單獨使用或者共同施用。對于本發明的目的，共同施用包括一起施用或依次施用。另外，本發明的制劑可以與其它化合物一起施用，所述其它化合物包括但不限于細胞因子，例如白細胞介素-2，白細胞介素-4,γ-干擾素(IPN-γ)，白細胞介素-12，白細胞介素-15和GM-CSF。也可以和其它癌癥治療相結合使用，包括但不限于化療，放療，抗體，和反義寡核苷酸。然而，本發明的優點是其可以單獨用作癌治療，使得不需要其它的治療。
本發明的組合物可以含有本發明的分離的黑素瘤細胞、膜、肽、T細胞(修飾的或未修飾的)或者它們的組合和藥學可接受載體或稀釋劑，例如但不限于Hanks溶液，鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水，蔗糖溶液和水。一般情況下，根據想要的給藥途徑和標準的藥學實踐來選擇藥學可接受載體。活性成分與載體的比例自然取決于組合物的化學性質、溶解性和穩定性，以及所采用的劑量，并且可以使用本領域的一般知識來優選。
在本發明的一個優選實施方案中，本發明的組合物是含有有效量的分離的半抗原修飾的黑素瘤細胞、膜、肽、T細胞或它們的組合的疫苗組合物。對于本發明的目的，“有效量”是實現期望的結果所需要的量。例如，在誘導抗腫瘤應答的方法中，“有效量”指具有引起至少一種下面現象的性質的黑素瘤細胞、膜、肽或T細胞的量腫瘤壞死、腫瘤消退、腫瘤炎癥，通過激活的T淋巴細胞的腫瘤浸潤和患者生存期的延長。類似地，在體外刺激T細胞的方法中，“有效量”指產生T細胞刺激的細胞、膜或肽的量。
疫苗組合物每劑量可以含有例如至少104個黑素瘤細胞，優選至少105個細胞，最優選至少106個細胞。一劑量是單次施用給藥的疫苗組合物的量。關于黑素瘤膜，疫苗組合物每劑量可以含有例如至少104c.e.分離的膜，優選至少105c.e.，最優選至少106c.e.。在一個實施方案中，疫苗組合物每劑量含有大約105至大約2.5×107個細胞，c.e.膜，或者它們的組合，更優選大約5×106個細胞/c.e.。在另一個實施方案中，疫苗組合物每劑量含有從大約105至大約2.5×107個細胞，c.e.膜，或者它們的組合分離的黑素瘤細胞肽，更優選地從大約5×106個細胞/c.e.分離。要使用的本發明的腫瘤細胞、膜或肽的量一般取取于象化合物對于癌細胞的親合性，存在的癌細胞的量和組合物的溶解度這樣的因素。可以根據患者的體重和臨床狀況決定劑量。
本發明的疫苗組合物可以以適合真皮內、靜脈內、腹膜內、肌內和皮下給藥的劑量形式包裝。或者所述劑量形式可以含有在給藥時用例如合適的稀釋劑重新配制的本發明的分離的制劑。半抗原本發明的黑素瘤細胞、黑素瘤細胞膜和黑素瘤肽可以作為修飾的、未修飾的或者修飾的和未修飾的組合來使用。對于本發明的目的，修飾的包括但不限于用半抗原修飾。不單獨誘導免疫應答(但是增強抗另一種它所綴合或以其它方式連接的分子的免疫應答)的任何小分子可以作為半抗原。一般情況下，使用的分子應該小于大約1000mw。
本領域公知多種半抗原，例如TNP(Kempkes等，J.Immunol.1991,147:2467)；磷酸膽堿(Jang等，Eur.J.Immunol.1991,21:1303)；鎳(Pistoor等，J.Invest、Dermatol.1995 105:92)；砷酸鹽(Nalefski和Rao,J.Immunol.1993,150:3086)。
一般情況下，適合在本發明中使用的半抗原具有結合親水性氨基酸(例如賴氨酸)的性質。半抗原可以通過賴氨酸的ε-氨基或-COOH基團與細胞綴合。另外，也可以使用可以通過重氮偶聯結合疏水性氨基酸例如酪氨酸和組氨酸的半抗原。適合在本發明中使用的半抗原的例子是二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-磺酰基(sulfonic)-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯(arsenic acid benzene isothiocyanate)，三硝基苯磺酸，磷酸膽堿，對氨基苯磺酸，對氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥(mustard)(Nahas和Leskowitz,Cellular Immunol.1980 54:241)和它們的組合。