調節免疫應答的方法及裝置的制作方法

專利名稱：調節免疫應答的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明普遍涉及一種在哺乳動物中調節對抗原的免疫應答的方法，該方法使用一種以受控方式將抗原暴露于免疫系統細胞的可植入裝置。通過建立一種模仿淋巴節的組成和作用的人工環境并對裝置內抗原的生物利用率進行調控，可誘導出針對某種抗原的強烈應答，或能夠對已有的免疫應答進行減量調節。
背景技術：
對抗原的免疫應答的誘導以及該應答的強度取決于抗原、各種免疫細胞、和包括細胞因子和趨化因子在內的協同刺激分子之間的復雜相互作用。免疫細胞暴露于抗原和協同刺激性環境的時間和程度可進一步調節免疫應答。體內這些不同類型的細胞和輔助因子可被方便地帶到諸如淋巴節等淋巴組織的附近。在涉及該過程的眾多類型的細胞中，諸如巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原呈遞細胞可將抗原由外圍傳送至有組織的局部淋巴組織，也可對抗原進行加工，將抗原性肽呈遞給T細胞，以及分泌協同刺激分子。因此，如果使抗原以一種局部交錯方式抵達淋巴器官，那么在最佳濃度梯度及含有協同刺激分子的適當環境下即能夠在引流淋巴節內誘導應答。
以這種方式，如通過疫苗接種，將外來抗原引入體內并不一定會引起具有預期強烈免疫應答的產生。用于疫苗接種的抗原可包括減毒并滅活的細菌和病毒及其組分。疫苗接種的成功在某種程度上取決于抗原的類型和數量、免疫位點的位置、以及疫苗接種時免疫系統的狀況。并非所有的抗原都具有同等的免疫原性，而對弱免疫原性抗原而言，幾乎沒有可用來提高免疫有效性的替代方法。盡管有多種技術可用來在實驗動物中加強免疫應答的產生，如將抗原與一種更具免疫原性的載體蛋白或生物分子(如鑰孔血藍素)相結合，或使用弗氏佐劑或明礬等佐劑，但這些技術和佐劑不能用于人類疫苗接種。因此，有許多疾病本可通過在暴露于感染性因子之前進行免疫接種的方法加以預防，或利用治療性疫苗來誘導產生對已有致病因子或細胞，如癌，的有效免疫應答，而這些方法卻無法對病人使用。
為確定由導致名為無菌性膿腫的異物所吸引的免疫細胞群體，而在哺乳動物體內進行了海綿植入研究，并使植入前或植入后的海綿帶有抗原以進一步研究被吸引的細胞群體。Vallera等(1982，癌癥研究42397-404)將含有腫瘤細胞的海綿植入小鼠以檢測在16天的周期內被吸引的細胞的構成，并發現在早期時出現了細胞毒性細胞前體，而細胞毒性在第16天時達到峰值。將含有腫瘤細胞的海綿植入已預先用腫瘤細胞免疫的小鼠，則顯示海綿內細胞毒性細胞的出現更加迅速。在兩種情況下，來自脾、淋巴節或腹膜的細胞均未顯示出細胞毒性，這表明對海綿內抗原的應答具有高度區域性。
Jenski等(1985，免疫學方法雜志85153-161)則利用類似條件通過植入帶有抗原的海綿使亞致死照射后接受同系骨髓移植的小鼠恢復了細胞免疫力。免疫力恢復的確定是通過測量海綿內恢復細胞的細胞毒性T淋巴細胞活性隨時間的變化。Zangemeister-Wittke等(1989，免疫學雜志143379-385)是將腫瘤疫苗注射到植入腫瘤免疫小鼠的海綿內，并監測海綿部位產生的二次免疫應答。在鄰近植入的海綿的淋巴節內未出現明顯的伴發效應。
Chen等(1994，癌癥研究541065-1070)收集了帶有已照射腫瘤細胞的植入海綿內的T細胞，以說明這些細胞可用來繼承性轉移抗腫瘤活性。在植入攜腫瘤細胞海綿的動物體內測量了由海綿及局部淋巴節和脾回收的腫瘤反應性細胞毒性T細胞的頻率。海綿內包含的腫瘤細胞反應性細胞毒性T細胞比淋巴節高4倍，比脾則高50倍。
盡管為了解決可用的有效疫苗方面的這些缺陷而在進行著有意義的研究，但與治療技術及材料相關的困難依然存在。因此需要開發出一種可克服目前與流行免疫療法及治療協議，如預防性和治療性免疫接種，相關的難題的技術或方法，從而需要推進有效而又高效的新策略的發展，用于改善對健康哺乳動物及那些可受益于免疫療法的動物實施免疫法的有效性。此外，對特定抗原或系列抗原的免疫應答加以抑制的能力將為，例如，過敏反應的治療及移植排異的預防提供優勢。因此，本發明將針對這些目標的實現。
發明概述本發明提供一種方法，該方法通過在哺乳動物體內植入一種含有被裝入帶孔但又不通透的容器的多孔基質的裝置來調節哺乳動物體內對某種抗原的免疫應答。在裝置的多孔基質中存在有所需免疫應答所針對的抗原。該抗原可在植入前即存在于裝置中，也可在植入后引入該裝置；植入時，裝置的基質中存在的抗原能夠以不具生物利用率但植入后可變為具有生物利用率的形式提供。該裝置將吸引免疫系統的細胞與裝置中的抗原相遇，并且這種相遇將調節對抗原的免疫應答。帶孔容器作為擴散屏障，可保持裝置內由免疫細胞在裝置中產生的高水平的細胞因子和其它協同刺激因子，這些因子與裝置中的其它免疫細胞接觸時可提高所需免疫應答的建立。孔洞可作為免疫細胞的進出通道。所需免疫應答可包括細胞免疫、粘膜免疫和體液免疫，并且對健康哺乳動物和那些可受益于免疫療法的動物均適用。
例如，本發明的實施是在植入哺乳動物體內之前在本發明的裝置中提供少量的抗原。而優選的是在植入哺乳動物體內約3天后，將抗原引入裝置的多孔基質，或使其中的抗原變為具有生物利用率。在哺乳動物體內將誘導出對該抗原的強烈免疫應答。
在另一實施方案中，該裝置由最終可在體內降解的生物可降解材料組成。作為選擇，也可在該裝置實現其預期效應后將其由體內取出。
從其最廣泛的方面來看，本發明提供一種用于免疫哺乳動物的可植入裝置，該裝置具有以下特征一種被裝入帶孔但又不通透的容器的多孔基質，裝置的基質中另含有一種在植入前即以生物可用形式存在或可在植入后變為生物可用形式的抗原，或在植入后將抗原引入其中。裝置內抗原的生物利用率可通過以延遲釋放劑型等非生物可用形式提供抗原來加以控制，如通過微球、微膠囊或脂質體等一旦降解即可將抗原釋放入裝置的基質中的形式提供。
在另一實施方案中，本發明的方法和裝置可用來降低或減量調節哺乳動物體內對某種抗原的免疫應答，它是通過在裝置中使用一種高濃度的特定抗原，這可導致對特定抗原的免疫應答的抑制，并抑制對該抗原的免疫應答的建立。細胞因子或其它協同刺激分子也可在裝置中提供。
本發明所述方法和裝置的更多應用包括從裝置中收集免疫細胞，以用于隨后為進行繼承性免疫療法、主動免疫法和免疫系統重建而實施的再次引入體內。其它應用還包括改善多克隆抗體(免疫血清)及單克隆抗體的制備，如在含有人免疫細胞的動物中制備人單克隆抗體。
由下文將會明顯看出，利用本文所述發明，通過建立一種模仿淋巴節的組成和作用的人工環境并對裝置內抗原的生物利用率進行調控，可產生針對某種抗原的強烈應答。在用于特定抗原的不同條件下，則能夠對已有的免疫應答進行減量調節。
附圖簡述

圖1顯示在植入哺乳動物皮膚后的9天時間中本發明所述裝置內的細胞群體的時程。
圖2顯示在植入不含任何抗原的裝置4天后，裝置中出現的細胞的數量及類型分析。
圖3顯示在不引入任何抗原的情況下，植入4、7和10天后裝置中各種細胞類型群體的變化。
圖4顯示在植入后第3、7和10天將抗原引入裝置對裝置中CD3-陽性細胞(T細胞)、CD80-陽性細胞(B細胞)、以及CD14-陽性細胞(作為抗原呈遞細胞的代表性亞類的巨噬細胞)數量的影響。
圖5顯示在植入不含或含有不同數量流感抗原的裝置10天后、或利用抗原加佐劑于爪墊中免疫10天后，小鼠脾臟中CD4陽性(輔助性T細胞)和CD8陽性(細胞毒性T細胞)細胞的表達變化分析。
圖6顯示脾細胞對流感抗原的增殖應答測定，這些細胞來源于已植入含有抗原并含有或不含佐劑的裝置的小鼠，或來源于由抗原加佐劑于爪墊中免疫的小鼠。脾臟T細胞的增殖是根據干擾素的產生來進行測量。
圖7顯示分離自小鼠腘淋巴節的T細胞的γ-干擾素分泌水平，這些小鼠已由流感抗原加佐劑于爪墊中免疫。
圖8顯示根據小鼠中γ-干擾素的分泌水平測量的脾臟T細胞的增殖應答，這些小鼠已利用含有或不含佐劑的本發明所述裝置以流感抗原免疫。
圖9顯示根據已利用不含佐劑的本發明所述裝置以一定劑量范圍的卵清蛋白抗原免疫的小鼠中γ-干擾素的分泌水平測量的脾臟T細胞激活水平與通過爪墊注射相同劑量范圍的抗原和佐劑而免疫的動物的脾細胞增殖應答的比較。
