磁響應組合物的制作方法

專利名稱：磁響應組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于將生物相容性顆粒遞送到體內選擇位點的組合物和方法，更具體來說，本發明涉及能攜帶生物活性化合物的顆粒，它能保證顆粒的靶向磁性運輸并保持在預定位點以定位診斷或治療疾病。
背景技術：
迄今為止，已經有人提出和/或使用用于治療各種疾病的金屬載體組合物(參見例如US 4849209和US 4106488)，并且包括通過對外加磁場起響應而在體內被定向或受控的組合物(參見例如US 4501726、US 4652257和US 4690130)。這類組合物不能總是被證實是實用和/或完全有效的。例如，這類組合物可能缺乏將所需生物活性劑運送到治療位點的足夠能力，磁敏性不足，和/或難以生產、貯存和/或使用。
一種通過血管內注射給藥的已知組合物包含微球，其中所述微球是由鐵磁成分組成的，并且覆蓋有生物相容性聚合物(白蛋白、明膠、和多糖)，所述聚合物還含有藥物(Driscol C.F.等人的Prog.Am.Assoc.Cancer Res.，1980，p.261)。
可以生產出含有磁性材料(磁鐵礦Fe3O4)和抗腫瘤性抗生素阿霉素、粒徑高達3.0μm的白蛋白微球(Widder K.等人的J.Pharm.Sci.，6879-82 1979)。這種微球是使白蛋白在乳液(油包水乳液)中經熱和/或化學變性而制得的，其中具有在藥用溶液中含磁鐵礦懸浮體的輸入相。類似技術已被用來制備覆蓋有包含抗生素絲裂霉素-E的乙基纖維素、磁控或定向的微膠囊(Fujimoto S.等人的《癌癥》(Cancer)，562404-2410，1985)。
另一方法是制備可溶解動脈粥樣硬化形成物、攜帶粒徑為200nm-800nm的磁性控脂質體的制劑。該方法的基礎是，在水存在下磷脂能產生封閉膜結構(Gregoriadis G.，Ryman B.E.，《生物化學雜志》(Biochem.J.，12458，1971))。
上述組合物需要通量密度非常高的磁場以控制它們，并且多少難以在不改變其指定特性的條件下以工業化規模穩定地生產、滅菌和貯存。
為了克服這些缺點，有人提出了一種制備磁控分散劑的方法(參見Kholodov L.E.，Volkonsky V.A.，Kolesnik N.F.等人的第0451299 A1號歐洲專利公開物)，其中是使用鐵碳顆粒作為鐵磁材料。所述鐵碳顆粒是通過將由粒徑為100μm-500μm的顆粒組成的鐵粉在含氧空氣中于800℃-1200℃加熱而制得的。然后將混合物在400℃-700℃用一氧化碳處理，直至在表面上開始出現約10％-90％(重量)的碳顆粒為止。之后將生物活性物質吸附到顆粒上。
制備鐵碳顆粒的該方法相當復雜，并且需要大量能量。因為在含氧空氣中于高溫下合成鐵碳顆粒使得鐵磁組分被氧化，所以與金屬鐵相比，所得分散劑的磁敏性平均下降了約1半。吸附在所得顆粒上的生物活性物質的量的上限一般為鐵磁顆粒重量的2.0％-2.5％。
通過上述方法制得的磁控顆粒具有球形鐵磁組分，該球形鐵磁組分具有從其延伸的線狀碳鏈，并且其大小通常約為2.0μm。據信該結構預先決定了該復合材料具有相當低的吸附能力，并且在貯存和轉運期間還導致來自鐵磁組分的易碎線狀碳鏈的破碎。
因此，仍然需要能磁性輸運、相對易于生產、貯存和使用的生物相容的有效組合物。
發明簡述本發明提供了可攜帶生物活性物質、或者可單獨使用的磁響應組合物。迄今為止，已經提出了多種可攜帶的溶解物質。例如但不限于烷化劑、抗代謝物、抗真菌劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、和化療劑、以及它們的適當組合可被吸附到顆粒上。通過使用本發明磁控載體顆粒，還可體內攜帶和給藥其它治療劑和藥物，例如系統毒性抑制劑、抗生素和氫化可的松等。本發明還提供了所述顆粒的制備方法和應用。
本發明的目的是改善用于靶向運送生物相容性顆粒的磁控組合物的一些參數，包括提高相對吸附能力，提高磁敏性，增強診斷與治療效果和使用方便性，以及簡化磁控組合物的生產技術，并保證其長時間貯存后所需特性不發生改變。
通過使用適當的體積混合的鐵碳復合顆粒作為磁控組合物的磁敏性材料，可實現本發明的目的。這些顆粒的主要尺寸(即最大直徑)為約0.2μm-約5.0μm(優選為0.5μm-5.0μm)，含有約1.0％-約95.0％(重量)的碳，其中碳與鐵緊密地結合在一起。顆粒是通過將鐵和碳粉混合物共同變形(即碾磨)獲得的。在某些情況下，成品顆粒含有微量碳化鐵(Fe3C)。
用于體內局部治療疾病的組合物包含主要尺寸約為0.5μm-5μm的顆粒，每一顆粒分別含有碳和鐵，并且可任選含有吸附在顆粒上、被選擇用來診斷或治療疾病的生物活性物質。
制備本發明組合物的方法包括，將鐵和碳粉機械混合物共同變形，采用的變形時間足以使粉末結合到平均主要尺寸低于5μm的鐵∶碳復合顆粒內，并且顆粒的主要部分包含約1.0％-95.0％(重量)的碳分散到每一顆粒體積內。優選將顆粒分離，以選擇主要尺寸為約0.5μm-約5.0μm的顆粒，之后高達20％(重量)的生物活性物質顆粒可吸附到所選顆粒上。
所用方法包括體內局部診斷或治療疾病的方法，包括提供吸附有被選擇用來診斷或治療疾病的生物活性物質的磁響應鐵碳載體(例如本發明載體)，把載體注射到患者體內。例如，載體通過將給藥裝置插到距離被治療體內位點很近、并在把血液運送到該位點的動脈網的分支處(優選最接近的)的動脈內來注射。把載體通過給藥裝置注射到血管內。就在注射前，在體外鄰近治療位點處建立足夠場強的磁場，以將大量注射載體引導到治療位點，并使大量載體保留在治療位點。磁場優選具有足以將載體引導到鄰近血管網的位點處的軟組織內的強度，由此就防止了任一較大血管被載體顆粒栓塞。
因此本發明的目的是提供一種任選用來攜帶生物活性物質的改進的磁響應組合物，及其制備方法和應用。
本發明的另一目的是提供一種用于攜帶生物活性物質的磁響應載體，所述載體具有改善了的磁響應性，在貯存和使用期間也持久耐用，并且含有高達20％(重量)的吸附在其上面的生物活性物質。
本發明的另一目的是提供一種包含主要尺寸為約0.5μm-5.0μm的顆粒的磁響應組合物，其中每一鐵∶碳復合顆粒含有約1.0％-95.0％(重量)的分散在顆粒體積內的碳。
本發明的另一目的是提供一種用于體內局部診斷或治療疾病的組合物，所述組合物包含主要尺寸為約0.5μm-5.0μm的鐵∶碳顆粒，其中每一鐵∶碳復合顆粒含有碳和鐵，碳分散在顆粒體積內，并任選含有吸附在顆粒上的、被選擇用來診斷或治療疾病的生物活性物質。
本發明的另一目的是提供一種制備磁響應載體組合物的方法，其中所述組合物包含鐵∶碳復合顆粒，所述顆粒含有碳和鐵，其中碳分散在顆粒體積內。
本發明的另一目的是提供一種為組合物給藥的液態或干燥藥盒，以用于體內局部診斷或治療疾病，其中所述組合物包含鐵碳顆粒，所述顆粒具有任選的吸附在其上面、并被選擇用來診斷或治療疾病的生物活性物質。
本發明的另一目的是提供一種用于為組合物給藥的藥盒部件的滅菌方法，其中所述組合物是用于體內局部診斷或治療疾病，并包含鐵碳顆粒，所述顆粒具有任選的吸附在其上面、并被選擇用來診斷或治療疾病的生物活性物質。
通過閱讀下述說明，本發明這些和其它目的對于本領域技術人員來說將變得顯而易見，本發明提供了基本上如下文所述的部分的構造、組合、排列和方法，并且通過權利要求書對其作了更特別的限定，應當理解，如果在本發明中公開的具體實施方案中的變化在本發明權利要求范圍內的話，則這些變化也包括在本發明范圍內。