根據本發明所公開的，技術人員能選擇用于本發明的半抗原。例如，通常可以使用遲發型超敏反應(DTH)試驗測定半抗原。佐劑在一個實施方案中，黑素瘤細胞、黑素瘤細胞膜、肽或T細胞和免疫佐劑一起施用。所述佐劑具有增強對本發明制劑的免疫應答的性質。佐劑的代表性例子是BCG，或合成的佐劑，含有從皂樹(Quillajasaponaria)的樹皮純化的均勻的皂甙的QS-21(Mccune等，Cancer1979 43:1619)，小棒桿菌，Corynebacterium parvum，普遍意義的皂甙，去毒的內毒素和細胞因子，例如白細胞介-2，白細胞介素-4，γ-干擾素(IFN-γ)，白細胞介素-12，白細胞介素-15，GM-CSF和它們的組合。
應該明白可以優化佐劑。換句話說，技術人員可以使用常規實驗確定要使用的最佳佐劑。本發明制劑的制備方法可以如下制備在本發明中使用的黑素瘤細胞。根據如下文獻所述處理腫瘤Berd等(1986)，上文，Sato等(1997),美國專利號No.5290551和美國申請系列號No.08/203004,08/479016,08/899905,08/942794，或者相應的PCT申請PCT/US96/09511，其各自在這里全文引作參考。簡要地說，通過解離抽提細胞，例如通過用膠原酶和DNA酶酶解，通過在混料器中機械解離，通過用鑷子挑開，使用研缽和研杵，使用解剖刀片切成小碎片。
通過使用例如低滲休克，機械解離和酶解破碎細胞，并且通過離心分離不同的細胞成分，從黑素瘤細胞制備黑素瘤細胞膜。簡要地說，可以使用下面的步驟裂解腫瘤細胞，從裂解的腫瘤細胞去除細胞核以獲得沒有細胞核的腫瘤細胞，接著獲得沒有細胞和細胞核的基本上純的膜，并且使腫瘤細胞膜接觸半抗原以獲得半抗原修飾的腫瘤細胞膜。可以根據Heike等的方法進行膜分離。
在本發明的一個實施方案中，可以通過連續離心去除完整的細胞和細胞核，直到根據顯微鏡觀察膜基本上不含細胞核和細胞。例如，可以以低速度，例如大約500-2000克將裂解的細胞離心大約5分鐘。分離程序使得大約2×108細胞當量(c.e.)的膜材料中留有少于大約100個細胞和/或細胞核。例如以大約100000克超離心例如大約90分鐘可以沉淀含有膜的核后的上清液。沉淀含有全部的膜。膜可以再懸浮于例如大約8％蔗糖，5mM Tris,pH7.6并在大約-80℃下冷凍備用。可以使用任何稀釋液，優選是作為穩定劑的。為了測定膜制劑的質量(大約6×107c.e.膜)，可以在標準的細胞培養條件下培養。細胞菌落應該不生長，光學顯微鏡檢測不到細胞或細胞核。
可以通過已知方法用DNP或者其它半抗原對制備的細胞或膜進行修飾，例如通過Miller和Claman的方法，J.Immunol.,1976,117,1519，其全文在此引作參考，該方法包括在無菌條件下將腫瘤細胞或膜與半抗原一起培育30分鐘，接著用無水鹽水洗滌。通過使用單克隆抗半抗原抗體的流式細胞儀證實半抗原的修飾作用。
解離的細胞或分離的膜可以新鮮使用或者例如在控速冷凍機中或者在液氮中冷凍保存備用。細胞和膜以備解凍使用。優選地，在給予患者之前不久解凍細胞或膜。例如，在對患者進行皮試或治療的那一天，可以解凍細胞或細胞膜。任選地，可以沖洗細胞或細胞膜，和任選地在2500R下照射。可以再次沖洗，然后懸浮于沒有酚紅的Hanks平衡鹽溶液。
可以如上制備同種異體黑素瘤細胞膜。但是在給予受者之前，它們要與同源(例如自身性)抗原呈遞細胞共培養。同源的抗原呈遞細胞處理同種異體的膜，使得患者的細胞介導的免疫系統可以對它們產生應答。該方法允許用源自患者自身腫瘤之外的來源的黑素瘤細胞膜免疫患者。同種異體黑素瘤細胞膜與抗原呈遞細胞培養一定時間，培養時間自大約幾小時至大約幾天不等。然后沖洗膜脈沖的抗原呈遞細胞并對患者注射。