圖10同樣顯示根據已利用不含或含有BCG佐劑的本發明所述裝置以0、50μg、50ng或50pg卵清蛋白免疫的小鼠中γ-干擾素的分泌水平測量的脾臟T細胞增殖應答與通過爪墊注射含Ribi佐劑的相同劑量抗原而免疫的動物的脾細胞增殖應答的比較。
圖11顯示已植入含不同劑量HIV gp120肽抗原裝置的動物中抗抗原IgG2a特異抗體的應答與通過爪墊注射含佐劑的相同劑量抗原而免疫的動物的比較。
圖12顯示除在第一次免疫后三星期時用初次免疫量的10％以相同途徑進行加強外，其余均與圖11所示的實驗相同時的結果。植入動物體內的裝置重新裝載抗原。
圖13為利用含有或不含Ribi或BCG佐劑的本發明所述裝置免疫的動物或利用含相同佐劑的傳統爪墊免疫法免疫的動物中產生抗HIV gp120肽的IgG2a特異抗體的比較。
圖14顯示利用不含佐劑的本發明所述裝置，或利用含Ribi佐劑的傳統爪墊免疫法以不同劑量細胞色素C抗原免疫的動物中IgG2a特異抗體的水平。循環IgG2a的水平利用連續稀釋的小鼠血清加以監測。
圖15顯示利用不含佐劑的本發明所述裝置以0.1μg或10μg流感血凝素蛋白片段(BHA)免疫后的小鼠與利用含Ribi佐劑在爪墊以相同抗原劑量免疫的小鼠所產生的總流感病毒特異IgG的水平比較。
圖16顯示利用γ-干擾素進行T細胞激活測定的讀出結果。顯示小鼠利用不含佐劑的本發明所述裝置以流感抗原進行免疫，與利用含佐劑的抗原以爪墊免疫法進行免疫，以及將抗原置于植入的多孔聚合基質中(但不象本發明的裝置那樣置于帶孔容器中)進行免疫之間的比較。
圖17顯示上述實驗中將來源于已被流感免疫的小鼠的脾細胞用無關抗原(EBV)進行體外攻擊的結果，表明在利用本發明所述裝置免疫后產生的應答的特異性。
圖18顯示一種蛋白(牛血清白蛋白)僅從海綿擴散與從本發明所述裝置擴散的測試結果比較。
圖19顯示在插入小鼠4天后由不含或含有流感抗原的本發明所述裝置提取的細胞的表型。圖中給出未處理的小鼠的外周血淋巴細胞中相同細胞類型的值。
圖20顯示不含抗原的本發明所述裝置與血清中的刺激性細胞因子水平的比較。
圖21顯示通過植入含流感病毒疫苗的本發明所述裝置與通過流感病毒疫苗加佐劑經皮下免疫的動物中，由經過流感感染的靶細胞裂解測量的細胞毒性T細胞的激發程度比較。
圖22顯示利用含流感病毒疫苗的本發明所述裝置免疫的小鼠與利用該疫苗加佐劑經皮下免疫的小鼠中，由流感病毒特異性IgG1的水平測量的體液應答的比較。
圖23顯示利用含流感病毒疫苗的本發明所述裝置免疫的動物與利用該疫苗加佐劑經皮下免疫的動物中產生的流感特異性IgG1的親和力比較。
圖24顯示在利用含流感病毒疫苗的本發明所述裝置免疫后，以及利用該疫苗加佐劑經皮下免疫后，用流感病毒攻擊的小鼠的存活率比較。
圖25顯示經本發明所述裝置免疫，以及經肌內免疫的SCID小鼠產生的流感特異性人IgG抗體的效價比較。
圖26顯示抗流感抗原的血清抗體(如圖25所述)與通過抗原的肌內給藥產生的抗體的親和力比較。
圖27顯示由本發明所述裝置中存在大量抗原而導致的免疫應答抑制。
圖28說明本發明所述裝置利用質粒DNA進行免疫方面的應用。
圖29-31說明本發明所述裝置在產生對多糖抗原的免疫應答方面的應用。
圖32顯示本發明所述裝置在誘導對高度保守從而具有弱免疫原性的抗原，親環蛋白，的免疫應答方面的應用。
圖33顯示本發明所述裝置在全動物誘導針對寄生蟲抗原的免疫應答方面的應用。
發明詳述本發明提供一種在哺乳動物中調節對抗原的免疫應答的方法，該方法使用一種以受控方式將抗原暴露于免疫系統細胞的可植入裝置。通過建立一種模仿淋巴節的組成和作用的人工環境并對該裝置內抗原的生物利用率進行調控，可誘導出針對某種抗原的強烈應答，或能夠對已有的免疫應答進行減量調節。該裝置包含一種多孔基質，即一種海綿狀材料，周圍環繞著或被包含在一種帶孔但又不通透的在此被稱為容器的包層或屏障中。帶孔容器作為擴散屏障，可使該裝置內保持高濃度的免疫細胞分泌產物。可在把該裝置插入皮膚內之前或之后將要產生的或要減量調節的免疫應答所針對的抗原置于裝置的多孔基質內。對誘導強烈的免疫應答而言，優選的是使裝置基質內的抗原在裝置插入約3天后變為具有生物利用率。這可通過在該時間點左右將抗原注射于裝置內，或通過使用一種裝置，其基質內含有一種可在約3天后變為具有生物利用率的延遲釋放形式的抗原，來加以實現。對減量調節或抑制針對特定抗原的免疫應答而言，根據具體的抗原，優選的是在裝置植入哺乳動物之前將具有完全生物利用率的抗原置于其中。在植入裝置后再將抗原置于裝置內的情況下，可利用注射器和皮下針頭通過確定裝置的位置，并將針頭插入該裝置的方法將抗原跨皮膚引入裝置。該裝置可留在體內適當位置，或可從體內取出。它可由最終能夠在體內分解的可生物降解材料制成，也可在實現其預定效果后被移除。在以后的時間里可將抗原再次引入裝置。抗原可在該裝置內單獨使用，也可與一種佐劑或混合佐劑共同使用。優選的是不使用任何佐劑。
本發明針對多種形式的免疫療法提供一些改進措施，由其可產生或加強針對某種抗原的預期免疫應答，也可反之將針對特定抗原的現有免疫應答或可能產生的免疫應答分別進行抑制或阻斷。它們包括接種法，如針對特定抗原對健康哺乳動物進行接種，和治療性接種法。免疫應答的阻斷或抑制可在與特定抗原相遇前施加于哺乳動物，如未來的移植受體、預期要與一種過敏原接觸的哺乳動物，或諸如在自身免疫疾病中易于對外源或內源抗原產生免疫應答的個體。在暴露于抗原后，對免疫應答的抑制可能是有用的，如對抗原產生變應性或過敏性應答的哺乳動物，或遭受移植排異的個體。本發明的方法和裝置可針對各種形式的免疫，如細胞免疫、體液免疫和粘膜免疫。
該裝置的形狀及其使用方法可模擬哺乳動物淋巴組織，尤其是淋巴節，的結構和功能。在體內，引入的外來抗原被抗原呈遞細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞吸收并加工，這些細胞進入淋巴節后將來自抗原的免疫原性肽以特定的構象與MHC抗原一同呈遞給T淋巴細胞。T細胞的特定亞類(CD4-Th2)可協助B細胞，并支持高親和力體液免疫的產生。B細胞能夠與抗原直接相互作用(尤其是復合抗原或記憶抗原)并分化為漿細胞，分泌針對免疫性抗原的特異抗體。抗原呈遞細胞還分泌可共同參與免疫應答產生的細胞因子、淋巴因子及趨化因子。裝置中的帶孔容器部件作為一道擴散屏障，可維持裝置內及裝置中的免疫細胞附近的抗原水平和諸如細胞因子等免疫細胞分泌產物的水平。孔洞可限制這些分子從裝置中擴散，但它允許免疫細胞和其它細胞自由進出該裝置。據觀察發現，極少量的抗原已足以誘導強烈的免疫應答。因此可將裝置中存在的抗原與裝置中的免疫細胞和協同刺激分子的相互作用進行優化，以增強對抗原的免疫應答的產生，并通過產生記憶細胞群體而賦予長期免疫。
將本發明的裝置植入哺乳動物體內可導致無菌性膿腫，其中，免疫系統的某些細胞被異物所吸引并穿過有限數量的孔洞。在起初的幾天里，裝置中積聚的細胞群體逐漸增加，甚至在不存在任何抗原的情況下也是如此。隨著裝置中的抗原約在第3天變為具有生物利用率，以及抗原與基質中存在的免疫系統細胞相遇，抗原則被抗原呈遞細胞所吸收并進行加工，然后呈遞給T淋巴細胞。由于該裝置經由帶孔容器而暴露于外界的程度有限，因而免疫細胞可以進入，但抗原卻保留在裝置內并保持高濃度，由裝置中的細胞群體所分泌的協同刺激因子同樣保持高濃度，這與淋巴節內的方式相同。當T淋巴細胞致敏并激活后可通過有限數量的孔洞離開裝置并重新進入循環。因此，該裝置提供一種方法，用于控制抗原暴露于免疫系統細胞的程度，并維持細胞因子和其它產生穩固免疫應答所需的因子的水平。由下文實施例將會發現，該裝置在產生對特定抗原的免疫應答方面將提供不同級別的改進措施。
從理論角度進一步考慮，植入含有大量特定抗原的本發明所述裝置將會以相反于上文所述的方式發揮功能，因為它能夠減量調節或抑制現有的或潛在的對抗原的免疫應答。將T細胞暴露于過量抗原明顯會誘發抗原特異性T細胞的凋亡，從而除去抗原特異性T細胞和祖細胞，而有效抑制針對抗原的細胞應答和體液應答。通過在抗原刺激中加入細胞因子(如IL-2、IL-4、-IFN、IL-12)而介導的T細胞超活化，或在不應狀態下(即在激活狀態消退之前)將T細胞暴露于額外抗原刺激都將觸發細胞的凋亡，并導致抗原特異性系統中反應性克隆(B細胞或T細胞)的缺失。熟練技術人員將了解或能夠很容易地確定應選擇的適當特定抗原濃度，以利用本發明所述裝置實現對免疫應答的刺激或抑制。特定抗原的免疫原性以及由此決定的其免疫抑制劑量和免疫刺激劑量的范圍可利用該領域已知的體外或體內方法加以確定。
