用于組織膨脹和治療的可植入顆粒的制作方法

專利名稱：用于組織膨脹和治療的可植入顆粒的制作方法
1．發明領域本發明涉及組織膨脹，胃食管回流癥和尿失禁的治療，以及皮膚皺紋的改善。
2．發明背景2．1胃食管回流癥(“GERD”)盡管胃食管回流是一種正常的生理現象，但在某些情況下，它是一種可導致種種癥狀的病理生理狀態，在極端情況下，這些癥狀可能變得嚴重。胃食管回流癥(“GERD”)描述的是酸液和酶液從胃回流到食管，導致胸骨后有灼熱感，同時伴有胃酸回流到嘴里，甚至是肺里。能說明GERD嚴重性的并發癥包括食管組織糜爛，以及正常上皮被病理性組織所取代的食管潰瘍。
統計數據表明，約35％的美國人口至少每個月患一次胃灼熱，有5-10％的美國人口至少每天患一次。關于這種疾病更為重要的是，內鏡檢查得到的醫學證明數據表明，約2％的美國人口患有GERD。該病與個體的年齡有關，40歲以上的人群似乎患該病的可能性增加。(Nebel O.T.等，《美國消化疾病雜志》21(11):953-956(1976))。
正常病人在飯后其下食管括約肌保持關閉，但患GERD的病人，其下食管括約肌松弛，使得一些酸性物質由于胃收縮而回流到食管。事實上，GERD可以主要歸結于下食管括約肌的短暫松弛。在其他情形下，GERD可歸結于下食管括約肌休息狀況的降低或是括約肌本身先天性尺寸短小。也存在其他原因，導致該疾病的存在和嚴重程度不同。
此外，一些外部因素加劇了GERD的癥狀，這些因素包括吃脂肪性事物、吸入咖啡因、吸煙、穿緊衣服，以及某些藥物治療。流涎的減少也是加劇GERD的一個因素，因為在正常情況下，唾液是一種堿性液體，能幫助中和酸回流，從而縮短食管與酸的接觸時間。
紅斑是GERD首先可見到的癥狀之一，可以通過內鏡檢查看到。組織糜爛表明了疾病的進一步發展，它可變為深度潰瘍并導致癌癥(腺癌的發病率比其他類型的癌癥增長更快)。約有3.5％的65歲以下的食管阻塞、失血、以及在某些情形中的穿孔病人發生彌漫性潰瘍和特定的并發癥。潰瘍狀況不僅會導致并發癥，而且對治療更有對抗性。盡管嚴重的并發癥在年輕病人中不常見，但是在20-30％的65歲以上病人中將發生(Reynolds J.C.，《美國衛生系統雜志-藥理學》53,(1996))。
在本發明之前，為提高括約肌的功能，曾嘗試兩種膨脹方法，將牛膠原和特氟隆糊劑用于病人。但是這兩種方法都未成功，因為隨著時間推移，這些物質會從植入的最初位置移開。
目前，GERD一般是通過不需處方而出售的(“OTC”)抗酸藥或者處方藥來控制，處方藥包括質子泵抑制劑、能動劑和H2阻滯劑。另外，一部分GERD病人需要外科手術介入；最常見的外科手術是胃底折術，這可以使用常規外科技術或者使用腹腔鏡檢查技術實現。然而，胃底折術有嚴重副作用的危險，在治愈GERD方面僅取得勉強的成功。約50％的GERD病人還有呼吸方面的癥狀，在經歷胃底折術的病人中，這些呼吸癥狀甚至進一步增加(在Johnson W.E.等人的一項研究中報告為76％，《外科學文獻》131:489-492(1996))。
2．2尿失禁尿失禁是一個普通流行的問題，它會影響整個社區和特定保健區內的所有年齡和不同身體健康狀況的人。在醫學上，尿失禁使病人易患上尿道感染、壓迫潰瘍、會陰疹和尿膿毒癥。從社會和心理的角度講，尿失禁與窘迫、社會斑痕形成、抑郁相聯，特別是對老年人而言，會提高入院治療的風險(Herzo等，《老年學年評-老年病學》9:74(1989))。從經濟上講，費用驚人，光就美國而言，每年用于治療失禁的費用多達100億美元以上。
失禁可歸結于真性尿壓迫(尿道活動過度)、內因性括約肌缺陷(“ISD”)，或者兩者都有。失禁在婦女中尤其普遍，其次在兒童中也發生(特別是ISD)，男子在接受根治性前列腺切除術后也可能出現失禁。
治療尿失禁的一種方法是服用具有膀胱松弛性能的藥物，以及主要依靠這類藥物的抗膽堿能藥物療法。例如，在治療緊急失禁時，已經使用了諸如溴丙胺太林等抗膽堿能藥，以及諸如消旋奧苦布寧、雙環胺等組合平滑肌松弛劑/抗膽堿能藥。(參見A.J.Wein，《北美泌尿學臨床雜志》22:557(1995))。然而，這些藥物療法經常不能在全部的失禁病人治療中獲得完全的成功，并且經常會在病人身上產生顯著的副作用。
除藥物療法外，在本發明之前被本領域技術人員所采用的其他方法包括使用人工括約肌(Lima S.V.C等，《泌尿學雜志》156:622-624(1996),Levesque P.E.等，《泌尿學雜志》156:625-628(1996))，膀胱頸支撐假體(Kondo A.等，《泌尿學雜志》157:824-827(1996))，注射交聯膠原(Berman C.J.等，《泌尿學雜志》157:122-124(1997)，Perez L.M.等，《泌尿學雜志》156:633-636(1996)；Leonard M.P.等，《泌尿學雜志》156:637-640(1996))，和注射聚四氟乙烯(PerezL.M.等，《泌尿學雜志》156:633-636(1996))。
最近一項較為有名的治療與ISD相關的尿失禁的方法是為病人進行尿道周內鏡膠原注射，這樣可以擴大膀胱肌，減少膀胱滲漏或者壓迫失禁的發生可能性。
