專利名稱：用鳶尾科和總狀花升麻的提取物和鳶尾黃素作為雌激素型對器官有選擇性而無趨子宮作 ...的制作方法
器官有選擇性而無趨子宮作用的藥物本發明是涉及鳶尾科(Iridaceae)提取物的用處(如權利要求1所述)和總狀花升麻(Cimicifuga racemosa)的提取物和鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷(如權利要求8所述)作為雌激素型對器官有選擇性的藥物。
形成于卵巢的17-β-雌二醇(以后提到的雌二醇都是指生理學上的17-β-雌二醇)[以后同樣也以E2表示]一般對該器官有促進增殖作用。除可以控制女性(月經)周期外，在其缺乏的時，它對骨骼的新陳代謝有內環境穩定的影響，也防止血管內皮的動脈粥樣斑塊形成。
在絕經期，由于卵巢功能的停止，雌二醇的水平下降。這將減弱增殖的過程，對于下丘腦則將造成促性腺素釋放激素(GnRH)脈沖發生器活動的增強。(促性腺激素釋放激素脈沖發生器是位于下丘腦的定時器，它也是黃體生成素(LH)的定時器，定時脈沖式的，LH分泌和甾族化合物影響其分泌的量幅和頻率。)對于更年期的婦女，其結果是被刺激的LH分泌將造成所謂的“熱潮紅(hot flush)”，即易發怒。
由于血液中雌二醇未達足夠高的水平，破骨細胞的活動和骨骼組織破裂占優勢地位，伴隨骨骼破裂，折斷危險的增高。同時，也有很長一段時間將經歷血管系統中粥樣斑塊形成的危險和由此增加的梗塞形成的風險。
總狀花升麻和射干的提取物兩者都已知是普通藥物，能用于圍減輕絕經期及絕經后的功能紊亂。迄今為止，通過事實的驗證，這兩種植物藥物的提取物除了對人類眾多器官(特別是腦、卵巢、骨骼、血管系統)都有有益的作用外，還有雌性激素型作用。雌激素型作用作用于子宮、陰道、乳房組織和肝，其結果是不利的。然而，令人不快的是，至今這種原可用于在雌激素不足情況下對器官有選擇性的預防或治療的植物藥物，在現有的技術水平下無法實現。
本發明的目的就是以這種技術狀況出發完成有雌激素型作用的植物藥物，且其作用是器官選擇性，對于子宮來說是沒有或只有很小的作用。
對于權利要求1所述的從鳶尾科提取物的用處和根據權利要求3所述的總狀花升麻提取物的用處的特征來說，這目的是獨立的。對于如權利要求8所述的以鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷基礎的藥物來說，權利要求2中的特征更表現了上述目的。
如權利要求11所述，另一解決方法是含鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷或富含鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷的植物提取物。
在體內和體外的實驗中，驚人地發現含有機溶劑或含超臨界CO2的鳶尾科(特別是射干)和總狀花升麻提取物兩者都可對于中樞神經系統、骨骼系統和血管系統器官選擇性的作用，而不存在對子宮的作用一所謂的趨子宮作用。按發明使用這種提取物被適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和／或預防骨質疏松癥。
它們也適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和／或預防心血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化。
它們也適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和／或預防圍絕經期和絕經期后的精神植物性(psychovegetative)疾病(如熱潮紅)。
