人p51基因及其基因產物的制作方法

專利名稱：人p51基因及其基因產物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的人基因。更詳細地說涉及作為抑制癌基因所公知的、與人p53基因及人p73基因類似的新的人基因及基因產物。
背景技術：
p53蛋白是以DNA型腫瘤病毒SV40的大型T抗原和結合核內蛋白而被發現，其基因(p53基因)被克隆著。最初，認為p53基因，通過與ras基因一起導入細胞，使來自胚胎的細胞被轉化而得到的，而認為癌基因。可是，通過以后的研究，明顯地看出，最初得到的p53基因的克隆是變異型，野生型倒是可以抑制變異型的轉化。現在，p53基因的缺失或異常，在很多人的癌中被檢測出，作為高發癌性基因病中所知道的Li Fraumeni癥候群中，發現了p53基因配偶子變異等，可以認為p53基因是重要的癌抑制基因[Baker,S.J.,et al.,Science,244,217-221(1989)Nigro,J.M.,Nature,342,705-708(1989)]。
人p53基因由393個氨基酸構成，大體上分為N末端結構域(第1～101的氨基酸領域)、芯結構域(第102～292的氨基酸領域)及C末端結構域(第293～393的氨基酸領域)的三個領域。N末端結構域包括酸性氨基酸和高脯氨酸領域等的復制控制所必須的領域，可認為是復制活性化結構域。另外C末端結構域包括很多的堿性氨基酸及形成四聚體的必需領域，可以認為擔負著非特異DNA結合和DNA損傷的識別及抑制轉化的作用。
在人癌細胞檢測出的p53基因的很多異常是誤義變異，其大部分是相當從N末端到100～300氨基酸的部位的芯結構域，特別是集中在超過種被保留下的熱點(Hot Spot)的領域。這樣的芯結構域中的熱點領域是涉及到p58蛋白和DNA結合的領域，實際上，由于該領域的變異阻礙了與DNA的特異結合。
從以上，可明顯地看出，p53蛋白與其他的基因特異結合后，具有控制復制因子的作用，該控制復制因子可以調節該基因的表達。
作為用p53蛋白誘導復制的基因，可以舉出p21基因[稱為WAF1或CIP1、或SDI1(EI-Dairy，W.S.，et al.，Cell，75，817(1993))；MDM2(Wu.X.，et al.，Genes Dev.，7，1126(1993))；MCK(Weintraub.H.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4570(1991)Zambetti.G.P.，et al.，Genes Dev.，6，1143(1992))]、GADD45[Kastan，M.B.，et al.，Cell，71，587(1992)]、細胞周期蛋白G[Cyclin GOkamoto，K.，EMBO J.，13，4816(1994)]、BAX[Miyashita，T.，et al.，Cell，80，293(1995)]及胰島素類的生長因子結合蛋白[IGF-BP3Buckbinder，L.，et al.，Nature，377，646(1995)]。
編碼p21基因的蛋白質是細胞周期蛋白依賴性激活酶(CDK)的阻礙蛋白質，野生型p53蛋白可以通過p21抑制地調節細胞周期[Harper，J.W.，et al.，Cell，75，805(1993)；Xiong，Y.，et al.，Nature，366，707(l993)；Gu，Y.，et al.，Nature，366，701(1993)]。另外也有報告，p21基因結合增殖細胞抗原(PCNA)可直接抑制DNA的復制[Waga，S.，et al.，Nature，369，574(1994)]。進而判明，p21基因是與誘導細胞的老化具有抑制DNA合成作用的SD11基因相同的基因[Noda，A.，et al.，Exp.Cell Res.，211，90(1994)]。
MDM2結合p53蛋白后可以將該蛋白的復制控制活性不活性化，推測可以作為負的反饋調節因子作用。
IGF-BP3是IGF是信號化的負的調節因子。因此，由于p53蛋白的IGF-BP3因子的增加，其結果暗示p53蛋白可以導致抑制IGF性依賴性細胞的成長。
另外，有報告說野生型p53蛋白可以誘導骨髓白血性細胞的編程性細胞的死亡[Yonish-Roboch，E.，et al.，Nature，352，345(1991)]。用放射線照射胸腺細胞編程細胞死亡的誘導對于p53缺損的老鼠不會產生[Lowe，S.W.，Nature，362，847(1993)；Clarke，A.R.，et al.，Nature，362，849(1993)]、另外p53蛋白，可以誘導在水晶體、網膜、腦中失去正常網膜胚種基因(RB基因)活性的細胞的編程細胞的死[Pan，H.，andGriep，A.E.，Genes Dev.，8，1285(1994)；Morgenbesser，S.D.，et al.，Nature，371，72(1994)；Howes，K.A.，Genes Dev.，8，1300(1994)；Symonds，H.，et al.，Cell，78，703(1994)]。何瓦特氏提出，p53蛋白對于RB基因變異的研究是有用的、可以誘導含在RB基因變異的細胞的編程性細胞死亡[White，E.，Nature，371，21(1994)]。
另外，對于只是表達具有溫度感受性的p53基因的白鼠的紅血球性細胞系，在溫度下降時變異的p53基因返回野生型、誘導編程性細胞死亡，從其取出的p53基因在p53缺損的線纖維胚細胞系的軟瓊脂的培養基中可付與增殖的能力(anchorage-independency)[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-291(1995)；Kato et al.，Int.J.Oncol.9269-277]。
BAX可以結合作為編程性細胞死亡的抑制因子的bc1-2上，促進編程性細胞死亡[Oltvai，Z.M.，et al.，Cell，74，609(1993)]。由于p53蛋白的BAX基因的增加和bc1-2的減少是與白鼠的白血病細胞株M1的編程性細胞死亡有關系，[Miysashita，T.，et al.，Oncogene，9，1799(1994)]。另外，有報告說對于編程性細胞死亡的信號轉導物之一的Fas，在其非小細胞肺癌和白血病中是增加的[Owen-Schaub，L.B.，et al.，Mol.Cell Bioll.，15，3032(1995)]。
從以上的很多研究。可以看出p53蛋白不限于p21基因，可以促進或抑制各種基因的復制。即使在復制調節機能缺損的變異型p53蛋白中，也顯示了與細胞內的其他蛋白質的相互作用后傳遞信號能力和DNA的損傷修復功能。
迄今所知道的p53的蛋白功能，可以舉出，復制調節功能、與其他的蛋白質結合的信號傳遞功能、涉及DNA復制的蛋白質復合體的要素、DNA結合功能、外切核酸酶活性等，這些功能的復合作用的結果，可以引起細胞的細胞周期停止、誘導細胞編程性死亡、DNA的修復、DNA的復制調節及分化誘導。
進而，p53蛋白的功能不僅是基因產生損傷時發生作用，例如在病毒感染、細胞因子刺激、低氧狀態、核甘酸庫的變化、藥物引起的代謝異常等的各種的應激涉及到生體組織時，該刺激作為觸發器會引起p53蛋白質的量及質的變化。接受量及質的調節的p53蛋白，通過與其他蛋白質的相互作用表達信號傳遞和控制其他基因復制的功能，接受生體緊張的生體的組織的細胞的DNA被進行復制調節，使細胞周期停止后修復細胞、通過編程性細胞死亡排除細胞或者促進細胞分化使生體從應激的狀態得到緩解[Ganman，C.E.，et al.，Genes Dev.，9，600-611(1995)；Graeber，T.G.，et al.，Nature，379，88-91(1996)；Linke，S.P.，et al.，Genes Dev.，10，934-937(1996)；Xiang，H.，et al.，J.Neurosci.，16，6753-6765(1996)]。
人的腫瘤一半是存在p53基因的變異，所以近年來對于腫瘤的診斷和治療，都在研究p53基因及其蛋白的臨床的應用。使用可特異認識p53基因的變異部位的引物，進行PCR，檢測淋巴細胞和體液中浸潤的腫瘤細胞的方法，是可以預測腫瘤的浸潤范圍或者再發等的有效的診斷方法[Hayashi，H.，et al.，Lancet，345，l257-1259(1995)]。
進而，p53蛋白，由于具有編程性細胞死亡誘導功能，所以使用病毒.載體，向腫瘤細胞內導入野生型p53基因的治療方法已在美國進行著[Roth，J.A.，et al.，Nature Med.，2，985-991(1996)]。最近在日本，有幾個地方也開始該基因的治療。
另一方面，又指出，人腫瘤半數以上不具有p53基因的變異，依此可以判斷存在有其他蛋白，該蛋白具有類似p53蛋白抑制腫瘤生成的功能。
本發明者首先發現p53的基因變異不是霍奇金型的惡性淋巴腫瘤(NHL)的前兆指標。
近年，確認了與上述的p53基因高度相同的、被命名為p73的新基因[Kaghad，M.，et al.，Cell，90，809-819(1997)]。根據本發明者的見解，p73蛋白在復制活性化結構域內(1～45的氨基酸領域)與人p53顯示29％的相同性，在有6個變異熱點的相輔的保存領域的DNA結合結構域(第113～290的氨基酸領域)的相同性是63％，在低聚化領域(第319～363的氨基酸領域)的相同性是38％。可是，對C末端結構域，在p73蛋白和p53蛋白間看不到有明顯的相同性。
有報告說，通過p73蛋白過剩表達，可以抑制神經胚細胞株和SAOS2細胞(骨肉腫瘤細胞株)的生長，另外，通過p73的暫時的表達，可以促進微型·同源腎細胞的編程性細胞死亡[Bruce Clurman and MarkGroudine，Nature，389，122-123(1997)；Christine，A.，et al.，Nature，389，191-194(1997)]。
可是p73蛋白，在正常的組織中只是低量的發現，這一點上是與p53蛋白有著小小的區別。進而，神經胚細胞株中的p73蛋白的表達，在用紫外線照射和用低量的放線菌素D不能誘導的點上也是與p53蛋白不同。
這樣的p73蛋白不是具有與p53完全相同的功能，今后還需要進一步研究。迄今的觀察，報告了此p73作為神經胚腫瘤上推測的腫瘤抑制因子的位置。
本發明的目的是提供人腫瘤的形態形成關連的新基因及基因產物的信息。更詳細地說，本發明的目的在于提供如上述的作為癌抑制基因的、與公知的p53基因類似性的新基因及其基因產物。
進而，本發明的目的在于提供培養含有由該基因的部分DNA構成的引物和探針、該基因的載體、導入該載體的形質轉化體及培養該形態轉化體得到上述基因產物的制造方法。
圖的簡單說明

圖1是與p53蛋白及p73β蛋白一起表示p51A蛋白的構造的結構域特征的圖。圖中，“TA”是復制活性領域、“DNA binding”是DNA的結合領域及“origo”是低聚領域。
圖2是表示用人51A基因編碼的氨基酸序列與p53蛋白及p73β蛋白的各氨基酸序列進行比較，觀察三者相同性的圖，三者相同的部分用四方框圍起來。
圖3是表示用人51B基因編碼的氨基酸序列與p73β蛋白的各氨基酸序列進行比較，觀察三者相同性的圖，三者相同的部分用四方框圍起來。
圖4是模式地比較p53蛋白的alternative splicing variant(p51A、p51B)的結構與p73蛋白的alternative splicing variant(p73α、p73β)的結構的比較圖。
圖5是用照片代替Northen印跡(克隆社的過濾器)的電泳圖，表示各種人組織中的p51mRNA表達情況。各泳道，1心臟、2腦、3胎盤、4肺、5肝臟、6骨骼肌、7脾臟、8胰臟。
圖6是用照片代替諾占布洛(克隆社的用于RNA過濾器)的電泳圖，表示各種人組織中的p51mRNA表達情況。各泳道，1乳腺、2前列腺、3唾液腺、4胃、5胸腺、6甲狀腺、7氣管、8子宮。
圖7是用照片表示形成p51A基因的菌落抑制能圖。具體的是表示用p51A表達質粒(p51A)、p53A表達質粒(p53)、帶有HA標記的p51A表達質粒(HAp51A)及只用載體(RcCMV)形質轉化的各細胞的菌落形成能比較圖的照片圖。
圖8是模式表示用于報道基因構建體的圖。圖中WAF-1 promoterIuc是分別表示殘留二個的p53調節因子的野生型p21WAFⅠ啟動子構建體、del 1表示除去一個上流因子的構建體及del 2表示除去二個上流因子的構建體。
圖9是表示圖8中所示的具有各種報道基因構建體的各p51A表達質粒(p51A)、p53A表達質粒(p53A)或將控制載體(Rc/CWV)導入SAO2細胞時的反式激活的圖(參照實驗例2)。
圖10實驗地表示p53應答性的PGC報道基因構建體的各p51A表達質粒(p51A)、HA標識的p51A表達質粒(HAp51A)、p53A表達質粒(p53)或將控制載體(Rc/CWV)導入SAO2細胞時的反式激活的圖(參照實驗例2)。
圖11是表示實驗例4中對于含有人p51A基因ICI細胞及4BI細胞、及不含有p51A基因1-2-3細胞，調查在32℃及37℃的不同溫度下培養時的DNA片段化結果的照相圖(瓊脂糖電泳的溴化乙錠染色像)。
圖中“1-2-3細胞”是只導入載體，不含有p-51A基因的對照細胞，“ICI細胞”或“4BI細胞”是導入用含有p-51A基因表達載體(pRcCMV/p51A)轉化的p51A的1-2-3細胞。另外，λ/Hind Ⅲ是用噬菌體DNA限制酶的分解物、DNA的大小標記(New England Biolabs.Ind.制)。另外，100bp ladder是由具有100bp整數倍大小DNA片段構成的大小標記(GIBCO-BRL制)。
圖12～圖14是人p51B基因的編碼領域的堿基序列(下段)和白鼠同種性(白鼠p51B基因)的該序列(上段)的比較圖。此外二者間是相同的堿基時在圖中標記*。
圖15是表示用圖12～圖14人p51B基因及白鼠p51B基因分別編碼人p51B蛋白及白鼠p51B蛋白的氨基酸序列的比較圖。此外二者間是相同的氨基酸時在圖中標記*。
發明的公開如上所述，人腫瘤組織的半數以上都不具有作為抑制癌基因的p53基因的變異體，從以前，就已經暗示了在p53蛋白以外也存在起著抑制腫瘤形成功能的基因產物(蛋白)。
為此本發明者們，對于相關抑制腫瘤形成的新基因及基因產物進行了不斷的研究，發現了編碼具有與上述p53蛋白相同活性的蛋白的、來自人體的新基因，該基因或其基因產物是與編程細胞性死亡有著明顯的關系。本發明在這樣的見解上完成的。
即本發明是關于下述1～8的人p51基因及與其相關的基因。
1，編碼以下的(a)或(b)蛋白質的基因(a)具有序列號1表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)在序列號1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質。
2，具有以下的(a)或(b)DNA的基因(a)序列號2表示的堿基序中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA，(b)在嚴謹的條件下與序列號2表示的堿基序中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA雜交，而且編碼具有p51活性蛋白質的DNA。
3，具有序列號2所示的堿基序列的上述2的基因。
4，具有以下的(a)或(b)cDNA的基因(a)序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA，(b)在嚴謹的條件下與序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA雜交，而且編碼具有p51活性蛋白質的DNA。
5，DNA，其特征是在嚴謹的條件下與序列號2表示的堿基序列雜交。
6，DNA，其特征是在嚴謹的條件下與序列號2的堿基號145～1488表示的堿基序列雜交。
7，上述5所述的DNA，其可作為引物使用。
8，上述5所述的DNA，其可作為探針使用。
進而，本發明是下述9～14涉及的人p51蛋白及與其關聯的蛋白質或多肽。
9，以下的(a)或(b)蛋白質(a)具有序列號1表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)在序列號1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質。