可以用多種方法制備抗原呈遞細胞，包括例如Grabbe等，1995和Siena等，1995的方法。簡要地說，例如通過靜脈穿刺或者通過白細胞除去法從要免疫的患者獲得血液。或者可以獲得骨髓。通過梯度離心從這些來源的任一來源分離單核白細胞。可以通過用針對抗原的單克隆抗體CD34陽性選擇來進一步純化白細胞。可以在組織培養基(例如補充有例如胎牛血清，集合的人血清或自身血清這樣的血清的RPMI-1640)中培養和擴增純化的白細胞。或者，可以使用沒有血清的培養基。為了刺激抗原呈遞細胞的生長，可以向培養基中加入細胞因子。細胞因子包括但不局限于粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素-4(IL-4)，TNF(腫瘤壞死因子)，白細胞介素-3(IL-3)，FLT3配體和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培養基中分離和擴增的抗原呈遞細胞可以是例如樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞和朗氏細胞。
本發明的肽可以根據Rotzschke等確立的技術從細胞分離，Nature,1990,348,252，其公開內容在這里全文引作參考。用弱酸，例如但不限于三氟乙酸，處理細胞。然后將細胞離心并取上清液。通過凝膠過濾(G25 Sepharose,Pharmacia)從上清液去除分子量大于5000的化合物。上清液的剩余部分在反相HPLC柱(Superpac Pep S,Pharmacia LKB)上分離，使用0.1％三氟乙酸(TFA)中增加乙腈濃度的梯度洗脫，洗脫速率為1毫升/分鐘，級分規格/毫升。根據Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉巷實驗室出版社，冷泉巷、紐約(1989)的方法，通過HPLC監測獲得含小肽鏈的級分，濃縮并冷凍。通過使它們與自身B類淋巴母細胞結合，然后測定它們刺激黑素瘤特異性T淋巴細胞的能力來對級分篩選免疫活性。
通過公知技術從活組織中分離T細胞，例如制備單細胞懸浮液，過濾，排除單核細胞和通過使亞群在TCR-亞型特異性抗體存在下和/或在IL-2存在下和/或在超抗原存在下擴增來分離表達特殊TCR型的亞群。可以使用本領域公知技術體外擴增感興趣的T細胞。
具體地說，可以如下從腫瘤制備T淋巴細胞。通過用0.14％膠原酶、0.03％DNA酶和任選地2.5U/ml透明質酸酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的混合物在室溫下消化3小時從腫瘤制備單細胞懸浮液。細胞通過一層尼龍no.100網層過濾、洗滌，并再懸浮于例如Hanks緩沖鹽水中。通過在補充有10％合并的人血清的終體積為2ml的RPMI-1640中在塑料皿中淘選混合物排除細胞混合物中的單核細胞并培養一星期。根據例如PCT/US93/05213中所公開的，通過將T細胞暴露給抗體和/或免疫刺激細胞因子(例如IL-2)和/或超抗原而擴增細胞。體外刺激4至5星期后可以測定T細胞的活性。也可以使用包被有各種抗體(例如抗-BV14或抗-CD8+)的Dynabeads(DYNAL,LakeSuccess，紐約)純化T細胞，以加快T細胞擴增前后純化T細胞的純度和速度。T細胞體外擴增的可替換的方法包括使用腫瘤浸潤細胞表達的T細胞受體的超抗原或單克隆抗體或者使用免疫刺激細胞因子，例如TNF,γ-干擾素和白細胞介素(IL-1,IL-2,IL-12等)。誘導抗腫瘤應答的方法本發明涉及通過給予有效量的含有至少一種下述物質的組合物誘導抗黑素瘤抗腫瘤應答的方法(ⅰ)基本上處于非生長期的半抗原修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞，(ⅱ)半抗原修飾的黑素瘤細胞膜，(ⅲ)從所述半抗原修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導抗腫瘤應答例如消退黑素瘤的T細胞。根據本發明治療的黑素瘤包括轉移性黑素瘤，其可以是肺、淋巴結或皮下轉移，并且優選是肺轉移。根據本發明治療的肺轉移優選是小的肺轉移。在本發明的一個優選實施方案中，哺乳動物的黑素瘤轉移限于所述哺乳動物的肺轉移。也可以根據本發明治療原發性癌。也可以根據本發明治療Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌癥，優選Ⅲ期和Ⅳ期。在本發明的一個實施方案中，可以治療家畜。