此外，由利用本發明所述裝置實現的免疫應答的加強要超出可由傳統免疫法實現的水平，傳統的免疫法通常包括對動物使用佐劑。從理論基礎上來看，僅將抗原受控暴露于裝置內的免疫細胞和其協同刺激因子似乎可提供一種用于實現強烈免疫應答的最佳環境，它要優于由利用佐劑實現的免疫應答。
免疫法可提供一種有效方法，用于預防眾多感染性疾病因素，例如病毒如流感病毒、HIV病毒、乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒、脊髓灰質炎病毒和狂犬病病毒；細菌，如大腸桿菌、假單胞菌、志賀氏菌、梅毒、分枝桿菌、衣原體、立克次氏體和粘質沙雷菌；真菌，如曲霉、念珠菌；以及原生動物和多細胞寄生蟲，如血吸蟲屬、瘧原蟲屬、盤尾屬和變形蟲。免疫法還可能利用治療性疫苗對已患有感染性疾病的個體進行治療。此外，免疫法還可預防或治療非感染性疾病，如癌癥。但許多抗原的免疫原性很弱，而在預防或治療這些疾病方面未能證明免疫法是一種適當的策略。在動物免疫中常規使用的佐劑不能使免疫應答增強。此外，個體或患者的免疫系統可能不處于最佳運行狀態，從而對能夠在其它健康個體中產生強烈免疫應答的抗原可能無法產生免疫應答。這些狀況為利用本發明所述裝置來刺激由傳統免疫法無法實現的強烈免疫應答提供了機會。
在治療某些病情，如過敏反應，或準備將患者暴露于外來抗原，如進行移植，時可能還需要對免疫應答進行抑制。不適當的免疫應答被認為是眾多自身免疫疾病及其它疾病的病因，如I型糖尿病、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、葡萄膜炎、系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力以及毒性彌漫性甲狀腺腫。在個體中植入含有可疑抗原的本發明所述裝置可誘導那些經致敏后能夠識別該抗原的進入細胞發生凋亡，并將其從免疫系統中清除。將抗原特異性祖細胞清除能夠使以后的外來抗原移植不發生排異。
本發明的更多應用包括改善實驗動物中多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體的產生，并獲得由此產生的所需同種抗體。在一項實施方案中，利用本發明的裝置可實現針對極少量抗原的多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體的制備過程。為對動物進行免疫，本發明所述裝置只需含有少量的稀有抗原，而且能夠在此后收集脾細胞。這種方法為目前直接將稀有抗原引入脾臟這種單調且無法預測結果的方法提供了改進措施。此外，利用本發明所述裝置可避免對加強免疫的依賴。并且除此之外還能夠更迅速地產生免疫應答。免疫動物所需的時間縮短，使得單克隆抗體的產生更加迅速。在另一項實施方案中，可在利用該裝置提供抗原以對動物進行免疫之后從裝置中收集用于產生雜交瘤的免疫細胞。該方法還可用于人單克隆抗體的產生，方法是將本發明的裝置植入個體，在裝置中裝填抗原，然后從裝置中收集用于產生雜交瘤的免疫細胞。上述的多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體可用于診斷、基礎研究、成像和/或治療。在另一項實施方案中，利用在重度復合性免疫缺陷病(SCID)小鼠中植入本發明所述裝置可產生人單克隆抗體，其方法如下。首先，將人周圍血淋巴細胞注射到SCID小鼠體內，使其中的人淋巴細胞填充小鼠免疫系統。將本發明的裝置植入，裝置中含有可在植入約3天后變為具有生物利用率的所需抗原，然后從裝置中收集細胞，由此獲得的人B淋巴細胞即可用于產生雜交瘤，這些雜交瘤能夠分泌抗所需抗原的抗體。
本發明所述裝置的進一步應用是從哺乳動物中收集免疫細胞，用于以后的再次引入哺乳動物。從該裝置中去除細胞的方法有，例如，從植入的裝置中吸出，或由體內取出后通過聚合物基質溶解而從裝置中收集，隨后可將細胞通過諸如冷凍保存的方法加以儲存，并可以在以后的時間里重新引入哺乳動物。這對經受全身放射治療的哺乳動物尤其有效。可將不含抗原的本發明所述裝置植入并保持7-10天，然后取出該裝置或其內容物，并把其中包含的細胞冷凍保存。在放射治療之后，可把這些細胞重新引入哺乳動物體內，由此，這些細胞將重構免疫系統。在該項應用的另一項實施方案中，可在收集前將協同刺激因子，如能夠誘導免疫細胞增殖的細胞因子，引入該裝置，以提高裝置內的細胞產量。在一項更進一步的實施方案中，從帶有抗原的裝置中收集的免疫細胞可用于主動免疫，其中的細胞可被儲存，而后可在，例如，化療或其它治療操作的一個療程后重新引入哺乳動物。在又一項實施方案中，可將由裝置收集的細胞儲存，并在此后于引入體內之前將其暴露于抗原(如癌抗原)，使T細胞先體外后體內傳播，以此來進行繼承性免疫治療。
在本發明的另一項應用中，該裝置可用于以基因轉染裝置內的免疫細胞。經轉染的免疫細胞繼而可致敏裝置中的免疫細胞，并且/或能夠在遷移出該裝置后致敏遠端的免疫細胞。舉例來說，可將編碼腫瘤特異性抗原或病毒性、細菌性或寄生蟲性抗原的DNA、RNA或cDNA置于含有或不含相應蛋白抗原的裝置內。進入該裝置的抗原呈遞細胞可被基因轉染，從而表達抗原蛋白，并且能夠遷移至體內的周邊部位，在那里它們將刺激免疫細胞。
本發明的裝置可通過熟練技術人員所了解的方法加以制備，只要其結構能夠使它以上文所述的方式發揮作用，其大小和形狀則可各不相同。如上文所述，該裝置可作為小分子，如引入裝置的抗原、細胞因子及其它由裝置內的免疫細胞分泌的因子，的擴散屏障，但它允許免疫細胞進出該裝置。因此，蛋白和其它小分子的被動擴散受到限制，而免疫細胞卻能夠主動移進并移出該裝置。在一項實施方案中，可在需要的情況下將裝置由一小段中空的生物惰性塑料管，如硅酮管制成，以便于插入皮膚的小切口，并便于以后取出。多孔聚合物基質，即海綿狀材料，要配合管孔的尺寸。其開口端封閉或不封閉均可。在管壁上造少量孔洞。孔洞數量、形狀及大小的各種變化均處在本發明的范圍之內。引入的抗原可采用溶液或懸浮液形式或不具有生物利用率的形式，這些抗原可通過在制造過程中摻入基質或通過管的一端或管壁本身注射入基質。
抗原能夠以文中稱為生物可用或完全生物可用的形式直接在裝置的基質中提供，或能夠以隨后可變為具有生物利用率的非生物可用形式提供。將抗原摻入提供受控釋放、持續釋放或延遲釋放特性的成分也同樣適合；這些方法及成分可包括裝入微囊、脂質體和小球體。優選而言，為刺激或加強對抗原的免疫應答，配制的抗原應在植入約3天后在基質內恢復生物利用率。適當的釋放劑型均被該領域所了解。
在另一項實施方案中，裝置可由聚合基質材料制成預期的最終裝置的形狀，并可在其表面使用一層不通透的涂層。作為選擇，也可將具有一定孔隙度和交聯度的聚合基質壓塑成預期的裝置形狀，然后外部用一種可在裝置表面與聚合物進一步交聯的制劑處理，以有效形成不通透的涂層或容器。隨后可將涂層打孔并引入抗原。如果使用一種可由紫外光固化的聚合物，那么表面用紫外光處理也可影響裝置表面聚合作用的增加。熟練技術人員在設計具有上述特性的適當裝置時均可輕易地實現，因而文中提供的實例均不是限制性的。
構成該裝置的材料可選自廣泛的天然或合成的適當組合物。在一項實施方案中，聚合基質可以是一種生物相容性材料，如羥基化聚乙酸乙烯酯。另一種可廣泛采用的基質是聚氨基甲酸乙脂。其它適當的材料包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚交酯/乙交酯共聚物、膠原蛋白、交連的膠原蛋白以及明膠。