10，上述9所述的蛋白質，在序列號1中，至少有氨基酸號1～59、氨基酸號142～321及氨基酸號359～397表示的氨基酸序列。
11，多肽，其在序列號1中，至少具有從復制活性功能、DNA結合性及低聚化功能中選擇出一種功能的氨基酸序列。
12，具有以下的(a)或(b)的多肽(a)在序列號1中具有用氨基酸號1～59表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有復制活性化功能的多肽。
13，具有以下的(a)或(b)所示的多肽(a)在序列號1中具有用氨基酸號142～321表示的氨基酸序列多肽，
(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有DNA結合性的多肽。
14，具有以下(a)或(b)所示的多肽(a)在序列號1中具有用氨基酸號359～397表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
進而，本發明是p51蛋白的制造方法，其特征是含有上述p51基因的載體、用該載體轉化的宿主細胞及在培養基中培養該宿主細胞，從得到的培養物中回收蛋白質。
此外，本發明中的“p51”的稱號，只是為了在說明書中使用方便的命名，對于本發明的基因及基因產物(蛋白質)等沒有任何的限定。
本發明中的基因(DNA)，不僅是二根鏈的DNA，也包括有義鏈及反義鏈的各一根的DNA，另外對其長度沒有任何限制。因此，本發明的基因(DNA)只要沒有特殊的說明，是指含有人基因組DNA的二根鏈DNA、及含有cDNA一根鏈DNA(有義鏈)及與該有義鏈相輔配列的一根鏈DNA(反義鏈)及這些片段的任何一種。
本說明書中的氨基酸、肽、堿基序列、核酸等的略號的表示是按照IUPAC、IUB的規定，“含有堿基序列或氨基酸序列說明書的編寫方針”(日本、美國及歐洲的三極特許廳)及該領域中慣用的符號來定義的。
(1)p51基因及其等效物本發明涉及編碼具有p53蛋白的作用或與其功能同樣或者同等作用或功能蛋白質的來自人的新基因。
本發明的基因是對現有的p53基因及p57基因的序列進行研究探索，利用選擇出的特定領域進行創意的基礎上，利用重新創造的引物，通過進行PCR而得到的。具體的是，使用后述實施例所述的創造的引物，通過進行PCR，雖然不能得到相同的p53基因及p57基因。但是可以得到類似二者的基因片段。作為探針使用此DNA片段，可以從人骨骼筋cDNA文庫任意選擇出的cDNA克隆中，成功地分離出編碼具有與p53蛋白的氨基酸序列高相同性的新蛋白的cDNA克隆。
從得到的cDNA歸納的氨基酸序列的計算分子量是50，894Da，所以本發明者為了方便起見將該cDNA(DNA)命名為“人p51A基因(或簡單地為p51基因)”，進而，將用該基因編碼出的具有氨基酸序列的蛋白質稱為“p51A蛋白質(或簡單地為p51蛋白。)”。
通過以后的研究，發現p51cDNA克隆編碼的基因中選擇地有剪接變異體。另外調查各種人組織中該基因復制產物的發生表達狀況的結果，在該產物(蛋白質)主要存在短型和長型的剪接形態。
從這些與剪接變異體相關的p51cDNA歸納的氨基酸信息，短型的剪接變異體是編碼具有上述448氨基酸(分子量約50，9KDA)的蛋白質(p51A蛋白)的基因(p51A基因)，另外長型的剪接變異體是編碼具有上述641氨基酸(分子量約71，9KDa)的蛋白質的基因。本發明者為了方便起見將后者的基因命名為“人p51B基因(或簡單地為p51B基因)”進而，將用該基因編碼出的具有氨基酸序列的蛋白質稱為“p51B蛋白質(或簡單地為p51B蛋白。)”。
本發明中，將上述的p51A基因及p51B基因統稱為“p51基因”，p51A蛋白及p51B蛋白統稱為“p51蛋白”。
此外，確認了在p51基因的剪接變異體中存在缺損T領域一部分等、復數的存在著。
調查這些p51基因的表達產物時，本發明的p51基因產物(p51蛋白)顯示了與p53蛋白類似的復制活性化作用、細胞的成長抑制性、及細胞編程性死亡誘導活性。另外，p51基因的人組織中的表達比p53基因的表達是組織限定的，盡管，與同樣組織限定地表達p73基因的組織分布重復，但是比組織分布是更廣泛的范圍。進而，在人的腫瘤組織或腫瘤細胞株中確認了p51基因的變異。
從這些的見解，更強烈地暗示了本發明的人p51基因是p53抑制腫瘤基因家族的新成員。
本發明的p51基因具體例可以舉出后述的實施例1表示的克隆(p51A、p51B)所具有的DNA序列。
作為p51A克隆具有的基因，可以舉出后述序列表中，編碼由序列號1所表示的448氨基酸殘基構成的蛋白質基因(1344核苷酸)。具體的是在序列號2中，相當開環讀框的145～1488位表示的堿基序列的基因。
此外，該p51A cDNA克隆的全長堿基序列是如序列號2所示的2816核苷酸。本發明的p51基因中含有用該序列號2表示的堿基序列的基因。序列號2所表示的堿基序列中，開始的密碼子(ATG)是位于堿基號第145-147的位置，多腺苷酸化信號(AATAA)是位于2786-2791的位置。
具有用p51A基因編碼的448個的氨基酸的p51A蛋白的氨基酸序列表示在序列號1中，但是該蛋白具有用氨基酸號1～59位所表示的復制活性化領域、用氨基酸號142～321位所表示的DNA結合領域、用氨基酸號353～397位所表示的低聚化域。
對于該p51A蛋白的各領域的氨基酸序列中，公知蛋白質p53及p73對于各個相當領域的相同性使用GCG軟件(維斯克信·序列分析計·遺傳·計算機·社制)的FASTA程序調查的結果，得到表1的結果)參照圖1、圖2)，(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，1435-1441(1988))。為了參考，將用同樣測定方法得到的蛋白質和p73β的蛋白質的相同性一起并記。
表1 另一方面，作為p51B克隆具有的基因可以舉出后述序列表中，編碼序列號4所表示的641氨基酸殘基構成的蛋白質的基因(1923核苷酸)。具體的是序列號5中具有相當于開放讀框145～2067位所示的堿基序列的基因。
該p51B cDNA克隆的全長堿基序列是序列號5所示的2270核苷酸。本發明的p51B基因包括含有用該序列號5表示的堿基序列的基因。
具有用p51B基因編碼的641個的氨基酸的p51蛋白的氨基酸序列表示在序列號4上，但是該蛋白具有氨基酸號1～59位所表示的復制活性化領域、氨基酸號142～321位所表示的DNA結合領域、氨基酸號353～397位所表示的低聚化域，進而，氨基酸號不能特定的，在C末端側的領域具有插入的序列(SAM結構域)，這里，是將含有SAM結構域的氨基酸號353～641位的領域作為廣義的低聚化域。
對于該p51B蛋白的各領域的氨基酸序列，與p51A蛋白相同地，對于公知蛋白質p73α各個相當領域的相同性使用GCG軟件的FASTA程序調查的結果，得到圖3的結果。在圖3中，四方框圍起的部分是p51B蛋白和p73α共同的氨基酸序列，從這里可以明顯地看出，本發明的p51B蛋白的氨基酸序列在廣范圍內是與p73β的蛋白序列有相同性。
這樣，本發明的p51基因，包括了具有編碼由序列號1表示的氨基酸序列構成的蛋白質的堿基序列的人p51A基因及具有編碼由序列號4表示的氨基酸序列構成的蛋白質的堿基序列的人p51B基因。但是本發明的p51基因不受這些限制，也包括該人p51基因的相同物。
這里所說的“人p51基因的相同物”是指具有與上述p51A基因或p51B基因序列相同性、上述結構的特征及基因表達圖形上的共同性及上述所述的或用其基因產物(蛋白質)的生物學的功能類似性可認識一個基因家族的一系列的關聯基因，當然也包括人p51基因的剪接變異體和等位體(對立基因)。
作為這樣的相同物，可以舉出用序列號1表示的特定氨基酸序列中，具有1至數個改變的蛋白質，而且，編碼具有與該序列p51A蛋白同樣作用或功能的蛋白質的基因。該基因可以舉出編碼保持與用序列號1表示的氨基酸序列有一定相同性的氨基酸序列的物質。
上述氨基酸序列的相同性在用上述的GCG軟件的FAST程序測定中，通常，氨基酸序列的全體大約是45％以上，優選的是50％以上。更優選的是在復制活性領域、DNA結合領域或低聚化域的至少一個領域有一定的相同性，例如復制領域的相同性，大約是35％以上、優選的是45％以上、DNA結合領域的相同性是88％以上、優選的是90％以上，低聚化域的相同性大約是70％以上、優選的是80以上。
即本發明的基因，只要滿足上述的性質，也包括編碼在序列號1所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入1個或數個氨基酸序列構成的蛋白質的堿基序列的基因。
“氨基酸的缺失、替換或插入”的程度及這些位置，只要是改變了的蛋白質與用序列號1或4所表示的氨基酸序列構成的蛋白質(p51A蛋白或p51B蛋白)具有相同功能的同效物，就沒有特別的限制。即本發明的“p51活性”是指p51A蛋白或p51B蛋白代表的p51蛋白所有的活性及功能，具體的是腫瘤細胞成長抑制活性、編程細胞性死亡誘導活性、細胞中復制調節功能等。
可認為本發明的p51蛋白是與作為細胞增殖抑制因子所公知的p53蛋白具有相同的作用。因此在本發明的說明書中，作為p51蛋白的作用或功能所表示的“p51活性”可用公知的p53蛋白的各種作用或功能來定義。
p53蛋白的作用或功能，可以舉出細胞內的復制功能、通過結合其他細胞內蛋白質的信號傳遞功能、作為DNA復制的蛋白質復合體構成要素作用的DNA結合能及外切核酸酶活性等、或這些功能復合作用發揮的細胞的細胞周期的停止功能、編程細胞性死亡作用、DNA修復功能，DNA復制調節或分化誘導作用等，但是這僅是考慮本發明的p51蛋白所具有的一部分或者全部的功能。
氨基酸序列等的變異，可以在天然中，例如通過天然變異和翻譯后的修飾而產生，也可以基于來自天然的基因人為地改變。
本發明，無論這些改變、變異的原因及手段如何，包括了編碼本發明的p51蛋白涉及的具有上述特性的蛋白的所有的變異基因。上述人為的變異手段可以舉出細胞機理〔Method in Enzymology，154，350.367-382(11987)；同100，468(1983)；nucleic acids Ress.，12，9441(1984)；續生化學實驗講座Ⅰ“基因研究法Ⅱ”日本生化學會編，p105(1986)〕等的基因工學試驗的手法、磷酸三酯法和磷酸磷酸酰化法等的化學合成手段〔J.Am.Chen.Soc.89.4801(1967)；同91，3350(1969)Science.150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同24，245(1983)〕及這些的組合方法等。更具體的是，DNA的合成是用核質體法或三酯法的化學合成法，通過市售的自動低聚核苷酸合成裝置進行。二個鏈片段，可合成相輔鏈，在適當的條件下該鏈一起退火，或與適當的引物序列一起，使用DNA聚合酶附加相輔鏈，從化學合成的一根鏈生成物得到。
本發明的基因的具體形態，可以舉出，在序列號2的堿基序列中具有序列號145～1488所示的堿基序列的基因、另外在序列號5的堿基序列中具有序列號145～2067所示的堿基序列的基因。這些堿基序列，是編碼組合上述的序列號1或4所示的氨基酸序列的各氨基酸殘基密碼的組合例子。為此本發明的基因，不限制于這些具有特定的堿基序列，對于各氨基酸殘基可組合任意的密碼子，具有選擇的堿基序列是可能的。密碼子的選擇可按照常法選擇，例如可以考慮利用縮主的密碼子的使用頻度[Neleic Acids Res.，9，43(1981)]。
本發明的基因如上所示也包括與由序列號2所示的堿基序列中堿基序列號145～1488(以下簡稱鹽基序列(145-1488))所示的堿基序列構成的堿基序列具有相同性的堿基序列。
作為這些基因可以舉出，在含有0.1％SDS的0.2×SSC中50℃或含有0.1％SDS的0.1×SSC中60℃下嚴謹條件下與堿基序列(145～1488)構成的DNA雜交所具有的基因。
本發明的基因，對于本發明具體所說的序列號2的序列信息，可以用基因工學的手段容易地制造和得到[參照Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)]；續生化學實驗講座“基因研究法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ”、日本生化學會編(1986)等]。
具體的，根據發現本發明的p51基因的適當的起源，按常規方法調制cDNA文庫，從該文庫，用本發明的p51基因中特有的適當的探針和抗體，選擇所希望的克隆，以此來實施。[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)等]。
在上述中，cDNA的起源，可以列舉出發現本發明的基因的各種細胞、組織和由這些得來的培養細胞等。另外，來自這些的全RNA的分離、mRNA的分離和精制、cDNA的取得及其克隆等，都是可以按常規方法實施。再有，cDNA文庫已有市售，本發明中，cDNA文庫可以使用例如從克隆技術公司(Clontech.Lab.Inc.)等購得的各種cDNA文庫等。
從cDNA文庫克隆本發明的基因的方法，沒有特別的限制，可以按通常的方法實施。
具體的，可以舉出例如對由cDNA所產生的蛋白質，通過使用該蛋白質特異抗體的免疫的篩選，選擇對應cDNA克隆的方法、有選擇地結合目的DNA序列使用探針的噬菌斑雜交、菌落雜交等及其組合等。
這里所使用的探針，一般可以列舉出以與本發明的基因的堿序列有關的信息為基礎，化學合成的DNA等，已經取得的本發明基因本身及其片段可以很好地利用。另外，可以使用基于本發明的p51基因的堿基序列信息所設定的有義引物、反義引物作為篩選用探針。
在取得本發明的基因之際，可以使用PCR方法[Science，230，1350(1985)]或優選使用該法的變型方法的DNA或RNA放大法。特別是，從文庫取得全長cDNA較難的場合，優選采用RACE法[Rapid amplification ofcDNA ends；實驗醫學、12(6)，35(1994)、特別是5′-RACE法(M.A.Frohman，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)]。
在采用所說的PCR法之際，基于所使用的引物根據本發明被明確的p51基因的序列信息可以適當設定，可以按常規方法合成。還有，放大的DNA或RNA片段的單離精制可以按上述的常規方法，例如可以根據凝膠電泳法、雜交法等實施。
另外，由上述的方法所得的p51基因或p51的各種DNA片段，按常規方法，例如，二脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]，或馬庫隆戈耳巴特法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或更簡便使用市售的序列盒決定其堿基序列。
若用本發明的p51基因，例如，通過使用該基因的一部分或全部的堿基序列，可以檢測人的個體或各種組織中的本發明的p51基因的有無表達。
所說的檢測可以按常規方法進行，例如，可以列舉出利用RT-PCR[Reverse transcribed-Polymerase chain reaction；E.S.Kawasaki，etal.，Amplification of RNA.In PCR Protocol，A Guide to methods andapplications，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991)]的RNA擴增或Northern印跡解析[Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989)]和原位的RT-PCR法[Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993)]和原位雜交等的細胞中的測定、NASBA法[Nucleic acid sequence-basedamplification，Nature，350，91-92(1991)]以及其它各種方法。優選可以列舉出，使用RT-PCR-SSCPD的檢測法。
