專利名稱：通過鼻內接種il－12加強免疫性的制作方法
相關申請本申請是于1998年3月5日遞交的美國申請No.09/035,188的部分繼續，前一申請通過在此引述而全文引入本文。
背景技術：
粘膜表面是細菌和病毒入侵的主要門戶，因此該表面構成了宿主的防御體系的第一界限。這樣，加強粘膜免疫性的免疫接種策略對于阻止感染性疾病具有實際的意義。但是大多數非腸道給藥的疫苗在誘導最佳粘膜免疫性時僅僅部分有效。因此，需要能夠加強粘膜免疫性和以安全，非入侵的方式釋放的佐劑。
發明概述如本文所述，鼻內白細胞介素(IL-12)治療可以有效地加強抗原特異性的免疫應答并且加強粘膜疫苗的免疫接種策略。因此，本發明涉及加強和/或誘導宿主(例如哺乳動物，包括人)對病原體的免疫應答(例如全身的，粘膜的)，它包括以有效量的IL-12和病原體的抗原(例如蛋白質，碳水化合物，脂類，重組DNA，整個生物體，毒素，有機分子)給宿主鼻內給藥。如本文所述，免疫應答是抗原特異性的。另外，免疫應答導致Th1型的細胞因子應答(例如干擾素-γ)和/或體液應答(例如IgG2a,IgG2b,IgG3)的加強表達。
在一個實施方案中，本發明涉及加強宿主對病原體的免疫應答的方法，包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。在另一個實施方案中，本發明涉及誘導宿主對病原體的免疫應答的方法，包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
在一個特定的實施方案中，本發明涉及誘導宿主對粘膜病原體的免疫應答的方法，它包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
本發明還包括誘導宿主對病原體的Th1類似的免疫應答的方法，包括它包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
本發明還涉及加強宿主對病原體的粘膜免疫應答的方法，包括它包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
如本文所述的以IL-12鼻內給藥有效地加強粘膜和全身腔室中抗原特異性的應答的結果，證明以IL-12鼻內給藥可用于獲得對抗病原體的免疫接種策略有效的潛在的疫苗佐劑，例如粘膜病原體。
附圖簡述附
圖1A-1C是顯示以IL-12鼻內給藥對呼吸道粘膜免疫應答的作用的條塊圖；數據以每組4個小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示；以對應于滴定曲線的線性部分的稀釋度測試支氣管肺泡的灌洗(對于IgG1和IgA1∶64，對于IgG2a為1∶8)。
附圖2A-2E是血清稀釋的倒數的O.D.405nm的圖，顯示鼻內IL-12給藥對全身抗體應答的作用；實心標記代表用DNP-OVA+IL-12注射的動物，空心標記代表用DNP-OVA+磷酸緩沖的鹽水(PBS)的動物；各個線代表抗體與單個小鼠的結合。
附圖3A-3B是顯示鼻內IL-12給藥對總Ig水平的作用的條塊圖；該數據以每組4個小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示；以對應于滴定曲線的線性部分的稀釋度測試血清(對于IgG1為1∶6400，對于IgG2a為1∶200)。
附圖4A-4F是顯示IL-12非腸道和鼻內給藥對糞便粘膜應答的作用的條塊圖；所顯示的數據代表第21天時對IgA的抗體應答和第28天時對IgG異型的應答，各個反應性應答的峰，該數據以每組4個小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示。
附圖5A-5B是血清稀釋的倒數的O.D.405nm的圖，顯示鼻內IL-12給藥對全身抗體應答的作用；在0天以純化的來自于流感病毒的血凝素和神經氨酸酶(HANA)免疫接種小鼠和以IL-12(閉合的三角)或磷酸緩沖鹽水(PBS)載體(開口的環)在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠；采用HANA-包被的微滴板異型-特異性的ELISA測定第14天時血清抗-HANA抗體的水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合。