如上文所述，能夠通過許多方法在聚合基質周圍實現帶孔但不通透的屏障或涂層。在一項實施方案中，是將多段聚合基質置于一小段諸如硅酮管等生物相容性塑料管的管腔中，在一項實施例中，是將一段內徑0.15cm、外徑0.2cm、長2.5cm的管材以相應長度2.5cm的一段預濕的羥基化聚乙酸乙烯酯基質填充。在另一項實施例中，屏障或涂層是由適當的天然或合成材料制成，如塑料或其它聚合物，如聚乙烯、交連的膠原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳膠樹脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、聚乙烯吡咯烷酮，以及其組合物。有一種可從Dow Corning購得的材料是SILASTIC硅酮。這些非限制性實例僅作為可適用于本發明的廣泛組合物中的典型。
在符合可限制小分子擴散但允許免疫細胞進出的上述的該裝置預期特性的情況下，作為制備本發明所述裝置的一個非限制性實例，可按照以下方法手工制備一種裝置。用外徑0.047英寸、直徑0.0235英寸、長1.125英寸的硅酮管作為本發明所述裝置的非通透性容器。孔洞可利用20號皮下注射針頭穿過該裝置的壁而手工鉆成，其產生的孔洞直徑約為1/16和1/32英寸。管內鉆20個孔。這些參數僅作為該裝置的特征的一個參考，熟練技術人員將了解可同樣實現上文所提目標，即不限制細胞進出但限制和禁閉裝置內諸如細胞因子等小分子的擴散，的其它參數。
本發明的可生物降解裝置可包含一種由已知能夠在體內緩慢降解的材料制成的基質和容器。這些材料包括明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物以及其它為熟練技術人員所了解的材料。因此，用于刺激免疫應答的優選可完全生物降解裝置含有一種可生物降解容器、一種可生物降解基質，以及包含于基質的一種可生物降解的延遲釋放抗原制劑。末尾提到的制劑可在植入約3天后釋放抗原；而基質和容器則在該裝置的使用期之后開始明顯生物降解，這大約是植入10天后。
該裝置的容器中的孔洞可通過多種方法中的任何一種來形成，如手工方法或自動方法。以少量的孔洞最為適宜，盡管其數量在某種程度上取決于該裝置的大小和形狀，但優選的數量為每厘米管長約10個。從上述的理論來考慮，孔洞的作用是允許免疫系統細胞進入裝置，從而使其能夠與抗原和協同刺激分子相接觸并被致敏，然后還允許致敏細胞外出。這些目標必須要實現，同時帶孔裝置還必須容納并保持裝置內預期水平的抗原和免疫系統細胞產生的諸如細胞因子等協同刺激因子。如下文的實施例所示，這些要求可通過適當數量和形狀的孔洞來得以實現。在裝置由一段管材制成的情況下，管的末端可保持開放以充當孔洞，也可充當植入前或植入后引入針頭或其它裝載抗原的方法的插孔。
該裝置可植入身體的適當部位，使插入、裝載抗原及取出能夠在患者的不適感最小的情況下得以實現。適當部位之一為上臂內側面。在另一項實施方案中，該裝置由可生物降解材料制成，其程度達到該裝置可在使用期后降解而無需取出。
對刺激免疫應答而言，可在植入時或優選的是在植入后將具有生物利用率的抗原置于該裝置中；如果是在植入后，則優選的時間約為植入3天后。也可在植入時將能夠在植入約3天后向裝置的基質中釋放抗原的具有延遲釋放特性的非生物利用率抗原制劑置于該裝置內。約3天后，裝置中所含細胞的數量和類型足以對存在的抗原產生應答，并且由這些細胞分泌的細胞因子和其它協同刺激分子通過帶孔容器賦予的擴散屏障而被維持在足夠高的水平，然后向裝置中引入抗原將誘發產生最佳的免疫應答。
如果該裝置不是由上述的可生物降解材料構成，那么可在它實現其預期作用后通過簡單的手術操作將其取出。一般約10天后，免疫細胞群體已離開裝置，而該裝置也不再發揮作用。另一方面，也可在此后用抗原重新裝填裝置以加強免疫應答。
如上所述，為實現對免疫應答的預期刺激或抑制，對裝置的基質中抗原的生物利用率進行時間調配顯得十分重要，而且依賴于特定抗原的特性。一般而言，在植入時提供高濃度的具有完全生物利用率的抗原將對該抗原引起的免疫應答產生抑制效應。而在裝置植入約3天后提供少量的具有生物利用率的抗原通常會產生刺激免疫應答的效應。這些條件在不降低本發明實用性的情況下可有所變化，這將取決于該裝置所用特定抗原的特性。熟練技術人員將能夠通過標準的體外或體內方法評定特定抗原的免疫原性，并能夠確定抗原的適當濃度以實現預期的效應。
利用本發明所述裝置來增強或刺激對抗原的免疫應答的方法是希望產生免疫細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞群體，這些細胞將針對該裝置所用抗原發動有效的免疫應答。
利用上述方法和裝置對一種特定抗原引起的免疫應答進行減量調節是本發明的另一目標。通過在裝置中加入高劑量的抗原，可誘導進入裝置并與抗原相遇的免疫細胞發生凋亡。如果在植入前或植入后讓受者使用一種含有供者抗原的本發明所述裝置，則可預防或治療移植物排斥或移植排異等病癥。免疫應答的減量調節可影響的一般病癥包括移植，在該病癥中可使受者耐受供者的血細胞，以減量調節受者對供者移植物的免疫應答；自身免疫疾病，在該病癥中，對自體抗原的耐受可減量調節致病T細胞，并可利用內源性抗原來改善免疫復合物的形成，如在類風濕性關節炎中使用膠原蛋白；糖尿病，在該病癥中可使糖尿病患者耐受胰島素或GAD；以及重癥肌無力，在該病癥中可使患者產生耐受性，以避免對乙酰膽堿受體的免疫應答。此外，以過敏癥和變應性反應為特征的免疫應答可通過誘導那些負責免疫應答的免疫細胞發生凋亡，從而使患者對變應原耐受或脫敏來加以治療。可在本發明所述裝置中使用以抑制免疫應答的過敏癥及抗原的實例包括貓過敏癥過敏原DERP-1，以及由漆酚修飾肽引起的毒葉藤/毒葛(poison ivy/oak)過敏癥。
給出以下實施例是為了能夠更充分地闡明本發明的優選實施方案。但它們決不應被認為是限制本發明的廣闊范圍。
實施例1制備本發明所述裝置的一個實例是采用一段內徑0.15cm、外徑0.2cm、長2.5cm的硅酮管，并用長2.5cm的一段羥基化聚乙酸乙烯酯海綿填充。將該裝置浸沒于含有磷酸緩沖鹽溶液的容器中并高壓滅菌。用三溴乙醇麻醉雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)。第1天將該裝置通過背側中線處的一個0.5cm的切口插入。在植入后2天時，取一些動物在裝置中引入50μl的1mg/ml流感抗原(FLUSHIELD流感病毒疫苗，三價，A&B型；來自Henry Schein，Melville NY)，方法是用一個注射針頭穿透植入裝置附近的皮膚，然后靠感覺將針頭導入裝置的一端。
利用注射針頭在植入后2、4、7和9天時各從5只動物的植入裝置中吸出流體，然后將流體中的細胞合并、清洗并計數。如圖1所示，在植入不含抗原的裝置的動物中，細胞群體于第4天開始增加，并在第7天達到峰值。第9天時，裝置中的細胞數下降，表明移入裝置的細胞正在移出該裝置而進入周邊。如果在植入后2天時把流感抗原加入該裝置，則在植入后4天時裝置中的細胞數量增加了數倍，達225,000，相比之下不含抗原的裝置中的細胞數為60,000。因此，裝置中抗原的存在增加了募集至裝置中的細胞數，并/或觸發了裝置內細胞的增殖。
實施例2該實驗利用BALB/c小鼠檢測裝置中出現的細胞的數量和表型。在如實施例1所述將裝置植入后的4天里，各從5只動物的裝置中吸出細胞，并將其合并、清洗，再分裝至幾個試管中。加入對以下標記物(CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD62P、CD62E、CD3和I-Ad)具有特異性的經異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標記的單克隆抗體，于4℃保溫30-45分鐘，然后清洗細胞并利用流式細胞光度計測定熒光的幾何平均值。為了進行比較，還利用同組特異抗體測定來自同系未處理的小鼠的外周血淋巴細胞的熒光值，并將各抗體的所得結果表示為來自裝置的細胞相對于外周血淋巴細胞的熒光值增加百分率。
圖2給出在插入后4天時由裝置吸出的細胞的表型。在裝置中明顯遷入并聚集有高密度的T細胞(CD3、CD40)、巨噬細胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、樹突狀細胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B細胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。