還有，作為此處PCR法所使用的引物，只要是可以特異地擴增本發明p51基因(含部分DNA)的該基因特有的引物，沒有特別的限制，基于本發明的p51基因的序列消息，可以適當設定。作為通常的引物可以列舉出具有10～35程度，優選的是15～30核苷酸長度的、具有本發明的p51基因的部分序列的引物。
這樣，在本發明的基因中也包括為檢出本發明的人p51基因的、作為特異引物和/或特異探針而使用的DNA片段或者包含這些的。
該DNA片段可以規定作為在由堿基序列(145-1488)所構成的DNA或在嚴謹的條件下進行雜交為特征的DNA。這里作為嚴謹的條件，可以列舉出作為引物或探針使用的通常條件，沒有特別的限制，例如，可以列舉出如前所述的含0.1％SDS的0.2×SSC中50℃的條件或含0.1％SDS的1×SSC中60℃的條件。
若用本發明的人p51基因通過使用通常的基因工程的手法，可以容易地大量地穩定地制造含有該基因產物(p51蛋白)的蛋白質。
(2)p51蛋白此外，本發明提供根據本發明的基因編碼的p51蛋白。
本發明的蛋白質的具體的形態，雖然可以列舉出被稱為具有序列號1所示的氨基酸序列p51A蛋白及具有序列號4所示的氨基酸p51B的蛋白的蛋白質，但本發明的蛋白質不限定所說的特定的p51A蛋白和p51B蛋白，其等同物也可。作為等同物，可以列舉出在上述各蛋白質的氨基酸序列中，1或數個乃至多個氨基酸有缺失、替換或插入的氨基酸序列，并且，具有上述的p51活性的蛋白質的等同物。具體的，可以列舉出上述的p51基因的相同物(含接枝變異體及等位體的p51相關基因)的基因產物。
本發明的蛋白質，可基于本發明所提供的人p51基因的序列信息，按通常方法的基因重組技術[參照Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1993)等]進行調制。
(3)含p51蛋白的功能的領域的多肽本發明還涉及上述p51蛋白的一部分領域的多肽。
所說的多肽最好是具有構成p51蛋白的各種功能的領域的某一種氨基酸序列的多肽，具體的，是具有從具有p51蛋白的復制活性化領域、DNA結合領域以及低聚作用領域中所選擇至少一種的領域的氨基酸序列的多肽。
如上所述，p51蛋白的復制活性化領域、DNA結合領域以及低聚作用領域分別位于以序列號1所示的p51A蛋白的氨基酸序列中的氨基酸號1～59位、氨基酸號142～321位以及氨基酸號359～397位。
從而，本發明的多肽含有以下各物(ⅰ)具有由序列號1的氨基酸號1～59所示的氨基酸序列(以下簡稱氨基酸序列1(1～59))的多肽及其同效物。
這樣，所說的同效物，可以列舉出在氨基酸序列1(1～59)中具有缺失、替換或插入1或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有復制活性化功能的多肽。關于氨基酸序列的改變程度，只要具有復制活性化功能，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(1～59)的相同性保持在35％以上，最好保持在45％以上。
(ⅱ)具有以序列號1的氨基酸號142～321所示的氨基酸序列(以下，簡稱氨基酸序列(142～321))的多肽及其同效物。
再有，所說的同效物，可以列舉出具有缺失、替換或插入1或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有DNA結合性的多肽。關于氨基酸序列的改變程度，只要具有DNA的結合性，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(142～321)的相同性保持在88％以上，最好保持在90％以上。
(ⅲ)以序列號1的氨基酸號353～397所示的氨基酸序列(以下，簡稱氨基酸序列(353～397))的多肽及其同效物。
再有，所說的同效物，可以列舉出具有缺失、替換或插入1或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有低聚作用功能的多肽，例如，包含p51B蛋白的廣義的低聚作用領域(序列號4的氨基酸號353～641)。關于氨基酸序列的改變程度，只要具有低聚作用功能，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(353～397)的相同性保持在70％以上，最好保持在80％以上。
另外，本發明，可以是把上述氨基酸序列1(1～59)或同效物、氨基酸序列1(142～321)或同效物、氨基酸序列1(353～397)或同效物中的某一種的氨基酸序列包含在一領域中的多肽，也可以是把所示的任意二個以上的氨基酸序列作為連續的或不連續的領域多肽。
本發明還包含具有編碼多肽的堿基序列的基因(DNA)。具體的，可以列舉出作為把上述的氨基酸序列1(1～59)編碼的堿基序列，在序列號2中，以堿基號145～321所示的堿基序列、作為把氨基酸序列1(142～321)編碼的堿基序列，在序列號2中，以堿基號568～1107所示的堿基序列、作為把氨基酸序列1(353～397)編碼的堿基序列，在序列號2中，以堿基號1201～1335所示的堿基序列。
(4)p51蛋白的制造方法及用于制造中的使用物。
另外，本發明還提供該p51蛋白的制造方法、及使用該制造方法的使用物，例如含有上述基因的載體，根據該載體所進行的形質轉化的宿主細胞。
該蛋白質的制造更詳細的說把所希望的蛋白進行編碼的基因在宿主細胞中可以表達地進行重組DNA(表達載體)，把它導入宿主細胞中進行形質轉化，對該形質轉化體進行培養，然后從所得到的培養物中收回所希望的蛋白質。
這里所說的宿主細胞可以使用真核生物及原核生物中的一種。
在真核生物細胞中包含脊椎動物、酵母等真核微生物的細胞。作為脊椎動物細胞，通常使用例如作為猿猴的細胞的COS細胞(Cell，23，175(1981))，中國田鼠的卵巢細胞以及這些二氫葉酸原還酶欠損株(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77，4216(1980))等，但不限于這些。再有，作為真核微生物，一般使用酵母，其中，使用酵母菌屬酵母較為有利。
作為原核生物的宿主，一般使用大腸菌和枯草菌。大腸菌中更為使用大腸桿菌K12株等。
表達載體，只要含有本發明的基因且可以表達該基因的載體，就沒有特別限制，一般根據同宿主細胞的關系進行適當選擇。
作為宿主細胞，在使用脊椎動物細胞的場合，作為表達載體，可以使用象通常發現那樣，位于本發明的基因的上游的啟動子、RNA的剪接部位、聚腺苷化部位以及保持復制完了序列的載體。進而這些根據需要也可有復制起點。作為該表達載體，例如，可以列舉出具有SV40的初期啟動子的pSV2 dhfr[Mol.Cell，Biol.，1，854(1981)]等。
作為宿主細胞，在使用酵母等真核微生物的細胞的場合，作為表達載體，例如可以使用對酸性磷酸酶基因具有啟動子作用的pAM 82[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，1(1983)]等，本發明的載體，可以在該啟動子的上游區域增加本發明的基因的辦法進行調制。最好，可以列舉出與原核生物基因融合的融合載體，作為該載體的具體例例如可以列舉出具有分子量為26000的GST結構域(由S.Japonicum得來)的pGEX-2TK和pGEX-4T-2等。
作為宿主細胞，在使用原核生物的細胞的場合，作為表達載體，可以舉出例如可以是在該宿主細胞中可以復制的質粒載體，為在該載體中表達所希望的基因，是在該基因的上流中付與啟動子及SD(Shine-Dalgarno)堿基序列、蛋白合成開始所需要的開始密碼子(ATG)的表達質粒。特別是，把大腸菌(例如大腸桿菌K12株等)作為宿主細胞使用的場合，作為表達載體，一般使用pBR322及其改良的載體。但是，不限于這些，公知的各種菌株及其載體都可以使用。另外，作為上述的啟動子，例如可以使用trp啟動子、lpp啟動子、lac啟動子、PL/PR啟動子等。
把本發明的載體導入宿主細胞的方法和以此的形質轉化方法，沒有特別限制，可以采用一般的各種方法。
所得的形質轉化體可以按常法培養，根據該培養，在形質轉換體的細胞內、細胞外或細胞膜上，發現、產生(蓄積、分泌)由按所希望那樣設計的基因編碼的本發明的目的蛋白。
作為在該培養中所使用的培養基，可以根據所采用的宿主細胞適當選擇慣用的各種培養基。
對所得到的本發明的重組蛋白，根據希望，通過利用其物理性質、化學性質等的各種分離操作[參照“生化學數據手冊Ⅱ”、1175～1259頁、第1版第1次印刷、1980年6月23日株式會社東京化學同人發行；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等]，進行分離精制。
作為該方法，具體的，可以列舉出通常的再構成處理、通過蛋白沉淀的處理、(鹽析法)、離心分離、滲透壓沖擊法、超聲波破碎、超過濾、分子篩色譜法、(凝膠過濾)、吸著色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、高速液體色譜法、(HPLC)等各種液體色譜法、透析法、這些的組合，作為優選的方法可以列舉出利用結合了對本發明的蛋白質特異抗體的柱的親和色譜法。
再有，把本發明的蛋白質編碼設計所希望的基因之際，可以很好地利用在序列號2中以堿基序列(145～1488)所示的人p51A基因的堿基序列，或在序列號5中以堿基序列(145～2067)所示的人p51B基因的堿基序列。也可以利用該基因，根據希望，適當選擇變更表示各氨基酸的密碼子。
另外，在以p51A基因或p51B基因編碼的氨基酸序列中，在其一部分氨基酸殘基乃至氨基酸序列通過替換、缺失、插入等改變的場合，可以按例如細胞特定誘變等上述的各種方法進行。
本發明的蛋白質還可以按由序列號1所表示的氨基酸序列或序列號4所表示的氨基酸序列，通過一般的化學合成法制造。該方法包含根據通常的液相法及固相法的肽合成法。
所說的肽合成法更詳細地說包含基于氨基酸序列信息，把各氨基酸一個一個地逐次結合鏈延長的所謂的步進寬幅延長法，和預先合成由數個氨基酸構成的片段，然后把各片段進行偶合反應的片段縮合法，本發明的肽的合成可以采用其中之一法。
上述肽合成法所采用的縮合法可以按常規方法進行，例如可以列舉出疊氮法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化還原法、DPPA(二苯基磷酰疊氮)法、DCC+添加物(1-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰胺、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亞胺)法、伍德沃德法等。這些方法所利用的溶劑，也可以從此種肽縮合反應所使用的公知的一般的溶劑中適當選擇。作為此例，例如可以列舉出二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六磷酰胺、二祐烷、四氫呋喃(THF)、醋酸乙酯等及其混合溶劑等。
另外，在上述肽合成反應之際，對于與反應無關的氨基酸乃至肽中的羧基。一般可通過酯化，可以作成例如甲基酯、乙基酯、叔丁基酯等低級烷基酯、例如芐基酯、對甲氧基芐基酯、對硝基芐基酯等芳烷基酯等進行保護。
再有，具有側鏈中的官能團的氨基酸，例如酪氨酸殘基的羥基可以用乙酰基、芐基、芐氧羰基、叔丁基等進行保護，但也非進行這種保護不可。進而，對于精氨酸殘基的胍基殘基，可用硝基、三甲苯基、對甲氧基苯磺酰基、亞甲基-2-磺酰基、芐氧羰基、異冰片基氧羰基、金剛烷基氧羰基等適當的保護基進行保護。
具有上述的保護基的氨基酸，肽及最終所得的本發明的蛋白質上的這些保護基的脫保護反應可用慣用方法進行，例如接觸還原法和液體氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟醋酸、醋酸、甲酸、甲磺酸等方法。
這樣所得的本發明的蛋白質，可以按上述的各種方法，例如按離子交換樹脂、分配色譜法、凝膠色譜法、對流分配法等肽化學領域中廣泛使用的方法，進行適當精制。
本發明的蛋白質也可以作為用于作成p51蛋白質的特異抗體的免疫抗原加以利用，通過利用這些抗原，可以取得所希望的抗血清(多克隆抗體)及單克隆抗體。
該抗體的制造方法本身，技術人員應理解，在本發明中也可以按這些常用的方法[參照續生化學實驗講座“免疫生化學研究法”、日本生化學學會編(1986)等]。這樣所得的抗體，可以有利地用于例如p51蛋白的精制及其借助于免疫學的手法的測定乃至識別等。
另外，本發明的蛋白質作為以其為有效成分的醫藥品，在醫藥領域中是有用的。
(5)含有p51蛋白的醫藥組成物因此，本發明涉及包含上述的本發明的蛋白質的醫藥。
該蛋白質也包括醫藥中所允許的鹽。所說的鹽包含以本領域周知的方法所調制的、例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨等無毒性堿金屬鹽、堿土金屬鹽以及銨鹽等。上述的鹽也可包括借助于本發明的肽和適當的有機酸乃至無機酸的反應的無毒性酸加成鹽。作為代表的無毒性酸添加鹽，可以列舉出例如鹽酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、對甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、羥基乙酸酯、馬來酸鹽、抗壞血酸鹽、苯磺酸鹽、以及石腦酸鹽(ナブシレ一ト)等。
本發明中，包括以上述的本發明的蛋白質作為活性成分，含有它的藥學有效量、適當的無毒性醫藥載體乃至稀釋劑的醫藥組成物或醫藥制劑。
作為上述醫藥組成物(醫藥制劑)中所利用的醫藥載體，可以列舉出根據制劑的使用形態通常使用的有填充劑、增量劑、結合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、等稀釋劑或賦形劑等，可根據由此所得的制劑的給藥單位形態加以適當選擇利用。
特別是，優選的本發明的醫藥制劑可適當使用在通常的蛋白制劑等中能使用的各種成分，例如穩定劑、殺菌劑、緩沖劑、等滲化劑、螯合劑、pH調整劑、表面活性劑等進行調制。
作為上述穩定劑，可以列舉出例如人血清白蛋白和通常的L-氨基酸、糖類、纖維素衍生物等，這些可以單獨或與表面活性劑組合使用。特別是，若按該組合，有時還進一步提高有效成分的穩定性。
作為上述的L-氨基酸，沒有特別的限制，例如甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任意一種酸均可。
作為上述的糖，沒有特別的限制，可以使用例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等單糖類、甘露糖醇、肌醇、木糖醇等糖醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖類、葡聚糖、羥丙基淀粉、硫酸軟骨素、透明質酸等多糖類以及它們的衍生物。
作為表面活性劑，沒有特別的限制，可以使用離子性或非離子性的表面活性劑中的某一種，例如可以使用聚氯氧乙烯二醇山梨糖醇酐烷基酯系列、聚氧乙烯烷基醚系列、山梨糖醇酐單酰酯系列、脂肪酸甘油酯系列等。
作為纖維素衍生物，沒有特別的限制，可以使用甲基纖維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉等。
上述糖類的添加量，每有效成分1μg約0.0001mg以上，優選約0.01-10mg左右的范圍是適當的。表面活性劑的添加量，每有效成分1μg約0.00001mg以上，優選約0.0001-0.01mg左右的范圍是適當的。人血清白蛋白的添加量，每有效成分1μg約0.0001mg以上，優選約0.001-0.1mg左右的范圍是適當的。氨基酸，每有效成分1μg約0.001～10mg左右。另外，纖維素的添加量，每有效成分1μg約0.001mg左右，優選約0.001-0.1mg左右，的范圍是適當的。含在本發明醫藥制劑中的有效成分量，可在廣范圍內選擇，通常是0.00001～70重量％，優選的是0.0001～5重量％左右。
在本發明醫藥制劑中，可以添加各種添加劑，例如緩沖劑、等滲化劑、螯合劑等。此處，作為緩沖劑可以列舉出硼酸、磷酸、醋酸、檸檬酸、ε-氨基己二酸、谷氨酸和/或它們的鹽(例如它們的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、等堿金屬鹽和堿土金屬鹽)等。
作為等滲化劑，可以列舉出例如氯化鈉、氯化鉀、糖類、甘油等。作為螯合劑，可以列舉出例如依他酸納、檸檬酸等。