附圖6A-6B是血清稀釋的倒數的O.D.405nm的圖，顯示鼻內IL-12給藥對全身抗體應答的作用；在0天以HANA免疫接種小鼠和以IL-12(閉合的三角)或PBS載體(開口的環)在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠；在14天時加強接種；采用HANA-包被的微滴板異型-特異性的ELISA測定第28天時血清抗-HANA抗體的水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合。
附圖7A-7B是血清稀釋的倒數的O.D.405nm的圖，顯示鼻內IL-12給藥對全身抗體應答的作用；在0天以HANA免疫接種小鼠和以IL-12(閉合的三角)或PBS載體(開口的環)在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠；在14和28天時加強接種；在第28天時小鼠還接收IL-12或載體；在第35天時殺死小鼠；采用HANA-包被的微滴板通過ELISA分析BAL體液的抗-HANA水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合。
附圖8A-8B是顯示鼻內IL-12給藥對亞單位流感疫苗的早期全身抗體應答在影響。在0天時以H1N1亞單位流感疫苗免疫接種小鼠，以IL-12(閉合的三角)或PBS載體(開口的環)在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠。采用H1N1-包被的微滴板通過異型-特異性的ELISA測定第14天時血清抗-H1N1抗體的水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合(每組4個小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的結合的差異是顯著的，對于IgG2a是p＜0.05。
附圖9A-9E是顯示鼻內給藥的IL-12給對亞單位流感疫苗的晚期全身抗體應答造成的影響。在0天以H1N1亞單位流感疫苗免疫接種小鼠，以IL-12(閉合的三角)或PBS載體(開口的環)在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠；在14和28天時加強接種；在第28天時小鼠還接收IL-12或載體；在第35天時采用H1N1-包被的微滴板通過異型特異性-ELISA測定血清抗-H1N1抗體水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合(每組4個小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的結合的差異是顯著的，對于IgG2a，總Ab和總Ig是p＜0.05。
附圖10A-10D是顯示鼻內IL-12給藥對呼吸道粘膜應答的影響的圖。在0天以H1N1亞單位流感疫苗免疫接種小鼠，以IL-12或PBS載體在0,1,2和3天鼻內治療的小鼠；在14和28天時加強接種；在第28天時小鼠還接收IL-12或載體；在第35天時殺死小鼠；采用H1N1-包被的微滴板通過ELISA分析BAL體液的抗-H1N1抗體水平；各條線代表來自于單個小鼠的抗體的結合(每組4個小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的結合的差異是顯著的，對于IgG2a，總Ab和IgA是p＜0.05。
附圖11A-11D是顯示流感亞單位疫苗+IL-12共給藥保護小鼠免受亞序列流感病毒感染的圖。以H1N1亞單位疫苗免疫+IL-12(閉合的三角)，疫苗+PBS載體(開口的環)，單獨的IL-12(開口的菱形)或單獨的PBS載體(開口的方塊)免疫接種小鼠。然后在4-5星期后所有的小鼠(每組8個)用103pfu(A)或2×103pfu(B)的A/PR/8/34流感病毒攻擊所有小鼠(每組8個)。每天監控小鼠的死亡率和重量的損失。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的成活性差異是顯著的，p＜0.05。
附圖12A-12B是顯示IL-12誘導的抗B細胞介導的流感病毒感染的保護作用的圖。以H1N1亞單位疫苗免疫+IL-12(閉合的三角)，疫苗+PBS載體(開口的環)，或單獨的PBS載體(開口的菱形)免疫接種小鼠μMT。用PBS載體預處理野生型(WT)小鼠(開口的方塊)。然后在6-7星期后所有的小鼠(每組8個)用103pfu的A/PR/8/34流感病毒攻擊。每天監控小鼠的死亡率和重量的損失。