附圖的簡要說明附

圖1是本發明載體組合物的復合顆粒的放大照片(12000倍)。
附圖2A是本發明載體組合物的顆粒的放大照片(30000倍)。
附圖2B是附圖2A顆粒的截面圖。
附圖3A-3H是用吸附在載體組合物上、用本發明方法輸送并維持在腫瘤位點中的藥物治療期間腫瘤的例圖。
附圖4是舉例說明施用并磁定向本發明載體組合物的一個實例的圖。
附圖5是舉例說明在病理結構處的載體組合物(具有吸附在其上的藥物)的圖。
附圖6是說明結合到載體顆粒上的PAC的Langmuir(朗繆爾)吸附圖的曲線圖，其中所述顆粒具有70∶30 E型碳的鐵∶碳比例，和僅有(-□-)E型碳。數據是通過簡單未加權線性回歸擬合的。
發明詳述本發明的磁可控或定向的載體組合物包含平均主要尺寸為約0.1μm-約5.0μm、優選為約0.5μm-約5.0μm的體積混合的鐵碳復合顆粒，所述顆粒含有約1.0％-約95.0％、例如約10％-60％(重量)的碳。已經發現約20％-約40％(重量)的碳是在許多應用中表現出有用特性的優選范圍。
所述顆粒是通過不采用外加熱將鐵和碳粉混合物機械碾磨制得的。然后將所制得的鐵∶碳復合載體顆粒置于生物活性物質的溶液中，以使生物活性物質吸附到顆粒上。分離出具有所需尺寸和磁敏性的復合顆粒。可在將顆粒露置于生物活性物質之前或之后分離顆粒。
如附圖1和2A所示，通過本發明方法制得的鐵∶碳顆粒8通常是球形，其中包含碳沉積物10，所述碳大概位于每一顆粒的整個體積內(在每一顆粒的表面和內部)。在將本發明磁控組合物長時間貯存、運輸、存儲、包裝和直接使用期間，組分(鐵12和碳10)之間的強連接沒有被打破。在鐵和碳之間可能會發生化學結合，例如在碾磨過程中形成的碳化鐵(Fe3C)的微量夾層。
本發明鐵∶碳顆粒還可用作在外加磁場控制下把一種或多種吸附的生物活性物質遞送到特定體內位點的載體。本說明書所用術語“生物活性物質”包括用于體內診斷和/或治療的物質。
生物活性物質包括但不限于抗腫瘤劑、血液制品、生物響應改性劑、抗真菌劑、抗生素、激素、維生素、肽、酶、染料、抗過敏劑、抗凝劑、循環劑、代謝加強劑、抗結核劑、抗病毒劑、抗心絞痛劑、抗炎劑、抗原生動物劑、抗風濕劑、麻醉劑、鴉片制劑、診斷造影劑、強心甙、神經肌肉阻斷劑、鎮靜劑、麻醉劑、以及順磁性和放射性顆粒。其它生物活性物質可包括但不限于單克隆抗體和其它抗體、天然或合成遺傳物質和前藥。
本說明書所用術語“遺傳物質”一般是指核苷酸和多核苷酸，包括天然或合成核酸、RNA和DNA，包括重組有義和反義RNA和DNA。遺傳物質的類型可包括例如攜帶在表達載體例如質粒、噬菌粒、酵母人工染色體和缺損(輔助)病毒上的基因，單鏈和雙鏈RNA和DNA及其類似物，以及其它蛋白和聚合物。
對于體內診斷造影，在選擇給定放射性同位素方面，可使用的檢測儀器的類型是主要因素。所選放射性同位素必須具有對于給定類型儀器可檢測的衰變類型。γ射線通常是必需的。在選擇放射性同位素方面，另一重要因素是半衰期，它應當長至使得在靶位點最大量攝取同位素時放射性同位素仍能被檢測，而短至使得對宿主的有害輻射最小。選擇適當放射性同位素對于本領域技術人員來說是顯而易見的。可采用的放射性同位素包括但不限于99Tc、142Pr、161Tb、186Re、和188Re。另外，其它診斷有用的化合物的典型實例是金屬離子，包括但不限于111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201TI。此外，特別適用于磁共振造影和電子自旋共振技術的順磁性元素包括但不限于157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、和56Fe。
還要指出，放射性同位素也適用于放射治療技術。通常情況下，α和β放射被認為可用于治療。治療化合物的實例包括但不限于32P、186Re、188Re、123I、125I、90Y、166Ho、153Sm、142Pr、143Pr、149Tb、161Tb、111In、77Br、212Bi、213Bi、223Ra、210Po、195Pt、195mPt、255Fm、165Dy、109Pd、121Sn、127Te、和211At。放射性同位素通常作為自由基團存在于鹽中，然而有些腫瘤和甲狀腺可直接攝取碘。適用的診斷和治療放射性同位素可單獨使用或組合使用。
在不損失顆粒在本申請所述治療方案中的效用的情況下，通過提高碳在顆粒中的比例，被吸附的水溶性生物活性物質的量一般可增加到最多占復合顆粒重量的約40％。已經發現，在許多情況下，生物活性物質量的增加與碳含量的增加大約呈線性關系。然而，當碳含量增加時，復合顆粒8對磁場的敏感性或響應能力也下降了，因此它們在體內的控制條件惡化了(雖然吸附能力增強了)。因此，為了獲得改善的治療或診斷結果，需要在鐵∶碳比例中達到平衡。在治療期間，為了提高活性劑的量，可將大劑量顆粒給予患者，但是增加劑量不能使顆粒更有磁性。本領域技術人員可確定適當比例。
已經確定出，用于如本申請所述在體內治療的顆粒的適用鐵∶碳比例范圍通常為約95∶5-約50∶50，例如約80∶20-約60∶40。對于具有任意給定碳濃度的鐵∶碳復合載體顆粒，其所吸附的生物活性物質的最大量也將由于生物活性物質的化學性質、以及在某些情況下組合物所用碳的類型(例如活性炭(AC))的不同而不同。例如，已經發現，對于用來遞送吸附的阿霉素以在體內進行治療的載體顆粒，最佳鐵∶碳比例約為75∶25。
然而，基本上不溶于水的生物活性物質(即在水中的溶解度低于約0.1％(重量))的吸附需要使用特殊方法來把有用量藥物吸附到顆粒上。本申請人已經發現，可通如下所述將基本上不溶于水的生物活性物質吸附到本發明載體顆粒上，不使用其中有許多種是有毒性的表面活性劑，將不溶于水的生物活性物質溶解在液態吸附介質(例如含水液態吸附介質)中，其中所述介質含有被選擇用來將顆粒和溶液間的疏水范得華力減至最小、以阻止顆粒在介質中聚結的賦形劑。例如，如果生物活性物質是高度非極性分子例如喜樹堿，并且吸附介質是高度非極性液體例如氯仿-乙醇，則藥物就不能優選離開吸附介質而吸附到碳上。然而，在極性更強的吸附介質中，吸附到載體顆粒上是完全可接受的。例如，使用含檸檬酸的乙醇作吸附介質，雖然紫杉醇是一種高度水不溶性藥物基本上不溶于水，也能將治療水平的紫杉醇結合到鐵∶碳比例為70∶30的載體顆粒上。在許多情況下，如果液態吸附介質含有生物相容性和生物可降解增粘劑(例如生物相容性聚合物)如羧甲基纖維素鈉以促進顆粒在介質中分離，則是有利的。
通過使用本發明方法，已經將阿霉素以占顆粒平均重量約0.0％-約20％的量吸附到鐵∶碳比例為80∶20-60∶40(A型活性炭)的載體顆粒上。實施例5舉例說明了用于增強阿霉素吸附到載體顆粒上的賦形劑的配方。采用對于本領域技術人員來說是顯而易見的類似技術，也可將其它生物活性劑吸附。
為了便于制備和將載體顆粒以干燥形式銷售，可將賦形劑制成干燥形式，并且當在液體溶液中時，將用于溶解藥物和生物活性物質用的一種或多種干燥賦形劑的吸附促進量與單位劑量的載體顆粒包裝在一起。為了克服在水溶液中導致有關生物活性物質不溶和顆粒聚結的化學力，根據生物活性物質的化學性質，本領域技術人員可確定出干燥賦形劑的吸附促進量。最優選將包含干燥賦形劑和干燥載體顆粒的包裝或藥盒與包含單位劑量藥物和足量生物相容性水溶液的小瓶按藥物生產商的指示說明混合配制，以使藥物達到所需藥用濃度。通過將含有被稀釋藥物的溶液與包括干燥組分(即干燥載體顆粒和干燥賦形劑)的藥盒組分混合，藥物被吸附到載體顆粒上，形成了含有吸附到載體顆粒上的治療量的生物活性物質的、適用于體內治療或診斷的磁控組合物。