本發明的醫藥制劑，除可作溶液制劑使用外，還能把它凍結干燥化作成保存的狀態后，用時，可以用含水、生理鹽水等緩沖劑等溶解，調制到適當濃度后使用。
作為本發明的醫藥制劑的給藥單位形態，根據治療目的可以選擇各種形態，作為其代表含有片劑、丸劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、膠囊劑等固體給藥形態、及溶液、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等液劑給藥形態，還可根據給藥路徑分成經口劑、非經口劑、經鼻劑、經腔劑、坐劑、舌下劑、軟膏劑等，按各自同常的方法來進行調合、成形乃至調制。
例如，在形成片劑的形態之際，作為上述制劑載體可以使用例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、硅酸、磷酸鉀等賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、淀粉液、明膠溶液、羧基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等結合劑；羧基甲基纖維素鈉、羧基甲基纖維素鈣、低取代度羥基丙基纖維素、干燥淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布多糖末、碳酸氫鈉、碳酸鈣等崩解劑；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯等表面活性劑；白糖、硬脂精、可可脂黃油、添加氫油等崩解抑制劑、季銨堿、月桂基硫酸鈉等吸附促進劑；甘油、淀粉等保濕劑；淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀硅酸等吸附劑；精制滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等潤滑劑等。
片劑，根據需要，可以作成實施通常的劑皮的片劑、例如，糖衣片、明膠包衣片、腸溶包衣片、涂層片，也可以作成雙層片或多層片。
在形成丸劑的形態之際，作為制劑載體，例如可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高嶺土、滑石等賦形劑；阿拉伯膠粉末、黃蓍膠粉末、乙醇等結合劑；昆布多糖、乙醇等崩解劑等。
膠囊劑，按通常方法將本發明的有效成分按上述的示例的各種制劑載體混合，填充硬質明膠膠囊、軟質膠囊等加以調制。
經口給藥用液體給藥形態，可以包含含有水的醫藥容許的溶液、乳化液、懸浮液、糖漿、酏劑等，還可以包含潤滑劑、乳劑、懸浮劑等助劑，按常法對此進行調制。
非經口給藥用液體投與形態，例如在滅菌水性乃至非水性溶液、乳化劑、懸浮液等調制之際，作為稀釋劑可以使用水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯以及橄欖油等植物油，另外，可以配合可以注入的有機酯類、例如油酸乙酯等。在這些當中還可以添加通常的溶解輔助劑、緩沖劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、分散劑等。
滅菌，通過保留細菌過濾器的過濾操作，殺菌劑的配合、照射處理以及加熱處理等實施。另外，在使用之前，可將其溶解于滅菌水和可以適當滅菌的溶劑中，調制成滅菌固體組成物。
在成形坐劑和腔給藥用制劑的形態之際，作為制劑載體，例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高級醇、高級醇的酯類、明膠以及半合成甘油酯等。
在成形漿、膏、凝膠等軟膏劑的形態的成形之際，作為稀釋劑，例如可以使用白色凡士林、石臘、甘油、纖維素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅膠、膨潤土以及橄欖油等植物油。
經鼻或舌下給藥用組合物用周知的標準賦形劑，按常法進行調制。
還有，在本發明的醫藥制劑中，根據需要可以含有著色劑、保存劑、香料、風味劑、甜味劑等其它醫藥品等。
上述醫藥制劑的給藥方法，沒有特別的限制，可根據各種制劑形態、患者的年齡、性別、及其它條件、疾病的程度而決定。例如，片劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑以及膠囊劑經口給藥，注射劑，可以單獨或與葡萄糖和氨基酸等通常的補液混合進行靜脈給藥，根據需要，可以單獨作筋肉內、皮內、皮或腹腔內給藥，坐劑為直腸內給藥，舌下劑作口腔內給藥，軟膏劑作經皮的局部給藥。
上述醫藥制劑中應含有的本發明的蛋白質的量及其給藥量，沒有特別的限制，根據所希望的醫療效果、投與法、治療期間患者的年齡、性別及其它條件雖可在廣范圍內作適當地選擇，但一般地，該投與量，通常，每日每體重1kg投與約0.01μg-10mg左右，優選約0.1μg-1mg左右為好，該制劑1日中可分數次給藥。
(6)基因治療本發明提供利用本發明的人p51基因的基因治療法。該治療法，采取在有變異p51基因的細胞處，供給野生型p51功能的方法。把野生型p51基因或其基因產物本來有的正常功能提供給細胞時，可以抑制受容細胞/標的細胞中的新生物的增殖。上述野生型p51基因，要使用將該基因維持在染色體外的載體或質粒，導入目的細胞。在此場合，該基因從染色體外表達。
在把野生型p51基因導入具有這樣的變異p51基因的細胞中，表達正常p51蛋白的場合，p51基因沒有必要是全長，只要保持與該基因的所希望機能實質上相同的機能，也可以是其改變體，也可以使用由還保持特定機能的一部分序列構成的基因。作為后者的例子，可以列舉出將細胞的非腫瘤的增殖(細胞增殖抑制)所需要的p51蛋白的一部分編碼的基因。
野生型p51基因或其一部分，最好導入突然變異細胞，以便與細胞內存在的內因突然變異p51基因之間引起重組。這樣的重組中，需要發生修正p51基因突然變異的雙重重組。
用于導入所說的重組及維持染色體外的為導入雙方所希望的基因載體，在該領域中，是已知的，在本發明中，所說的已知載體的任一種均可使用。
可舉出例如，含有與表達控制元件連接的p51基因的拷貝，而且在目的細胞內，表達該基因產物的病毒載體或質粒載體。作為所說的載體雖可利用通常上述的表達用載體，但作為起源載體，最好使用美國專利第5 252 479好說明書及PCT國際公開WO 93/07282號說明書中所公開的載體(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、Pwp-21和/或pRSVL等)或pRC/CMV(Invitrogen公司制)等，進行調制的載體。最好是后述的各種病毒載體。
另外，作為導入基因治療中，用于載體的啟動子優選利用構成治療各種疾病對象的患處組織中固有的啟動子。
做為其具體的例子，例如對于肝臟，可以例舉出白蛋白、α-甲脂蛋白、α1-抗胰蛋白酶、鐵傳遞蛋白、甲狀腺運載蛋白等。對于結腸，可以例舉出羧酸脫水酶Ⅰ、抗癌胚抗原等。對于子宮及胎盤，可以例舉出雌激素、阿洛嗎他賽得色素、膽甾醇側鏈切斷、17α羥基酶等。
對于前列腺，可以列舉出前列腺抗原、gp91-聚焦基因、前列腺特移的激肽釋放酶等。對于乳房可以列舉出erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳漿蛋白質。對于肺可以列舉出活性劑蛋白質C尿球蛋白等。對于皮膚可以列舉出K-14-角蛋白、人角蛋白1或6、白細胞素等。
對于腦可以列舉出神經膠纖維質酸性蛋白質、成熟星形細胞特異蛋白質、髓磷酶、酪氨酸羥基酶胰臟蛋白質、高血糖素、胰島淀粉狀蛋白多肽等。對于甲狀腺可以列舉出甲狀球蛋白、降鈣素等。對于骨可以列舉出α1-膠原、骨鈣素、骨唾酸糖蛋白等。對于腎臟可以列舉出凝乳酶、肝臟/骨/腎臟堿性磷酸酶、細胞生成素等對于胰臟可以舉出淀粉酶、PAP1等。
在基因導入用載體的制造中，基于本發明的p51基因的堿基序列信息，如前所述，通過一般的基因工程手法可以容易地制造、或取得導入的基因(全部或一部分)。
所說的導入基因用載體向細胞的導入例如以電穿孔法、磷酸鈣共沉法、病毒形質導入法為主的、在細胞中，導入DNA的該領域中，按已知的各種方法進行。另外，以野生型p51基因所進行型質轉化的細胞，以自體分離狀態作為癌的抑制乃至癌轉移抑制的醫藥和治療研究的模型加以利用。
在基因治療中，上述的基因導入用載體，通過注射投與患者的腫瘤部位局部或全身的辦法可以導入患者的腫瘤細胞內。此時若作全身的給藥也能達到能轉移到其他部位的腫瘤細胞內。在形質導入的基因不能永久性地進入各標的腫瘤細胞的染色體內時，可以通過定期地反復給藥達到。
本發明的基因治療方法包含，把前述的基因導入用的材料(基因導入用載體)直接投與體內的體內、從患者體內取出一度作為標的的細胞，在體外導入基因，然后再把基團反回到體內的體外法這兩種方法。
另外，把人p51基因直接導入細胞內，可以用作為切斷RNA鏈的活性分子的硫辛酸酰胺、進行基因治療。
含有本發明的人p51基因或其片段的基因導入用載體及由該載體導入人p51基因的細胞作為有效成分的本發明基因治療劑。雖然是以癌為利用對象，但上述的基因治療(處置)也可以進行癌以外的基因性疾病、如AIDS那樣的病毒疾病的治療，也可進行以基因標識做為目的。
再有導入基因的標的細胞、根據基因治療(處理)的對象可以適當地選擇。例如，作為標的細胞除癌細胞和腫瘤組織以外，還可以列舉出淋巴細胞、纖維胚細胞、肝細胞、造血干細胞等細胞。
在上述基因治療中的基因導入方法中，包含病毒的導入方法及非病毒的導入方法。
作為病毒的輸入方法，如鑒于人p51基因是在正常細胞里表達的外來基因、所以作為載體可舉出使用逆轉錄病毒載體方法。作為其他的病毒載體還可以舉出腺病毒載體、HIV(human immunodeficiencyvirns)載體、腺伴隨病毒載體(AAV，adeno-associated viras)皰疹病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體及埃布斯坦一巴病毒(EBV，Epstein-Barrvirus)載體。
作為非病毒的基因導入方法、可以使用以下的方法。磷酸鈣共淀法；用封入DNA的核糖體和予先以紫外線破壞基因的不活性化仙臺病毒融合作成膜融合核糖體，它和細胞膜直接融合后將DNA導入到細胞內的膜融合核糖體法[Kato，K.，ct al.，J.Biol.Chem.，266，22071-22074(1991)]；將質粒DNA用金屬包被，用高壓放電物理性地將DNA導入到細胞內方法[Yang，N.S.et a1.，Proc.Nafl.Acad.Sci.，87，9568-9572(l990)]；將質粒DNA直接用體內法注入到臟器官和腫瘤里的裸(naked)DNA方法；[Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1467(1990)]；將包埋多重膜正電荷核糖體的基因導入到細胞里的陰離子核糖體方法[八木國夫，醫學之路，Vol.175，No.9.635-637(1995)]；為了能只導入特定的細胞，不讓其他的細胞進入，與可在目的細胞里表達的受體的配位體和DNA結合，進行給藥的配位體DNA復合體法。[Frindeis，et al.，Trends Biotechnol.，11，202(1993)；Miller，et al.，FASEB J.，9，190(1995)]。
上述的配位體DNA復合體法還包含以下所舉的方法等。例如，將肝細胞表達的脫唾液糖蛋白受體作為靶子，將脫唾液糖蛋白作配位體使用的方法和強烈表達腫瘤細胞的運鐵蛋白受體作為標的，作為配位體使用的方法等。[Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，87，3410(1990)]。
另外，本發明所用的基因導入法，將如上所述的各種生物學及物理學的基因導入法適當組合而形成的方法也是可以的。作為該組合而形成的方法，例如，將某種尺寸的質粒DNA和與腺病毒。六鄰體蛋白質特異的聚賴氨酸抱合抗體組合的方法。根據該方法，所得到復合體和腺病毒載體相結合，用如此得到的三分子復合體去感染細胞，由此便可以進行本發明的基因導入、在這個方法中，在和腺病毒載體偶合的DNA在被損傷前可以進行效率化的結合，可能成為內在化及核內體分解。另外，前述的核糖體/DNA復合體，直接在體內可作為導入基因的媒介。
下面具體闡述本發明的基因導入用病毒載體的作成方法及向標的細胞或標的組織導入基因的方法。
逆轉錄病毒載體系統是由病毒載體和輔助細胞(包裝細胞)構成。在這里的輔助細胞是指事先表達著逆轉錄病毒的結構蛋白質gag(病毒粒子內的結構蛋白質)、P01(逆轉錄酶)、env(外被蛋白質)等的基因，但是沒有生成病毒粒子的細胞。另一方面，病毒載體雖然具有包裝信號和LTR(long terwinal repeats)但是不具有“病毒復制所必須的gag、P01、env等的構造基因。包裝信號在病毒粒子的裝配時，成為標記序列，重組所希望的導入基因(p51基因或者他的片段)代替病毒基因被插入到被選擇基因(neo，hyg)和克隆細胞內。在這里為得到高力價的病毒粒子，增加盡可能的短些，將含有包裝信號的gag基因的一部分盡量多的取得，不留下gag基因的ATG等是非常重要的。
通過將含有所希望的p51基因載體的DNA移入到輔助細胞里，據此，再根據輔助細胞作成的病毒結構蛋白質，載體基因組RNA被包裝，形成病毒粒子，被分泌。作為重組的病毒粒子，感染靶細胞后被病毒基因組RNA逆轉錄的DNA被編入到細胞核里。插入到載體內部的基因進行表達。
另外，作為提高所希望基因的導入效率的方法，也可以采用這種方法，即使用含有粘接纖連蛋白的細胞粘結構成，和與肝素結合部位接合的區段的片段的方法[Hanenberg.H.，et al.，Exp.Hemat.，23，747(1995)]。
還有在上述逆轉錄病毒載體系統里被使用的載體，可以舉出起源于小鼠的白血病病毒的逆轉錄病毒例子[McLachlin，J.R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.，38，91-135(1990)]。
關于利用腺病毒載體的方法，要進行詳述的話，該腺病毒載體的作成可以基于巴克奈耳[Berkner，K.L.，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)]、瀨戶口康弘等[Setoguchi，Y.，et al.，Blood，84，2946-2953(1994)]、鐘之江裕美等[實驗醫學，12，28-34(1994)]及肯納等[Ketner，G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，91，6186-6190(1994)]的方法進行。
例如，作成非增殖性腺病毒載體時，首先要除去腺病毒的初期基因的E1及/或E3基因領域。接著，將含有所希望的外來基因表達單位(作為目的的基因，在本發明中是由p51基因，為轉錄此基因的起動子、賦與被轉錄基因穩定性的聚A構成)及含有腺病毒基因組DNA一部分的質粒載體和含有腺病毒基因組的質粒同時轉染例如293那樣的細胞里。在這兩者間引起相同性重組，根據基因表達單位和E1的替換，可以作成含有所希望的p51基因的本發明載體的非增殖性腺病毒載體。另外在粘粒載體里編入腺病毒基因組DNA也可以做成附加了末端蛋白質3′側腺病毒載體。進而重組作成腺病毒載體時，也可利用YAC載體。
關于腺伴隨病毒(AAV)載體的制造概括地說，AAV是作為混進腺病毒的培養系內的小型病毒被表達的。在這里確認了病毒的復制時，不需要輔助病毒，在宿主細胞內自主地增殖的小球病毒屬和必須具有輔助病毒的依賴病毒屬的存在。該AAV是宿主領域較寬感染各種細胞常見的病毒，病毒基因組的大小是由4680堿基的線狀一根鏈DNA構成的，其兩端的145堿基具有被稱為1TR(inverted terminal repeat)那樣特征的序列。這個1TR部分作為復制開始點，起到引物作用。進而，在對病毒粒子的包裝和對宿主細胞染色體DNA的重組該1TR也是必須的。另外，關于病毒蛋白質、基因組左半部分是非構造蛋白質，即編碼著起著復制和轉錄的調節蛋白質的Rep。