在一個優選的實施方案中，對單一肺轉移和多發肺轉移的哺乳動物(優選人)進行了治療。小的轉移特別適于根據本發明治療。這樣的轉移病灶的大小可以是直徑大約2cm，優選小于大約1.5cm，最優選小于大約1cm。這樣的治療產生的抗腫瘤應答可以部分或完全消退轉移腫瘤或可以是穩定性疾病。“完全”消退指大約100％消退至少一個月，更優選至少三個月。“部分”消退指消退大約50％以上至少一個月，更優選至少三個月。“穩定性”疾病指疫苗治療后沒有明顯腫瘤生長的狀況。本發明治療后觀察到的另一種抗腫瘤應答是生存期的延長。
給予本發明疫苗組合物之前，通過對皮膚施用可以對受者免疫用來修飾腫瘤細胞和膜的半抗原。例如可以使用二硝基氟苯(DNFB)使患者產生抗DNP的免疫性。接著(例如大約二星期后)，可以對患者注射本發明的制劑。在本發明的一個實施方案中，在給予疫苗之前沒有免疫患者。
在給予本發明組合物之前可以施用藥學可接受量的低劑量環磷酰胺或者另一種低劑量化療藥。給予半抗原化疫苗組合物后可以任選地給予藥學可接受量的沒有半抗原化的組合物。也可以根據本發明的方法施用沒有半抗原化的組合物。
可以施用(例如反復注射)組合物共至少三次，優選至少六次治療。在一個實施方案中，給藥的總次數可以是8次(包括起始給藥)，在另一個實施方案中可以是10次。可以由醫生設計適合特定患者狀況的接種方案。注射疫苗可以例如每星期，每兩星期或每四星期。可以給予加強疫苗。優選地，給予一次或兩次加強疫苗。可以在例如初次給藥之后大約六個月或大約一年后給予加強疫苗。
可以在癌癥的常規治療例如手術后使用本發明。切除的腫瘤或收集的腫瘤細胞可以用來根據上文所述制備腫瘤細胞和膜。
本發明的制劑可以通過任何合適途徑給藥，包括接種和注射，例如真皮內、靜脈內、腹膜內、肌內或皮下。每次疫苗治療可以在多個位點給藥。例如每次給藥，可以通過在至少兩處，優選三處連續的位點真皮內注射給予疫苗組合物。在本發明的一個實施方案中，在上臂或腿部給予疫苗組合物。
可以通過給予各種生物反應調節物來提高疫苗的效力。這些藥劑通過直接或間接刺激免疫應答而起作用。本發明的生物反應調節物包括但不限于白細胞介素-12，白細胞介素-15和γ-干擾素。在一個實施方案中，在每次疫苗注射之后給予IL-2。對有炎癥反應的患者給予IL-2可以引起腫瘤塊內的T淋巴細胞增生并且變得更具活性。增加的T細胞數目和提高的功能能力導致腫瘤的免疫破壞和消退。
修飾的腫瘤細胞、膜和肽各具有刺激T細胞的性質。“刺激”對于本發明目的來說指誘導T細胞增殖以及體外通過T細胞的細胞因子的產生。通過攝入修飾的核苷酸，例如但不限于3H胸苷，125IUDR(碘代脫氧尿苷)；和對活細胞染色的染料，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)可以檢測和測定T細胞的增殖。另外，例如但不局于IFNγ，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2這樣的細胞因子的產生在表現出T細胞增殖中可能是有用的。可以使用本領域公知的試驗可以檢測和測定細胞因子的產生。細胞因子的產生應該高于背景水平，其一般高于25皮克/毫升，優選高于100皮克/毫升。
下面非限制性實施例進一步詳述本發明。
對3/16的患者觀察到部分應答(PR)(計算機體層攝影術記錄)。第4個患者表現出進行性的腫瘤消退，＜50％消退至今(穩定的疾病)。PR的詳細情況如下患者1多個(＞50)小的(5-10mm直徑)肺小結消退90％；患者2直徑1cm的實體小結消退75％；患者31cm的小結完全消退，兩個伴生小結部分消退。所有應答都出現在轉移灶限于肺的患者身上。直到接種治療開始后4-6個月，在反應者身上的腫瘤消退才是明顯的。4名PR或穩定病情的患者的存活期分別是34.5個月，8.5+個月，9.2+個月和17+個月。因此，DNP-黑素瘤細胞疫苗可以誘導放射照相術記錄的黑素瘤轉移灶的消退。小的肺轉移病灶特別敏感于免疫破壞。
可以如下治療小而多肺轉移黑素瘤患者和肺轉移黑素瘤患者。疫苗組合物可以含有最少2.5×106c.e.排除錐蟲藍的黑素瘤細胞膜和最多7.5×106c.e.黑素瘤細胞膜，懸浮于0.2ml Hanks溶液中。每一次疫苗治療可以由向鄰近位點三次注射組成。