實施例3通過在植入后3、7和10天時從裝置中收集細胞來計算如實施例1所述的裝置中細胞群體隨時間的變化。在第一次實驗中，裝置內不含任何抗原。將每個時間點由5只小鼠的植入裝置中吸出的細胞合并，并按照實施例2所述的相同方法測定帶有CD3、CD8、CD80、CD44、CD11c、CD45R/B220和CD14標記物的細胞的密度，測定值表示為相對于未處理的小鼠外周血淋巴細胞的增加百分率。
圖3給出在植入后3、7和10天時計算的各表型細胞的密度。對所有標記物而言，裝置中各細胞類型的富集明顯發生在第3天和第7天，而第10天時，細胞群體已遷出該裝置。
實施例4在與上例完全相同的第二次實驗中于植入后2天時將流感抗原引入該裝置。如圖4所示，裝置中抗原的存在進一步加大了T細胞和抗原呈遞細胞(CD3、CD80或CD14)的密度，而且導致第10天時仍存留有這3種類型的細胞。加入抗原可延緩免疫細胞離開該裝置。
實施例5通過測定植入動物的脾臟中CD4和CD8 T細胞的表達變化，對植入含流感抗原裝置的遠端效應進行了評估。方法如上文所述，并利用實施例2的方法測定T細胞的表型。在植入后2天時，裝置中引入0、5、10或50μg流感疫苗，并在免疫后10天(植入后12天)時收集脾臟。將脾臟置玻片粗面輕輕磨碎以分離脾細胞。細胞用PBS清洗并在紅細胞裂解緩沖液(Sigma)中保溫5分鐘以去除紅細胞。如上所述用流式細胞光度計測定CD4和CD8的熒光。作為對照，還采用了傳統的標準免疫方案，將小鼠經爪墊注射相同劑量的流感抗原和Ribi佐劑R-700，一種由RibiImmunoChem Research,Inc.制造的含有單磷酰基脂A及合成海藻糖dicrynomycolate(MPLA+TDM)的乳劑。對照鼠亦在免疫后10天時取血。
如圖5所示，在裝置中裝載抗原后，來源于已植入裝置小鼠脾細胞的T細胞顯示出CD4和CD8分子的密度增加。來自以傳統方法用50μg抗原加佐劑免疫的動物脾臟的細胞毒性T細胞(CD8)的水平與利用本發明所述裝置用10μg抗原誘導的水平相等。此外，不含抗原的裝置中也顯示出脾臟內CD8細胞的增加，這是該裝置誘導的無菌性炎癥的結果。值得注意的是，在動物中植入含有50μg抗原(與對照動物中經爪墊注射含佐劑的抗原的量相等)的本發明所述裝置顯示出脾臟內CD8細胞表達的喪失。一種解釋是在裝置中加入高劑量的抗原導致抗原特異性細胞的凋亡。過強刺激的使用可能觸發了一種滋擾效應，而其最終結果是清除已處理小鼠的脾臟中所有的CD4+CD8+T細胞。在免疫應答被認為有害，如移植排異，的情況下，這可應用于對免疫應答的預期減量調節。
有關利用本發明所述裝置可提高免疫效率的解釋且認為是在把抗原注射于周邊部位后真正到達動物的淋巴節的抗原量要比免疫所提供的量少幾個數量級。因此，利用本發明所述裝置誘發出陽性免疫應答所需的最佳劑量會比傳統免疫法所采用的劑量少得多(即少幾個數量級)。
實施例6以脾臟T細胞分泌的γ-干擾素為標記物來確定由本發明所述裝置提供的對流感抗原的免疫應答的強度。分泌γ-干擾素是Th1型和CD8細胞毒性T淋巴細胞應答的主要特征之一，它被認為是對抗細胞內病原體和癌癥的保護性武器。如上所述將裝置植入小鼠，并在植入后3天時提供5μg的流感疫苗。對照組則通過爪墊以50μg抗原加Ribi佐劑免疫。免疫后10天時，按前例中的方法將脾細胞分離，涂片，并在以一定劑量范圍的抗原(1.4-180μg/ml)刺激之后利用ELISA試劑盒(Endogen)檢測產生的γ-干擾素。
圖6表明，利用含5μg抗原的本發明所述裝置對動物進行免疫與利用50μg抗原加佐劑經爪墊免疫所產生的活化T細胞水平相同。因此，利用本發明所述裝置無需使用佐劑即可實現強免疫應答，并且所用抗原的量要少得多。
將分離自相同動物的腘淋巴節的T細胞暴露類似濃度范圍的抗原之后，對這些T細胞的γ-干擾素分泌進行了測定。如圖7所示，來自利用抗原加佐劑經爪墊免疫的動物的T細胞的γ-干擾素分泌并不象利用本發明所述裝置免疫的動物的脾T細胞所產生的那樣強烈(與圖6對比)。由于腘淋巴節可對爪墊區域進行引流并因而認為可通過提供抗原而被致敏，因此該結果進一步表明本發明所述裝置無需佐劑即可用來產生強烈免疫應答的效能。在進一步的測定中，針對植入10天后仍保留在裝置中(已于第3天引入抗原)的細胞群體評定了γ-干擾素分泌隨暴露于抗原的反應。圖8顯示，與記錄的脾細胞應答水平相比，在對流感抗原體外誘發的應答中只分泌了極少量的γ-干擾素。這一結果意味著，由裝置內免疫法致敏的效應細胞已移出該部位，并且第10天時(此時由裝置中吸出)大多數效應細胞群體已喪失。圖1和圖3顯示第9天和第10天時裝置中帶有B細胞和T細胞表型的細胞的喪失，也證明了這些細胞移出至外周器官的可能性。
實施例7在進一步的實驗中測定了脾細胞的增殖，目的是明確檢驗植入裝置并裝載抗原后由本發明所述裝置誘導的對抗原的免疫應答的強度。采用的方案與前例所述相同。該實驗中使用的抗原為卵清蛋白；裝置中含有不同劑量的卵清蛋白，范圍為10pg-50μg；對照動物則利用相同劑量的抗原加Ribi佐劑經爪墊注射免疫。
植入后10天時，將小鼠無痛致死，并除去脾臟。增殖測定在96孔板中進行。于37℃下將每孔20萬個細胞暴露于180μg/ml的抗原，時間為72小時；對照采用相同劑量的Epstein-Barr病毒抗原。在暴露于抗原或對照抗原后，用3H-胸腺嘧啶核苷將細胞脈沖標記6小時，測量摻入的標記，并表示為刺激指數。
圖9顯示，利用含有卵清蛋白的裝置對小鼠進行免疫可引起強烈的抗原特異性脾細胞增殖應答。在利用低至幾皮克的抗原免疫的動物中亦檢測到了應答。而來源于由傳統方法加佐劑免疫的動物的脾細胞要在高出5-7個數量級的抗原濃度下才產生增殖應答。對照(Epstein-Barr病毒)抗原的刺激水平可以忽略(數據未給出)，表明由卵清蛋白誘發的免疫應答具有高度特異性。
在以卵清蛋白為抗原的進一步實驗中，利用本發明所述裝置或通過爪墊，以單獨存在于裝置中、與BCG佐劑同存在于裝置中或與Ribi佐劑一同經爪墊免疫的50μg、50ng或50pg卵清蛋白對小鼠進行免疫。這些實驗中使用的BCG(卡介苗)佐劑TheraCys(R)為Connaught LaboratoriesLimited制備的減毒牛結核菌株凍干懸浮液，可用于膀胱癌的治療。免疫10天后時收集脾細胞，并在體外將其暴露于不同濃度的抗原(1.4-180μg/ml)，或同樣范圍的對照抗原，Epstein-Barr病毒。保溫72小時后，細胞用3H-胸腺嘧啶核苷脈沖標記6小時，標記的摻入以刺激指數表示，并作為T細胞刺激和增殖的量度標準。
圖10顯示，利用本發明所述裝置可實現以低劑量抗原誘導強烈的抗原特異性T細胞應答。將脾細胞暴露于對照抗原后所檢測到的刺激水平可以忽略，進一步表明該應答對免疫原具有特異性。
實施例8將極低劑量的HIV gp120肽(315-322位殘基，RIQRGPGRAFVTIGK)抗原裝載到本發明所述裝置中后，評定對該抗原的抗原特異性抗體應答。利用不同劑量的HIV肽經裝置或與佐劑經爪墊對BALB/c小鼠進行免疫。免疫10天后收集血液，測定抗體對該肽的效價。四天后，用初次免疫原量的10％對動物進行加強注射，10天后收集二次血液并測定效價。
根據常規方法通過ELISA對抗原特異性IgG2a亞類抗體進行檢測。簡單地說，即4℃下用溶于磷酸緩沖鹽溶液的抗原(1g/ml)包被微量滴定板，時間為16小時。將板清洗，并在孔中加入100μl血清樣品，從1∶50的稀釋度開始，每步再進一步稀釋3倍。樣品的測試一式兩份。室溫保溫1小時后，如上所述清洗板，并在孔中加入生物素標記的抗鼠IgG2a抗體溶液(1μg/ml)。保溫1小時后，如上所述充分清洗，并在孔中加入以1∶4000稀釋于阻斷緩沖液的抗生蛋白鏈菌素偶聯的辣根過氧化物酶。室溫保溫30分鐘后加入底物(每孔加入100μl四甲基聯苯胺)。將板保溫30分鐘。每孔加入100μl 2N的H2SO4以終止反應。利用ELISA板閱讀儀在450nm波長下讀板。