或者，可使用液態藥盒。在這種藥盒中，載體顆粒是作為一個單元包含在例如小瓶中，而上述賦形劑是以水溶液形式包含在另一單元中。在給藥時，按照藥物生產商的指示說明將包含單位劑量藥物的小瓶組分與足量的生物相容性水溶液例如鹽水混合，以使藥物達到所需藥用濃度。然后，把其上面吸附有生物活性物質的所得顆粒與在水溶液中包含賦形劑的另一單元混合。可采用任意合適的滅菌技術。例如，可采用γ幅射將鐵碳顆粒滅菌，可通過高壓滅菌器將賦形劑的水溶液滅菌。使用高壓滅菌器會將鐵碳顆粒氧化，這是不利的。
通過考慮多種因素，例如患者的體重、年齡、全身健康狀況、藥物的診斷或治療特性、疾病的性質和嚴重程度，本領域技術人員可確定出吸附到載體顆粒上的生物活性物質的診斷或治療量，即對具體疾病或病癥的診斷或治療所需的量。
確定用于任一具體治療的載體顆粒的尺寸要考慮很多因素。顆粒尺寸的選擇部分是由在生產大小低于0.2μm的顆粒所固有的技術約束決定的。此外，對于大小低于約1.0μm的顆粒，在血流中的磁控以及攜帶能力下降了。較大的粒度在注射期間會導致血管不利栓塞，或者由于機械地或者由于生理機制促使形成凝塊。分散劑可能會凝結，這使得更加難以注射，并且在靶病理區域生物活性物質從顆粒上解吸附的速率也可能下降。將鐵和碳粉混合物一起碾磨的方法(例如下述方法)使得顆粒呈具有粒狀表面的近似球形，并且生成了平均主要尺寸為約0.1μm-約5.0μm的顆粒群體。
因為鐵在本發明顆粒中不是以氧化鐵形式存在，如在一些現有技術中公開的磁控分散劑中那樣，所以鐵碳顆粒8的磁敏性或響應性保持在高水平。
本發明鐵碳顆粒的特征是，具有健全的子結構(參見附圖2B)，所述結構具有鐵形成的連接網絡，網絡填充有截留在其中的碳沉積物10。與具有其它類型子結構的鐵顆粒相比，在把鐵和碳粉機械混合物連接變形的過程中形成的顆粒的這種特征子結構也提高了包含在鐵碳顆粒8中的鐵的磁敏性。例如，通過本發明方法制得的鐵碳復合顆粒的磁敏性比在第0451299 A1號歐洲專利公開物中公開的顆粒的磁敏性要好，雖然這兩種顆粒中的鐵磁組分含量是大約相同的。在有些情況下，鐵碳顆粒8的高磁響應性使得其能采用低于約250高斯的磁場來把顆粒定向到所需解剖學位點。
因為在顆粒8中的碳沉積物10具有大表面，所吸附的生物活性物質的量可占顆粒8重量的高達約20.0％；或者，換句話說，每克顆粒8可吸附高達約200mg生物活性物質。因此，在使用中，與一些現有技術已知載體相比，可注射更少量的載體就能達到給定劑量的生物活性物質，或者每次注射能達更高劑量的生物活性物質。
下面描述制備少量本發明鐵碳組合物的方法，應當理解，為了使包含制備載體的基本原料的鐵和碳粉共同變形，除了碾磨之外，也可使用其它方法和機制。所用方法對碳和鐵顆粒混合物施加機械壓力，以將鐵顆粒變形和形成捕獲碳的基本結構。在該方法中，不加熱就形成了鐵碳顆粒(雖然在機械變形步驟中混合物溫度升高)，并且是在液體例如乙醇存在下進行的，以抑制鐵氧化，并確保生成的顆粒是干凈的(無菌)的。在將鐵和碳粉碾磨過程中，液體還起潤滑劑作用，并且可降低處理期間碳的壓縮。結果是，維持了在組合物中碳沉積物的密度，以使顆粒有最大吸附能力。
例如，為了制備平均鐵∶碳重量比約為75∶25的顆粒，將一部分平均直徑為0.1μm-5μm的基本上純的鐵顆粒與約0.1-1.0重量份基本上純的碳顆粒(直徑一般約為0.1μm-5.0μm)混合。將所述鐵顆粒和碳顆粒劇烈混合，以使其在整個體積中良好分布。碳顆粒優選為活性炭。為了確定最佳的可逆的活性炭結合，應當用各種類型的碳獨立地評價每一生物活性物質。因素例如pH、溫度、粒度、鹽溶液粘度、和溶液中其它潛在競爭性化學品可影響吸附能力、速率和解吸參數。可使用的活性炭類型包括但不限于A、B、E、K和KB及其化學改性變型。
將混合物置于標準實驗室用行星式球磨機、或者在粉末冶金中使用的磨碎機中。例如，碾磨機可具有直徑為6mm的球。加入適當量的液體例如乙醇以進行潤滑。將該混合物碾磨1-12小時，或者碾磨能產生本文所述顆粒所需的時間。根據所用碾磨機，碾磨機的速度可以介于約120rpm-約1000rpm之間(通常約350rpm)，加工效果對碾磨速度并不過度敏感。
將鐵∶碳混合物共同變形后，把顆粒從碾磨機中取出來，并通過例如粗濾器與碾磨球分開。可將顆粒重懸在乙醇中并均化，以將顆粒彼此分開。通過例如旋轉蒸發將乙醇除去，然后真空干燥。可使用任一干燥技術。應當在例如氮氣氛下處理顆粒以防止鐵被氧化。
干燥后，應當根據適當尺寸收集顆粒。例如，可將顆粒過20μm篩并在氣體旋流器中收集以除去大于20μm的顆粒。旋流器僅收集一定粒徑和密度的顆粒，這提供了除去細小和散粒碳的方法。可在氮氣下包裝篩分顆粒，并在室溫貯存。
可將顆粒再等分成劑量單位，例如每單位劑量50-500μg，并可進一步用例如氮氣覆蓋。可將劑量單位密封，例如用丁基橡膠塞子和鋁卷邊密封。然后可通過適當滅菌技術將配量單元滅菌，例如用2.5-3.5Mrads(百萬拉特)的γ輻射滅菌。
當準備使用時，或在包裝之前，如果要制備具有吸附在其上面的預選擇的生物活性物質的載體，則將在溶液中的約50mg-150mg(為了完全保證最大吸收，優選約75mg-約100mg)生物活性物質加到1g載體中。當準備用于患者時，用標準方法將該組合物置于生物相容性液體例如水或鹽水的懸浮液中(例如約5-10ml)。
實驗證據表明，與現有技術中已知的磁控分散劑相比，使用具有抗腫瘤制劑的本發明磁控載體組合物，使得對腫瘤的治療效力增加了。
實施例1用Wistar Line雄性大鼠(在Stolbovaya Station of the USSR Academyof Medical Sciences飼養的)進行測試。在大鼠尾部皮膚下灌輸癌肉瘤Walker 256。當腫瘤平均體積為986±98mm3時，將大鼠分成4組，每組10只。第一組(組I)是對照組，組II-IV是實驗組。
在5天期間內，給組II大鼠靜脈注射2mg/kg體重的rubomicine(變紅菌素)的水溶液(按臨床傳統使用該抗癌制劑的模型)。給組III大鼠注射通過第0451299 A1號歐洲專利公開物中描述的現有技術已知方法制得的鐵碳分散劑的懸浮液。該顆粒包含體積百分比為60∶40的鐵/碳。鐵碳顆粒的劑量為160mg/kg體重，吸附其上面的rubomicine的劑量為3.2mg/g顆粒。在把磁場強度為6000奧斯特的永久磁鐵置于腫瘤表面之后，將該懸浮液注射到尾靜脈內。通過X-射線照片監視在外置磁場控制下該懸浮液在腫瘤生長區域的定位。
使用相同注射技術和磁定位，包括將磁場強度為600奧斯特的永久磁鐵置于腫瘤表面并監視。給組IV大鼠一次性靜脈內注射依據本發明方法制得的磁控分散劑，并通過X-射線觀察顆粒的定位。載體顆粒的劑量為160mg/kg體重。在分散劑中各顆粒的鐵∶碳比例為60∶40，類似于在實驗組III中使用的通過現有技術已知方法制得的分散劑中的鐵∶碳比例。
由于顆粒8的改善的吸附能力，吸附到本發明磁控載體顆粒上的rubomicine的劑量為9.96mg rubomicine/g顆粒，這是在實驗組III大鼠中使用的現有技術已知載體顆粒吸附的rubomicine量的3.1倍。達到該結果僅是由于該給定載體顆粒的較特定的吸附能力。