此外還發現，從射干中分離的鳶尾黃素組份與整個提取物基本呈現相同的作用。 鳶尾黃素除了射干，其他鳶尾科如德國鳶尾(Iris germanica)，鳶尾(I．illyrica)，(illrica)，和野鳶尾(I．dichotoma)中同樣也發現了這種組份。
從分類學說，射干可以如下分類 對于生產提取物來說，這些植物的根莖、葉梗、葉和／或花瓣是較好的。對于射干和其組份的基本植物化學描述可見于Ms．A．Nenninger(LMUM_nchen，1997)的論文題為“射干一種TCM藥用植物和其它Irisarten的植物化學和藥理學調查(Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen vonBelamcanda sinensis，einer Arzneipflanze der TCM und anderer Irisarten)”。
本發明中的藥物，即由總狀花升麻和射干及其他鳶尾科制得的藥物和以鳶尾黃素為基礎的藥物，首次可用作骨骼、心血管系統和大腦的全雌激素受體促效劑。
本發明更詳盡的優勢和特征可由實驗數據及后面的圖例描述
圖1總狀花升麻有機相和水相的比較。一種典型雌激素受體-配體的結合測試的替換圖。起始濃度為17．66mg／ml，按1∶2，1∶4，等稀釋，直到1∶64；圖2先加入LH血漿，2小時后，靜脈注射射干提取物、E2和載體。射干提取物與E2對于降低被升高的血漿LH水平的作用相似；圖3對于卵巢切除的大鼠進行7天的皮下處理后，總狀花升麻和E2對子宮重量(圖3a)和血液中LH水平的作用(圖3b)；(平均值+SEM(均數的標準誤差)，n=8，*=p＜0．05 vs．聚乙二醇化合物作為載體)；圖3a)子宮重量；圖3b)血液中的LH濃度；圖4a)對于卵巢切除的大鼠進行7天的皮下處理后，總狀花升麻和E2的作用；(平均值+SEM，n=8，*=p＜0．05vs．聚乙二醇化合物作為載體)下丘腦視葉前區域對E2-受體的mRNA的表達；圖4b)對于卵巢切除的大鼠進行7天的皮下給藥后，子宮內對于IGF1和C3的mRNA的表達；圖4c)對于卵巢切除的大鼠進行7天的皮下給藥后，對于其骨骼中膠原1(Coll1)和骨鈣蛋白的mRNA的表達；關于總狀花升麻和射干的雌激素作用的實驗證明一系列不同復雜程度的實驗系統過程的不同階段來示范選擇性雌激素的作用。
1．體外實驗1．1對于總狀花升麻的體外實驗體外可由直接針對17-β-雌二醇(=E2)的抗體來識別組合物中雌激素型結構。
總狀花升麻的提取物由殘留液中蒸發。由二氯甲烷和水間的相分布，濃縮了不同極性的物質。由豬子宮的雌激素受體蛋白的體外實驗可測得兩相組份的結合親和力。豬子宮胞質的雌激素受體是由標準步驟分離得，用于配體的替換實驗。
在此也發現了，雌激素型的結構如分離于總狀花升麻的，在性質上是不親水性的，而是親油性的，因為它們可以借助有機溶劑的抽提而被提取。在有機萃取相中的該物質與抗體的結合能力較在水相中留下的物質強約10倍。
在雌二醇受體結合實驗中這兩相間差別就更大了。在無細胞制備中，與雌二醇結合的物質的相似性必須高到足以與雌二醇受體發生選擇性的競爭性的相互作用。在這個實驗系統中，相反有機相與受體有很強的結合能力，水相確無任何結合受體的活性。
結果顯示于圖1。
1．2對于射干的體外實驗由其他研究可知，射干的提取物也有可由抗17-β-雌二醇的抗體識別并可和17-β-雌二醇受體(參看Nenninger loc．cit)結合的組份。然而，奇怪的是，本發明的發明者發現這些提取物對不同器官系統有不同的雌激素作用，特別是它們沒有趨子宮作用。