現行防止失禁發生的方法有大家所熟知的缺陷。給患有頑固性失禁的兒童使用人工括約肌，需要對尿道進行長期的監視，因為在設備放置后有潛在的腎衰竭可能(Levesque P.E.等，《泌尿學雜志》156:625-628(1996))。利用內窺鏡在膀胱頸周圍直接注射膠原，在治療沒有顯著發病率的括約肌缺陷方面有很高的成功率。但是，使用膠原在平均兩年之后會導致失敗，因此需要考慮其成本有效性(Khullar V.等，《英國婦產科學雜志》104:96-99(1996))。此外，可能由于移動現象而使病人的節制能力惡化，為恢復節制能力需要重復注射(Herschorn S.等，《泌尿學雜志》156:1305-1309(1996))。
在根治性前列腺切除術之后使用膠原治療壓迫尿失禁，其結果一般會令人失望(Klutke C.G.等，《泌尿學雜志》156:1703-1706(1996))。并且，有一項研究提供證據表明，注射牛皮膠原會產生IgG和IgA類的特異性抗體(McCell M.&Delustro F.，《泌尿學雜志》155:2068-2073(1996))。這樣，病人對膠原的致敏作用將可能長期需要。
由于缺乏其他合適方法，盡管成功率有限，經尿道的膠原注射療法仍為一種可接受的治療內因性括約肌缺陷的方法。
2．3皮膚皺紋由于年老、暴露于陽光或者其他原因對皮膚造成的傷害經常導致皺紋和其他皮膚異常。為除去皮膚皺紋，人們通常求助于美容手術，諸如拉臉整容和縮皮。另外，膠原注射也被用來去除或者減少皮膚皺紋。膠原注射還被用于組織膨脹或者用于提高身體某些部位的豐滿度，例如提高嘴唇或者臉上眼睛和眼眉周圍的豐滿度。但是，膠原是一種天然產的物質，長期以后身體可能會將其酶促降解和去除，因而需要重復治療。從美容角度看，有一個更為驚人的問題是，膠原可能會從注射的起始點移開，在皮膚下面不希望的地方產生難看的隆起或腫塊。
微珠或者固體微粒已被用于修正皮膚皺紋。例如，硅粒、特氟隆糊劑、膠原珠和聚丙烯微球已被使用，但由于特別是組織副反應、生物降解和從起始植入處移開等原因，治療結果令人失望。
2．4微粒在本發明之前，已經制造和銷售了用于體外錨地依賴細胞培養的微球(Van Vezel,A.L.，《自然》216:64-65(1967)；Levine等，《體細胞遺傳學》3:149-155(1977)；0brenovitch等，《生物細胞》46:249-256(1983))。它們也在體內在進行動脈管畸形、痿管和腫瘤治療時用于閉塞血管(參見美國第5635215號專利，1997年6月3日授予Boschetti等人；Laurent等，《美國神經學會雜志》17:533-540(1996)；以及Beaujeux等，《美國神經學會雜志》A:533-540(1996))。
此外，雖然曾經嘗試將細胞直接植入活組織如腦或肝，以治療特定缺陷，但大多都失敗了。與直接細胞移植相聯的主要問題是，細胞移植的長期生存能力以及免疫病理學和組織學反應。表面附著有細胞的微粒已被用于某些體內應用。Cherkesey等人在《IBRO》657-664(1996)中描述了在包衣的葡聚糖珠上培養腎上腺細胞，并將其植入哺乳動物大腦，以排擠一些與6-羥基多巴胺誘導的單邊黑質損害有關的特定疾病。細胞預先附著在葡聚糖微載體上可以提高植入大腦中的細胞的功能。肝細胞移植也已用于控制急性肝衰竭或者用于取代特定的有缺陷的功能，如膽紅素的綴合或白蛋白的合成。出于這個目的，要進行生長于微球表面的肝細胞的脾內注射(Roy Chowdhury等人，載于AOA Miller主編的《動物細胞技術高級研究》第315-317頁，Kluers學術出版社，1989年)。
然而，大多數細胞移植結果，在指定功能方面都令人失望(或者具有低水平的生物學功能)。
3．發明概述本發明包括在治療GERD、尿失禁和皮膚皺紋時使用可植入微粒。在每次使用時，微粒作為膨脹劑植入到合適的組織、肌肉、器官等中。另外，在每次使用時，微粒都優選用諸如肌肉細胞、脂肪細胞及類似的自體細胞預先包覆。本發明的微粒是用細胞粘連促進劑包覆、與之相連或用其填充的生物相容性無毒聚合物。這些微粒優選用陽離子單體或聚合物使其表面帶有正電荷。
在一個實施方案中，本發明包括對一個胃食管回流癥患者的治療，該治療包含將親水性生物相容性微粒植入到下食管括約肌中，所述微粒包含(a)一正電荷和細胞粘連促進劑；(b)層積在所述珠粒表面上的自體細胞。這些微粒優選為本文中詳細描述的微球或微珠。自體細胞優選從將要進行植入的區域提取。植入前可以用從病人提取的血清或全血洗滌微粒。關于GERD的治療，也可以通過使用本領域技術人員公知的標準技術來進行植入，如用注射器或其他合適的設備進行注射。
在另一個實施方案中，本發明包括對一個尿失禁患者的治療，該治療包含將親水性生物相容性微粒植入到尿道括約肌中，所述微粒包含(a)一正電荷和細胞粘連促進劑；(b)層積在所述珠粒表面上的自體細胞。這些微粒優選為本文中詳細描述的微球或微珠。另外，自體細胞優選從將要進行植入的區域提取。植入前可以用從病人提取的血清或全血洗滌微粒。通常使用注射器或者其他適于植入特定組織的設備進行移植。
在另一個實施方案中，本發明包括一種治療人的皮膚皺紋的方法，該方法包含給藥或植入已用自體細胞預先處理的微粒，這些微粒包含帶正電荷的親水性共聚物和細胞粘連促進劑。微粒在植入前可以只是簡單地與自體細胞接觸或者與自體細胞充分混合。
值得注意的是，上述治療GERD和尿失禁的這兩種方法可以與現今治療這些疾病的常規方法結合使用，即口服利尿藥、抗酸藥、合適的藥物治療及類似方法。這種聯合治療能使病人恢復得更快、更安全和更舒服。
在另一實施方案中，本發明包含對皮膚皺紋的治療或改善，方法是將親水性生物相容性微粒給藥到皮膚皺紋區域或者周圍，所述微粒包含(a)一正電荷和細胞粘連促進劑；(b)層積在珠粒表面上的自體細胞、膠原、膠原衍生物或葡糖胺聚糖。換言之，是將用細胞粘連促進劑包衣并用適宜的組織膨脹細胞預先處理的微球或者微珠給藥到治療區域。