觀察大鼠獲得了下述結果。在對照組I中，大鼠的生命期限平均為21±1.5天。在組II中，作為將rubomicine的水懸浮液靜脈內注射到按臨床傳統使用抗腫瘤藥物的模型中的結果，治療后，大鼠的生命期限平均增加了4.5天(P＜0.05)。治療后，實驗組III大鼠的平均生存了46±4.3天，比對照組大鼠的生命期限多2.2倍。
在組IV中，在一次性注射磁控組合物的懸浮液后5-7天期間內，10只大鼠中有6只(即60％)被證實腫瘤完全消失。此外，治療后，該組剩余4只大鼠平均存活了57.4±5.9天，因此超過了組III大鼠的生命期限25.0％。治療后它們的平均生命期限比對照組I的大鼠長2.7倍。在157天的觀察期間內，在表現出腫瘤完全消退的組IV大鼠中沒有看見任何腫瘤生長復發，該結果與在這些大鼠中腫瘤的完全消失是一致的。
實施例2進一步臨床觀察已經證實了本發明的有效性。附圖4和5舉例說明了使用本發明組合物對在1992年2月13號住入Zil Hospital inMoscow，Russia(CIS)(俄羅斯莫斯科Zil醫院)、并被診斷出患有左乳腺癌T3N1M1的61歲婦女進行治療和觀察的結果。
在1989年，通過作活組織檢查進行第一次診斷。在1991年12月，局部放射治療(10戈瑞)使腫瘤部分減小了。決定用其上吸附有作為生物活性劑的阿霉素(Adriamycin)的本發明載體的動脈內選擇性定位進行化學治療。
在治療前，腫瘤的尺寸(如附圖3A和3B所示)為44mm×33mm×37mm(65mm×45mm，手工)。在1992年2月24日，在局部麻醉下(0.5％奴佛卡因，30ml)將股動脈(附圖4)穿刺，并依據Seldinger法把血管導管插到主動脈內。在X射線和對比監控下，將導管置于距離左胸內動脈(a.mammaria interna sinisra)分支25mm處。經由該血管注射新制備的在其上吸附有15mg阿霉素(Adriamycin)的鐵碳顆粒8的明膠醇(gelatinol)懸浮液。同時將磁場強度為15000奧斯特的磁體在腫瘤上面放置20分鐘，結果，注射的懸浮液由磁場保持在腫瘤區域就位20分鐘(足以將供給腫瘤營養的毛細管完全微栓塞的時間)。在治療時，患者的癥狀令人滿意。
到1992年2月28日時，患者的癥狀已經改善了。對左乳腺的超聲檢查表明，如附圖3C和3D所示，腫瘤的尺寸為42mm×33mm×40mm。腫瘤有清晰的輪廓。到1992年3月12日，腫瘤的尺寸已經減小了66.3％，降至32mm×27mm×21mm(附圖3E和3F)。到1992年4月14日，腫瘤的尺寸已經減小了99.22％，降至10mm×6mm×7mm(附圖3G和3H)。
據信，通過將載體直接釋放到腫瘤位點上流(或其它病理位點)，而不是穿過腫瘤，能同樣有效地施加生物活性物質，同時限制了由于腫瘤組織穿刺而引起的腫瘤擴散，這對患者是有利的。同時在上述治療實例中采用了更大的磁場，已經發現本發明載體組合物在小至250奧斯特/cm的磁場中開始發揮作用(在感應前，許多現有技術載體需要500奧斯特/cm的磁場)。
附圖5圖示說明了在治療位點、在磁控制下發生了什么。在施加的磁場的感應下，載體顆粒被引到供給腫瘤營養的毛細血管網中。顆粒被引到毛細血管腔的軟組織鄰近處(或者也許甚至是進入軟組織)，因此就降低或消除了載體顆粒栓塞血管的可能性。生物活性物質通過動力學過程從載體顆粒中釋放出來，其中載體中的物質被體內產生的物質代替。例如腫瘤自身的壞死產物可能替代生物活性物質，而吸附到顆粒上，例如蛋白、葡萄糖、脂質、肽等。因此，生物活性物質就象字面意思所講的那樣從載體顆粒上釋放出來。
通常有低于約10％的生物活性物質被血流中的體內物質替代。因此，據信置換的物質一定比生物活性物質具有更高的比重。少量顆粒也許不能被磁場吸引到治療位點，或者會從治療位點脫逸。這部分顆粒可能也在血液以及其它地方發揮抗腫瘤細胞的治療活性。在某些病例中，用本發明方法治療后，已經觀察到了轉移的減少。因為載體組合物是由生物可降解或可被身體輕易代謝的材料形成的，所以也許在施用30天內，所有載體顆粒都能被排泄或代謝。
可以理解，本發明提供了用于生物活性物質的改善的磁響應載體、和制備以及使用所述載體的方法。本發明載體顆粒對磁場表現出改善的響應性，具有改善的藥物吸附能力，在貯存和使用期間更持久耐用。
實施例3最近用吸附到本發明載體顆粒上的放射性锝(Tc)作為造影劑在豬動物模型中進行了一系列螢光屏檢查指導的器官造影實驗。為了評價帶碳(C)的Tc以及鐵∶碳載體顆粒的物理化學性質以及相互作用，使用錸(Re)作為Tc的非放射性替代品。在元素周期表中，Re是剛好在Tc下面的VIIIB族元素。Re有兩種人工同位素，186Re和188Re，如下表1所示，二者的半衰期比Tc長，放射大約相同的γ射線。
表1

將在冶金領域中使用的比色Re分析作適應性改動來測定Re在鐵∶碳比例為70∶30的載體顆粒上的吸附。簡言之，將0.1-0.5ml樣品置于含有1.0ml Hcl、1.3ml糠偶酰二肟(60％丙酮溶液)、0.5ml 10％氯化亞錫以及足量水的溶液中，以達到5.0ml。將該混合物在45℃加熱20分鐘，然后冷卻至室溫。在532nm測定Re在該溶液中的吸光度。該分析的靈敏度為約5mcg的Re。這些實驗表明，當在室溫培養時，結合到一系列碳上的Re從在吸附介質中有30mg碳時的約35％到有180mg碳時的約90％不等。如其它藥物一樣，Re在吸附介質中的％結合率隨Re與碳比例的增加而減小。然而，Re與碳的結合與朗繆爾等溫線的平衡結合不一致，并且與溫度和pH無關。在室溫將Re在生理鹽水中從各種預載有吸附Re的碳上釋放24小時，結果釋放了50％(重量比)。
通過將顆粒在含有緩沖的氯化鈉的吸附介質中于室溫培養，將Re分別吸附到鐵∶碳比例分別為70∶30和85∶15的載體顆粒上。通過分光光度分析法測定Re在顆粒上的結合量。這些實驗表明，在吸附介質中，Re在載體顆粒上的結合量隨碳(即顆粒中的碳)與Re比例的增加而增加。吸附放射性同位素的適用量將隨所需特定結果的不同而不同，例如為10pgm-700ng。本領域技術人員可輕易地確定出正確用量。兩種不同鐵∶碳載體顆粒組合物的結合參數如下表2所示表2

通過在鹽水中于流動條件下培養24小時，釋放了不到10％的Re。Re在載體顆粒上的低結合量與其它帶電小離子分子在活性炭上的低結合量相一致，而疏水性芳香分子具有高親合力結合。這些發現與使用吸附有Re或Tc的本發明載體顆粒作為造影劑和治療劑的應用相一致。