可以用1ml無菌水或磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.2(PBS)重新配制凍干的材料。可以在無菌緩沖鹽水中制備合適的稀釋液。然后在注射之前可以取0.1ml與疫苗混合。第一和第二疫苗可以與0.1ml的1∶10稀釋的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是從Organon Teknika公司(Durham,NC)獲得的Tice株(Pasteur Institute株的亞株)。第三和第四疫苗可以與0.1ml的1∶100稀釋液(“Tice-3”)混合)。第五和第六和加強疫苗可以與0.1ml的1∶1000稀釋液(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反應是不大于小的(＜5mm)中心潰瘍的炎性丘疹。
可以通過在前臂上真皮內注射0.1ml試驗材料進行皮試，通過測量硬結的平均直徑評價48小時時的DTH。對下面的材料進行測試1)1×106沒有用DNP修飾的和用DNP修飾的自身黑素瘤細胞膜；可以使用酶解的(TCE)和機械解離的(TCM)黑素瘤細胞；2)3×106沒有用DNP修飾的和用DNP修飾的自身外周血淋巴細胞；3)Hanks溶液；和4)PPD-中間強度。也通過對上臂腹側表面皮膚施用200μg DNFB并且在48小時時檢查硬結圈的面積可以測試對DNFB的接觸過敏性。可以在給予疫苗六星期期滿后進行全套DTH試驗。預處理DTH試驗可以限于DNP-修飾的黑素瘤細胞膜，PPD和稀釋液。設計該方案以避免1)患者對DNP-修飾的淋巴細胞敏化和2)通過注射未修飾的黑素瘤細胞使患者有耐受(tolerizing patients)。
可以對所有患者采集血液用于淋巴細胞和血清的分離和深低溫保存，每一次都進行皮試。可以周期性地測定對自身癌細胞的反應，這一點通過增殖，細胞因子釋放和細胞毒性來測定。
可以在疫苗治療開始之前對患者評定轉移病灶。疫苗治療頭六個星期之后，可以每三個月進行一次評定。可以在第二年中連續進行評定，在第三年中每四個月評定一次，之后每六個月評定一次。一年評定中反應的患者可以接受最后一次加強疫苗注射。然后在不再治療的情況下跟蹤他們的狀況。
也可以進行功效研究來確定DNP疫苗是否延長了這些患者不復發的時間和/或總的存活時間。可以測定存活參數(Kaplan-Meier方法)。
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1．一種誘導哺乳動物抗黑素瘤轉移的抗腫瘤應答的方法，包括對所述哺乳動物施用含有治療有效量的至少一種下述物質的組合物(ⅰ)基本上處于非生長期的半抗原-修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導抗腫瘤應答的T細胞；其中所述轉移位于所述哺乳動物的肺。
2．權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤應答是至少一種下述情況腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過激活的T淋巴細胞的腫瘤浸潤，穩定的疾病和延長患者生存時間。
3．權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤應答是轉移的完全或部分消退。
4．權利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
5．權利要求1的方法，其中所述細胞膜是同源黑素瘤細胞膜或同種異體的黑素瘤細胞膜。
6．權利要求5的方法，其中所述黑素瘤細胞膜是同種異體的并且所述組合物進一步包含一種抗原呈遞細胞。
7．權利要求1的細胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，熱激蛋白或者它們的組合的膜級分。
8．權利要求1的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-磺酰基-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，對氨基苯磺酸，對氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它們的組合。