這里所用的術語“給藥”、“植入的”或“植入”可以互換使用，意思都是指用本領域技術人員熟知的適于治療這類疾病的技術將物質釋放到治療區域。可使用侵入與非侵入法進行釋放。
4．附圖簡述

圖1為括約肌膨脹的示意圖。珠粒被包覆并在生理條件下注射到括約肌中。隨著珠粒注入量的增加，括約肌體積成比例增大，腔的尺寸成比例減小。珠粒逐漸而不可逆地整合在肌肉內。
5．本發明的詳細描述本發明使用表面帶正電荷和細胞粘連促進劑以及可選的細胞成長促進劑的微粒，特別是微珠，治療GERD、尿失禁和皮膚皺紋。本發明的微粒優選與自體細胞一起使用。換言之，本發明的微粒在植入前用合適的細胞定居。這個在植入前的步驟已經表明可以減少或消除免疫反應和移植排斥反應。另外，使用帶正電荷的、不可生物降解的、生物相容的微珠和無論是否為組織特異性的自體細胞，可提高組織接受性和整體治療效果。
按照本發明的方法，可以治療GERD、尿失禁和皮膚皺紋，并避免或顯著減少組織副反應，包括移植排斥、顆粒降解、吸收、移動和其他副反應。本發明的方法也包括增強的結締組織反應。
本發明所使用的微珠或微粒是基于用促進細胞粘連的試劑包覆的生物相容性無毒聚合物。為增強珠粒的長期穩定性，活細胞附著在微粒上，在此形成與周圍組織相連的層積細胞。
按照本發明，將被植入身體不同位置的微粒由含有用于細胞粘連的適宜物質的不可再吸收的親水聚合物組成。它還可以含有不透射線的分子或其他標志劑，以在插入之前或者當中通過放射學加快定位。適于該應用的親水共聚物為丙烯族共聚物，如聚丙烯酰胺及其衍生物、聚丙烯酸酯及其衍生物，以及聚烯丙基和聚乙烯基化合物。所有這些聚合物都是交聯的，以便穩定和不可再吸收，并可在它們的結構中含有其他顯示特定性能諸如趨化作用的化學物質、促進細胞與細胞或組織例如食管壁或尿道壁細胞或者皮膚細胞粘連的化學物質，和/或標志劑。
用于本發明的微粒對組織和細胞無毒，它們是生物相容的，并借助于它們所促進的細胞生長而在植入部位與各種細胞和組織相粘連。另外，這些微粒是不可再吸收和不可生物降解的，因而是穩定的、持續的，一經被植入所需部位，它們將保留其通常形狀與位置。
一般而言，本發明所用的微粒可以為任何形狀，但優選為球形微粒。本發明所用的微粒直徑可為約10-約1000μm。本發明所用的在其表面粘附有細胞的微粒優選的直徑是50-1000μm。
本發明的可能的變化包括用任何生物相容的、無毒的、不可再吸收的聚合顆粒、膜、纖維或者用細胞粘連促進劑處理過的其他固體物質取代微粒。本發明也包括線性可溶性聚合物，它們在注射后于原處交聯成固態的細胞粘連促進填充劑。本發明也設想了空微粒(微泡)的配制和/或注射，它們是事先配制好的，或通過使用合適的導管在適當位置生成。
本發明所使用的微粒或其他固體物質是能變形的，因此能容易地進入或通過注射器具和小導管，而不會持久改變。但是，微粒也能抵抗在植入過程中或之后所產生的肌肉收縮壓力。它們也是熱穩定的，使消毒和冷凍儲存容易且方便。
本發明所用的微粒或其他固體物質在懸浮液中也是穩定的，使得微粒和其他固體物質能在懸浮液中配制和儲存并與不同的液體一起注射。更具體地說，微粒的親水性允許將它們放入懸浮液中，特別是為無菌和熱性(無熱原)的可注射溶液形式，同時避免聚集體的形成或者與儲存容器和移植設備器壁的粘連，如導管、注射器、針頭及類似物。優選地，這些可注射溶液含有近似分布在管徑切面中約為10-2000微米的微粒或其他固體物質。
本發明的微粒既親水又為陽離子。這些微粒優選包含中性親水單體、雙官能單體、帶有陽離子電荷的一個或多個單體以及可選的能使微粒可檢測的功能化單體的共聚物。微粒也可以包含一種或多種細胞粘連促進劑以及一種標志劑。
共聚物優選為親水性丙烯酸共聚物，它包含共聚形式的約25-約98重量％的中性親水性丙烯酸單體，約2-約50重量％的雙官能單體和約0-約5重量％的一種或多種具有陽離子電荷的單體。
舉例而言，作為參考文獻而引入本文的法國專利第2378808號所記載的共聚物可以按照本發明用于制備堿性微粒共聚物。
至于親水性丙烯酸單體，可以使用丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酰胺及其衍生物、或者羥基甲基丙烯酸甲酯。
雙官能單體的例子包括但不限于N,N’-亞甲基-雙-丙烯酰胺、N’,N’-二烯丙基tartiamide或者乙二醛-雙-丙烯酰胺。
另外，帶有陽離子電荷的單體包括但不限于帶有叔胺或季胺功能的那些，優選為二乙氨基乙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺丙基三甲銨或者丙烯酰胺乙基三乙銨。
在一個特別優選的實施方案中，使用一個包含約25-約98重量％的甲基丙烯酰胺，約2-約50重量％的N,N-亞甲基-雙-丙烯酰胺的共聚物。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，有可能通過使粘合劑成網狀而提高微球的穩定性。以明膠為例，可以從對明膠胺有反應的雙官能化學劑中挑選網化劑(例如戊二醛、甲醛、乙二醛及類似物)。