實施例4如上所述制備鐵∶碳比例為80∶20的載體顆粒。在吸附溶液中讓顆粒吸附不同濃度的各種藥物，以確定下述每種化合物的吸附曲線和吸附常數A.反義寡聚核苷酸用于反義基因指導治療的16-mer抗-C-Myc寡聚核苷酸是在5’末端用熒光素標記的寡聚脫氧核苷酸全硫代磷酸酯(MacromolecularResources，Fort Collins，CO)。將該寡聚核苷酸溶于在TE緩沖液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中制成的吸附貯備液中。依據制造商的使用說明，以1 AU260＝33μg寡聚核苷酸的假設測定該寡聚核苷酸在緩沖液中的濃度。使用標準曲線，由熒光素熒光(Exc.495nm，em.549nm)確定未結合藥物在吸附上清液中的濃度。B.光敏劑血卟啉二鹽酸鹽(Sigma Chemical，USA，H-1875.Lot#23H0879)是用于腫瘤治療的光敏劑。該化合物通過生物過程聚集在一些類型的腫瘤組織中。當暴露于光、例如通過激光提供的光下時，該化合物會經歷化學變化過程，以產生對其所聚集在其中的細胞有毒性的氧的單線態。制備吸附貯備液，依據G.Garbo等人Anal.Biochem.(分析生物化學)15170-81，1985的方法，通過分光光度法測定藥物濃度(λ403＝327mM-1，在1N鹽酸中)，該文獻引入本發明以作參考。在1N鹽酸吸附溶液中通過分光光度法測定未結合藥物在吸附上清液中的濃度。用市售軟件通過計算機分析確定的吸附方程是在403nm處，C(μg/ml)＝0.0984A2+1.85A。C.抗炎劑6-巰基嘌呤鈉鹽(Dr.Gruber，Burroughs Wellcome，Lot#7P2774提供)是抗炎劑。通過將含有該化合物的小瓶組分溶于10ml MilliQ水中來制備吸附貯備液。通過分光光度法測定在吸附上清液中的藥物濃度(標準曲線在311nm處，C(μg/ml)＝9.0A-0.035，R＝0.0999，在0.9％NaCl中，用NaOH將pH調節至10.4)。D.抗真菌劑兩性霉素B(Sigma Chemicals，A-4888，Lot 64H4005)是用于抗真菌感染的治療活性劑。在0.9％NaCl、10mM KOH、pH為12的溶液中制備貯備液，其濃度由修正為主要化合物含量(80％)的藥物重量得出。通過分光光度法測定吸附上清液中的藥物濃度，獲得了下述濃度曲線方程在403nm，C(μg/ml)＝3.61A2+18.1A+0.14，R＝0.9997，在0.9％NaCl、10mM KOH中。E.抗癌劑喜樹堿(Sigma Chemical，C-9911，Lot#34H0956)是用于一些類型腫瘤治療的抗增殖劑。通過把精確重量的藥物溶于體積比為1∶1(C/E 1∶1)的氯仿和乙醇混合物中，制得了濃度為2mg喜樹堿/ml的貯備液。通過分光光度法測定吸附上清液中的藥物濃度，獲得了下述濃度曲線方程在360nm，C(μg/ml)＝(16.7±0.26)A，在C/E 1∶1中。
還將喜樹堿以1mg/ml的濃度溶于pH為3.0的DMSO和0.9％鹽水溶液中。以253nm處的吸光度測定濃度(λmax＝253nm，在鹽水溶液中)。用0.9％鹽水溶液制備稀釋液，加入MTC顆粒以確定Langmuir結合等溫線。
將測定的吸附參數總結在下表3中表3

10.15M NaCl，20mM HEPES-Na，pH7.42在檢測限之下表3中的結果表明，藥物在載體顆粒上的結合量受吸附溶液或介質組成的明顯影響。喜樹堿是一種高度非極性分子。在高度非極性介質(氯仿/乙醇)中，藥物不優先離開吸附介質以吸附到碳上。然而，在極性更強的吸附介質中，據信藥物吸附到載體顆粒上是完全可能的。影響藥物在吸附介質中吸附到載體顆粒碳上的一個因素是藥物和顆粒之間的疏水性范德華相互作用。或者，可通過蒸發技術將藥物干燥到顆粒上，例如將紫杉醇(PAC)吸附到顆粒上。
實施例5用于吸附紫杉醇(PAC)的載體顆粒具有70∶30的鐵∶碳組分。所述碳是E型活性炭。為了分析測定鐵含量，采用下述方法。稱重一部分樣品(預先在真空干燥器中干燥過)，并在2000℃洗滌，以氧化所有存在的碳和鐵。在該處理過程中，碳定量地轉化成了二氧化碳并揮發了，剩余的是Fe2O3殘余物。假定最初不存在任何Fe2O3，通過公式Fe＝Fe2O3/1.42977計算鐵含量。假定碳是剩余部分。用LECO碳燃燒分析儀對另一部分樣品進行第二分析。將樣品燃燒，然后測定二氧化碳的量，并計算碳總含量。通過這兩種方法計算鐵和碳含量，獲得了可比結果，即顆粒中含有約69％重量的鐵元素。A.紫杉醇對復合顆粒的結合特性用兩種方法測定藥物吸附1)先通過UV分光光度法測定結合到不同活性炭上的藥物。自始至終使用HPLC(高壓液相色譜)或分光光度級的溶劑。在乙醇中測定的λmax是220nm。使用具有3mL石英比色杯的Milton Roy Spectronic 21分光光度計。選擇254nm波長進行UV分析，因為該波長能對藥物提供良好靈敏度。在該波長幾乎未發現或未發現各種分析技術或材料有的污染。HPLC分析使用同一波長。對于紫杉醇，在0.05-3.0mg/ml之間UV分析是線性的。
在一個測試中，載體顆粒含有KB型碳。其具有小的孔徑(約40nm有效半徑)、＞1000cm2/gm的表面積、和良好硬度。然而，PAC吸附能力是有限的。測定20種其它候選活性炭，最后選擇了3種預示有藥物遞送特性的活性炭，即A、B和E型碳。也測定了單獨的鐵粉。這些材料都是在含檸檬酸的乙醇中以30mg的濃度使用的。對于3mgPAC，通過UV方法分析給出了下述結合結果。A型碳＝74％，B型碳＝65％，E型碳＝33％，鐵粉＝0％(沒有結合)。A型碳和B型碳都是具有與E型碳相同的藥物釋放特征的大孔、大表面積(1800m2/gm)碳。E型碳是具有較小表面積的硬度更大的碳，因此其具有更好的碾磨特性。B.紫杉醇對不同活性炭的結合特性A、B和E型活性炭的分數結合(fb)(結合量占最初PAC量的分數)隨碳量的增加而增加(在固定PAC濃度下)。據顯示，A型和B型碳可以結合100％PAC，并且在結合曲線中于高活性炭含量下出現平穩段。E型碳的分數結合僅為68％。據顯示，結合能力Q(以％重量/藥物載體重量表示)隨活性炭量的增加而下降。對于A型碳，當碳的量從40mg下降到5mg時，結合能力Q從8％增加到44％。對于E型AC碳，相應的Q值約為5％-7％。
A型碳結合藥物的其它研究提出，在作為吸附劑量的函數的藥物結合分數中，平穩段是在載體表面上多層藥物覆蓋的結果。相反，分數結合中的線性增加表示的是單層覆蓋，因此與Langmuir等溫線分析一致。
我們的研究表明，A型碳和E型碳能在吸附介質中吸附大分數(fb)的PAC，其結合能力Q也很顯著。另一方面，鐵∶碳比例為70∶30的載體顆粒(E型碳)的結合能力和分數結合都下降了。與單獨的碳相比，這些下降的值與載體顆粒中按比例下降的碳含量是一致的。與之相反，對于具有結合能力較高的A型碳的載體顆粒，fb和Q值都低于2％。這可能是由于在生產期間該碳中的孔經不住磨碎過程的壓力所致。
盡管A型和B型活性炭對PAC有大量結合，但是在載體顆粒中使用E型碳是優選的，這是因為E型碳可商購獲得，并且在結合和釋放特性之間有適當平衡。此外，E型碳之所以是藥物載體優選使用的活性炭還是因為其已經被確立具有美國藥典(第22版)質量。附圖6表明了結合到鐵∶碳比例為70％∶30％(E型碳)的載體顆粒上的PAC(-○-)和僅含E型碳的載體顆粒上的PAC(-□-)的Langmuir吸附點。數據是通過簡單的未權重線性回歸擬合的。
使用一定范圍量的載體，測定鐵∶碳比例為70∶30(E型碳)的載體顆粒對PCA的親和(Km)與最大結合(Qm)常數。下表4表示了這些組合物的吸附等溫線的結果。這些值是由附圖6和Langmuir方程通過圖解確定的。
表4

親和常數＝(Km)；最大結合(mg藥物/mg載體)＝(Qm)將PAC附載在載體顆粒上，并通過HPLC測定藥物含量，然后將藥物釋放24小時或更長時間。在高達10小時內每2小時、然后每天測定一次以及替換一次液體。在前2個小時內，將0.54特斯拉的磁場置于一組包含顆粒的兩個試管上，在對照組試管上不加任何磁場。在藥物被磁保持的載體顆粒與沒有施加磁場的載體顆粒之間，沒有發現PAC釋放特性有任何統計學意義上的不同(數據未顯示)。