重組AAV的作法是利用AAV進入染色體DNA里的性質而進行的，這樣一來，就可以作成所希望的基因導入用載體。這個方法要更詳細的說的話，首先，留下野生型AAV的5’和3’兩端的1TR作成插入其間所希望導入用的基因(人p51基因)質粒。另外，對于病毒復制和病毒粒子的形成所必須的病毒蛋白質，是從別的輔助質粒提供的。必要的是在其兩者間不存在共同的堿基序列、通過基因重組的野生型病毒不再出現。然后，將兩者的質粒轉染到293細胞里，進行導入，進而作為輔助病毒，讓其去感染腺病毒(使用293細胞時非增殖型也可以)，產生非增殖性的所希望的重組AAV。接著，因為這個重組的AAV存在于核內，將細胞凍結融解之后，回收，將混入的腺病毒加熱到56℃，讓其失去活性。之后，必要時，使用氯化鈣，用超離心法分離濃縮重組的AAV。向上述那樣就可以得到將希望的基因導入用的重組AAV。
HIV載體的作成，可以基于島田等的方法進行[Shimada，T.，et al.，J.Clin.Invest.，88，1043-1047(1991)]。
HIV病毒，將CD4作成受體特異地感染輔助T細胞，所以按其利用，就可以作成，作為在人CD4陽性細胞里特異地導入基因可能組織的特異基因導入載體的HIV載體。該HIV載體最適于AIDS的基因治療。
重組HIV載體的作成，首先，通過巨細胞病毒(CMV)的啟動子和人球蛋白基因的聚A信號(polyA)表達gag.Pol.env的結構基因和這些表達必要的調節基因(tat.rev等)，而作成包裝質粒的CGPE。接著在HIV的兩個LTR間插入帶有作為標識基因的胸苷激酶(TK)的起動子的新霉素耐性基因(neok)，進而，在作為基本的質粒載體里增加SV40的復制機能，由此在COS細胞內可以高效率增殖地構建載體-質粒HXN。將這些包裝質粒的CGPE和載體質粒HXV同時轉染到COS細胞里，由此，形成由大量的neok基因進入的所希望的重組病毒，在培養地中可以讓其釋放。
EBV載體的制造，可以基于清水等的方法進行[清水則夫、細胞工學，14(3)，280-287(1995)]。
關于本發明基因導入用EBV載體的制造簡略聽說EB病毒(Epstein-Barr virusEBV)是1964年，由Epstein氏從Burkitt淋巴腫瘤的培養細胞中分離出來的，屬于皰疹科的病毒[Kieff，E.and Liebowit z，D.Virology，2nd ed.Raven Press，New York，1990，pp.1889-1920]。該EBV里因為有可以轉化細胞的活性，為了使其能作為基因導入用載體，就必須調制出沒有這種活性轉換的病毒，這個是如下那樣實施的。
也就是說，首先，將所編入有希望的外來基因靶DNA近旁的EBV基因組進行克隆。在那里加入外來基因的DNA片段和藥劑耐性基因，作為重組病毒制作用載體。接著，將由適當的限制性內切酶產生的重組病毒制作用載體轉染到EBV陽性Akata細胞里。由相同重組產生的重組病毒由于表面免疫球蛋白處理產生病毒刺激，可與野生型AkataEBV同時回收。將此感染在EBV陰性Akata細胞內，在藥劑存在下，通過選擇耐性株，就可以得到野生型EBV不共存的所希望的重組病毒感染的Aktata細胞。進而將病毒活性引進到重組病毒感染的Akata細胞里，就可以產生出大量的重組病毒載體。
不用重組病毒載體而將所希望的基因導入到靶細胞里的、非病毒載體制造方法，如可以用基于膜融合核糖體的基因導入法就可以進行。這是因為使膜核糖體(由脂質二重膜構成的小胞)有進入細胞膜的融合活性，是將核糖體的內容物直接導入到細胞內的方法。
上述膜融合核糖體基因的導入，用中西等的方法，就可以進行。[Nakanishi，M.，et al.，Exp.Cell Res.，1 59，399-499(1985)；Nakanishi，M.，etal..Geneintroductioninto animaltissues.In Trends and Future Perspectives inPeptide and Protein Drug Delivery(ed.By Lee，V.H.et al.).，HarwoodAcademic Publishers Gmbh.Amsterdam，1995 pp.337-349]。
下面關于用該膜融合核糖體進行基因導入法概略如下。用紫外線將基因不活性化的仙臺病毒和封入所希望的基因及蛋白質等的高分子物質的核糖體在37℃下使其融合。這個膜融合核糖體，內側有因為核糖體而產生的空洞，外側有和包膜病毒相同突起那樣被稱模擬病毒那樣的構造。然后，用蔗糖密度斜度離遠心法精制后，對于作為靶的培養細胞或者組織細胞，在4℃吸附膜融合核糖體。接著，當到37℃時核糖體的內容物導入細胞。所希望的基因就可以導入到靶細胞里。在這里作為核糖體使用的脂質是具有50％(摩爾比)膽甾醇和卵磷脂及陰電荷的合成磷脂質，希望能作成直徑為300nm的一塊膜核糖體后使用。
另外，作為使用其他的核糖體將基因導入到靶細胞里，可以舉出用陽離子核糖體進行基因導入的方法。該方法是基于八木等的方法而實施的[yagi，K.，et al.，B.B.R.C，196，1042-1048(1993)]。這個方法是，質粒也好細胞也好都給予負電荷，核糖體膜內外兩面給予正電荷，用靜電使質粒的進入增加，使和細胞的相互作用增加。在這里所使用的核糖體為具有正電荷的多層膜的大的模核糖體(multilamellar largevesiclesMLV)，但是使用1枚大的核糖體(large unilamellar vesiclesLUV)和1枚小的膜核糖體(small unilamellar vesiclesSUV)與質粒作成復合體，也可以導入所希望的基因。
關于質粒包埋陽離子的調制方法，概括的說，如下首先將脂質TMAG(N-(a-trimethy lammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride)、DLPC(dilauroy phosphatidylcholine)及DOPE(dioleoyl phosphatidylethanol-amine)按摩爾比1∶2∶2的比例調制成含有氯仿的溶液(作為脂質濃度為1mM)。接著將總量為1μmol的脂質注入到尖嘴型試驗管里，用輥式蒸發器將氯仿減壓、除去、調制成脂質薄膜。再次減壓直到將氯仿完全除去，使其干燥。之后將含有20μg的基因導入用質粒的0.5ml的Dulbecco的磷酸緩沖生理食鹽液-Mg，Ca添加進去，用氮置換后，用渦流混合器攪拌20分鐘，就可以得到包埋含有所需基因質粒陽離子懸浮液。
把上述所得到的包有質粒的陽離子MLV作為治療劑使用，可以作為一例，例如，將含有表達目的基因的cDNA的表達質粒上包埋在上述的陽離子性MLV中，使得DNA的量為0.6μg，核糖體脂質量30nmol，使其在2μl的磷酸緩沖生理食鹽液里懸浮，對從患者處抽出的靶細胞或者患者組織隔日投入的這樣方法。
可是，所稱的基因治療根據日本厚生省的指導方針的定義為以治療疾病為目的，將基因或者導入基因的細胞注入到人體內。但是本發明的基因治療，不僅是在該指導方針的基礎上，在前述的靶細胞里導入作為人p51基因等的癌抑制基因，由此導入的基因不僅治療以癌為首的各種疾病，而且還包括可以將成為標識的基因或者導入標識基因的細胞導入到人的體內。
本發明的基因治療中，在所希望的基因向靶細胞或者靶組織導入的方法，有2個代表的方法。
其中的第1個方法為，從作為治療對象的患者那里采取靶細胞后，將該細胞在體外，例如在白細胞介素-2(IL-2)等的添加下培養，導入被逆轉錄病毒載體包含的p51基因之后，將得到的細胞再移植的方法(ex vivo法)。該方法適合用于治療以欠缺ADA為首的，因欠缺基因而發生的基因病和癌癥、AIDS病等的治療。
第2個方法，是將目的基因(人p51基因)直接注入患者的體內或腫瘤組織等的靶部位的基因直接輸入法(直接法)。
上述基因治療的第1種方法，現詳細的說向如下那樣實施。即，將從患者處采取的單核細胞用血液分離裝置從單核細胞中分出，將取出的細胞在1L-2的存在下AIM-V培養地等的適當培養地里，培養72小時左右，加入含有應導入基因(人p51基因)的載體。為了加速基因的導入效率，在魚精蛋白存在的情況下，32℃1小時，2500轉離心分離后，在37℃ 10％二氧化碳氣條件下培養24小時也可以。將這種操作反復進行數次后，進而在1L-2存在下，AIM-Vt培養地里培養48小時，把細胞用生理鹽水里洗凈，算出生細胞數，基因導入效率，在上述的in situ PCR中例如，所希望的對象是酵素活性的話，根據測定他的活性程度來確認目的基因導入效果。
另外，對培養細胞中的細菌、真菌培養，枝原體感染的有無，內毒素檢索等的安全度進行檢查，確認安全性后，將導入予測效果用基因(人p51基因)的培養細胞點滴靜脈注射到患者身體里。此方法從數周到數月的間隔反復進行，以此來實施基因治療方法。
在這里病毒載體的投入量，根據導入靶細胞進行適當選擇。通常，作為病毒價，例如對于靶細胞1×108細胞希望采用1×103cfu到1×108cfu范圍的投入量為好。
作為上述方法的另一種方法，將含有目的基因(人p51基因)的逆轉錄病毒載體的病毒產生細胞和患者的細胞共同培養，向目標細胞里導入基因的方法。
當實施基因治療的第2種方法(直接法)的時，特別是根據在體外進行預備實驗，根據基因導入法，實際上，目的基因(人p51基因)是否被導入，要根據予先載體基因cDNA的PCR法的檢索和根據in situPCR法進行確認，或者基于目的基因(人p51基因)的導入所希望的治療效果的特異活性的上升或靶細胞的增殖增加或增殖抑制，來進行確認。另外，使用病毒載體時，是否用PCR法進行了增殖性逆轉錄病毒等的檢索、是否測定逆轉錄酶活性或根據用PCR法對膜蛋白(env)基因進行監控，由此來確認基因治療對基因輸入的安全性。這種重要性自不待言。
本發明的基因治療法中特別是以癌和腫瘤為對象時，從患者身上采取癌細胞后，進行酶處理等后，樹立培養細胞后，如用逆轉錄病毒，將所希望的基因導入到靶的癌細胞里，用G418細胞篩選之后，測定1L-12等的表達量，接著進行放射線處理，在患者腫瘤內或者腫瘤旁接種的癌治療法。
皰疹單體病毒胸苷激酶(HSV-Tk)基因是，特別是將是核苷酸類似物的鳥嘌呤(GCV)轉換為毒性中間體、引起分裂性細胞死亡，將該基因針對于腫瘤進行基因治療是公知的[美國專利等5631236號說明書；特表平9-504784號公報]。該方法注入編入被稱為自殺基因的前述HSV-TK基因的逆轉錄病毒載體產生細胞，一周后，投入作為抗病毒劑被人所知GCV時，在基因導入細胞內GCV接受磷酸化后，被活性化，導致基因導入細胞自殺，同時，通過間隙連接的細胞，使周圍的非導入細胞也被殺死了。就是這樣利用這些的基因治療方法。本發明的基因導入載體或者是含有該載體的細胞，也以用于上述的基因治療法。
作為別的基因治療法可以舉出，制作免疫核糖體，該核糖體含有結合了在靶細胞表面的抗體的基因，將包埋cDNA選擇地有效地導入到靶細胞里的方法。另外，將含有細胞因子基因病毒載體和含有自殺基因腺病毒同時投入的結合基因療法也是可能的。這些方法是在該領域的從業者應具有的水平。
(7)基因治療用醫藥組合物本發明另外還提供導入了本發明的基因用載體或者目的基因(人p52基因等)的細胞作為活性成分，把這些和醫學的有效量適當的無毒性醫藥載體或者稀釋劑共同作為醫藥組合物或者醫藥制劑(基因治療劑)。
本發明的醫藥組合物(醫藥制劑)作為能利用的醫藥載體，根據制劑的使用形態使用通常的填充劑、增量劑、結合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等的稀釋劑及賦形劑等。根據這些制劑的投入單位形態，可以進行適當的選擇。
作為本發明藥制劑的投入單位形態同樣可以舉出，如與前所述p51蛋白制劑相同的例子，根據治療目的，可以從各種形態進行適當地選擇。
例如，含有本發明的基因導入用載體醫藥制劑，可以調制成該載體被核糖體包埋在核糖體的形態或者調制成用含有所希望的基因的逆轉錄病毒載體的病毒感染的培養細胞的形態。
還可以調制成，磷酸緩沖生理食鹽液(PH7.4)，林格氏液，細胞內組成液用注射劑里配合的形態。另外還可以調制成和精蛋白等基因導入率很高的物質共同投入的形態。
上述醫藥制劑的給藥方法，沒有特別的限制，根據各種制劑形態，患者的年齡，性別及其他條件，患病的程度等而定。
上述醫藥制劑中，應含有的本發明的有效成分的量及給藥量無特別規定，根據所希望達到的治療效果，投入法，治療期間，患者的年齡，性別及其他條件，適當選擇適用的幅度。
一般來說，作為醫藥制劑所希望的基因含有逆轉錄病毒載體的投入量，每日體重1kg，例如作為逆轉錄病毒效價大約從1x103pfu到1x105pfu程度為好。
另外，導入有所希望的導入用基因的細胞時，從1x104細胞/body到1x105細胞/body的范圍中選擇的話為好。
該制劑也可以分1日1至數次給藥，也可以從1周及到數周的間隔來進行給藥。
另外，優選的是，也可以和魚精蛋白等提高基因導入效率高的物質及含有這些物質的制劑同時投入使用。
將本發明的基因治療適用于癌癥治療時，前邊已講述的各種基因治療方法可以適當地組合進行，前述的基因治療也可以和目前的癌癥化學療法，放射線療法，免疫療法等組合進行。進而本發明的基因治療包括它們的安全性，可以參考NIH的基準進行實施[RecombinantDNA Advisory Committee，Human Gene Therapy，4，365-389(1993)]。
(8)在腫瘤診斷方面的應用根據本發明，為了能夠檢驗出促使人的細胞的腫瘤形成的p51變異基因的存在。通過調制血液或血清的生物學類的試樣，萃取所希望的核酸，來分析p51敏感性變異基因是否存在。另外，根據本發明，為了能檢測出在細胞或者組織里的新生物，向惡性前驅的發展，或者予后指標的存在，可以調制有障礙的生物學的試樣，來分析p51新生物變異基因存在與否。使用這種方法就可以檢測出在細胞或者組織里新生物，惡性前驅障礙的進行，或者作為予后指標是否存在。這些診斷，如癌的診斷及癌治療效果的判定及予后的預測等都可以進行了。
該檢驗的方法例如予先從患有腫瘤患者那里取樣，得到關于p51變異基因的情況并以此為基礎，如根據p51基因的變異部位及它的變異序列情報，作成該變異DNA片段，設計成可以進行變異基因的篩選和/或可用于擴增那樣的形式。具體地講，作成可在噬斑雜交、菌落雜交、Northene印跡法、RNA印跡法等使用的探針、用PCR可以擴增變異DNA片段的探針。為此，首先要作成具有和變異相同序列的引物，作為篩選用探針使用，讓其和生物學的試樣(核酸試樣)相反應，可以確認含有該p51基因的變異序列的基因是否存在。該核酸試樣，為了能容易地檢測出靶序列，可以用變性、限制消化、電泳或者斑點印跡法等的種種方法進行調制。
作為前述的篩選方法，特別是用PCR法，靈敏度方面更好一些，該方法是只要p51變異片段作為引物使用，就沒有別的特別限制，以前為眾所周知的方法(science，230，1350-1354(1985))和新的被開發及將來要使用的PCR變法(木神、佳之等編，羊土社、實驗醫學，增刊，8(a)(1990)；蛋白質、核酸、酶、臨時增刊，共立出版(株)，35(17)(1990)]中的任何一種都可以利用。
作為引物使用的DNA片段，是化學合成的低聚DNA，這些低聚DNA合成是由自動DNA合成裝置如使用DNA合成裝置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus富馬西亞社制)而合成的。合成的引物(有義引物或反義引物)的長度約10～30核苷酸程度。上述作為篩選用的探針通常使用帶有標識的探針，沒有標識的也可以，用直接或間接的與標識的配位體的特異結合也可進行檢測。適當的標識以及標識探針及配位體方法等在本發明的技術領域里為人所公知，如用切口平移、隨機引物或激活酶處理的方法，編入的放射性標識、維生素H、熒光性基、酶、抗體等都被包含在這個技術里。
作為檢測用PCR法，如可以舉出PT-PCR法，可以適用于該領域的各種各樣的變法。
使用PCR法，可以測定野生型p51基因和/或變異p51基因的存在以及定量這些基因的DNA。該方法是如MSSA法的競爭定量法[Kiaoshita，M.et al.CCA，228，83-90(1994)]或者是作為伴隨著一根鏈DNA的高次構造變化的移動度，利用此變化而作成的突然變異檢驗法的PCR-SSCP法(Ohta，M.et al.Genomics，5，874-879(1989))。
在上述的分析法中，調制含有p51的變異(例如基于從癌癥患者那里得到的部位變異情報而制成的變異序列)1個及數個引物，與從生物學試樣得到的DNA雜交后、對PCR擴增片段和p51野生株DNA片段，用標準的SSCP解析法，測定得到的移動度及峰領域，與用前述的引物擴增的擴增產物的被檢試樣的移動度以及和峰領域的進行對比，由此可以同時進行特定領域變異和該變異產物的定量。