圖11顯示抗HIV gp120肽的特異性IgG2a的水平，該圖表明，在利用本發明所述裝置進行單次免疫后，誘導出高濃度的抗原特異性抗體(IgG2a)，而利用傳統方案經單次爪墊免疫后卻沒有產生應答。二次爪墊免疫(加強)后，由傳統方法免疫的動物中產生了抗體應答，而起初用本發明所述裝置免疫然后再加強(以裝置內提供的最初劑量的10％)的動物卻顯示出IgG2a水平的增加，并且在較低的抗原水平下還誘導出顯然更加強烈的應答(圖12)。
實施例9在比較由本發明所述裝置免疫和由傳統爪墊免疫法免疫而產生的所得免疫應答的基礎上對不同佐劑的效應進行了評定。如上所述，利用裝置或經爪墊用不同劑量的HIV gp120肽(如前例)單獨或與Ribi或BCG佐劑一同免疫BALB/c小鼠。植入后3天時將免疫原引入裝置，并在免疫后10天時測定抗體的效價。如上例所述通過ELISA測定IgG2a抗體對gp120肽抗原的特異性。
使用了Ribi或BCG佐劑的傳統免疫法產生低水平的肽特異性IgG2a(圖13)。相比之下，由不含佐劑的本發明所述裝置(50ng肽)進行的免疫明顯產生了高水平的肽特異性IgG2a。肽與任一種佐劑(Ribi或BCG)共同使用均產生低水平的應答。這些數據表明，在已經很強的抗原性刺激物中加入佐劑則導致免疫應答的降低。為了證明佐劑與抗原的加合效應或協同作用，也許應該以較低范圍(低于飛克劑量)的抗原和較低濃度的佐劑來檢驗免疫方案。
檢驗單純皰疹病毒糖蛋白B的一種15元肽(497-507位殘基TSSIEFARLQF)時獲得了類似的結果。
實施例10在檢驗由本發明所述裝置中的抗原誘導的體液免疫應答強度的進一步測試中，將裝置植入小鼠，并在3天后引入不同劑量的細胞色素C。對照是將不同劑量的相同抗原經爪墊與Ribi佐劑一同給藥。植入后10天時或爪墊接種后10天時，取動物血液并對血清進行ELISA以檢測可特異識別該抗原的IgG2a。除進行ELISA時血清系列稀釋度為1∶50-1∶6400之外，方法與前例中采用的方法相似。
圖14顯示，在本發明所述裝置中使用極低劑量的抗原即實現了對該抗原的極強的特異性體液免疫應答。在裝置中使用低至50飛克的抗原所產生的抗體應答類似于在傳統爪墊加佐劑免疫法中使用高出4個數量級的5ng抗原所產生的抗體應答。
實施例11利用由流感A病毒裂解并純化的血細胞凝集素蛋白抗原(斷裂血細胞凝集素抗原，BHA)對體液應答的發展作進一步的評定。利用在植入后3天時被引入0.1μg和10μg劑量抗原的本發明所述裝置對BALB/c小鼠進行免疫。對照鼠則利用相同劑量的抗原及Ribi佐劑經尾基部皮下注射進行免疫。免疫后7、14、21和28天時取動物血液，并通過ELISA檢測血清中的抗原特異性總IgG抗體。
如圖15所示，免疫后2周時，由0.1μg抗原獲得了強體液應答，并實現了高濃度的HA-特異性抗體。而第2周時，利用傳統方案與佐劑一同免疫的小鼠顯示出低水平的抗原特異性體液應答，并且其水平在免疫后3周和4周時有所增加。在利用裝置免疫的小鼠的血清中，BHA-特異性抗體的水平比使用更高劑量的抗原且使用佐劑的傳統免疫法所實現的水平高出75-80％。在該實驗中，裝置含有低劑量的抗原所產生的體液應答要優于含更高劑量抗原所產生的應答。由前述實驗可看出，高于5μg的劑量可導致免疫應答的抑制，這可能是由于過量刺激誘發了凋亡。
實施例12利用包含于完整的上述裝置，或僅包含于植入到一段帶孔管旁邊的海綿基質的流感抗原對小鼠進行免疫，由此來評定在本發明所述裝置的海綿基質周圍加上帶孔但不通透的生物惰性涂層或容器的重要性。在植入3天后，將評定的一定范圍劑量的抗原(0、50pg、500pg、5μg和50μg)引入裝置，或僅引入海綿。作為對照，用相同劑量的抗原與Ribi佐劑一同對小鼠爪墊進行免疫。植入后或爪墊免疫后10天時，收集動物脾臟，并如上所述進行T細胞增殖測定，所用抗原量的范圍為0.1-180μg/ml。作為特異性的對照，還于體外使用Epstein-Barr病毒。3H-胸腺嘧啶核苷的摻入表示為刺激指數，以說明T細胞刺激和增殖。
如圖16所示，與抗原由不處在帶孔但不通透容器中的海綿提供時相比，由完整裝置免疫的動物顯示出的T細胞活化應答明顯更強。圖18表明對無關抗原的應答及其微弱。
實施例13通過進行擴散測試來評定在本發明所述裝置的海綿基質周圍加上帶孔但不通透的生物惰性涂層或容器的重要性。將200μg牛血清白蛋白(BSA)注入裝置或海綿。將裝置或海綿放在含有1.5ml PBS的管中。在不同時間點取樣，并測定BSA濃度。
如圖18所示，在5分鐘的保溫時間內，海綿完全釋放了其內容物。而本發明所述裝置控制著抗原的釋放，并且在960分鐘后仍保留有65％以上的抗原。保持一道擴散屏障，以維持裝置內有高水平的抗原、細胞因子、趨化因子和其它協同刺激分子與免疫細胞相接觸，這被認為是該裝置在強烈免疫應答的激發中對傳統免疫方法做出明顯改進的一種重要機制。
因此以上實例可證明，與傳統爪墊免疫法和僅將抗原裝載于植入的海綿基質相比，本發明所述裝置能夠刺激更優越的對不同抗原的T細胞應答及體液應答。
實施例14測定植入后不加抗原的本發明所述裝置中出現的細胞的表型。將植入后4天時由本發明所述裝置中吸出的細胞收集，清洗，并利用經異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標記的對以下標記物有特異性的單克隆抗體染色CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD3和I-Ad(PharMingen，CA)。利用流式細胞光度計測定熒光的幾何平均值。為了進行比較，還利用同組特異抗體測定來自同系未處理小鼠的周圍血淋巴細胞(PBL)的熒光值，并將各抗體的所得結果表示為平均熒光強度(MFI)。
圖19給出在插入后4天時由裝置吸出的細胞的表型。裝置中明顯遷入并聚集有高密度的T細胞(CD3、CD40)、巨噬細胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、樹突狀細胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B細胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。因此，裝置中存在產生免疫應答所必需的免疫細胞。與PBL(數據未給出)相比，由本發明所述裝置吸出的免疫細胞上協同刺激分子(CD80和CD86)及粘連分子(CD44)的表達明顯增加。有趣的是，對本發明所述裝置的切面進行的電鏡分析結果表明存在含有大量溶酶體的巨噬細胞，在是其細胞活化的強化狀態。
實施例15將植入后不含抗原的本發明所述裝置中包含的細胞因子的濃度與未處理的鼠血清中的細胞因子濃度進行比較。如圖20所示，裝置中含有更高濃度的刺激性細胞因子L-2、IL-4和TNF-α以及約1/7濃度的TGF-β(數據未給出)。因此，本發明所述裝置一旦用抗原“點燃”，將為免疫應答的爆發準備好一個可引起強烈反應的環境。
實施例16細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答被認為是對流感病毒產生免疫所必需的。為評價本發明所述裝置在引發抗原特異性CTLs方面的能力，利用含有500pg流感病毒的本發明所述裝置對小鼠進行免疫。作為對照，還利用500pg疫苗加Ribi佐劑經皮下注射對小鼠進行免疫。獲得免疫動物的淋巴細胞，并通過經流感病毒感染的靶細胞的裂解來檢測其對流感病毒的特異性。CTLs的制備如下。將小鼠無痛致死并去除脾臟。制備單細胞懸浮液并用PBS清洗細胞。利用紅細胞裂解緩沖液(Sigma,MO)去除紅細胞。在體外將脾細胞(5×106)與5×106個已被病毒感染(100 HAU/107個細胞/ml，37℃,60分鐘)并經過照射(3000Rad)的同系脾細胞共培養，并在37℃和5％CO2條件下保溫5天。
以PR8感染(500HAU/106細胞)的P1.HTR細胞和未經感染的P1.HTR細胞作為細胞毒性的靶。用100mCi的Na251CrO4將細胞標記90分鐘，然后清洗3次。在效應細胞中以不同的濃度加入懸浮于100ml RPMI 1640的靶細胞(104/ml)及5％的FCS培養基，濃度由100∶1的比率(E∶T)開始，并在96孔圓底微量滴定板中滴定為兩倍。保溫6小時后收集上清。結果根據以下公式表示為51Cr特異釋放的百分率〔(實驗釋放量)-(自發釋放量)〕×100/〔(最大釋放量)-(自發釋放量)〕。