附圖13是顯示從以亞單位流感病毒+IL-12免疫接種小鼠被動轉移的血清授予的抗病毒攻擊的保護作用。從以H1N1亞單位流感疫苗+IL-12(閉合的三角)，疫苗+PBS載體(開口的環)，或單獨的PBS載體(開口的方塊)免疫接種小鼠收集血清。在無菌的PBS中以1∶10稀釋儲存的血清并且以0.1毫升/小鼠的劑量鼻內注射。然后在5小時以后將所有的小鼠(每組7-8個)用103pfu的A/PR/8/34流感病毒攻擊。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的成活性差異是顯著的，p＜0.05。
附圖14A-14B是顯示從以亞單位流感病毒+IL-12免疫接種小鼠被動轉移的鼻內BLA液體授予的抗病毒攻擊的保護作用。從以H1N1亞單位流感疫苗+IL-12(閉合的三角)，疫苗+PBS載體(開口的環)，或單獨的PBS載體(開口的方塊)免疫接種小鼠收集BLA體液。然后給所有的小鼠(每組8個)用儲存的BLA體液和2×103pfu的A/PR/8/34流感病毒接種。以疫苗和IL-12免疫接種的小鼠和以疫苗和PBS載體免疫接種的小鼠之間的成活性差異是顯著的，p＜0.05。
發明的詳細描述如本文所述，已經檢查了以半抗原-載體抗原免疫接種的小鼠的全身性和粘膜細胞因子和抗體生產。結果顯示鼻內IL-12給藥在治療的小鼠的脾臟和肺誘導Th1類似的細胞因子和抗體方式。結果證明鼻內IL-12接種是影響粘膜和全身性免疫性的強有力的手段。
因此，本發明涉及加強和/或誘導宿主抗病原體(一個或多個)的免疫性的方法，包括以有效量的IL-12和病原體的抗原(例如粘膜病原體)給宿主鼻內給藥。本發明的方法可用于加強哺乳動物宿主的對抗原的免疫應答，例如靈長類動物(例如人)，鼠，貓，犬，牛或豬宿主。
如本文所述，術語“加強”和/或“加強”是指增強對病原體的現有的免疫應答。該術語也是指對病原體的(啟動，誘導)免疫應答的開始。
用于本發明方法的抗原(一個或多個)誘導(或抗原從……獲得)，但是不限于蛋白質或其片段(例如蛋白水解片段)，肽(例如合成的肽，多肽)，糖蛋白，碳水化合物(例如多糖)，類脂，糖脂，半抗原偶合物，重組DNA，整個生物體(殺死或減毒)或其部分，毒素和類毒素(例如破傷風，百日咳，霍亂)和/或有機體分子。用于本發明的特定的抗原的例子包括從流感病毒獲得或衍生的血凝素和神經氨酸酶。
從各種各樣的病原體或有機體，例如細菌(例如芽孢桿菌，B組鏈球菌，包特菌屬，利斯特，炭疽芽孢桿菌，肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌)，病毒(例如肝炎，風疹，脊髓灰質炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒)，分枝桿菌(結核分枝桿菌)，寄生蟲(利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬)和真菌(例如念珠菌屬，隱球菌屬，球孢子菌屬，曲霉屬)，可以獲得或衍生出抗原，在宿主中抗這些抗原的免疫應答是令人滿意的。利用本領域內技術人員已知的技術可以獲得病原體的抗原。例如，可以直接從病原體分離(純化，基本上純化)抗原，利用化學合成抗原衍生或利用重組方法可以獲得抗原。另外，可以從商業途徑獲得抗原。用于本發明的合適的抗原是包括至少一個B和/或T細胞抗原表位(例如T輔助細胞或胞溶性T細胞抗原表位)的一種。用于本發明組合物的其它合適的抗原可以通過本領域內技術人員已知的方法測定。
IL-12是近來鑒定的異源二聚體細胞因子，具有75kDa的分子量并且由二硫橋鍵的40kDa和35kDa亞單位組成。它是由提供抗原的細胞例如巨噬細胞和樹突細胞產生的并且結合到活化的T,B和NK細胞上的受體[Desai,B.B.,等人，免疫學雜志，148:3125-3132(1992)；Vogel,L.A.,等人，國際免疫學，8:1955-1962(1996)]。它具有幾個作用，包括1)加強的T序列和NK細胞的增殖，2)提高的T細胞，NK細胞和巨噬細胞的胞溶性活性，3)IFN-γ生產的誘導和以最小的程度誘導TNF-α和GM-CSF和4)Th1細胞的活化[Trinchieri,G.,等人，血液，84:4008-4027(1994)]。已經證明IL-12是在Th1克隆的增殖的重要的共同刺激劑(Kennedy等人，歐洲免疫學雜志24:2271-2278,1994)和導致當鼻內給藥時血清中IgG2a抗體的產生增加[Morris,S.C.等人，免疫學雜志152:1047-1056(1994)；Germann,T.M.等人，歐洲免疫學雜志25:823-829(1995)；Sher,A.等人，美國科學院年報795:202-207(1996)；Buchanan,J.M.等人，國際免疫學雜志，7:1519-1528(1995)；metzger,D.W.等人，歐洲免疫學雜志27:1958-1965(1997)]。IL-12鼻內給藥也可以臨時降低IgG1抗體的產生[Morris,S.C.等人，免疫學雜志152:1047-1056(1994)；McKnight,A.J.免疫學雜志，152:2172-2179(1994)；Buchanan,J.M.等人，國際免疫學雜志，7:1519-1528(1995)]，表明抑制Th2應答。IL-12的純化和克隆公開于PCT申請公開號92/05256和WO90/05147，歐洲專利公開號322,827(鑒別為“CLMF”)。