用不同量的PAC將吸附有PAC的載體顆粒和E型活性炭預附載。在豬血清(4ml)中于37℃放置72小時后，用5ml乙酸乙酯將游離PAC萃取一次。將乙酸乙酯萃取液分別在空氣中干燥，重新配制在5ml甲醇中，并經由Millex GV濾器過濾。隨后進行的HPLC分析表明，對于載體顆粒，在24小時內和72小時后藥物累積釋放了平均67％(介于53％和86％之間)，對于E型碳，平均64％。通過下述生物分析系統獨立地驗證了低水平釋放的PAC。C.磁場在流動物流中捕獲載體顆粒使用與Senyei等人(J.Appl.Phys.(應用物理雜志)49(6)3578，1978)所述相似的動力學流體流動循環模型，來評價在低(水)和高(35％甘油)粘度下的流動流體中將載體顆粒或鐵捕獲、保持、和聚集所需的力和距離。使用甘油模擬血液粘度。用流量和管直經模擬靜脈和動脈流量。用精密注射泵來獲得校準流體流動。磁體是釹-鐵-硼磁體(2.4×3.5cm)。用高斯計在離磁場表面不同距離處測定磁場。將磁體置于流出口上5cm處，并水平地移入和移出，以捕獲鐵和載體顆粒。完全(100％)捕獲或保持是本項實驗的終點。將懸浮液形式的載體顆粒或鐵粉通過注射器閥從距離泵注射器約40cm、且距離流出口40cm處引入。在甘油中將鐵或吸附有PAC的顆粒100％保持所需的磁場強度比在水中高約10％。
用人鱗狀癌細胞系SCC-9進行附載有PAC的載體顆粒的腫瘤細胞毒性生物分析。分別用下述物質培養6天后獨立地測定細胞生存力1)紫杉醇，2)附載有PAC的載體顆粒，3)E型活性炭，4)不含有藥物的載體顆粒，和5)鐵元素。該分析是Mosmann’s MTT細胞毒性技術的輕微變型。該分光光度法分析測定了活細胞的線粒體將黃色四唑鹽3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]2，5-二苯基四唑溴化物定量還原成其紫色甲簪衍生物。在這些實驗中使用的載體的量是0.5-117g/ml。包括DMSO(用于單獨的紫杉醇)在內，沒有任何對照組對SCC-9有細胞毒性。
同時評價單獨的長期CF克隆遺傳分析。在該分析中，將細胞鋪在35mm培養皿上，并置于上述藥物和對照中。將處理細胞培養2-3周，以能形成菌落。將這些菌落固定在2％乙酸和8％乙醇中，并用結晶紫染色。將菌落在Bella Glass Plate Reader上計數。對于附載有紫杉醇的微載體，用于CF分析的IC50是1×10-2g/mL，對于單獨的紫杉醇，IC50是3×10-3g/mL。對于從載體顆粒中釋放的PAC和單獨的紫杉醇，在500和1000個鋪展細胞時，通過MTT分析測得的IC50相等，是9×10-3g/孔。測定藥物或化學誘導的細胞毒性的MTT分析是“真正”細胞殺死的代用品。因此，使用菌落形成(CF)分析通常需要更多的藥物來證實給定水平的細胞殺死。因此，劑量反應曲線轉移到了更高濃度水平的紫杉醇上。
此外，在培養物腫瘤細胞上的不含藥物的載體顆粒的磁場保留，沒有發現任何不利作用。單獨游離紫杉醇的IC50(5ng/ml)與使用或不使用磁鐵從載體顆粒上釋放的紫杉醇的IC50(5ng/ml)相等。在這兩種情況中，在體外細胞毒性評價期間載體顆粒對細胞沒有表現出任何不利作用。
這些結果表明，藥理活性紫杉醇可從本發明載體上釋放，吸附和釋放的藥物的化學分析可通過生物方法證實。從游離紫杉醇和從載體顆粒上釋放的紫杉醇獲得了類似劑量反應曲線。
如本說明書所述，用A型活性炭作為碳原料制備具有介于95∶5-45∶55之間的不同鐵∶碳比例的鐵碳載體顆粒。將顆粒在于鹽水-檸檬酸鹽緩沖液(pH7.4)中含有0.67mg/ml阿霉素(Dox)的吸附溶液中培養，以確定具有不同組成的復合顆粒對Dox的結合能力和結合。下表5表示了這些實驗的結果。
表5

*結合能力＝mg Dox/mg載體顆粒％**結合＝4mg Dox/25mg所加載體顆粒表5中的數據表明了顆粒的鐵∶碳組成與其對藥物的結合之間的關系。
實施例6進行其它實驗以比較吸附溶液的組成對Dox在鐵∶碳比例介于60∶40-80∶20之間的載體顆粒上的結合的影響。配制下述6種測試吸附介質組合物，以提供足夠粘度將載體顆粒在吸附Dox期間保持實體分開。先將顆粒置于粘性劑中，然后加入Dox/鹽水溶液。
1. 10％甘露醇；2％羧甲基纖維素鈉(CMC)(粘性介質)；2％聚乙烯吡咯烷酮(在50mM檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中的PVP)。
2. 5％甘露醇；2％CMC；2％PVP，在50mM檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中。
3. 5％甘露醇；2％CMC；2％PVP；5％山梨醇，在檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中。
4. 10％甘露醇；1％CMC；2％PVP(K15)，在10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中。
5. 10％甘露醇；1％CMC鈉；磷酸鉀緩沖液(pH7.4)。
6. 5％山梨醇；1％CMC鈉；2％PVP(K15)；5％甘露醇；在磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中。
用每一上述吸附介質進行的吸附實驗表明，使用上面第4、5和6組的制劑，載體顆粒對Dox有最高吸附。
或者，可先將顆粒與Dox/鹽水溶液混合，然后再加入粘性劑。在該方法中，10％甘露醇和5％CMC提供了理想結果。
實施例7一些卟啉是用于光動力治療腫瘤的光敏化合物。所謂的“第二代”光敏劑在650nm波長處表現出主要吸附峰，在美國、日本和歐洲，有許多這類化合物正在進行臨床試驗。篩選出幾類光敏劑用于對具有不同組成的鐵∶碳顆粒進行比較結合。使用在特定光敏劑激活波長(通常是主要波長)附近的波長來定量測定藥物。結果發現，以80mcg/ml(0.11mM)濃度在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4中的各種卟啉便于進行初始結合實驗。測試的光敏劑是血卟啉衍生物(HPD)；苯并卟啉衍生物單酸A(BPD-ma)；Photofrin porfimer sodium(PF2)；和clorin e6。對于結合實驗，10mg碳或50mg鐵∶碳顆粒是最適的。這4種化合物的辛醇/緩沖液(pH7.4)分配系數如下HPD＝1；clorin e6＝1.1；PF2＝0.1；BPD-ma＝4000。
這些結合實驗的結果總結在下表6中表6

為了獲得更高負載水平的BPD-ma，用1.4mM在異丙醇(含有0.5％0.02M乙酸)中的藥物作為吸附介質，采取18小時的長平衡時間，測定4種原型鐵碳顆粒載體(MTCs，或磁靶向化合物)對該藥物的結合能力和分數結合。如下表7所示，通過該技術，將藥物的初始濃度增加10倍以后，結合能力提高了30倍。
表7BPD-ma結合和釋放的總匯

這些結果表明，在結合能力和所用藥物總量的分數結合方面，使用A型碳、且鐵∶碳比例為60∶40的載體顆粒(MTC 15.1)與其它測試顆粒顯著不同。當使用磁場來幫助把未結合的BPD-ma從每一載體上洗掉時，MTC 15.1載體顆粒沒有給出其它溶液所給出的澄清溶液。據假定，在結合過程中，有大量碳從顆粒表面上釋放了出來。與之相反，使用A型碳、且鐵∶碳比例為70∶30的載體顆粒(MTC 26.2)比其它測試載體顆粒更有效地去掉了未結合的BPD-ma，同時保持了良好水平的初始吸附。