在前述中含有作為測定對象變異p51基因的被檢試樣，只要含有該基因的話就沒有特定限定，可以使用，例如可以舉出，血液、血清、尿、切除組織等的生體生物材料。變異p51基因從這些被檢測試樣中，可以按照通常作法萃取、精制及調制。
所以，關于作為本發明上述標準的DNA片段將予先測定的移動度與使用p51變異引物對的被檢試樣中的p51 DNA的PCR擴增工序里作為擴增產物的被檢試樣的移動度相比較，可以較簡單，良好地進行p51 DNA特定領域的變異的檢測。
進而，使用設定既知階段量的標準時，將其峰領域與以上述的方法的使用p51變異引物對的被檢測試樣中的p51 DNA的PCR擴增工序里，作為擴增產物的被檢試樣的峰領域，進行對比，可以同時進行被檢試樣中的p51變異的定量。在該方法中使用的引物對、標準、PCR-SSCP解析及其檢驗手段等的改變，這些對于在此領域里的從業者來說，是很容易得到的，只要使用野生p51基因及變異p51基因的序列，本發明理所當然的包括了這些改變。
關于本發明的測定方法，更詳細的舉例如下首先從患者血清里用堿、酸處理等通常的作法抽出DNA，在得到的DNA溶液里，將序列號為1的堿基序列(145-1488)的一部分的特定長度構成的負鏈部分序列，和將含有熒光標識的該堿基序列(145-1488)的一部分序列的特定長度構成的正鏈部分序列的引物對，讓其和具有耐熱性DNA聚合酶相作用來擴增標識了的DNA片段。另一方面，基于從患者處得到的p51部位變異情報，含有化學合成的變異序列1或由多數的DNA片段分別加入質粒載體上，對大腸桿菌形成轉換大量培養后，使用精制重組的質粒，制成如103拷貝、104拷貝、105拷貝、106拷貝、107拷貝及108拷貝的標準。在這里將含有上述的堿基序列(145-1488)的一部分的特定序列的負鏈部分序列、及含有熒光標識的堿基序列(145-1488)的一部分的特定序列的正鏈部分序列，將此二個序列的引物對，讓其和耐熱性DNA聚合酶作用來擴增被標識的DNA片段。把在前述中被擴增的DNA溶液在95℃，5分鐘左右的情況下加熱，直接在冰中冷卻，根據ALF自動序列儀(弗爾馬西亞社制)進行自動序列的SSCP分析，由此可以測出熒光峰。另外，該SSCP解析的泳動最好在大約30℃±10℃的情況下進行。
將從患者血清里得到的峰(移動度)和標準的峰(移動度)相比較，其泳動時間來確認和標準一致的峰，由此就可以判定出患者的p51的變異的類型(種類)。另外，算出標準的峰領域，由此作成標準曲線，從患者DNA中峰領域的計算值，可以進行該p51 DNA的定量。
(9)p51基因的變異檢驗法及各種測試法本發明提供了一種將被檢測試樣中的p51 DNA的特定領域的變異檢驗和其定量法能同時進行的簡單的檢測方法。
另外，本發明的測試方法，利用試劑盒，能簡單地測試出試樣中的野生型p51基因及變異p51基因。
故本發明還提供了能測試出含有上述野生型p51DNA片段及變異p51DNA片段為特征的野生型p51及變異p51的檢測用試劑盒。
該試劑盒，至少含有下列必須具備的構成成分序列號2所表示的堿基序列(145-1488)或者它的輔助的堿基序列的一部分或者全部的雜交的DNA片段、或堿基序列(145-1488)的變異序列或者它的變異序列相輔的堿基序列的一部或者全部雜交的DNA片段。其他的成分包括標識劑、PCR法所必需的試劑(例如，Tag DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸、引物等)。另外序列號5所標示的堿基序列(145-2067)可以代替上述序所標示的堿基序列(145-1488)。
作為標識劑，可以舉出放射性同位元素或者螢光物質等的化學修飾物質等。同時，DNA部分自身也可預先用該標識劑偶聯。還有該試劑盒為了能夠順利進行，也可含有反應稀釋液，標準抗體、緩沖液、洗凈液、反應停止液等。
另外，本發明還提供了用前述測試方法進行癌的診斷方法，及用用該方法的診斷劑及診斷用試劑盒。
另外，根據前述的方法，直接或間接地決定從被檢試樣得到的p51變異序列；由此可以發現和野生型p51相同性高的相同物新的p51基因，及與其相關連的基因。
因此，本發明也提供了一種由根據所測定和被檢試樣中的變異p51DNA的序列所決定，篩選被檢試樣中的人p51基因相關連的關連基因的方法。
另外，本發明通過序列號1所示的用人p51A基因編碼的蛋白質，或者在序列號1里的1個或數個乃至多數個氨基酸缺失，替換或者插入氨基酸序列，或者從這些片段合成蛋白、或者合成對該蛋白的抗體，來進行對野生型p51及/或者變異型p51的測試。另外也可以用序列號4所表示的人p51基因所編碼的蛋白質來代替上述人p51A基因所編碼的蛋白質。
因此，本發明提供了野生型p51及/或者變異型p51的抗體測試法、抗原測試法。根據該測試方法，可以基于野生型p51蛋白的變化來測試出新生物狀態的障礙程序或者惡性腫瘤的程度。所發生的變化，在本領域中，依照前述的慣用技術根據p51序列分析可以決定，但是更好的方法是用抗體(多克隆或單克隆抗體)來檢測出p51蛋白的差異及p51蛋白的有無。另外，本發明測定法的具體例，p51抗體是從人的血液·血清采取的生體材料，試樣含有液，從其中免疫沉降p51蛋白質，而且在聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質，印跡或免疫印跡上可與p51蛋白質反應。p51抗體可以用免疫組織化學的技術檢測出石臘或者凍結組織切片中的p51蛋白。抗體產生技術及精制技術在該領域為人所公知。這些技術也可以進行適當地選擇。
關于作為檢驗野生型p51或者其突然變異體的方法，更優選的具體例子包括使用單克隆抗體和/或多克隆抗體的層狀法的免疫吸附劑分析(ELISA)、放射線免疫檢測法(RIA)、免疫放射線檢定法(IRMA)及免疫法(IEMA)。
本發明可以提供相對p51蛋白具有p51結合活性的細胞膜成分或者存在在細胞表面上的p51受體。該p51受體的取得，是在含有細胞膜成分的生體材料試料中，使標識p51蛋白共軛，提出·單離、精制p51結合反應物、通過特定的單離物的氨基酸序列可以達到，該p51受體蛋白的取得及序列決定是本領域的生產者容易作到的。
(10)藥劑篩選的應用本發明是將p51受體多肽或其結合片段應用于各種藥劑的篩選技術中，可以利用篩選化合物(p51受體反應物化合物一般指低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分片段、抗原、或者抗體)。最好是利用p51受體。在相關篩選試驗中使用p51受體多肽或其片段，可在固體支撐體上附著該片段，或者運送在細胞表面的溶液中的游離物。作為藥劑篩選的一例，例如可利用表達多肽或其片段的重組多肽穩定地形質轉化為原核生物或真核生物宿主細胞，優選的在競爭結合試驗中可以利用。使游離或者固定形態的相關細胞應用在標準結合化驗中。更具體地說，測定p51受體多肽或其片段和試驗的物質間復合體的形成，根據p51受體多肽或其片段和p51多肽或其片段之間形成的復合體經過試驗的物質檢測阻害的程度，可以篩選化合物。
根據本發明的技術領域應知的方法，可以提供相關物質和p51受體多肽或其片段接觸，接著測定該物質和p51受體多肽或該片段之間的復合體存在，或者p51受體多肽或其片段和配位間的復合體的存在為特征的藥劑的篩選方法。首先，測定p51受體活性后，相關的物質能夠阻害p51受體、判斷上述被定義的p51的活性，例如能否調節細胞周期？或者可否誘導編程性細胞死亡。在相關的競爭結合試驗中，更具體的，是標識p51受體多肽或其片段。從蛋白質分離，該蛋白質是以蛋白質復合體存在的物質，游離(復合體術形成)標識的量成為對于各個試驗因子的p51受體的結合或者p51受體p51多肽結合的阻害的尺度。分析p51多肽的小的肽(肽模擬體)，可以測定具有p51受體阻害活性的物質。
在本發明中，藥劑篩選的其它方法是對于p51受體多肽具有適當結合親和性的化合物的篩選法，簡略地說，可以舉出在塑料針或者其它的物質的表面如同固體支撐體上合成多數的不同肽試驗化合物，接著肽試驗化合物與p51受體多肽反應，洗凈。然后用現有的方法檢測反應結合p51受體多肽的方法(PCT特開號WO84-03564號)。被精制的p51受體直接被復在使用上述的藥劑篩選技術的板上。對于多肽使用非-中和抗體、補足抗體，可以在固相上固定p51受體多肽。本發明是以競爭藥劑篩選試驗的使用作為目的，關于p51受體多肽或其片段的結合性，使可與p51受體多肽特異地結合的中和抗體與試驗化合物競爭。根據該抗體的得到的該競爭，p51受體多肽的1或具有該以上的抗原決定部位的任何肽的存在都可以檢測。
關于藥劑篩選，可舉出作為該種方法選擇含有非機能性p51基因的宿主真核細胞系或者細胞的使用。在藥劑化合物的存在下讓宿主細胞系或者細胞在一定期間增殖后，測定該宿主細胞的增殖速度，確認可否調節該化合物例如編程性細胞死亡和細胞周期。作為測定增殖速度1個手段也可以測定p51受體的生物活性。
本發明為了開發出更活性或者穩定形態的p51多肽誘導體，或者例如在活體內提高p51多肽的機能或者妨害藥劑，在它們相互作用為目的的生物學中，可以制作出活性的多肽或模擬構造，例如p51激動劑、p51拮抗藥、p51阻化劑等。上述構造模擬體，例如通過X線結晶學、計算機模擬試驗和這些組合方法可以決定p51和其它的蛋白復合體的三次元構造。再者，關于模擬構造的構造情報，可以根據相同蛋白質的構造為基準的蛋白質的模擬試驗得出。
作為由上述得到活性或穩定的形態的p51多肽誘導體的方法，例如，可以根據丙氨酸掃瞄分析。該方法用Ala置換氨基酸殘基，測定對于肽的活性的影響的方法，分析肽的各氨基酸殘基，決定該肽在活性和穩定性方面的重要領域的方法。該方法可以設計更活性的或者穩定的p51誘導體。
根據機能性化驗，分離選擇的靶一特異的抗體，接著可以解析該結晶構造。作為原則，根據此研究方法得到構成繼續設計藥劑的基本藥核芯(藥物母核)。通過生成在機能性藥理學中，對于活性抗體的獨特型抗體，從化學或者生物學生成的肽庫就可以鑒定或分離肽。故被選擇的肽也予測可作為藥核芯作用。
可以設計、開發具有被改善的p51活性或者穩定性或者p51活性的抑制劑、激動劑、拮抗藥等作用的藥劑。
根據克隆化p51序列，取得大量的p51多肽后，可以進行X線結晶學那樣的分析研究。進而本發明通過提供由序列號1的氨基酸序列構成的p51蛋白，不僅可用X線結晶學，而且還可以適應計算機模型技術。
本發明通過制成含有人類p51基因的缺痕小鼠(變異小鼠)，可以確認人p51基因序列在身體內哪個部位可否給予多樣的p51活性影響，即p51基因產物，并且改變p51基因產物在身體內具有的哪些機能。
該方法是利用基因的相同重組，有意地修飾生物基因情報的技術，可以例舉出使用小鼠的胚性干細胞(ES細胞)的方法(Capeccchi，M.r..，Science，244，1288-1292(1989))。
上述變異小鼠的制作方法，作為本領域的技術人員是通常的技術，該改變的技術(野出哲生編、試驗醫學，增刊，14(20)、(1996)、羊土社)，適應本發明的人野性型p51基因及變異p51基因，容易制作得到變異小鼠。即根據上述技術的應用，可以設計、開發具有作為被改善的p51活性、或者穩定性或者p51活性的抑制劑、激動劑、拮抗藥等作用的藥劑。
本發明含有以下的方法1.移動p51基因到在腫瘤細胞中，形成抑制腫瘤的方法。
2.移動p51蛋白到在腫瘤細胞中，形成抑制腫瘤的方法、3.含有p51基因或者同效物以及藥學中許可的載體的醫藥組合物。
4.含有p51蛋白或者同效物以及藥學中許可的載體的醫藥組合物。
5.具有有效成分的p51基因或者同效物的基因治療劑。
6.含有p51基因或者同效物的癌診斷劑。
7.含有p51蛋白或者同效物的癌診斷劑。
8.使用p51基因或者同效物的p51或者p53相關連的基因的篩選方法。
9.使用p51基因或者同效物篩選抑制細胞腫瘤形成的抑制作用物的方法。
10.使用p51基因或者同效物篩選p51基因的誘導以及/或者阻害物質的方法。
11.用上述篩選方法得到的p51基因的誘導以及/或者阻害物質對于p51基因表達異常引起的疾病治療的利用。
實施本發明的最佳形態以下詳細說明本發明的實施例及實驗例。但是本發明不受這些實施例以及實驗例的限制。實施例1 人p51基因的單離1.人p51基因的克隆以及DNA序列a.本發明者們使用P73-F1有義引物以及P73-R1反義引物進行PCR擴增，接著使用P73-F2有義引物以及P73-R2反義引物進行Nest增幅。
P73-F15′ -TA(CGT)GCA(CGT)AAA(G)ACA(CGT)TGC(T)CC-3′P73-R13′ -TGC(T)GCA(CGT)TGC(T)CCA(CGT)GGA(CGT)A(C)G-5′P73-F25′ -TA(CGT)ATA(CT)A(C)GA(CGT)GTA(CGT)GAA(G)GG-3′P73-R23′ -ATGAAC(T)A(C)GA(CGT)A(C)GA(CGT)CCA(CGT)AT-5′
具體地說，由人骨骼筋聚A+RNA(克隆社制)，使用隨機引物以及低聚dT引物合成cDNA，以λZipLox(基布克社制)作為載體構建的約107噬斑組成cDNA文庫被擴增，提取DNA。以cDNA0.2μg作為模板，使用上述引物-P73-F1及P73-R1，按照Tag聚合酶(基布克BRL社制)的說明書，在25周期94℃ 30秒、45℃ 30秒，72℃ 30秒地進行擴增，接著該100分之1作為模板，使用上述引物P73-F2及P73-R2，按照同樣地反應擴增。
從p53基因的結構得到推測的172bp的帶，制作該帶的限制性內切酶地圖時，判明存在p53基因以外的基因。在PGEM7里(Promega社制)亞克隆該帶域、使用ABI377自動序列儀(ABI社制)，按照常法決定堿序列時，盡管類似p53基因的基因，但是來自具有不同的新規堿序列的新規基因的DNA片段。
其它的途徑，由其它的臟器(腦等)來的cDNA文庫進行同樣的解析時，來自類似個別的p53基因的新規基因的DNA片段被檢測出來，這是由p73基因產生的。
切出被亞克隆的DNA片段，使用BcaBest labeling kit(寶酒制造)制成標識探針。只是使用低聚dt引物，除此之外與上述cDNA文庫同樣構建的未擴增的文庫2.4×106的噬斑，通過噬斑雜交篩選的結果，得到8個陽性克隆。λZipLox使用Cre-LoxP系、可以容易地變換成質粒，使用LICOR社的自動序列儀和AB1377自動序列儀(ABI社)，按照常法決定變換質粒的堿序列。
對于得到的基因的堿序列和p53基因以及p73基因的堿配列相同性，使用GCG軟件(維斯可辛·序列分析包裝遺傳·計算機·組制)用的FASTA程序(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl，Acad，Sci，U.SA.，85，1435-1441(1988))，進行探索。
關于相同性檢索的結果發現用上述的方法選擇，決定堿基序列的克隆中的2個發現具有p53基因及p73基因的高相同性。用這些具有二個克隆基因的序列編碼的氨基酸推定分子量時，分別為50，894Da及約71，900Da。本發明者分別以p51A及p51B命名這些克隆。
上述得到的p51A克隆具有基因(p51A的基因)的整個堿基序列表示在序列號2、p51B克隆具有基因(p51B的基因)的整個堿基序列表示在序列號5。
p51A純系具有序列號2所示那樣的，編碼序列號1所示的氨基酸序列(448氨基酸)的堿基序列(1344核苷酸)、作為開放讀框具有145-1488位的基因。通過由克隆具有的基因的堿序列，而編碼的推定氨基酸序列中，復制活性化領域是1～59位、DNA結合領域是142～321位及低聚化域是359-397位。
p51B克隆如序列號5所示，編碼序列號4所示的氨基酸序列(641氨基酸)的堿基序列(1923核苷酸)、作為開放讀框具有145-2067位的基因。通過克隆基因具有的堿基序列編碼推定氨基酸序列中，復制活性化領域是1～59位、DNA結合領域是142～321位及低聚化域是359-397位，這些是在C末端側的領域中具有付加的序列(SAM結構域)，把含有該付加的序列353-641位的領域，可以作為廣義的低聚化域。
用本發明的p51A基因被脊髓(編碼)的氨基酸序列與p53蛋白以及p73β蛋白的氨基酸序列比較，調查了三者件的相同性(圖2)。在圖中三者間同一的氨基酸，用方框圍起來。
在圖1中圖解地表示p51A蛋白的構造的結構域特征，和p53蛋白以及p73β蛋白。在圖中[TA]表示復制活性化領域、DNA binding表示DNA結合領域、oligo表示低聚化域。此外p51蛋白和p73β蛋白的構造特征可從p53蛋白的構造特征推測出。