如本文所述，“白細胞介素-12”和“IL-12”是指白細胞介素12蛋白質，它的單個的亞單位，它的單個的亞單位的多聚體，IL-12的功能片段，和“白細胞介素-12”和“IL-12”的功能等同物和/或類似物。如本文所述，IL-12的功能片段是當鼻內給藥時，調節抗宿主的抗原的免疫應答的片段。還如本文定義的，“白細胞介素-12”和“IL-12”的功能片段或等同物包括修飾的IL-12蛋白質，以便獲得的IL-12的生產具有本文所述的IL-12的活性(例如當鼻內給藥時加強免疫應答的能力)。“白細胞介素-12”的功能等同物或片段也包括核酸序列(例如DNA,RNA)和其部分，它編碼本文所述的具有IL-12功能或活性的蛋白質或多肽(例如當鼻內給藥時加強免疫應答的能力)。另外，該術語包括通過遺傳密碼的簡并編碼相似的肽基因的產物如IL-12的核苷酸序列并且具有本文描述的IL-12的活性。例如，“白細胞介素-12”和“IL-12”的功能等同物包括含有“靜止”密碼子替代的核苷酸序列(例如編碼一個氨基酸的密碼子替代編碼相同氨基酸的另一個密碼子)的核苷酸序列或含有“靜止”氨基酸替代的一個氨基酸序列(例如，一個酸性氨基酸替代另一個酸性氨基酸)。
適用于本發明方法的IL-12可以從各種各樣的來源獲得或利用已知的技術合成。例如，IL-12可以從天然來源(例如哺乳動物，例如人來源)純化(分離，基本上純化)，由化學合成生產或通過重組DNA技術產生。另外，與本發明一起使用的IL-12可以從商業途徑獲得。
在本發明的方法中以有效量的IL-12鼻內給藥，該量是誘導和/或加強對宿主的抗原的免疫應答的量。尤其是，“有效量的IL-12”是當以抗原給宿主鼻內給藥時，相對于當有效量的IL-12不是鼻內給藥宿主時對宿主的免疫應答而言，加強對宿主的抗原的如本文所述的免疫應答的量。就是說，“有效量”的IL-12是當以抗原鼻內給藥時，相對于如果IL-12不是以IL-12鼻內給藥時產生的對抗原的免疫應答而言加強本文所述的對抗原的免疫應答的量。
IL-12和/或抗原可用于作為預防疫苗或治療疫苗給藥。即在宿主中出現和/或顯露病原體的作用之前(抑制)或之后(治療)以IL-12給藥。因此以IL-12和/或抗原給宿主給藥，它顯示由從其獲得或衍生抗原的病原體引起的疾病狀態，或沒有顯示由由從其獲得或衍生抗原的病原體引起的疾病狀態。因此，在宿主中疾病狀態顯露之前或之后以IL-12和/或抗原給宿主給藥，可以導致由從其獲得或衍生抗原的病原體引起的疾病狀態的啟動的抑制，減輕或去除或延遲。
如本文所述，IL-12和抗原鼻內給宿主給藥。可以使用鼻內給藥的常規途徑。例如，可以使用透過表皮或粘膜襯里(例如將IL-12和/或抗原利用鼻的合劑給藥；將IL-12和/或抗原利用滴眼劑給眼睛給藥，其中IL-12和/或抗原流到鼻腔)。另外，可以將IL-12和抗原與其它成分或生物學活性試劑例如佐劑(例如膠)，藥物學可接受的表面活性劑(例如甘油)，脂質體，賦形劑(例如乳糖)，載體，稀釋劑和媒體一起給藥。如果需要，也可以加入甜味劑，香味劑和/或增色劑。
此外，在其中抗原是蛋白質(肽)的實施例，IL-12和/或抗原可以以宿主體內表達的多聚核苷酸編碼的多肽給藥。例如IL-12或抗原可以利用活的載體給藥宿主，其中含有IL-12和抗原核苷酸序列的活載體在其中IL-12和/或抗原可以體內表達的條件下鼻內給藥。也可以用編碼和體內表達抗原的載體與IL-12蛋白質和/或肽或者與編碼和體內表達IL-12蛋白質的載體一起鼻內注射到宿主。含有編碼抗原和IL-12蛋白質的序列的單個載體也可用于本發明的方法。
幾個表達載體系統是商業上可獲得的或可以用根據重組DNA和細胞培養技術再生產。例如，載體系統例如酵母或疫苗病毒表達系統，或病毒載體可用于該方法和本發明的組合物(Kaufman,R.J.,A細胞和分子生物學方法雜志2:221-236(1990))。利用裸露的質粒或DNA，和囊包于靶脂質體或紅細胞血影的克隆的基因的其它技術可用于將IL-12多聚核苷酸導入到宿主(reidman,T.,科學，244:1275-1281(1991)；Rabinovich,N.IL，等人，科學，265:1401-1404(1994))。利用遺傳工程技術可以完成表達載體的構建和將載體和核酸轉移到各種宿主細胞，如在類似于分子克隆和現在的分子生物學方案手冊中描述的，在此可以引入作為參考，或利用商品試劑盒(Sambrook,J.,等人.,分子克隆，冷泉港出版社，1989；Ausubel,F.M.,等人.,現在的分子生物學方案，Greene出版社和Wile□Interscience,1989)可以完成。