將單體與標志劑進行化學偶聯，通常可以獲得官能化單體，它們可以是-化學染料，如Cibacron藍或Procion紅HE-3B，使微球能直接可見(Boschetti，《生物化學與生物物理學雜志，方法學》19:21-36(1989))。用于這類標志劑的官能化單體的例子包括N-丙烯酰六亞甲基Cibacrone藍或者N-丙烯酰六亞甲基Procion紅HE-3B；-磁共振顯影劑(鉺、釓或磁鐵礦石)；-造影劑，如鋇或碘鹽(例如，包括酰氨基-e-丙酰胺基-3-三碘-2,4,6-苯甲酸，這些可以在Boschetti等人所描述的條件下配制(《法國化學會通報》1986年第4期)。對鋇或磁鐵礦鹽而言，它們可以以粉末形式直接加入最初的單體溶液。
如上所示，也可以在微球合成以后再標記，例如通過嫁接熒光標記衍生物進行(例如，包括異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸羅丹明(RITC)及類似物)。
本發明中可使用本領域熟知的不同種類的細胞粘連促進劑。具體而言，可以從膠原、明膠、葡糖胺聚糖、纖連蛋白、凝集素、聚陽離子(例如聚賴氨酸、脫乙酰殼多糖及類似物)或者其他天然或合成生物細胞粘合劑中選出生物粘連促進劑。
細胞粘連促進劑在微粒或者其他固體物質中的優選量為每1ml所確定的微粒有約0.1-1g的促進劑。
通過懸浮液聚合反應、點滴聚合反應或者本領域技術人員熟知的任何其他方法可以配制微粒。微粒制備方式的選擇通常取決于所得微粒的所需特性，如微粒直徑和化學組成。本發明的微粒可以采用本領域中公開的標準聚合方法制得(E.Beoschetti，“用于生物色譜分析和生物醫學應用的微球”，第一部分，“微帶的制備”，載于John,Wiley＆Sons,Arshady R.所著《微球、微囊化和脂質體》，1998年(出版中)，其引用在此作為參考)。微球的制備是從含有諸如膠原(明膠是一種變性膠原)等粘合劑的單體水溶液開始的。然后該溶液與非水性的可混溶的溶劑混合，生成液滴的懸浮液，再利用合適的催化劑通過單體聚合反應，將懸浮液變成固態凝膠。之后通過過濾或離心作用收集微球并進行洗滌。
通過親和層析中被稱為“配體固定”的化學偶聯過程將細胞粘連促進劑或標志劑引入到微珠上。另一種引入的方法是在組成微珠的明膠網內擴散，然后通過沉淀或化學交聯在適當位置捕獲擴散的分子。在珠粒植入前，治療劑、藥品或其他適合由珠粒轉運的活性分子也能按照最后一種方法引入微珠中。
本發明的微球也可以通過作為參考文獻引入本文的法國專利第2378808號和美國專利第5648100號中所描述的標準聚合方法獲得。一般而言，單體在溶液中的聚合在約0-100℃之間進行，在有聚合反應起始劑的情況下，為約40-60℃。
聚合反應起始劑最好從氧化還原系統中選出。值得注意的是，有可能使用堿金屬過硫酸鹽與下列物質的組合物N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、二甲氨基丙腈，或者使用有機過氧化物諸如苯甲酰過氧化物，或者甚至是2,2’-偶氮基-雙-異丁腈。
起始劑的用量由該領域技術人員根據單體的量和所需的聚合速率進行調整。
聚合反應可以在本體或者乳液中進行。
在進行本體聚合時，含有不同溶解組分的水溶液與起始劑在均勻介質中進行聚合。這樣有可能獲得一塊水凝膠，其再通過篩網分離成微球。
乳液或懸浮液聚合是一種優選制備方法，因為可以直接獲得所需尺寸的微粒。其過程是含有不同溶解組分(如不同單體、細胞粘合劑)的水溶液，通過攪拌與不與水混溶的有機液相混合，作為選擇還可以存在乳化劑。調整攪拌速率，以獲得能形成所需直徑液滴的在有機相中的水相乳液。然后加入起始劑開始聚合反應。與之相伴的是放熱反應，接著可以測量反應介質的溫度。
有可能使用植物或礦物油、某些石油蒸餾產物、氯化烴或這些不同溶液的混合物作為有機相。此外，當聚合反應起始劑包括幾種組分(氧化還原系統)時，可以在乳化之前，將其中一個組分加入水相。
由此獲得的微球可以通過冷卻、傾析和過濾而回收。之后按照大小種類進行分離，并進行清洗，以去除副產品的任何痕跡。
聚合反應階段之后為細胞粘合劑的網狀形成階段。如果在合成后通過嫁接使得微球可以辨認，那么，也有可能在聚合反應階段后出現標志劑階段。
本發明的具有細胞粘連和生長促進特性的微粒可以直接用于組織膨脹。并且，在體外，這些微粒能有特定的自體細胞長在它們表面，因而使得這些微粒對于組織膨脹特別有用。
在本發明之前，將懸浮在生理溶液中的可植入物質注入組織導致了在肌肉塊內生成分散的聚集體。這些分散的聚集體能生成處在一起的、不同量的植入物質，但是這些物質不能附著或成為組織本身的一部分。這種分離使得植入物從移植起始部位移走。
按照本發明，為了避免上述問題，可以單獨分開注射微粒。更為優選的是，微粒表面可以定居一層細胞，以使植入物更好地整合并長期穩定。
本發明的微粒顯示出在其表面生長細胞的卓越能力。例如，原發性肌細胞已經成功地粘附在本發明的微粒表面上，使得在肌肉組織內可以獲得更好的整合。另外，由于組織膨脹的最終目標是人為地增大組織質量，因此在注射前，也將前脂肪細胞用于定居微粒表面。在這種情況下，前脂肪細胞具有同其他正常細胞相類似的體積，但在植入后，當前脂肪細胞在體內生理條件下時，它們會積聚脂肪液滴，從而使植入物質的體積增大10％以上。
按照本發明，在病人體內進行組織膨脹的一種方法可以按以下描述進行a)通過簡單的活檢從病人體內提取原始細胞并進行分離；b)這些細胞在生長促進條件下(如可能使用含有自體血清(從病人身上提取)的營養培養基，直至匯合)在微粒表面上生長；c)將生長在頂部的帶有病人細胞的微粒注射到病人的預定膨脹組織中。