如圖21所示，利用含有500pg流感病毒疫苗的本發明所述裝置進行的免疫觸發了強有力的流感特異性CTLs，它在裂解經流感感染的靶細胞方面明顯優于對同時使用Ribi佐劑進行傳統皮下免疫的應答中所產生的CTLs。產生的CTL在體外不殺死非感染靶細胞，這表明了激發的應答的特異性。在本發明所述裝置中使用更高劑量的抗原則未見到刺激。
實施例17為確定利用本發明所述裝置進行免疫還可調節體液免疫應答，利用一些不同劑量的流感病毒疫苗經本發明所述裝置給藥或與Ribi佐劑一同經皮下注射給藥來對小鼠進行免疫。與結合Ribi經皮下免疫的方法(數據未給出)相比，在利用本發明所述裝置以更低劑量的疫苗進行免疫的小鼠的血清中產生了高水平的流感特異性IgM、IgG1和IgG2a抗體。通過逐步提高血清稀釋度并記錄吸光度的方法對病毒特異性IgG1進行測量，檢測結果顯示出更高的結合(圖22)。由IgG2a抗體亦觀測到類似的結果。
實施例18為確定抗體對流感抗原的相對親和力，把利用本發明所述裝置進行免疫而產生的血清抗體以及作為比較的經傳統方案并使用佐劑而產生的血清抗體與摩爾濃度逐漸增加的KSCN(硫氰酸鉀)混合，KSCN可從結合在由抗原包被的微量滴定板上的復合物中洗脫抗原特異性抗體。如上文所述采用一種基于微量滴定板的標準ELISA方法。在加入生物素標記的抗鼠IgG之前，要先將板清洗并在孔中加入不同濃度的KSCN。室溫下將板保溫30分鐘。清洗板，然后在孔中加入生物素標記的抗鼠IgG抗體溶液(0.5μg/ml)。不斷增加KSCN的濃度是分解由高親和力抗體與抗原結合所形成的復合物所必需的。如圖23所示，產生的抗體對病毒性抗原具有更高的親和力。因此，若利用本發明所述裝置，則極少量的疫苗已足以刺激強有力的免疫應答。
實施例19在小鼠流感模型中測試利用本發明所述裝置進行的免疫在保護哺乳動物免受感染性疾病侵害方面的能力。利用本發明所述裝置或結合Ribi佐劑經皮下給藥以兩種劑量的流感病毒疫苗流感疫苗(5pg和500pg)對小鼠進行免疫。約免疫12周后，用致死劑量的流感疫苗對動物進行攻擊。如圖24所示，利用本發明所述裝置以5pg和500pg劑量的流感疫苗進行接種均產生了完全的保護性，而利用500pg流感疫苗加Ribi佐劑經皮下免疫的小鼠中只有60％存活下來。到第14天時，所有用5pg劑量加佐劑免疫的動物均死于該疾病。引人注意的是，不但利用本發明所述裝置進行免疫可提供完全的保護，而且使用1/100的抗原劑量且無需佐劑亦可實現完全的保護。用病毒攻擊后，由本發明所述裝置免疫的小鼠還表現出穩定的體重，表明產生了一種與其對急性感染的相對抵抗力相關的更輕度的疾病。
實施例20通過植入含有流感病毒疫苗的本發明所述裝置來評定該裝置在含有人免疫細胞的重度復合性免疫缺陷(SCID)小鼠中產生特異性人IgG的效用。在SCID Beige CD17(6-8周齡雌性)小鼠中注入(腹膜內方式)20×106個來自正常人供體的PBMC。3天后通過肌內注射或通過植入預注有50ng流感病毒疫苗的本發明所述裝置對小鼠進行免疫。免疫3周后取小鼠血液，并利用傳統ELISA測試血清的流感特異性體液應答。如圖25所示，用疫苗免疫產生了流感特異性人IgG。此外還如圖所示，利用摩爾濃度逐漸增加的KSCN來測定血清抗體對流感抗原的相對親和力(按照上文實施例18所述)，與傳統的肌內免疫相比，本發明所述裝置產生了更高效價的人流感特異性抗體(圖26)。該方法還可用來生成能夠產生人單克隆抗體的人雜交瘤。
實施例21在本發明所述裝置中提供更高劑量的抗原可導致免疫應答的抑制。在Balb/c小鼠體內植入裝載了5-50μg流感疫苗的裝置，或利用混有Ribi佐劑的抗原進行爪墊內免疫。免疫后10天時將小鼠無痛致死，分離脾細胞并鋪在96孔板內(2×105細胞/孔)。37℃下將細胞暴露于流感抗原72小時。用抗原刺激后，去除培養物中的上清，并利用ELISA試劑盒(Endogen)測定γ-干擾素的產生。如圖27所示，利用抗原結合Ribi佐劑免疫的小鼠產生一種直接隨抗原劑量而增加的免疫應答。相比之下，由裝置中的抗原免疫的小鼠在低劑量抗原情況下顯示出對免疫應答的刺激(如前文中的實施例所述)，但在更高劑量抗原的情況下卻顯示出免疫應答的下降。因此，在植入的本發明所述裝置中含有大量抗原會導致免疫應答的減量調節。在特定免疫抑制被認為有益，如移植、過敏癥等，的治療策略中可使用該方法。
實施例22本發明所述裝置還可用來產生對多糖抗原的免疫應答。利用裝載有肺炎球菌抗原(Pneumovax-23)的裝置進行單次免疫可產生一種特異的免疫應答。在23種最流行的或侵襲性的肺炎球菌類型中，Pneumovax是一種多價的肺炎球菌疫苗，它含有高純度的莢膜多糖。用5μg或40pgPneumovax疫苗通過如上文所述植入皮下的裝置，或通過與Ribi佐劑混合并注入墊腳對小鼠進行免疫。第10天時取所有小鼠的血液，并通過ELISA測定總IgG應答(圖29)、IgG1應答(圖30)和IgG2a應答(圖31)。這些結果表明，利用本發明所述裝置可實現對多糖抗原的免疫應答。
實施例23本發明所述裝置可用來對高保守性抗原產生免疫應答。在這些實驗中選擇親環蛋白作為模型蛋白，這是因為該蛋白在哺乳動物物種中高度保守，因而產生對親環蛋白的免疫應答一直難以實現。將5μg、50ng或0.5ng人親環蛋白裝載入本發明所述裝置并植入，或將其與Ribi佐劑混合并皮下注射，由此對小鼠進行免疫。取小鼠血液，并通過ELISA測定血清對人親環蛋白的IgG2a應答。如圖32所示，與利用親環蛋白加Ribi佐劑經皮下免疫的小鼠相比，利用本發明所述裝置以兩種較低劑量的抗原進行免疫的小鼠顯示出更優越的對抗原的應答。這一結果表明，該裝置可誘導對高保守抗原的免疫應答，而這些抗原在其它方面可能不具有免疫原性。利用本發明所述裝置中含有的高劑量抗原進行的免疫未能誘導出免疫應答。
實施例24本發明所述裝置可用來產生對完整活組織的免疫應答。在該實驗中使用活鉤蟲幼蟲對小鼠進行免疫，方法是利用植入皮下的本發明所述裝置提供5只幼蟲，或2周中分別皮下注射1000只活幼蟲。如圖33所示，由ELISA測定發現兩種方案均誘導出L3特異性總IgG。分別利用照射后的幼蟲和孢子體可能會產生對多種寄生生物的免疫，如鉤蟲和瘧疾；文中的研究結果表明，利用本發明所述裝置可通過較少量的生物來實現免疫。
本發明可在不偏離其實質或基本特征的情況下通過其它形式體現，或通過其它方式加以實施。因此無論從哪方面來看，本公開內容都將被認為是說明性的和非限定性的，本發明的范圍通過所附的權利要求書表示，并且所有處在同等含義和界限的范圍內的變化都將被認為包含在本文中。
文中引用多種出版物，其公開內容將被全面包括在內以作為參考。
權利要求
1．一種調節哺乳動物中對抗原的免疫應答的方法，該方法是通過在所述哺乳動物身體中植入一種裝置，該裝置含有一種多孔基質，基質則包含在一種帶孔但不通透的容器中，所述基質含有一定量的所述抗原，其中該裝置可吸引免疫系統細胞與所述抗原相遇并調節所述免疫應答。
2．權利要求1的方法，其中所述多孔基質內的抗原在將所述裝置植入所述哺乳動物時具有生物利用率。
3．權利要求1的方法，其中所述多孔基體內的抗原在裝置已植入所述哺乳動物之后變為具有生物利用率。
4．權利要求3的方法，其中所述抗原在植入所述哺乳動物后約3天時變為具有生物利用率。
5．權利要求1的方法，其中所述抗原在植入后約3天時被引入所述裝置。
6．權利要求1的方法，其中所述抗原以延遲釋放劑型提供。
7．權利要求1的方法，其中所述多孔基質含有一種聚合材料。
8．權利要求7的方法，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
9．權利要求8的方法，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、聚氨基甲酸乙脂、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
10．權利要求1的方法，其中所述容器包含的聚合材料選自天然原料和合成原料。