如本文所述，以IL-12和抗原給宿主體內給藥可以加強受體宿主的免疫應答。例如，本發明涉及誘導對宿主的病原體的Th14類免疫應答的方法，包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。本發明也涉及加強對宿主的病原體的粘膜的免疫應答的方法，包括以有效量的IL-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。本文描述的方法可以導致IFNγ的表達加強。另外可以誘導和/或加強宿主的體液免疫應答，導致IgG2a,IgG2b和/或IgG3抗體的表達加強。免疫應答可以是抗原特異性的。
在宿主中加強對抗原的免疫應答的方法中，以有效量的IL-12給宿主體內給藥，該量是加強和/或誘導宿主對抗原的免疫應答和導致宿主的條件改善的量(即，抑制，減輕或去除由從其獲得或衍生抗原的病原體存在下引起的疾病或紊亂)。用于加強宿主中對抗原的免疫應答的IL-12的量將根據各種各樣的因子進行變化，包括宿主的大小，年齡，體重，總的健康，性別和食料，給藥分時間，疾病狀態的持續時間或特定的性質。IL-12的合適的劑量范圍通常每千克體重約0.5微克到約150微克。在一個實施方案中，劑量范圍是從每千克體重約2.75微克到約100微克。在另一個實施方案中，劑量范圍是從每千克體重約5微克到約50微克。從體外衍生的劑量應答曲線推知有效的劑量。
在本發明的方法中，將有效量的IL-12與抗原一起鼻內給藥。即，在相對于以抗原免疫接種宿主的相近的時間以IL-12給藥，以便相對于沒有以IL-12免疫接種而言給宿主對抗原的免疫應答進行誘導或加強。因此，在免疫接種之前或優選地剛好在免疫接種之前，在免疫接種的時間(即皮下)；或在免疫接種之后(隨后)將IL-12鼻內給藥。另外可以在用抗原免疫接種，隨后在抗原免疫接種之后以IL-12隨后給藥之前將IL-12鼻內給藥。
如本文所述，鼻內和以非侵入的方式給藥IL-12重新將免疫系統的粘膜腔室指導到Th1類型的細胞因子和抗體發布情況。如本文所述IL-12的體內釋放調節在免疫系統的遠緣全身的腔室中細胞因子和抗體的表達方式。
用DNP-OVA+IL-12鼻內免疫接種的小鼠顯示在以24小時時表示的最大表達之后6小時肺中加強的IFN-γmRNA水平。在脾臟中在IL-12給藥之后IFN-γmRNA水平有類似的增加。IFN-γTh性別亞型的潛在的免疫調節劑和其效應子的功能(Trinchieri,G.,等人，免疫學研究146:423431(1995)；Trinchieri,G.,今天的免疫學，14:335-338(1993))。特異性地說，已經證明IFN-γ激活巨噬細胞鼻腔調節異型轉變為IgG2aand IgG3抗體的產生，它是類型免疫應答的特征[Snapper,C.M.,等人，科學，236:944～947(1987)；Snapper,C.M.,等人，免疫學雜志140:2121-2127(1988)；Finkelman,F.D.,等人，免疫學雜志140:1022-1027(1988)]。類似地，T-細胞應答的重要的負調節劑是白細胞介素-10[IL-10)[Meyaard,L.,等人。免疫學雜志，156:2776-2782(1996)]。IL-10主要是由T細胞和單核細胞產生的并且通過其在提供抗原的細胞的作用發揮調節作用[Fiorentino,D.F.,等人，免疫學雜志146:3444-3451(1991)；Ding,L.,等人，免疫學雜志148:3133-3139(1992)]。
近來，幾個研究者已經發現IL-12流感誘導人T細胞分泌IL-10[Meyaard,L.,等人，免疫學雜志156:2776-2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫學雜志157:12-20(1996)；Gerosa,F.,等人，實驗方法雜志183:2559-2569(1996)]。在這些研究工作中，評價了鼻內給藥IL-12在肺和脾臟中誘導IL-10mRNA的能力。該結果清楚地顯示IL-12誘導IL-10mRNA的能力。但是，僅僅在接種后24小時注意到最大表達。在IL-12處理后對誘導IL-10mRNA表達的延遲表明該細胞因子參與設計為調節IL-12/IFN-γ的作用的反饋機理。