2．體內實驗對卵巢切除的大鼠雌激素作用證據雖然與受體E2的結合是非常選擇性的，但并不能說下一步細胞內過程是被促進或是抑制的，亦即該物質是促效劑還是拮抗劑。這種特性只能在適合的細胞系統或完整的動物上測得。
卵巢切除的大鼠可作為更年期后的婦女模型，此時的婦女內分泌雌激素量降低。外部提供的17-β-雌二醇或有雌激素型作用的物質的結果是，產生對雌激素敏感的解剖形態學參數修復，如子宮重量的增加；角質細胞的產生，例如陰道上皮的空斑上皮細胞；或激素的變化，如受處理動物血液中LH水平的降低。
以下所有的實驗都是以重量在240-280g之間的卵巢切除的Sprague-Dawley大鼠(=ovx大鼠)進行的。
2．1射干的一次加藥對于射干提取物的雌激素型作用的開始非常快。將載體、雌二醇和射干提取物一次靜脈注射給藥ovx大鼠剛完，在E2和射干作用下搏動都停止。隨著藥值的發展，與先前的值和用聚乙二醇化合物處理的對照動物相比，對血清中LH水平的抑制非常顯著。聚乙二醇化合物是以聚乙氧基蓖化麻油衍生物為基礎的乳化劑。
圖2顯示了實驗結果。
注射了射干提取物六小時后，與對照組相比，動物子宮的內子宮VEGF、IGF1和C3的基因表達沒有變化，而注射雌二醇的對于這三種雌激素調節蛋白的基因表達有了很顯著的增加。任何這些處理對細胞色素C氧化酶(CCO)基因的組成型表達都無顯著影響。
這些發現表明，射干的組份對下丘腦的雌激素接受結構的GnRH脈沖發生器有抑制作用，及由此產生的雌激素競爭作用。據此，腦垂體的LH的分泌被射干和雌二醇的組份顯著的抑制了。與雌二醇相比，射干的組份沒有趨子宮作用。雌二醇能顯著地對VEGF、IGF1和C3的基因表達起向上的調節，而未被觀察到射干有這種作用。
靜脈注射射干提取物作用的急性實驗實施例。
實驗前一天，對24只大鼠(即8只／組)乙醚麻醉下頸靜脈導管插管。實驗當天，每10分鐘取一次血樣共六次。當第六次樣品取完后，迅速分別靜脈注射62．5mg的射干提取物或10μg的17-β-雌二醇(E2)或1ml含5％聚乙二醇化合物的等滲壓的NaCl，再每10分鐘取血樣，一次共兩小時。在靜脈加藥的6小時后，將大鼠斷頭、采血、割除子宮、稱重并在液氮下深度冰凍。
2．2鳶尾黃素酮的一次加藥在單加藥鳶尾黃素酮后，可測量到血液中LH水平受時間發展影響和雌二醇型免疫反應性。在E2放射免疫分析(E2-RIA)測定，20分鐘后，動物血液中鳶尾黃素的濃度與100pg相當量的雌二醇相應。
鳶尾黃素酮觸發LH迅速地減少。直到靜脈注射與雌二醇精確相應的鳶尾黃素60分鐘后，完成了LH的動力學減少，但減少并不進一步下去反而緩慢增加。
實施例參考Harms和Ojeda(Harms PG；Ojeda SR大鼠頸靜脈慢性插導管的一種迅速且簡單的操作．J．Appl．Physiol．(1974)36∶391-392)的技術，將導管置于在實驗開始前24小時已乙醚麻醉的OVX大鼠的頸外靜脈。將管的一端置于勁部的一個皮膚囊內。為了在采血樣時不接觸動物，用硅膠管將導管延長。導管和硅膠管都用含50IU／ml的肝素的林格溶液沖洗。
100μl的血樣都是以10分鐘為間隔從每個動物上采取的，以同樣體積的林格／肝素溶液補充。在第六次的取樣后，靜脈注射1．0ml各自的測試溶液。測試溶液為2％的聚乙二醇化合物(=載體溶液)，鳶尾黃素(7mg／ml載體)，17-β-雌二醇(10μg／ml載體)。在接下的140分鐘，每10分鐘取一次血樣。
將如上所得的血樣置于放了10μl肝素-losung(5000IU／ml，liquemin)的0．5ml的Eppendorf反應管內，10000*g離心10分鐘，然后將它們在-20℃貯存，直到放射免疫測定。