實施例8在一種滅菌技術中，可用γ放射將顆粒在玻璃瓶中滅菌。在該系統中，用發自鈷放射源的2.5-3.5 Mradγ射線把至少1000個小瓶同時滅菌。例如，可以以該方式把批量顆粒0198(用A型碳制得的)和0498(用KB型碳制得的)滅菌。滅菌后分別進行測試，發現顆粒保留了所有制備的特性，例如粒徑分布和阿霉素結合能力。相類似的是，可將賦形劑水溶液通過在121℃用高壓滅菌器處理30分鐘來滅菌。例如，將批量0398(100ml/瓶)和批量0598(20ml/瓶)以這種方式滅菌。滅菌后分別進行測試，發現保留了所有制備的特性，例如能在適于對人給藥的載體中將顆粒懸浮。
實施例9已經表明喜樹堿能結合到用K型碳制備的、且鐵∶碳重量比為75∶25的MTC顆粒上。喜樹堿可從0.9％鹽水溶液或10％乳糖溶液中結合到顆粒上，但是優選從鹽水中結合。下圖表示的是在一定范圍溶液濃度下的結合，并表明從鹽水中的最大結合能力為大約110μg/mg MTC(11％)。
表8喜樹堿從鹽水中的吸附
喜樹堿有兩種市售衍生物，托泊替堪和伊立替康，正在進行臨床試驗的第三種化學衍生物稱為氨基喜樹堿。這些衍生物是對喜樹堿分子作了較小化學改變。這些和其它化學衍生物應當也能結合。
實施例10已經表明甲氨蝶呤能結合到用K型碳制備的、且鐵∶碳重量比為75∶25的MTC顆粒上。甲氨蝶呤可從0.9％鹽水溶液或10％乳糖溶液中結合到顆粒上，但是優選從鹽水中結合。下圖表示的是在一定范圍溶液濃度下的結合，并表明從鹽水中的最大結合能力為大約100μg/mgMTC(10％)。
表9甲氨蝶呤從鹽水中的吸附 甲氨蝶呤有一種化學衍生物，氨基蝶呤，該衍生物是對甲氨蝶呤分子作了較小化學改變。這些和其它化學衍生物應當也能結合。甲氨蝶呤屬于葉酸拮抗劑類分子。這些分子干擾葉酸在癌細胞中的合成。葉酸拮抗劑在結構上是類似的，因為它們的作用方式需要它們結合并抑制特定酶的作用。葉酸拮抗劑的實例有pyritrexin、10-乙基-10-去氮雜氨基蝶呤、曲美沙特、5，10-去氮雜-10-炔丙基葉酸、和5，10-二去氮雜四氫葉酸鹽。這些和其它葉酸拮抗劑應當也能結合。
實施例11已經表明紫杉醇能結合到用K型碳制備的、且鐵∶碳重量比為75∶25的MTC顆粒上。紫杉醇可從乙醇或cremaphor EL制劑中結合到顆粒上，但是優選從檸檬酸鹽緩沖水乙醇混合物中結合。下圖表示的是在一定范圍溶液濃度下的結合，并表明從檸檬酸鹽緩沖水乙醇混合物中的最大結合能力為大約160μg/mg MTC(16％)。結合延伸到0％-16％之間的所有濃度。
表10Langmuir等溫線Darco KB

紫杉醇已經結合到由其它3種碳組成的顆粒上。在每種顆粒中觀測到的最大結合如下表所示表11

紫杉醇是紫杉醇(taxol)的化學衍生物，紫杉醇(taxol)有另一種化學衍生物—taxotere。存在其它紫杉醇(taxol)衍生物(大多數是半合成得到的)，杉醇(taxol)和紫杉醇有類似的結構。這些衍生物是對紫杉醇(taxol)分子作了較小化學改變。這些和其它化學衍生物應當也能結合。
實施例12已經表明維拉帕米能結合到用K型碳制備的、且鐵∶碳重量比為75∶25的MTC顆粒上。維拉帕米可從乳糖或鹽水溶液中結合到顆粒上，但是優選從鹽水中結合。下圖表示的是在一定范圍溶液濃度下的結合，并表明從鹽水中的最大結合能力為大約140μg/mg MTC(14％)。結合延伸到0％-14％之間的所有濃度。
表12維拉帕米結合能力對未結合藥物的濃度的關系 實施例13制備鐵碳顆粒，并吸附阿霉素以制備0.4mg/ml阿霉素和5.0mg/ml載體的所得劑量溶液。對Yorkshire馴養豬的肝臟動脈選擇性地插入導管以給藥。每10-30分鐘給動物進行3-6脈沖的輸注，以給予14.2-18mg累積劑量的阿霉素。在輸注期以及輸注后15-30分鐘期間放置外置磁體。將動物評價28天，然后處死。病理組織學評價表明，每15分鐘在7.5ml輸注循環中給予的18mg阿霉素是最大耐受劑量。該測定主要是基于肝臟壞死和肝門區域發生改變作出的。
權利要求
1.一種包含顆粒的磁響應組合物，其中所述顆粒包含碳和鐵，其中碳基本上均勻地分布在顆粒的整個體積內，每一顆粒的橫截面尺寸低于約5μm，并且碳選自A型碳、B型碳、E型碳、K型碳、KB型碳、及其化學改性型。
2.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的阿霉素。
3.權利要求2的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
4.權利要求3的組合物，其中阿霉素的平均含量高達顆粒重量的20％。
5.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的喜樹堿或其類似物。
6.權利要求5的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
7.權利要求6的組合物，其中喜樹堿的平均含量高達顆粒重量的20％。
8.權利要求5的組合物，其中所述喜樹堿類似物是托泊替堪。
9.權利要求8的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
10.權利要求9的組合物，其中托泊替堪的平均含量高達顆粒重量的20％。
11.權利要求5的組合物，其中所述喜樹堿類似物是伊立替康。
12.權利要求11的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
13.權利要求12的組合物，其中伊立替康的平均含量高達顆粒重量的20％。
14.權利要求5的組合物，其中所述喜樹堿類似物是氨基喜樹堿。
15.權利要求14的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
16.權利要求15的組合物，其中氨基喜樹堿的平均含量高達顆粒重量的20％。
17.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的紫杉醇或其類似物。
18.權利要求17的組合物，其中所述紫杉醇類似物是taxotere。
19.權利要求18的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
20.權利要求19的組合物，其中taxotere的平均含量高達顆粒重量的20％。
21.權利要求17的組合物，其中所述紫杉醇類似物是紫杉醇(paclitaxel)。
22.權利要求21的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
23.權利要求22的組合物，其中紫杉醇(paclitaxel)的平均含量高達顆粒重量的20％。
24.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的維拉帕米或其類似物。
25.權利要求24的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
26.權利要求25的組合物，其中維拉帕米的平均含量高達顆粒重量的20％。