為治療GERD，運用內鏡釋放或腹腔鏡技術，將微粒或其他固體物質通過食管引入并注射到食管與胃相接的括約肌，即下食管括約肌壁內。這樣就減小了括約肌的內腔，使得肌肉收縮更容易，只有更少的胃液回流到食管。此外，這種治療減少了下食管的炎癥。這些微粒或其他固體物質也可以加載不透X射線的染料或其他顯影劑，以用于隨后的X射線顯影。
在另一個實施方案中，為治療GERD而在食管和胃相接的括約肌內注入的微粒也包括適量的用于治療GERD的藥物，如H2組胺拮抗劑，包括西米替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁；H+，K+-腺苷三磷酸酶抑制劑，包括奧美拉唑和蘭索拉唑；抗酸藥，包括例如Al(OH)3、Mg(OH)2和CaCO3。用于治療尿失禁和皮膚皺紋時，微球可以與抗炎劑、血管生成抑制劑、放射性元素和抗有絲分裂劑一起使用。
在McGraw-Hill出版社(1996)出版的第九版《Goodman＆Gilman治療藥理學基礎》和1997年的《醫師手冊》中報道了與本發明的微球或微粒結合使用的其他治療劑，包括用于治療皮膚疾病、GERD和尿失禁的那些。
與在先技術中的方法相比，本發明治療GERD方法的主要優點在于a)與外科手術相比，對病人的侵襲作用更小；b)比抗酸藥或其他藥物的作用更持久；c)有具有趨化作用的良好的生物相容性；d)能應用X射線顯影或MRI來幫助隨后對病人的評估。
為治療尿失禁，將微粒或其他固體物質經尿道引入并注射到膀胱括約肌壁內，從而減小了括約肌內腔，使得肌肉收縮更容易，由此降低失禁發生的可能性。微粒或其他固體物質也可以加載不透X射線的染料或其他顯影劑，以用于隨后的X射線顯影。
在另一個實施方案中，為治療尿失禁而注入膀胱括約肌的微粒中也可以包括適量的用于治療尿失禁的藥物，如制尿藥、抗膽堿能藥、鹽酸羥丁寧和抗利尿激素。
所注入的微粒會產生一些短暫的副作用，如局部發炎，因此微粒可含有或與抗炎藥一起注射，如水楊酸衍生物，包括阿斯匹林；對氨基苯酚衍生物，包括撲熱息痛；非類固醇抗炎藥，包括消炎痛、蘇林大、依托度酸、托美丁、雙氯酚酸、酮咯酸、布洛芬、萘普生、氟瑞托芬、酮洛芬、苯氧苯丙酸鈣、噁丙秦；鄰氨苯甲酸，如甲芬那酸、甲氯芬那酸；烯醇酸，如吡羅昔康、替諾昔康、保泰松、oxyphenthatrarone；以及萘丁美酮。這些抗炎藥優選吸收在微粒的網上，在一小段時間(幾天)里慢慢釋放。在被注射到病人體內之前，微粒也可用來釋放其他可摻入微粒網內的特定藥物。藥物將只在一段短時間內在植入部位局部釋放，以提高整體治療效果。
將活性分子，如藥物摻入本發明微粒的方法是，將干燥的微粒與所述活性分子或藥物的水溶液或氫化有機溶液混合。微粒由于吸收溶液而膨脹，感興趣的活性分子摻入到微粒網中。由于實質基于離子交換作用的主動吸收機理，活性分子將保留在微粒內。這些微粒本身攜帶陽離子基因，具有吸附陰離子分子的能力，如眾所周知的抗炎藥。然后，隨著注射到病人體內，由于生理鹽和pH的作用，這些陰離子分子將緩慢釋放。不同種類的微粒吸附藥物分子的能力可以由技術人員容易地確定，它取決于制備微粒時所用的起始溶液中所存在的陽離子單體的數量。
與在先技術中的方法相比，本發明治療尿失禁方法的一些主要優點在于a)比使用常規膠原粘性溶液具有更持久的作用；b)具有趨化作用的良好的生物相容性；c)可在X射線或者MRI中顯影，有助于隨后的評估；d)避免了用可再吸收的天然產生物質如膠原進行重復治療。
按照本發明進行的皮膚皺紋治療方法的主要優點在于a)與外科手術相比，對病人的侵襲作用更小；b)比使用膠原注射的作用更持久；c)具有趨化作用的良好的生物相容性。
為治療皮膚皺紋，可以通過注射導入微粒，這些微粒也可以包括一種或多種抗炎劑。
下列實施例作為參考對本發明作了更進一步的定義，這些實施例詳細描述了用于組織膨脹、治療皮膚皺紋、尿失禁和GERD的微粒的制備。下列實施例僅僅是說明性的，它們不以任何方式限制本發明的范圍。對本領域技術人員不言而喻的是，在不背離本發明的目的和范圍的情況下，可以對材料和方法進行許多更改。
6．實施例6．1實施例1制備具有趨化性能的不規則水凝膠顆粒將58g氯化鈉和27g醋酸鈉在室溫下溶于100ml軟化水。向此溶液中加入400ml甘油，將pH調節至pH6.0，然后將單體溶解。更明確地說，向此溶液中加入90g羥甲基丙烯酰胺、2g鹽酸甲基丙烯酰胺丙基-三甲基-氯化銨和10g N,N’-亞甲基-雙丙烯酰胺，并攪拌該混合物直至完全溶解。將該溶液加熱至約70℃，并加入100ml濃度為500mg/ml的明膠溶液。然后加入軟化水將該混合物的總體積調整至1000ml。最后加入20ml 70mg/ml的過硫酸銨水溶液和4ml N,N,N’,N’-四甲基-乙二胺。所得混合物在70℃下儲存大約3小時，直至形成致密的三維凝膠。此凝膠完全不溶于水。將其切成小塊，然后研磨得到尺寸接近于100-200μm的非常小的顆粒。將這些顆粒懸浮于1升含有5％(w/v)戊二醛的生理緩沖劑中并振搖2小時。最后，充分洗滌這些顆粒，以去除未聚合的物質、副產物和鹽。為了得到均勻的顆粒大小分布，利用合適的篩網將顆粒懸浮液過篩。
這些顆粒具有在肌肉膨脹之前的組織細胞粘連所需的特性，并包括用于有效細胞粘連機理的陽離子基團和粘合劑。
6．2實施例2制備具有趨化性能的球形聚丙烯水凝膠顆粒將如上述實施例1中所述制得的單體溶液緩慢倒入1500ml攪拌的熱石蠟油(50-70℃)中。幾分鐘后，得到液態的懸浮液/乳液(單體水溶液分散到油中，形成非常小的球形液滴)，在懸浮液中發生聚合反應。微滴轉化成微珠。通過離心回收固體微珠，將其懸浮于1升含有5％(w/v)戊二醛的生理緩沖劑中并振搖2小時。最后用水充分洗滌這些顆粒，以完全去除痕量的油。可以用有機溶劑萃取更有效地去除油或者在痕量非離子洗滌劑的存在下進行充分洗滌。如果需要，可以通過尼龍網過篩調整所得到的微珠并在高壓滅菌器中滅菌。這些微球具有在肌肉膨脹之前的細胞粘連所需的特性和性能。