催乳素(Prolaktin)和LH的RIA都是以國家衛生研究所NIH(Bethesda，Maryland，USA)的抗血清、對照物、分離劑(iodisation)的制劑為基礎。通過DPC(Bad Nauheim)的RIA可測得雌二醇和交叉反應的異黃酮的濃度。
2．3加藥7天中射干提取物的作用在每天的皮下用藥后的7天中，測定再次加藥雌二醇、射干提取物和載體對于切除卵巢的大鼠的總重、子宮的重量、激素的水平以及子宮和骨骼的基因活性的作用。
用聚乙二醇化合物和射干處理的動物的平均體重沒有區別，而E2處理的動物的體重則顯著減輕了。同樣用聚乙二醇化合物和射干處理的動物子宮的重量也沒有顯著的區別，而E2處理的動物的子宮的重量比原來的三倍還多。
LH的血清水平，在射干處理的動物上的降低是輕微的，但與聚乙二醇化合物對照相比，降低是有顯著性的，而用雌二醇處理的減少更很顯著的。
處理的一周后，在子宮的mRNA提取物中，雌二醇明顯上升了VEGF的基因表達，到達對照值的149％。對于射干提取物，表達的提高是輕微的，無顯著性的。對于細胞色素C氧化酶(=CCO)的非雌激素調節的組成型基因則沒有影響。
對股骨頭提取物測定了膠原-1Al、骨鈣蛋白、IGF1和TGFβ-mRNA的表達。與射干一樣，雌二醇對這四種基因的表達都有顯著的抑制而對組成型基因CCO沒有影響。
在7天的處理后，雌二醇與射干的不同作用就很明顯了。射干提取物通過抑制GnRH脈沖發生器和骨骼中的四種雌激素調節基因的表達對腦垂體的LH分泌有雌激素競爭性影響。形成對比的是，射干提取物對子宮無雌激素影響，即子宮的重量和雌激素調節的VEGF基因都沒有受到影響。而雌二醇確造成了子宮的膨脹和VEGF的激活。
七天期內每天皮下注射作用的亞急性實驗的實施例8只動物每測試組(共24只)每天在早上800-900分別皮下注射62．5mg的射干提取物和10μg的雌二醇或溶劑(5％聚乙二醇化合物，1ml)。在最后加藥的6小時后，將大鼠斷頭，切除得每只大鼠的主動脈、子宮和左股骨頭，清洗，在液氮下冰凍。
由血樣測得了LH和雌二醇的免疫反應性。
2．4總狀花升麻的反復加藥盡早在卵巢切除術后的14天，動物通過每天一次早上皮下注射劑量為62．5mg的總狀花升麻／大鼠或8μg的雌二醇／大鼠分別進行測試，共7天。這兩種物質都溶解在5％的聚乙二醇化合物中，對照組動物只接受載體。
在將大鼠斷頭后，為獲得mRNA而制備腦、子宮和股骨。通過RIA可測得動物血液的LH濃度。通過半定量的逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)可測得上述確定器官的雌激素調節基因的表達。
用雌二醇處理的動物子宮的重量是用總狀花升麻和載體處理的三倍還多，而后二者基本上它們的平均值沒有區別。這就意味著總狀花升麻的組份對動物的子宮沒有影響。對于陰道也是一樣，用總狀花升麻和載體處理的動物的上皮組織沒有角質化發生，而雌二醇處理的動物則情況相反。
LH的水平在用載體處理的動物上保持的相當高，而用雌二醇和總狀花升麻處理的則被顯著地降低了。
圖3a)和圖3b)顯示了結果。
子宮重量(濕重)
血液的LH濃度
作為雌激素作用的另一標記，測定了雌激素誘導的蛋白質的mRNA的激活。用到的是子宮、骨骼(股骨)和下丘腦的視葉前區的組織。
在下丘腦中，總狀花升麻和E2都刺激雌激素受體α的mRNA的表達(圖4a)。對于骨組織來說也一樣，總狀花升麻的表現如一種雌激素，與雌二醇相似，減少了骨骼特異的膠原1和骨鈣蛋白基因的mRNA的表達(圖4b)。
與此形成對比的是，觀察到總狀花升麻對子宮的雌激素調節基因沒有影響。只有雌二醇增加了IGF1的mRNA和補體因子C3(圖4c)。
這些發現證明總狀花升麻的組份選擇性地作用于單個器官其提取物雌激素地作用于下丘腦(E2受體α的表達和LH的釋放)和骨骼(由膠原1和骨鈣蛋白的基因表達可證明)。但與雌二醇不同的是，因為在子宮的重量和IGF1和C3的基因表達上缺乏作用，總狀花升麻確對子宮沒有作用。