27.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的葉酸拮抗劑。
28.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是甲氨蝶呤。
29.權利要求28的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
30.權利要求29的組合物，其中甲氨蝶呤的平均含量高達顆粒重量的20％。
31.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是氨基蝶呤。
32.權利要求31的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
33.權利要求32的組合物，其中氨基蝶呤的平均含量高達顆粒重量的20％。
34.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是pyritrexin。
35.權利要求34的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
36.權利要求35的組合物，其中pyritrexin的平均含量高達顆粒重量的20％。
37.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是10-乙基-10-去氮雜氨基蝶呤。
38.權利要求37的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
39.權利要求38的組合物，其中10-乙基-10-去氮雜氨基蝶呤的平均含量高達顆粒重量的20％。
40.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是曲美沙特。
41.權利要求40的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
42.權利要求41的組合物，其中曲美沙特的平均含量高達顆粒重量的20％。
43.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是5，10-去氮雜-10-炔丙基葉酸。
44.權利要求43的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
45.權利要求44的組合物，其中5，10-去氮雜-10-炔丙基葉酸的平均含量高達顆粒重量的20％。
46.權利要求27的組合物，其中所述葉酸拮抗劑是5，10-二去氮雜四氫葉酸鹽。
47.權利要求46的組合物，其中鐵∶碳的重量比為約80∶20-60∶40。
48.權利要求47的組合物，其中5，10-二去氮雜四氫葉酸鹽的平均含量高達顆粒重量的20％。
49.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的放射性同位素。
50.權利要求49的組合物，其中所述放射性同位素的量為約10pgm-700ng。
51.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有診斷量的放射性同位素。
52.權利要求51的組合物，其中所述放射性同位素的量為約10pgm-700ng。
53.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有治療量的生物活性物質。
54.權利要求53的組合物，其中所述生物活性物質是藥物、放射性物質、或遺傳物質。
55.權利要求54的組合物，其中所述放射性物質是186Re、188Re、123I、125I、或90Y。
56.權利要求1的組合物，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且其上吸附有診斷量的生物活性物質。
57.權利要求56的組合物，其中所述生物活性物質是放射性同位素、造影劑、染料或遺傳物質。
58.權利要求57的組合物，其中所述放射性物質是186Re、188Re、99Tc。
59.一種用于將生物活性物質給到患者體內位點的藥盒，它包含受器，所述受器包含a)單位劑量的干燥鐵碳顆粒，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且碳分布在顆粒的整個體積內；和b)一種或多種干燥的賦形劑，其中所述賦形劑的量為，當在水溶液中使用時該含量的賦形劑能促進生物活性物質吸附到顆粒上。
60.權利要求59的藥盒，其中單位劑量為約0.05-約0.5克顆粒。
61.權利要求59的藥盒，其中所述賦形劑包括當加到水溶液中時用于把顆粒分開的生物相容性聚合物，
62.權利要求59的藥盒，其中所述賦形劑包括甘露醇、羧甲基纖維素鈉、或它們的組合物。
63.權利要求59的藥盒，其中藥盒的內含物是與生物活性物質的市售制劑組合的。
64.一種用于將生物活性物質給到患者體內位點的藥盒，它包括a)第一個受器，該受器包含單位劑量的干燥鐵碳顆粒，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且碳分布在顆粒的整個體積內；和b)第二個受器，該受器包含一種或多種干燥的賦形劑，其中所述賦形劑的量為，當在水溶液中使用時該含量的賦形劑能促進生物活性物質吸附到顆粒上。
65.權利要求64的藥盒，其中單位劑量為約0.05-約0.5克顆粒。
66.權利要求64的藥盒，其中所述賦形劑包括當加到水溶液中時用于把顆粒分開的生物相容性聚合物，
67.權利要求64的藥盒，其中所述賦形劑包括甘露醇、羧甲基纖維素鈉、或它們的組合物。
68.權利要求67的藥盒，其中甘露醇的量為10％，羧甲基纖維素的量為5％。
69.權利要求64的藥盒，其中藥盒的內含物是與生物活性物質的市售制劑組合的。
70.權利要求64的藥盒，其中單位劑量的鐵碳顆粒已經γ輻射滅菌。
71.權利要求64的藥盒，其中含有賦形劑的水溶液已經高壓滅菌器滅菌。
72.一種將包含鐵碳顆粒的組合物滅菌的方法，其中包括使用γ輻射。
73.權利要求71的方法，其中所用γ輻射的量為2.5-3.5Mrad。
74.一種用于將生物活性物質給到患者體內位點的藥盒，它包含單位劑量的干燥鐵碳顆粒，其中所述顆粒的橫截面尺寸為約0.1μm-5.0μm，每一顆粒包含的鐵∶碳重量比為約95∶5-50∶50，并且碳分布在顆粒的整個體積內。
全文摘要
本發明公開了磁控或定向的鐵碳顆粒組合物,及其應用和制備方法。本發明組合物還可攜帶吸附在顆粒上面的生物活性物質。本發明組合物包含尺寸為0.1－0.5μm、優選為0.5－5.0μm的體積混合的顆粒,所述顆粒含有1.0－95.0%(重量)的碳,優選含有約20%－約60%(重量)的碳。所述顆粒可通過將鐵和碳粉混合物機械碾磨來制得。還可將所得顆粒置于生物活性物質的溶液中,以將生物活性物質吸附到顆粒上。本發明組合物通常是以懸浮劑形式給藥。
文檔編號A61K9/18GK1348362SQ99803728
公開日2002年5月8日 申請日期1999年1月6日 優先權日1998年1月6日
發明者V·A·沃爾孔斯基, S·D·久克舍爾斯特諾夫, S·V·切爾尼亞科夫, L·M·阿倫, T·B·肯特 申請人:費克斯公司