6．3實施例3制備用于組織膨脹的親水性球形聚苯乙烯共聚物顆粒將10g苯乙烯與60ml甲苯混合。向所得溶液中加入1g二乙烯基苯、1g二甲基-氨基乙基-甲基丙烯酸酯和1g二甲基-丙烯酰胺。完全溶解后，將該單體溶液與作為聚合反應催化劑的1％AIBN(2,2’-偶氮二異丁腈)和作為粘度誘導劑的40ml石蠟油混合。將該混合物倒入含有0.5％吐溫80的攪拌的水溶液中。在此情形下，有液滴懸浮液形成，當溫度升高至80-90℃達3-5小時的時候，它變成固體微珠。將所得微珠干燥并用有機溶劑萃取。然后使它們在存在于中性pH的磷酸鹽緩沖劑中的膠原水溶液中膨脹。如實施例1和實施例2中所述，使包埋的膠原與戊二醛交聯。所得微珠具有與細胞組織相互作用的陽離子電荷和用于細胞粘連的膠原，以及用于細胞生長和生物相容性的趨化劑。它們適宜作為組織膨脹劑。
6．4實施例4制備用于細胞粘連和組織膨脹的親水性硅珠將10g直徑為20-300μm的硅珠懸浮于30ml十六胺(10mg/ml)的乙酸乙酯溶液中。將該懸浮液攪拌2小時并加入100ml乙醇。緩慢加入1M硫酸銨或氯化鈉的水溶液，直至得到300ml懸浮液。然后使含有氨基的硅珠在堿性條件下與丁二醇二縮水甘油醚反應。由此得到環氧衍生物，其上使用本領域中熟知的方法偶聯了明膠。所得微珠具有生物相容性、親水性、非生物降解性和借助于陽離子氨基以及作為細胞生長促進劑的明膠的存在使細胞粘連等目標性能。它們適合按照本發明的組織膨脹。
6．5實施例5制備用于組織膨脹的、含有粘連因子的微珠按照實施例2制備的珠粒用制備親和層析吸著劑時所用的熟知試劑進行化學活化。然后將活化珠粒用于細胞粘合劑諸如纖連蛋白或玻連蛋白或層粘連蛋白的固定。將粘合劑以1-10mg/ml的濃度溶于偶聯緩沖劑(pH8-10的100mM碳酸鹽或硼酸鹽緩沖劑)，然后將該溶液與活化珠粒混合。所得珠粒具有細胞粘連和生長、非生物降解性以及是不可再吸收的等目標性能。它們適合按照本發明的細胞粘連和永久性組織膨脹。類似地，也可以使用按照實施例3和實施例4制備的珠粒。
6．6實施例6制備具有趨化性能的球形聚丙烯水凝膠顆粒可從商業上獲得的、名稱為SPEC-70的微珠(BioSepra Inc.,Marlborough,MA)是具有彈性的聚丙烯聚陰離子珠粒，它們適合用于組織膨脹。然而，這些微珠沒有趨化性，也不具有陽離子電荷。首先將SPEC-70微珠在真空下干燥以除去水，然后在生理條件下將其懸浮于1％硫酸軟骨素鈉鹽的水溶液中。一旦此化合物被吸收到珠粒結構上，就將這些珠粒在真空下排水并懸浮于含有20重量％聚賴氨酸的水溶液中。將該懸浮液振搖幾小時，然后在真空下排水并迅速用蒸餾水洗滌。將這些珠粒懸浮于5％丁二醇二縮水甘油醚的乙醇溶液中，振搖過夜。在這些條件下，聚賴氨酸以及硫酸軟骨素發生交聯。所得改性珠粒具有以下性能，諸如帶有用于細胞粘連的陽離子電荷和用于細胞生長的促進劑諸如聚賴氨酸和硫酸軟骨素。
6．7實施例7制備用于組織膨脹的、具有趨化性能的、不透射線的微珠將從實施例2得到的微珠在真空下排水，然后懸浮于氯化鋇的飽和溶液。將它們在室溫下振搖2小時，然后在真空下排水，以除去過量的氯化鋇溶液。將這些珠粒懸浮于硫酸銨飽和溶液并再振搖2小時，之后通過真空過濾除去過量的硫酸銨。與鋇鹽和硫酸銨接觸的這一操作過程可以重復數次，直至在珠粒里面所產生的不透射線的沉淀達到所需數量。所得珠粒具有用于組織膨脹的不透射線的性能，同時也沒有失去它們最初所期望的性能。可以類似地使用從實施例3、4和6得到的微珠。
6．8實施例8制備用于組織膨脹的、具有趨化性能的、不透射線的微珠將從實施例6得到的、用聚賴氨酸包覆的微珠用蒸餾水充分洗滌并懸浮于迭氮酸鈉溶液。加入醋酸將該懸浮液的pH調節至約pH7，振搖數小時。迭氮酸鹽是一種不透射線的分子，將它緊緊吸收到珠粒上，殘留試劑通過在真空下洗滌而除去。所得珠粒仍然具有細胞促進性能，現在還具有了射線不透性。
6．9實施例9在膨脹珠粒里面引入抗炎藥當前面的實施例中描述的微珠注射到目標組織中時，可能導致局部的臨時性炎癥反應。為了避免或減少這種現象，微珠一旦被自體細胞包覆后，就可填充一種或多種抗炎藥。這些微珠的本身是帶有陽離子的，并可通過離子交換作用吸收陰離子藥物。
注射前，將微珠與存在于無菌生理鹽水中的10mg/ml陰離子抗炎藥物溶液混合。將該懸浮液振搖數小時，通過過濾或離心回收填充了藥物的珠粒。所得含有抗炎藥的微珠可以在本發明中用作組織膨脹劑。
6．10實施例10前脂肪細胞在聚合珠粒上的體外粘連和生長為了評定從實施例2得到的聚合珠粒允許前脂肪細胞粘連和生長的能力，從Wistar大鼠附睪周脂肪組織采集并分離出新鮮的前脂肪細胞。然后使用用于體外微載體培養的經典方案，在上述微珠的存在下培養前脂肪細胞，微珠的濃度為約7.1×105-約1.7×106細胞/ml。在第一階段中，細胞粘附在珠粒表面，然后在整個珠粒表面上生長。總的定居期為約72小時。
從這種培養類型得到的前脂肪細胞顯示出與分化成脂肪細胞(脂質積聚)有關的良好的生長和特定生物活性。另外，這些細胞顯示存在特異性酶標志，諸如甘油-3-磷酸-脫氫酶和蘋果酸脫氫酶。帶有粘附于其上的細胞的微珠可在本發明中用于組織膨脹。可以類似地評估實施例2-5的聚合珠粒。