通過體外和體內的實驗可確定，總狀花升麻和射干的提取物有雌激素作用。但驚人的是，這些藥物的提取物對中樞神經系統、骨骼和血管器官有選擇性的作用，但對子宮則無作用，由此它們非常適用于雌激素缺乏的預防和治療同時對子宮內膜沒有負影響。
射干中的鳶尾黃素也有等同的效果。
因此這是首次使有雌激素型作用而無趨子宮作用的藥物成為可用。
該類似的藥物可用于治療和／或預防心血管疾病(特別是動脈粥樣硬化)、骨質疏松癥和圍絕經期和絕經期后的植物性的混亂(如熱潮紅)。
在應用的類型中，口腔、靜脈和皮下的應用都是很好的。
權利要求
1．鳶尾科提取物的用途，其特征在于，用于生產雌激素型對器官有選擇性的藥物，該藥物沒有趨子宮作用或作用可忽略。
2．如權利要求1所述的用途，其特征在于，該提取物由射干制得。
3．總狀花升麻提取物的用途，其特征在于，生產雌激素型對器官有選擇性的藥物，該藥物沒有趨子宮作用或作用可忽略。
4．含有鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷或富含鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷的提取物的用途，其特征在于，生產雌激素型器官有選擇性的藥物，該藥物沒有趨子宮作用或作用可忽略。
5．如權利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，提取物用于生產已定劑型的藥物，以選擇性治療和／或預防心血管疾病，特別是動脈粥樣硬化。
6．如權利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，提取物用于生產已定劑型的藥物，以選擇性治療和／或預防骨質疏松癥。
7．如權利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，提取物用于生產已定劑型的藥物，以選擇性治療和／或預防更年期疾病，特別是預防或減輕熱潮紅。
8．鳶尾黃素和／或其糖苷作為藥物。
9．如權利要求8所述的藥物，其特征在于，雌激素型對器官選擇性的藥物，其沒有趨子宮作用或作用可忽略。
10．如權利要求8或9所述的藥物，其特征在于，該藥物選擇性治療和／或預防的藥物，用于心血管疾病，特別是動脈粥樣硬化；骨質疏松癥；和更年期疾病，特別是預防或減輕熱潮紅。
11．含鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷或富含鳶尾黃素和／或鳶尾黃素糖苷的植物提取物。
12．如權利要求11所述的植物提取物，其特征在于，雌激素型對器官選擇性的藥物，該藥物沒有趨子宮作用或作用可忽略。
13．如權利要求11或12所述的植物提取物，其特征在于，選擇性治療和／或預防的藥物，用于心血管疾病，特別是動脈粥樣硬化；骨質疏松癥；和更年期疾病，特別是預防或減輕熱潮紅。
全文摘要
本發明是關于用鳶尾科和總狀花升麻的提取物和鳶尾黃素作為一種雌激素型對器官有選擇性的藥物,來選擇性治療和/或預防心血管疾病,特別是動脈粥樣硬化,骨質疏松和更年期疾病,例如預防或減輕熱潮紅。事實上沒有觀察到趨子宮作用。
文檔編號A61K36/8965GK1293575SQ99804123
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月19日 優先權日1998年3月19日
發明者W·武特克, H·哈里, V·克里斯托夫, B·施彭格勒, M·波珀 申請人:白奧諾里卡制藥有限公司