還對作為針對Th2分化的特異性標記物的IL-5mRNA進行分析，并且發現在用IL-12治療的小鼠的肺部IL-5mRNA明顯降低。該結果與檢查鼻內給藥IL-12對全身免疫性的作用的其它結果一致[Trinchieri,G.,等人，免疫性研究.,146:423431(1995)；Trinchieri,G.,今天的免疫學，14:335-338(1993)；Manetti,R.,等人，實驗方法學雜志.,177:1199-1204(1993)；Hsieh,CS.,等人，科學，260:547-549(1993)]并且進一步支持IL-12的免疫調節功能。該結果清楚地證明鼻內IL-12給藥可以誘導全身性和粘膜腔室的Th1-型細胞因子應答。
由于體內產生的細胞因子可以決定在免疫應答期間產生的抗體的分布[Finkelman,F.D.,等人，免疫學綜述年報303-333(1990)]，檢查了BAL，血清和糞便提取物中抗原特異性的抗體的水平，抗原和IL-12的鼻內釋放導致BAL IgG2a抗體水平明顯加強。這是鼻內IL-12給藥可以調節小鼠的呼吸道抗體應答的第一個證據。Yang等人[Yang,.,等人，自然方法學1:890-893(1995)]以前證明IL-12和重組腺病毒的呼吸道接種導致BAL中抗原特異性的IgA的降低，沒有改變IgG水平。但是該系統中IL-12的作用沒有完全根據IgG異型定性并且因此關于IL-12可能在呼吸道抗體應答中的作用沒有任何信息。此外，呼吸道內接種是入侵性的并且與免疫接種方案沒有相關性。根據宿主的防御系統本文描述的結果具有重大意義，因為抗病毒感染的較低呼吸道的保護作用是與IgG抗體[Palladino,G.,等人，病毒學雜志69:2075-2081(1995)]。此外，已知IgG2a異型的鼠抗體在補體的調理和固定是非常有效的，其初步的機理是參與呼吸道病原體例如肺炎沙門氏桿菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的清除。
以前的研究工作證明鼻內IL-12給藥可以改變小鼠的應答雞蛋白溶菌酶(HEL)的異型-限制的抗體[Buchanan,J.M.,等人國際免疫學7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美國科學院年報，79S:100-115(1996)]。非腸道注射IL-12+HEL大大地提高了HEL-特異性血清IgG2a和臨時抑制的IgG1抗體的產生。另外，其它人[McKnight,AJ.,等人，免疫學雜志152:2172-2179(1994)；Morris,S.C.,等人，免疫學雜志152:1047-1056(1994)；Germann,T.,等人，免疫學雜志25:823-829(1995)；Wynn,TA.,等人，免疫學雜志157:40684078(1996)；Bliss,3.,等人，免疫學雜志156:887-894(1996)]已經證明鼻內IL-12給藥加強了血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗體對蛋白質抗原的應答。
本文所述的是下面事實由非侵入性途徑鼻內釋放的IL-12能夠以類似的方式影響血清抗體應答。與僅僅接收抗原的動物相比以抗原和IL-12鼻內免疫接種的小鼠顯著地提高了血清IgG2a,IgG2b和IgG3的水平。所觀察到的IgG2a和IgG3水平的增加與IL-12誘導IFN-γ的能力一致，這是IgG2a和IgG3抗體應答的潛在的開關因子[Metzger,D.W.,et a1.歐洲免疫學雜志27:1958-1965(1997)；Snapper,C.M.,等人，科學236:9～947(1987)；Snapper,C.M.,等人，實驗方法雜志175:1367-1371(1992)；Collins,3.T.,等人，國際免疫學雜志5:885-891(1993)]。另外，到第28天以IL-12治療的情況，失去了對起始IgG1的抑制，這與以前的發現一致[Buchanan,IM.,等人，免疫學雜志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美國科學院年報795:100-115(1996)]。這些結果證明IL-12可以以非入侵的方式鼻內釋放以類似于非腸道給藥的方式影響體液的應答。因此鼻內IL-12給藥對于蛋白質疫苗的釋放是安全的和有效的佐劑。