6．11實施例11前脂肪細胞和肌細胞在微珠上的體外培養，以檢查它們整合到體內組織中的能力按照經典方案，從Wistar大鼠分離出前脂肪細胞和平滑肌細胞，以去除大多數其他污染細胞。這些細胞各自在陪替氏培養皿中、在添加有10％胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養基的存在下培養。向在體外培養的細胞中加入按照實施例2制備的明膠包衣的陽離子微珠，直到它們覆蓋了陪替氏培養皿的表面。起始細胞種子濃度為0.7×106細胞/ml。
反復觀察顯示，細胞附著在微珠的表面并進一步繁殖，最終覆蓋了珠粒的所有表面。培養5-7天后，有珠粒的固體網狀構造形成，此時細胞充當粘合劑，將幾個珠粒的團塊聯合在一起。在大多數情況下，形成包含珠粒和細胞的、固態的、不易離解的聚集體。
生長期(一般為5至7天)之后，當向前脂肪細胞中加入分化因子諸如3,3’5-三碘-D-甲狀腺氨酸時，前脂肪細胞開始在細胞質中積聚作為微液滴的脂肪。
用3,3’-雙十八烷基氧雜碳菁高氯酸鹽或2’-[4-羥基苯基]-5-[4-甲基-1-哌嗪基]2,5’-雙-1H-苯并咪唑進行的特異性染色證明了細胞在珠粒底物上的良好粘連。
細胞在分化期開始時用紅油染色證明了脂肪在細胞中的聚集。
此外，蘋果酸酶的特異性酶促反應表明，在培養結束時，所產生的脂肪細胞是有功能活力的，具有它們主要的已表明的特性。這種酶在培養開始時并不明確，而是與脂肪的積聚同時出現。
利用DNA合成測定觀察平滑肌細胞的增殖；以每個前脂肪細胞觀察它們在底物上的粘連。肌細胞也顯示了良好的增殖以及在珠粒上的粘連。
6．12實施例12肌細胞在聚合珠粒上的體外粘連和生長為了評定從實施例2得到的聚合珠粒允許肌細胞粘連和生長的能力，按照經典方法，從大鼠的食管采集新鮮的平滑肌細胞。然后使用用于體外微載體培養的經典方案，在上述微珠的存在下培養這些細胞，微珠的濃度為約106細胞/ml。在第一階段中，細胞粘附在珠粒表面，然后生長直至覆蓋了整個珠粒表面。總的定居期為約72小時。
從這種培養類型得到的肌細胞顯示出良好的生長和性能，并顯示出特異性肌球蛋白標志。帶有粘附于其上的細胞的微珠可按照本發明用于組織膨脹。可以類似地評估從實施例2-5得到的珠粒。
6．13實施例13制備用于體內膨脹的細胞-微珠顆粒的可注射懸液在細胞培養期后，通過過濾收集細胞-微珠顆粒，并用來自將植入該物質的宿主的血清充分洗滌。此操作確保去除了來自細胞培養物的外源物質。然后將這些微珠懸浮于幾毫升自體血清中(微珠/血清比為約1∶1)，準備好借助于合適的注射器或其他注射設備注射到想要膨脹的組織中。
6．14實施例14制備用于體內膨脹的細胞-微珠顆粒的可注射懸液將實施例2中描述的微珠按照實施例10用大鼠肌細胞進行定居，并按照實施例13使用用生理鹽水稀釋(50％-50％)的大鼠血清調理。將固定在珠粒上的細胞的最終無菌懸液(體積的50％由珠粒組成加上50％的生理鹽水)注射到大鼠的右大腿肌肉中。珠粒注射3個月后，觀察肌肉的形狀并進行組織學檢查。尸檢應顯示右大腿的肌肉體積大于左大腿肌肉。肌肉塊里面的珠粒應被成纖維細胞圍繞著出現，同時沒有特定的炎癥或壞死副作用。
上面所描述的本發明的實施方案僅僅是例舉性的，本領域技術人員最多使用常規實驗就可識別出或能夠查明許多與本文中所述的具體方法等價的方法。所有這類等價方法都被認為包含在本發明的范圍內并被以下權利要求書所覆蓋。
本文中所描述的所有參考文獻的內容均引用在此作為參考。
其他實施方案在下列權利要求書中。
權利要求
1.一種治療胃食管回流癥的方法，該方法包含對需要這種治療的哺乳動物給藥治療上有效的組織膨脹量的生物相容的陽離子親水性微粒，該微粒包含位于其表面上的正電荷及細胞粘連促進劑，所述給藥為給藥到下食管括約肌或橫膈膜中。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
3.如權利要求1所述的方法，其中的微粒用自體細胞預先處理、給藥或包覆。
4.如權利要求1或3所述的方法，其中的微球或用細胞包覆的微球在給藥前用血清或全血洗滌。
5.如權利要求3所述的方法，其中的自體細胞是粘膜細胞、肌細胞、脂肪細胞、或其組合物。
6.如權利要求1所述的方法，其中的微粒用至少一種膠原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者與它們相連。
7.如權利要求1所述的方法，其中的微粒存在于無菌和無熱原的注射溶液中給藥。
8.如權利要求1的方法，其中所述微粒是包含陽離子電荷和細胞粘連促進劑的親水性微球。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述微粒是包含親水性共聚物和細胞粘連促進劑的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的約25-約99重量％的中性親水丙烯酸單體、約2-約50重量％的一種或多種具有陽離子電荷的單體、和約1-約30重量％的官能化單體。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述微球的直徑范圍為約10-約1000μm。
11.一種治療尿失禁的方法，該方法包含對需要這種治療的哺乳動物給藥治療有效量的生物相容的陽離子親水性微粒，該微粒包含位于其表面上的正電荷及細胞粘連促進劑，所述給藥為給藥到膀胱括約肌。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