這些的結果，在全序列、復制活性化領域、DNA結合領域以及低聚化域中，各p51A蛋白、p53蛋白以及p73β蛋白的推定氨基酸序列的相同性，在p51A蛋白及p53蛋白間分別為36％、22％、60％、37％；在p51A蛋白及p73蛋白間蛋白間分別為42％、30％、87％、65％；在p53蛋白及p73蛋白間分別為28％、27％、63％、83％(參閱表1)。
p51A蛋白的448氨基酸殘基比p73α蛋白的636氨基酸殘基短、但p51A蛋白的全構造的p73的羧基末端部位的割裂部分類似。
從這些結果中，判斷p51A蛋白的推定氨基酸序列與p53蛋白及p73β蛋白的任何一種都類似，但是比起p53蛋白的氨基酸序列與p73β蛋白的氨基酸序列相同性高，另外p51A蛋白和p73β蛋白的相同性在低聚化域以外的領域，要比p53蛋白和p73β蛋白的相同性高。進而在p51A蛋白和p73β蛋白間或p53蛋白和p73β蛋白間或p53蛋白和p51A蛋白間即使沒有相同性領域，也可看到相同性。從以上所述，可以說p51A蛋白在氨基酸配列水準中，比起p53蛋白p73β蛋白近似。
同樣用本發明的p51B基因編碼的氨基酸序列與p73α蛋白的氨基酸序列比較，調查了二者間的相同性(圖3)。如圖所示，二者間相同的氨基酸用方框圍起來。
在圖4中，表示了用p51(A及B)基因編碼的剪接變異體的構造的結構域特征和p73蛋白(α及β)。
p51A蛋白和p51B蛋白的分支點在內含子10開始，而p73α蛋白和p73β蛋白的分支點在內含子13開始。實施例2在正常人組織里p51 mRNA表達的確認(1)Northen印跡分析在正常人組織里p51mRNA的表達根據隨機低聚核苷酸剪接法標識的人cDNA克隆作為探針的Northen印跡法評價的。
Northen印跡分析，按照產品使用法，使用人MTN印跡(HumanMultiple No-them blot；克隆社制、帕羅阿爾特、加里弗尼亞、美國)進行實施。
即在實施例1中得到的DNA克隆的PCR擴增產物的EcoRI片段(與600bpcDNA的5’端相當)，用[32p]-dCTP(隨機引物DNA標識盒、貝材卡-漢姆社)標識后，作為探針。
另外，印跡是使用ExpressHyb Hybridization Solution(克隆社制)，按照使用說明書中記載的條件進行，使用BAS2000(FUJI)檢測出的。
結果如圖5及圖6所示。
圖5是由克隆社購入的過濾器進行Northen雜交，圖6是由克隆社購入RNA自己制作過濾器進行Northen雜交的結果。圖5各泳道2μg聚A+RNA、圖6各泳道附加0.5μg的聚A+RNA后泳動的結果。
圖5分別表示各泳道、心臟1、腦2、胎盤3、肺4、肝臟5、骨骼筋6、脾臟7、胰臟8的結果。圖6的各泳道表示乳腺1、前列腺2、唾液腺3、胃4、胸腺5、甲狀腺6、氣管7、子宮8的結果。
該結果，被命名人p51基因的本發明的基因mRNA(4.4kb)的表達，與各處發現的p53mRNA的表達圖形對照，莫如是一種限定，在骨骼筋里最高表達，接著是胎盤、氣管、乳腺、前列腺、唾液腺、胸腺、子宮、胃、肺、腦以及心臟順次表達著。在其他組織(例如腎腺、小腸、脊髓、脾)中，沒有檢出p51 mRNA的表達。
P73基因的表達也是組織限定。雖然p51基因的表達與p73基因的表達是重復的基因(在相同組織被表達)，我們還是知道p51基因比p73基因在更廣泛范圍被表達。
這樣的人p51基因、p53基因及p73基因在組織分布上有差異，盡管這些基因有類似生物活性，但是在生體內按相應的組織也可能有不同的功能。
根據進一步的研究了解到各種人組織中p51mRNA上存在著與p73蛋白相同的、編碼p51蛋白短型和編碼p51蛋白長型的、選擇剪接的形態(可變剪接變異)。編碼后者p51B長型的，是與舌的谷氨基酸受體的檢索上突然發現的被稱為ket具有相同性。骨骼筋中的主要復制物的3kbRNA是調查全組織內觀察最多的mRNA。可能短型的cDNA克隆是來自此復制物。有趣的是用正常組織觀察的mRNA，相對照地，在很多的腫瘤細胞系中此短型的p51mRNA表達著。
p51蛋白和p73蛋白的可剪接變異體的結構比較表示在圖4中，其p51B的mRNA是編碼與p73α類似分布量的蛋白質。
對于p51A及p51B兩者間功能的區別，目前尚不明。實施例3 p51基因的染色體作圖使用放射混合盤(Gene Bridge 4R Radiation Hybrid Panel；ResenrchGenetics社)將p51基因布列在人染色體上。其結果p51基因，存在于標記AFBM327 YD9和WI-1189間(距前者標記，5.66CR)、3q 28-ter。實施例4各種人癌細胞株和人腫瘤中的p51變異對于p51基因最有興趣的是該p53基因所具有的特征，p51基因是否有、或者該基因的變異和人腫瘤的形成關系。
因此，使用各種腫瘤細胞株，檢索p51基因是否有變異。另外，檢索的方法，使用以前本發明者決定p51變異時使用的酶母的獨立列陣體的功能分析法(FASAY)(1Shioka et al.，Nat.Genet.5，124-129(1933))。
涉及編碼人51A基因的全系列的相輔DNA片段，用以前使用的PCR擴增，取得覆蓋編碼p51A基因全序列的擴增片段的堿基序列，通過直接序列確定法決定此堿基序列，檢測有無變異。
腫瘤細胞在5％二氧化碳的條件下，添加10％牛胎兒血清的Dulbecco修飾培養基(Dulbecco’s Modified Essential Media)中培養。p51A cDNA的所有的可以擴增p53cDNA，所以，可以保證細胞株的cDNA質量。
從102的細胞株分析的67株可能是p51ADNA的片段的擴增。其中的35株，可直接用序列確定法確定堿基序列。
可以確認頭頸部的癌細胞株的ho-1-u-1(JCRB 0828)和頸部癌細胞株的SKG-Ⅲa(JCRB 0611)二個細胞株中看到變異。
前者是從ser145來的leu的變異，后者是從GIn165來的leu的變異。關于p53蛋白前者是變異型，后者是通過人乳突瘤病毒的感染而失去p53蛋白的正常功能的。另外，來自腫瘤細胞的mRNA存在著各種的剪接變異體。
關于人的原發腫瘤，對用SSCP法及RT-PCR法得到的DNA擴增產物的堿基序列，按照直接堿基序列確定法決定，檢索p51A基因變異。在neuroblastoma 8例、colon cancer 8例、breast cancer 8例、lungcancer 8例、brain tumor 8例、esophageal cancer 8例、hepatocellular cancer8例、pancreas cancer 6例、renal cancer 4例的66例的人腫瘤中從肺癌1例檢測出從Ala 148向Pro的變異。
這些3例的解析都是cDNAd的解析，從單一的染色對座發現的。實驗例1抑制用p51轉化的菌落形成
p53蛋白具有嵌入GI期內細胞的、或誘導編程性細胞死亡能力。
本發明的p51蛋白，為了調查抑制菌落的形成能力，在SAOS2的骨肉腫瘤細胞(寄存號ATCC HTB85)中，與嘌呤霉素抗性的表達質粒一起(pBABEpuroMorgenstern J.Nuc.Acids Ru，18，3587，1990)轉化p51A表達構建、p51A的HA標識的構建(HA標識-ATGTATCCATA-TGATGTTCCAGATTATGCT酸序列MYPYDVPDYA)、p53表達構建及載體，調查菌落形成能。
表達的載體可以通過克隆以下片段構建即p51A DNA的編碼領域片段(2816堿基、序列號2中堿基號1～2810、上述p51A cDNA付與標記的片段及p53 cDNA的編碼領域片段(1698堿基、鹽基號62～1760)。接著將骨肉腫瘤細胞株的SAOS2細胞在5％二氧化碳的條件下在添加牛胎血清的Dulbecco’s修飾的培養基中培養，將上述SAOS2散布在6cm皿上(1×106細胞/皿)。24小時后用含有p51 cDNA鏈的野生型p51表達載體(pRC MV/p51A)進行轉化。同樣地在p51AcDNA上，僅轉化成帶有HA標記的HA p51A及野生型p53基因以及作為對照物的pRC CWVD表達載體。
使用Mammalian transfection kit(stratagene社)將1μg的pBABEpuro導入細胞。將得到的細胞固定，用結晶生物紅進行染色。對于染色的細胞菌落進行照相。各轉化分別進行二次，分析這樣得到的菌落。
其結果菌落明顯地減少，在用p53基因及p51基因轉化的細胞培養皿內觀察到，與其對稱的只是載體構建的細胞培養皿內可以培育很多的菌落，對于這樣的p51基因，可以確認其控制形成菌落的能力，但是比p53基因的能力要差。另一方面，附有HA標記的p51基因具有與p53基因相同的菌落控制能力(圖7)。實驗例2 p51蛋白的復制活性化功能試驗對于GI期內細胞的阻止或編程性細胞死亡的誘導的p53蛋白的能力是依存p53蛋白的復制活性化功能，所以對于p51蛋白試驗其是否發揮活性。
通過p53復制活性化功能，可調節的WafⅠ啟動字和RGC(ribosomalgene cluster)序列下游，按照實施例5的方法與魯西酶·報導·質粒一起將p51A基因的表達構建體導入，具體的是將SAOS2細胞與上述的魯西報導質粒和p51A表達載體、p53表達載體或控制載體任何一種一起共轉化，對從轉化體得到的裂解物測定蟲熒光素酶。使用雙向蟲熒光素酶報導測定系統(普羅木家公司制)算出轉換效率。
圖8中表示用于實驗的報導構建物。在該圖中，在各種的p21WAF1起動子的下流調節的3個熒光反射酶基因構建物被表示出來。圖中[WAF-1 promoter1uc]、表示殘留兩個p53調節元件的野生型p21WAF1起動子構建物，[delⅠ]表示一個上流的元件被去除的構建物，及[del 2]表示除去兩個元件的構建物，其結果分別表示在圖9及圖10中。縱軸的Relative activity是使用雙向的蟲熒光素酶報導測定系統，考慮轉化效率換算成的蟲熒光素酶活性。
圖9、表示圖8所示的具有各種的報導構建體的各p51表達質粒(p51A)、p53表達質粒(p53)或載體(Rc/CMV)分別導入到SAOS2細胞中的轉化活性。其結果，在p51蛋白中表示了具有與p53蛋白相同的可誘導依存反應性序列數的表達活性。
圖10中，使用p53反應性實驗地所示的PGC報導構建體，表示用報導該構建體所具有的p51A表達質粒(p51A)、p51A中HA標記的表達質粒(HA p51A)、p53表達質粒(p53)或載體(RcCMV)進行同樣的實驗結果。其結果如圖9所示結果相同，p51A及HA p51A都是具有p53相同的誘導p53反應性序列的數依存的表達活性。使用p51A反應質粒時活性弱，可以推定因為在加有leader sequence下組入表達載體內，其表達量是少的。
而后的實驗中，在缺少leader sequence時，p51A蛋白是具有比p53蛋白更強的誘導功能，從上述的菌落形成的抑制能的點上看也具有強烈的活性。
上述的結果教導我們，p51蛋白，通過其復制調節領域可以保存誘導復制的能力。通過該元件中的變異誘導，復制活性消失，所以p51蛋白也利用了與p53蛋白相同的認識序列。
以下這種復制關系可以說是在體內進行的嗎？加以確認。將具有HA付加抗原表位的p51A基因的發達構建體，短期導入到SAOS2細胞中。細胞吸取了p51基因后p51存在該核內，這些細胞所有都可以使p21 Waf1的含量上升，這件事教導我們可以誘導由p51蛋白或者p53蛋白所控制的公知的p21 Waf1。實施例3初生腫瘤的p51基因的變異p51的基因變異是以66名患者的初生癌細胞(8名神經芽腫、8名大腸癌、8名乳腺癌、8名肺癌、8名腦腫瘤、8名食道癌、8名肝細胞癌、8名胰腺癌及4名的腎癌)為對象，使用逆轉錄-PCR一根鏈結構的多態法(RT-PCR-SSCP)及DNA序列決定法進行調查。
(1)RNA的配制用外科方法摘除新鮮的腫瘤樣品后立即凍結，在使用之前保持-80℃。RNA按照中川等的文獻記載(Nakagawa，A.，et al.，N.Engl.J.Med.，328，847-854(1993))進行提取。
(2)RT-PCR-SSCP及DNA序列的決定使用Superscript Ⅱ逆轉錄酶(BRL社制)和隨機的引物，將全RNA的5μg復制到cDNA上。為了PCR擴增，使用cDNA的第20個的一個cDNA。PCR-SSCP按增山等方法(Mashiyama S.et al.，Oncogene，6，1313-1318(1991))進行實施。更具體的是對于p51A cDNA用三個引物擴增PCR。
以下表示用于PCR的引物堿基序列p51-F1 5’-AAAGAAAGTTATTACCGATG-3’p51-R1 5’-CGCGTGGTCTGTGTTATAGG-3’p51-F2 5’-CATGGACCAGCAGATTCAGA-3’p51-R2 5’-CATCACCTTGATCTGGATG-3’p51-F3 5’-CCACCTGGACGTATTCCACT-3’p51-R3 5’-TGGCTCATAAGGTACCAG-3’p51-F4 5’-CATGAGCTGAGCCGTGAAT-3’p51-R4 5’-TATCTTCATCCGCCTTCCTG-3’p51-F5 5’-ATGAACCGCCGTCCAATT-3’p51-R5 5’-GTGCTGAGGAAGGTACTGCA-3’p51-F6 5’-TGAAGATCAAAGAGTCCCTG-3’p51-R6 5’-CTAGTGGCTTTGTGCCTTTG-3’接著，用加樣緩沖液將32PdCTP中稀釋到1∶10。進而在98℃下變性5分鐘，在室溫下，用200伏，用5％丙三醇和5％的聚丙烯酸凝膠分離12小時到14小時，電泳后膠體干燥，X線膜曝光一晚直到可以具體地看到移動帶。為了確定變異的存在和不存在，將PCR產物在pGEM-T(容易型載體)(普羅麥加)中亞客隆使用ABI377DNA用序列器決定序列。
其結果，在高度分化的扁平上皮細胞癌系統的肺癌的組織中，可以看到p51A的推定DNA結合領域是在氨基酸替換點變異(148位的Ala替換Pro)，其腫瘤表示上述氣管的淋巴轉移和胸膜的浸潤。任意的選擇5個克隆都是具有相同的變異，這種腫瘤細胞所具有的p51基因教導我們可能屬于單一對立性基因或者單一對立基因表達的產物。實施例4 p51 cDNA導入編程細胞死亡的誘導作用p51蛋白與p53蛋白相同地進行誘導細胞的編程性細胞死亡的情況進行檢索。
p51蛋白的編程性細胞死亡的試驗，與上述本發明的方法相同，也就是在32℃培養細胞株時，按照使用轉化小鼠紅血病細胞株(1-2-3細胞株)的方法進行(Kato，M.V.，al.，Int.J.Oncol.，9，269(1996))。
此外，小鼠紅白血病細胞株(1-2-3細胞株)中、只是發現了[Friendspleen focus forming virus gp55遺傳----[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-29l(1995)；Karo et al.，Int.J.Oncol.9269-277]溫度感受性，變異p53蛋白的(Alal 353 Val點變異)的細胞株。該ts-變異p53蛋白用通常的培養溫度，即37度保留在細胞質內，p53分子核內是否發揮了所有控制機能，可是在32℃，移到核內誘導p53的活性[Levine，A.J.etal.，Nature 351453-456(1991)]。此細胞株，在32℃時可緩慢地誘導編程性細胞死亡。
在5％CO2條件下，10％添加小牛胎血清RPMI的1640培養基中培養1-2-3細胞。接著以PRC/CMV作為表達載體將p51A基因導入該細胞，在選擇培養基下培養根據新霉素耐性選擇(Neo)，選擇G418耐性細胞，對表達p51A細胞的編程性細胞死亡進行探討。
即導入用含有p51A基因的表達載體(pRCCMV/p51A)轉化的兩個p51A導入1-2的細胞(以下稱ICI細胞及4BI細胞)，及作為對照的載體，將不含有p51A基因的1-2-3細胞以1×105/ml濃度種植在10cm的直徑板上，在37度和32度兩個條件下，培養24小時后回收細胞。用ProteinaseK及R NaseA處理該細胞作為DNA樣品，將得到的DNA樣品，進行瓊脂電泳。其溴化乙錠染色像表示在圖11中。
從圖中可以看出，在37℃培養下，是不能檢測1-2-3細胞的DNA片段(泳道Ⅰ)，可是對于導入了p51基因的ICI細胞及4B1細胞，是可以檢測出180bp低聚物的DNA片段(泳道2及3)。