也如本文所述，發現鼻內或非腸道給藥IL-12導致糞便的IgG2a抗體水平增加。相反，鼻內以IL-12治療導致IgA的表達降低，而IL-12的非腸道釋放導致IgA水平增加。這些結果顯示IL-12借助于兩種不同的給藥途徑給藥其作用有重要的差異。近來，與本文所述的數據相反，Okada等人[Okada,E.,等人，免疫學雜志，159:3638-3647(1997)]報道以表達IL-12的質粒中的HIV DNA疫苗鼻內免疫接種不限定糞便IgA抗體水平。此外，Marro等人[Marinaro,M.,等人.,實驗方法雜志185:415427(1997)]報道囊包于脂質體中的IL-12的口腔釋放沒有改變IgA水平，而非腸道給藥導致糞便IgA應答的降低。在Marinaro等人的研究工作中，對于釋放IL-12的兩條途徑，口腔以抗原免疫接種小鼠，這樣于本文所述的結果難于進行直接比較，本文的結果利用了釋放抗原+IL-12的不同途徑。該結果清除地顯示IL-12分化影響糞便抗體應答的能力取決于免疫接種的途徑。
對開發安全的，潛在的和更好的靶擊的抗一定范圍內的感染性疾病的疫苗佐劑一直是研究的重點[Van Regemnortel,M.,ASMNews,63:136-139(1997)]。其部分原因是目前批準用于人的佐劑例如明礬失去了激發細胞介導的免疫學的能力。對于抗特定的疾病的保護作用這是關鍵性的(Gupta，等人，″佐劑和釋放系統在調節對疫苗的免疫應答中的作用，設計和生產疫苗的新方案，Cohen,S.和Shaffemian，編輯，A.,Plenum出版社出版，紐約1996,pp.105-113)。在疫苗的研制過程中，合適的Th細胞的激活是與免疫系統的調節整合的。例如，已經證明ml型免疫應答保護免受Leishmania菌的感染[Muller,I.,等人，免疫學綜述，112:95-113(1989)]和利斯特菌(Listeria)的感染[Kratz,S.S.,等人，免疫學雜志141:598-606(1988)]。由于其指導Th細胞轉變為IFN-γ分泌增加和IgG2a水平增加的Th1表現型的能力，在免疫調節中IL-12是關鍵的細胞因子。這樣，本文所述的結果證明鼻內使用IL-12作為佐劑加強疫苗的免疫學。而且，在目前的階段，沒有用于臨床的合適的粘膜佐劑。由給途徑即時IL-12給藥可以與目前用于臨床實驗的鼻用流感疫苗結合使用。由于抗流感的保護作用是由IgG抗體介導的[Palladino,G.,等人，病毒學雜志，69:2075-2081(1995)]，IL-12鼻內共給藥是增加抗流感的粘膜和全身抗體應答的手段。關于這一點，如本文所述，亞單位流感疫苗+IL-12的鼻內給藥顯著增加了全身和呼吸道IgG2a水平。
如本文所述，將非侵入性的鼻內釋放系統用于提高IL-12調節免疫系統的粘膜和全身腔室的能力。發現與沒有接收IL-12的小鼠相比用偶合到OVA(NP-OVA)的DNP與CTB和IL-12一起免疫接種小鼠已經提高了肺部和脾臟中IFN-□和IL-10mRNA轉錄物的水平。另外抑制了肺部IL-5mRNA的表達。在IL-12治療之后發現BAL顯示IgG2a和未改變的IgG1和IgA抗OVA抗體水平顯著增加。通過鼻內IL-12給藥顯著增加了血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗-DNP抗體水平，而抑制了血清IgG1抗體水平，結果類似于全身性的抗原+IL-12給藥之后觀察到的結果。與增加糞便IgG2a和IgA抗體表達的非腸道治療相反鼻內IL-12釋放也加強了糞便的IgG2a和抑制了水平，這些結果顯示鼻內IL-12治療可以有效地調節抗原特異性免疫應答并且加強用于粘膜疫苗的免疫接種方案。
總之，該結果清楚地證明用于增加粘膜和全身性腔室的抗原特異性應答的IL-12鼻內給藥的效果。該結果顯示IL-12可作為抗粘膜病原體的免疫接種方案的潛在的疫苗佐劑。
因此，本文的描述和方法可用于治療和/或抑制與宿主中具有一個或多個抗原的病原體相關的疾病或狀態。本文所述的方法可以利用有效量的與單個抗原或來源于相同的病原體，來源于一個病原體的不同菌株或來源于不同的病原體的多個抗原結合的IL-12。因此，IL-12和一個或多個抗原可用于抑制和/或治療與從其獲得抗原的病原體的一種或多種疾病或狀態。
通過下面的實施例描述本發明，這些實施例不是用于以任何方式對發明進行限制。