13.如權利要求11所述的方法，其中的微粒用自體細胞預先處理、給藥或包覆。
14.如權利要求11或13所述的方法，其中的微粒或用細胞包覆的微球在給藥前用血清或全血洗滌。
15.如權利要求13所述的方法，其中的自體細胞是囊細胞、肌細胞、脂肪細胞或其組合物。
16.如權利要求11所述的方法，其中的微粒用至少一種膠原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者與它們共價相連。
17.如權利要求11所述的方法，其中的微粒存在于無菌和無熱原的注射溶液中給藥。
18.如權利要求11的方法，其中所述給藥是經注射器完成的。
19.如權利要求11所述的方法，其中所述微粒是包含陽離子電荷和細胞粘連促進劑的親水性微球。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述微粒是包含親水性共聚物和細胞粘連促進劑的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的約25-約99重量％的中性親水丙烯酸單體、約2-約50重量％的一種或多種具有陽離子電荷的單體、和約1-約30重量％的官能化單體。
21.如權利要求11所述的方法，其中所述微粒加載或施與了一種或多種抗炎劑。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述微球的直徑范圍為約10-約1000μm。
23.一種改善皮膚皺紋的方法，該方法包含對需要其的哺乳動物給藥生物相容的陽離子親水性微粒，該微粒包含位于其表面上的正電荷及細胞粘連促進劑，所述給藥是在所述皮膚皺褶部位或周圍。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
25.如權利要求23所述的方法，其中所述皮膚皺紋部位是在人的臉、頸、軀干、手臂、手、胃、髖部、腿或腳上。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述皮膚皺紋部位是在人的眼睛、嘴唇、面頰、耳朵或鼻子區域內。
27.如權利要求23所述的方法，其中所述微粒用自體細胞預先處理或給藥或包覆。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述自體細胞是前脂肪細胞。
29.如權利要求23或27所述的方法，其中的微粒或用細胞包覆的微球在給藥前用血清或全血洗滌。
30.如權利要求23所述的方法，其中所述微粒用至少一種膠原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者與它們相連。
31.如權利要求23所述的方法，其中的微粒存在于無菌和無熱原的注射溶液中給藥。
32.如權利要求23的方法，其中所述微粒是包含陽離子電荷和細胞粘連促進劑的親水性微球。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述微粒是包含親水性共聚物和細胞粘連促進劑的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的約25-約98重量％的中性親水丙烯酸單體、約2-約50重量％的一種或多種具有陽離子電荷的單體、和約1-約30重量％的官能化單體。
34.如權利要求23所述的方法，其中所述微粒加載或施與了一種或多種抗炎劑。
35.如權利要求33所述的方法，其中所述微球的直徑范圍為約10-約1000μm。
36.如權利要求23所述的方法，其中所述給藥在數天內重復多次。
37.如權利要求1、11或23所述的方法，其中所述細胞粘連促進劑選自纖連蛋白、層粘連蛋白、軟骨粘連蛋白、巢蛋白(entacin)、epibolin、肝細胞粘連分子、血清鋪展因子、膠原、硫酸肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、葡糖胺聚糖、及其混合物。
38.一種適合組織膨脹的無菌注射溶液，它包含a)直徑為10-1000μm的親水性陽離子微球，所述微球包含一種中性親水單體、一種或多種陽離子單體、一種或多種官能化單體和一種細胞粘連促進劑；和b)自體細胞。
39.一種用于組織膨脹的方法，它包含(a)制備包含親水性聚合物和細胞粘連促進劑的陽離子微粒；(b)將所得微粒給藥至哺乳動物的需要所述組織膨脹的部位。
40.一種改善皮膚皺紋的方法，它包含(a)制備包含親水性聚合物和細胞粘連促進劑的陽離子微粒；(b)將所得微粒給藥至哺乳動物的所述皮膚皺褶部位。
41.一種治療胃食管回流癥的方法，它包含(a)制備包含親水性聚合物和細胞粘連促進劑的陽離子微粒；(b)將所得微粒通過注射到位于食管與胃交切處的括約肌壁內而對哺乳動物給藥。
42.一種治療尿失禁疾病的方法，它包含(a)制備包含親水性聚合物和細胞粘連促進劑的陽離子微粒；(b)將所得微粒通過尿道對哺乳動物給藥并將該微粒注射到膀胱括約肌壁內。
全文摘要
本發明涉及使用生物相容的親水性陽離子微粒和細胞粘連促進劑治療尿失禁、胃食管回流癥和改善皮膚皺紋。
文檔編號A61K9/18GK1299291SQ99805884
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月4日 優先權日1998年3月6日
發明者J·M·沃格爾, R·托馬斯, E·波舍蒂 申請人:拜奧瑟普拉醫療公司