在32℃培養下，可以檢測出1-2-3的DNA片段的同時(泳道4)，可以促進用ICI細胞及4B1細胞的DNA片段化(泳道5及6)。其結果是與如以下所述的編程性細胞死亡的觀察結果及p51導入的細胞繁殖抑制的結果是相一致的。
細胞的編程細胞死亡形態的變化是否存在，通過各將細胞固定在玻璃滑片上用吉姆隆進行染色后用顯微鏡觀察細胞形態及染色程度。此外，細胞的生存數可用錐蟲藍進行染色后，求出細胞生存的計數。
其結果，32℃培養的細胞，在細胞的表面上有突起物，呈現收縮、形變或腰細的形態。另外，吉姆隆染色細胞標本中該核膜的周圍或細胞內的某處有染色質凝縮。
另一方面，對于37℃培養的細胞沒有觀察這種變化。
32℃培養24小時后，由于編程性細胞死亡的細胞和細胞周期繼續繁殖的細胞混合在一起，p51表達細胞的24小時后的細胞數是105/ml，1-2-3細胞的細胞數是1.7×105/ml。
從以上可以看出溫度32℃處理下的含有p51基因的細胞，在p53共同可以引起急劇的編程性細胞死亡。這種事情也說明p51蛋白與p53蛋白相同具有明顯地誘導編程細胞死亡。實施例5作成人p51B蛋白的C末端領域(氨基酸序列的570～641位的領域)的特異抗體，進行人細胞的免疫染色。
即將人p51B DNA的該編碼領域(堿基序列1851-206位領域)連接在GST融合蛋白表達載體PGEX-1λT(弗馬西亞社)用大腸菌合成融合蛋白。使用融合蛋白按照常規方法，使用BALB/C小鼠配置抗血清(多克隆抗體)，用GST蛋白吸收得到p51B蛋白的C末端領域的特異抗體。
將上述的抗體與人皮膚組織凍結切片進行第一次反應，接著將熒光標記山羊抗小鼠IgG抗體進行第二次反應。
其結果該抗體對人皮膚的棘細胞層到基底層的細胞核特異地進行染色。這種特異性通過上述融合蛋白進行處理，使反應消失，而用GST蛋白處理這種反應是不能消失的。產業上的可利用性本發明的基因是相當于作為腫瘤抑制基因所公知的p53基因相關的基因。用這些基因，可以解析各細胞的表達水平和功能，或通過表達物的解析等，能夠解明、診斷、治療與這些有關的疾病(例如惡性腫瘤等)。
本發明基因與神經系發現的p73對比，可以表達腺組織(前列腺、乳腺)、肌肉組織及胸腺等的免疫系，可能涉及到這些的異常，對于這些控制物質的開發是有貢獻的。
按照本發明，提供了作為細胞增殖抑制基因，有用的新p51基因。本發明的新基因具有與編碼p53蛋白或p73蛋白基因的類似性。為此，可以利用于解析這些相關基因的功能和這些疾病相關疾病的研究，可以用于對各種疾病的基因診斷及該基因的醫藥用途的應用研究。另外，通過利用本發明的基因，可以調查各種人組織的該基因表達情況，可以解析人體內的該功能。
另外，通過該基因，可以用遺傳工學大量地制造編碼該基因的人p51蛋白。即，通過提供本發明的基因將基因及基因片段組入載體，制造重組體人p51蛋白，可以探查p51蛋白活性和p51蛋白的結合活性等的結合功能。
另外，p51蛋白可利用于p51基因及其產物相關聯的疾病(例如，細胞的復制活性相關的和細胞編程性死亡的各種疾病，特別是癌)的病態解析、治療等。
p51蛋白與p53具有同樣的生理學作用或功能，例如產生病毒的感染、細胞因子的刺激、低氧狀態、核苷酸庫的變化、藥物異常代謝的各種應激所涉及的組織和、與其他的蛋白質的相互作用的信號傳遞和其他基因的轉錄控制等的功能，調節接受生體應激生體組織細胞的DNA的復制，使細胞的周期停止，修復細胞，排除由于編程性細胞死亡的細胞或促進細胞分化，可以防御生體從應激狀態下緩解。
按照本發明，可以提供含有人p51基因或其等位體的基因治療有用的導入基因載體，該p51基因或導入其等位體的細胞及以載體或細胞作為有效成分的基因治療劑及利用他的治療方法。
按照本發明可以提供有各種癌細胞的成長抑制作用，使用在由于該作用的各種癌的疾病及病態的處置的以p51蛋白作為有效成分的醫藥。
人p51基因和小鼠的該基因的功能領域顯示了在TA領域的3個氨基酸以外的所有相同，高度的保存性，其重要性(兩者的堿基的序列的對比表示在圖12～14及圖15)。
序列表<110>Ikawa,YojiOtsuka Pharmaceutical Co.Ltd.<120>人p51基因及其基因產物<130>P99-16<140><141><150>JP P1998-100467<151>1998-03-27<160>23<170>patentln Ver. 2.0<210>1<211>448<212>PRT<213>人類<220><221>域<222>(1)..(59)<223>反式激活域<220><221>DNA結合<222>(142)..(321)<223>DNA結合域<220><221>域<222>(353)..(397)<223>低聚化域<400>1Met Ser Gln Ser Thr Gln Thr Asn Glu Phe Leu Ser Pro Glu Val Phe1 5 10 15Gln His Ile Trp Asp Phe Leu Glu Gln Pro Ile Cys Ser Val Gln Pro20 25 30Ile Asp Leu Asn Phe Vat Asp Glu Pro Ser Glu Asp Gly Ala Thr Asn35 40 45Lys Ile Glu Ile Ser Met Asp Cys Ile Arg Met Gln Asp Ser Asp Leu50 55 60Ser Asp Pro Met Trp Pro Gln Tyr Thr Asn Leu Gly Leu Leu Asn Ser65 70 75 80Met Asp Gln Gln Ile Gln Asn Gly Ser Ser Ser Thr Ser Pro Tyr Asn85 90 95Thr Asp His Ala Gln Asn Ser Val Thr Ala Pro Ser Pro Tyr Ala Gln100 105 110Pro Ser Ser Thr Phe Asp Ala Leu Ser Pro Ser Pro Ala Ile Pro Ser115 120 125Asn Thr Asp Tyr Pro Gly Pro His Ser Phe Asp Val Ser Phe Gln Gln130 135 140Ser Ser Thr Ala Lys Ser Ala Thr Trp Thr Tyr Ser 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ctc atg cag tac ctt cct cag cac aca att 1323Ile Lys Glu Ser Leu Glu Leu Met Gln Tyr Leu Pro Gln His Thr Ile380 385 390gaa acg tac agg caa cag caa cag cag cag cac cag cac tta ctt cag 1371Glu Thr Tyr Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Gln His Leu Leu Gln395 400 405aaa cag acc tca ata cag tct cca tct tca tat ggt aac agc tcc cca 1419Lys Gln Thr Ser Ile Gln Ser Pro Ser Ser Tyr Gly Asn Ser Set Pro410 415 420 425cct ctg aac aaa atg aac agc atg aac aag ctg cct tct gtg agc cag 1467Pro Leu Asn Lys Met Asn Ser Met Asn Lys Leu Pro Ser Val Ser Gln430 435 440ctt atc aac cct cag cag cgc aac gcc ctc act cct aca acc att cct 1515Leu Ile Asn Pro Gln Gln Arg Asn Ala Leu Thr Pro Thr Thr Ile Pro445 450 455gat ggc atg gga gcc aac att ccc atg atg ggc acc cac atg cca atg 1563Asp Gly Met Gly Ala Asn Ile Pro Met Met Gly Thr His Met Pro Met460 465 470gct gga gac atg aat gga ctc agc ccc acc cag gca ctc cct ccc cca 1611Ala Gly Asp Met Asn Gly Leu Ser Pro Thr Gln Ala Leu Pro Pro Pro475 480 485ctc tcc atg cca tcc acc 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29<210>11<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述HA標識的構建<400>11atgtatccat atgatgttcc agattatgct30<210>12<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F1有義引物<400>12aaagaaagtt attaccgatg 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R1反義引物<400>13cgcgtggtct gtgttatagg20<210>14<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F2有義引物<400>14catggaccag cagattcaga 20<210>15<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R2反義引物<400>15catcaccttg atctggatg 19<210>16<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F3有義引物<400>16ccacctggac gtattccact 20<210>17<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R3反義引物<400>17tggctcataa ggtaccag 18<210>18<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F4有義引物<400>18catgagctga gccgtgaat 19<210>19<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R4反義引物<400>19tatcttcatc cgccttcctg20<210>20<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F5有義引物<400>20atgaaccgcc gtccaatt 18<210>21<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R5反義引物<400>21gtgctgagga aggtactaca 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-F6有義引物<400>22tgaagatcaa agagtccctg20<210>23<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述p51-R6反義引物<400>23ctagtggctt tgtgcctttg 20
權利要求
1．編碼以下(a)或(b)的蛋白質的基因，(a)具有序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質，(b)具有序列號1的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、替換或插入的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質，
2．具有以下(a)或(b)的DNA的基因，(a)序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA，(b)序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488的堿基序列構成的DNA，而且能與編碼p51活性蛋白質的DNA在嚴謹條件下雜交。
3．權利要求2所述的基因，其具有序列號2所表示的堿基序列。
4．具有以下(a)或(b)的DNA的cDNA，(a)序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488所示的堿基序列構成的DNA，(b)序列號2表示的堿基序列中，由堿基號145～1488的堿基序列構成的DNA雜交，而且能與編碼p51活性蛋白質的DNA在嚴謹條件下雜交。
5．一種DNA，其特征是在嚴謹的條件下能與具有序列號2表示的堿基序列雜交。
6．一種DNA，其特征是在嚴謹的條件下能與具有堿基號145～1488所示的堿基序列進行雜交。
7．權利要求5所述的DNA，其特征是作為引物被使用。
8．權利要求5所述的DNA，其特征是作為探針被使用。
9．(a)或(b)表示的蛋白質，(a)具有序列號1表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)具有序列號1表示的氨基酸中缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質。
10．權利要求9所述的蛋白質，其所具有的氨基酸序列至少是以氨基酸號1～59、氨基酸號142～321及氨基酸號359～397表示的。
11．具有序列號1所示氨基酸序列的多肽，該多肽至少具有一種從復制活性功能、DNA結合功能及低聚化功能選擇出的功能。
12．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號1中，具有從氨基酸號1～59表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有復制功能的多肽。
13．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號1中，具有以氨基酸號142～321表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有復制功能的多肽。
14．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號1中，具有以氨基酸號359～397表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸中具有缺失、替換或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
15．一種基因，其編碼權利要求12～13任何一項所述的多肽。
16．一種載體，其含有權利要求1的基因。
17．一種宿主細胞，其是用權利要求16所述的載體轉化的。
18．權利要求10所述的蛋白質的制造方法，其特征是在培養基中培養權利要求17所述的宿主細胞，再從得到的培養物中回收蛋白質。
全文摘要
本發明的目的是提供包含有作為細胞繁殖基因所公知的p53基因所關聯的家族基因、新的人基因及其基因產物。本發明是以編碼序列號1所示的氨基酸序列為特征的人p51基因,在序列號2中具有表示堿基序列號145—1488的人p51基因、具有該基因的載體,用該載體轉化的宿主細胞、培養該宿主細胞,從得到的培養物回收具有序列號1所示的氨基酸序列p51蛋白的制造方法及序列號1所示的氨基酸序列p51蛋白。
文檔編號A61K48/00GK1295615SQ99804565
公開日2001年5月16日 申請日期1999年3月24日 優先權日1998年3月27日
發明者井川洋二, 井川俊太郎, 帶刀益夫 申請人:大塚制藥株式會社, 井川洋二