11．權利要求1的方法，其中多孔聚合基質含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
12．權利要求1的方法，其中與所述裝置植入所述哺乳動物的時間相關的該裝置中的所述抗原量和該抗原的生物利用率的時間安排可導致對該抗原的免疫應答的誘發或增強。
13．權利要求12的方法，其中所述裝置內的所述抗原在該裝置植入所述哺乳動物之后具有生物利用率。
14．權利要求13的方法，其中所述抗原在所述裝置植入所述哺乳動物后約2-4天時被引入該裝置。
15．權利要求1的方法，其中與所述裝置植入所述哺乳動物的時間相關的該裝置中的所述抗原量和該抗原的生物利用率的時間安排可導致對該抗原的已有或潛在免疫應答的抑制或減量調節。
16．權利要求15的方法，其中所述裝置中的所述抗原在植入所述哺乳動物時具有生物利用率。
17．權利要求1的方法，其中所述裝置可在約10天的周期后由所述哺乳動物的體內取出。
18．權利要求1的方法，其中第二種量的所述抗原可被再次引人所述裝置。
19．權利要求18的方法，其中所述第二種量的所述抗原是通過植入時裝置中存在的該第二種量的該抗原的延遲釋放而被再次引人所述裝置。
20．一種用于調節對抗原的免疫應答的可植入裝置，該裝置含有多孔基質，基體則包含在一種帶孔但不通透的容器中。
21．權利要求20的裝置，其中所述抗原存在于所述多孔基質中。
22．權利要求20的裝置，該裝置進一步包含用于在植入前或植入后將所述抗原引入并接觸所述多孔基質的工具。
23．權利要求20的裝置，其中所述多孔基質含有一種聚合材料。
24．權利要求23的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
25．權利要求24的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
26．權利要求20的裝置，其中所述容器含有一段帶孔管。
27．權利要求20的裝置，其中所述容器含有一種帶孔但不通透的涂層并安排在所述多孔基質的周圍。
28．權利要求27的裝置，其中所述涂層含有一種聚合材料。
29．權利要求28的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
30．權利要求29的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括交連的膠原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯、硅酮、乳膠樹脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、聚乙烯吡咯烷酮及其組合物。
31．權利要求20的裝置，其中多孔基質含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
32．一種從哺乳動物中獲得免疫細胞的方法，其中所述免疫細胞收集自植入在所述哺乳動物中的一種裝置，該裝置含有一種多孔基質，基質則包含在一種帶孔但不通透的容器中。
33．權利要求32的方法，其中所述收集的細胞被重新引入所述哺乳動物。
34．權利要求33的方法，其中所述收集的細胞在被重新引入所述哺乳動物之前被冷凍保存。
35．權利要求32的方法，其中在所述裝置的多孔基質內存在一種抗原。
36．權利要求35的方法，其中所述免疫細胞被重新引入所述哺乳動物。
37．權利要求35的方法，其中所述免疫細胞在體外接觸所述抗原后被重新引入所述哺乳動物。
38．權利要求32的裝置，其中所述基質含有一種聚合材料。
39．權利要求38的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
40．權利要求39的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
41．權利要求32的裝置，其中所述容器含有一段帶孔管。
42．權利要求32的裝置，其中所述容器含有一種帶孔但不通透的涂層并安排在所述多孔基質的周圍。
43．權利要求42的裝置，其中所述涂層含有一種聚合材料。
44．權利要求43的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
45．權利要求44的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括交連的膠原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳膠樹脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮及其組合物。
46．權利要求32的裝置，其中多孔基質含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
47．權利要求35的方法，其中所述免疫細胞用于制備一種為產生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤。
48．一種用抗原免疫哺乳動物用于制備一種為產生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤的方法，其中哺乳動物是利用權利要求12的方法進行免疫。
49．一種用抗原免疫哺乳動物用于制備一種為產生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤的方法，其中哺乳動物是利用權利要求21的裝置進行免疫。
50．權利要求12的方法，其中針對所述抗原的所述免疫應答選自預防性接種、治療性接種、細胞免疫、體液免疫、粘膜免疫、長期免疫及其組合。
51．一種用于產生雜交瘤的方法，該雜交瘤可產生針對選定抗原的人單克隆抗體，該方法的連續步驟包括(a)將人外周血淋巴細胞引入一種嚴重復合性免疫缺陷(SCID)小鼠的循環，并使該淋巴細胞在該小鼠的免疫系統中增殖；(b)在該小鼠中植入權利要求21的裝置，該裝置的抗原包括所述的選定抗原；(c)從該裝置中收集免疫細胞；(d)從該收集的免疫細胞中的B淋巴細胞制備雜交瘤；以及(e)通過篩選法鑒定那些可產生能夠識別所述選定抗原的單克隆抗體的雜交瘤。
52．一種用遺傳物質轉染哺乳動物免疫細胞的方法，該方法包括將所述遺傳物質引入一種裝置的基質中，該裝置含有多孔基質，基質則包含在一種帶孔但不通透的容器中，將該裝置植入所述哺乳動物的體內。
53．權利要求52的方法，其中所述遺傳物質的選擇集合包括DNA、RNA和cDNA。
54．權利要求52的方法，其中所述遺傳物質可編碼一種抗原。
55．一種對免疫應答引起的疾病或病癥進行治療或預防的方法，該方法包括根據權利要求15的對免疫應答的抑制。
56．權利要求55的方法，其中所述疾病或病癥的選擇集合包括過敏癥、移植排異和自身免疫疾病。
57．一種調節哺乳動物中對抗原的免疫應答的方法，該方法是通過在所述哺乳動物體內植入一種裝置，該裝置含有所述抗原，并進一步包含一種用于限制分子被動擴散到該裝置外，但不限制免疫細胞主動移入或移出該裝置的工具。
全文摘要
本發明提供了用于誘導、刺激、封閉、和減弱對于抗原的免疫應答的方法和裝置,采用一種可植入裝置,將抗原以受控方式暴露于免疫系統細胞。該裝置包含放置在帶孔但不通透的容器中的多孔基質。通過調節該抗原的生物利用率,以及相對于裝置植入動物的時間抗原導入裝置的時間安排,可以誘導針對所述抗原的強烈的長期的應答,或減量調節或封閉現存的或潛在的免疫應答。該方法和裝置可用治療接種,以及未暴露的動物的預防接種。免疫可以細胞的,體液的,粘膜的。免疫應答的抑制可用于變態反應,自身免疫病的預防和治療,以及使動物耐受以抑制移植性抗原的免疫應答。該裝置亦可用于收獲免疫細胞,以稍后再導入動物,及制備免疫血清和雜交瘤。
文檔編號A61K9/00GK1299272SQ99805765
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月2日 優先權日1998年3月2日
發明者A·切拉米, C·切拉米, C·格爾貝爾, D·達夫 申請人:應用疫苗技術公司