9．權利要求1的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
10．權利要求1的方法，其中所述組合物進一步包括一種佐劑。
11．權利要求10的組合物，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，去毒的內毒素和細胞因子。
12．權利要求1的方法，其中所述給藥是以一定時間間隔重復至少六次。
13．權利要求12的方法，其中所述給藥每星期重復一次。
14．權利要求1的方法，進一步包括在給予所述組合物之前給予治療有效量的環磷酰胺。
15．權利要求14的方法，其中所述的治療有效量的環磷酰胺包括在給予所述組合物之前給予大約300mg/M2劑量的環磷酰胺。
16．一種誘導患黑素瘤的哺乳動物抗轉移的抗腫瘤應答的方法，包括對所述哺乳動物施用含有治療有效量的至少一種下述物質的組合物(ⅰ)基本上處于非生長期的半抗原-修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導抗腫瘤應答的T細胞；其中所述轉移是小的肺轉移。
17．權利要求16的方法，其中所述抗腫瘤應答是至少一種下述情況腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過激活的T淋巴細胞的腫瘤浸潤，穩定的疾病和延長患者生存時間。
18．權利要求16的方法，其中所述抗腫瘤應答是肺轉移的完全或部分消退。
19．權利要求16的方法，其中所述哺乳動物是人。
20．權利要求16的方法，其中所述的膜是同源黑素瘤細胞膜或同種異體黑素瘤細胞膜。
21．權利要求20的方法，其中所述黑素瘤細胞膜是同種異體的而且所述組合物進一步包含一種抗原呈遞細胞。
22．權利要求16的細胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，熱激蛋白或它們的組合的膜級分。
23．權利要求16的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-碘酰基-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，對氨基苯磺酸，對氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它們的組合。
24．權利要求16的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
25．權利要求16的方法，其中所述組合物進一步包括一種佐劑。
26．權利要求25的組合物，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，去毒的內毒素和細胞因子。
27．權利要求16的方法，其中所述給藥是以一定時間間隔重復至少六次。
28．權利要求27的方法，其中所述給藥每星期重復一次。
29．權利要求16的方法，進一步包括在給予所述組合物之前給予治療有效量的環磷酰胺。
30．權利要求29的方法，其中所述的治療有效量的環磷酰胺包括在給予所述組合物之前給予大約300mg/M2劑量的環磷酰胺。
全文摘要
本發明涉及通過施用有效量的含有至少一種下述物質的組合物誘導抗轉移黑素瘤的抗腫瘤應答的方法:(i)基本上處于非生長期的半抗原－修飾的同源哺乳動物黑素瘤細胞,(ii)半抗原－修飾的黑素瘤細胞膜,(iii)從所述半抗原－修飾的黑素瘤細胞或膜分離的肽和(iv)能介導抗腫瘤應答例如消退黑素瘤的T細胞。根據本發明治療的轉移黑素瘤包括限于肺的轉移黑素瘤,并且優選是小的肺轉移。本發明進一步涉及黑素瘤細胞,分離的黑素瘤細胞膜,從這樣的細胞或膜分離的肽和具有誘導抗腫瘤應答性質的T細胞,含有這樣的細胞、膜、肽、T細胞或它們的組合的組合物,以及它們的分離和制備的方法。
文檔編號A61K35/28GK1301174SQ99806236
公開日2001年6月27日 申請日期1999年4月9日 優先權日1998年4月9日
發明者D·伯德 申請人:托馬斯杰斐遜大學