實施例1通過鼻內白細胞介素12的釋放調節粘膜和全身性的免疫學材料和方法6到8周齡的雌性BALB/c小鼠是從國家癌癥研究院(Bethesda,MD)獲得。將小鼠圈養于Ohio醫學院的動物飼養器中，并且隨時提供食物和水。Ohio醫學院動物護理和實驗程序按照國家動物護理和使用委員會(IACUC)的規定。鼻內免疫接種方案對腹膜內用鹽酸氯胺酮(Forr Dodge實驗室，Fort Dodge,IO)和X□lazine鹽酸賽拉嗪(Ba□er Corporation,Shawnee Mission,KA)結合麻醉的小鼠進行鼻內治療，麻醉時濃度分別為每個小鼠80毫克和16毫克。在0天，以50毫升的含有100微克的偶合到卵白蛋白(D NP-OVA；Biosearch Techno1ogies,San Raphael,CA)和10微克的霍亂毒素B-亞單位(CTB；Sigma,St.Louis,MO)的二硝基苯半抗原無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)免疫接種小鼠。在0天，1,2和3天之后以1微克的溶于含有1％正常重組BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS中的重組鼠IL-12鼻內給藥，對于對照小鼠，僅僅用PBS-NMS給藥。用相同量的DNP-OVA和CTB在第14天和第28天給小鼠鼻內加強給藥。在第28天，小鼠接收1微克的溶于PBS-NMS的IL-12或僅僅PBSNMS。對于鼻內接種，在0天用溶于完全弗氏佐劑(CFA；Life Technologies,Galthersburg,MD)，隨后在0,1,2和3天，用溶于PBS-NMS的1微克IL-12注射。對照小鼠僅僅接收抗原和PBS-NMS。在第14和28天以相同的途徑用溶于不完全弗氏佐劑(IFA；Life Technologies)的DNP-OVA加強免疫。在第28天，以單獨的溶于PBS-NMS或PBS-NMS的IL-12腹膜內注射小鼠。通過從小鼠的眼眶采血制備血清。RNA分離根據制造商的說明用Trizol試劑(Gibco-BRL Gaithersburg,MA)從速凍的脾臟和肺部分離總RNA。簡單地說，用臼和缽勻漿冷凍的組織，立即轉移到含有2毫升的Trizol試劑的聚苯乙烯試管。將勻漿的樣品在室溫下保溫5分鐘以允許核蛋白復合物的解離并且以12000g在4℃離心10分鐘。將上清液與0.4毫升的氯仿混合15秒，置于冰上保溫，并且以12000g在4℃離心15分鐘。離心之后，通過加入1毫升的異丙醇在20℃將液相中的RNA沉淀1小時。以12000g將樣品離心15分鐘并且用1毫升的75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。將沉淀空氣干燥2-5分鐘，溶解于DEPC處理的水中，并且儲存于-80℃。利用單鏈RNA的A260值計算總RNA的濃度(1A260單位=40微克的單鏈RNA/ml)。最后制備的總的RNA產生260/280比例為1.7-2.0。cDNA合成的第一條鏈根據制造商的說明(Gibco-BRL)進行第一條鏈cDNA的合成。簡單地說，將1微克的寡聚(dT),3微克的總RNA，和無菌的DEPC-處理的水加入到無菌的eppendorf試管至終體積為11微升。將混合物于70℃動物20分鐘，然后于冰上冷凍。隨后，依次加入下面的成分4.0微升的5X第一條鏈的緩沖液，2微升的0.1M DDT，和1微升的dNPT混合物(各10mM的dATP,dGTP,dCTP和dTTP)。將試管的內含物緩慢混合并且在42℃保溫2分鐘，隨后加入1微升(200U)的轉錄物Ⅱ逆轉錄酶(RT)。將反應混合物緩慢混合并且在42℃保溫1小時，然后在70℃保溫15分鐘中止反應。聚合酶鏈反應(PCR)用下列成分31.30微升DEPC處理的水，10.0微升的5×Tris-HCL緩沖液(對于各個引物組沉淀最適鎂和pH)，來自于第一條鏈合成的2微升的cDNA，2微升引物(20微摩爾濃度的原液濃度)，5.0微升的dNTP混合物(2.5mM aATP,2.5mM dCTP,2.5mMdGTP,和2.5mM dTTP,pH8.0)(Invitrogen公司)，和0.5微升1(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)在無菌的eppendorf試管中制備50微升的反應混合物。將試管置于Perkin Elmer熱循環儀480(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)的孔中，在95℃保溫5分鐘并且然后進行下面的擴增反應95℃1分鐘，56℃1分鐘和72℃進行1分鐘，持續35個循環。隨后的在72℃保溫10分鐘，隨后在4℃進行滲透循環。在2.5％的瓊脂糖凝膠上制備PCR產物并且以溴化已啶染色。觀察譜帶，利用透射照相。將次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)用作為管家對照以確保在所有的泳道RNA的負載量相同并且將100bp DNA梯(Gibco-BRL)用作為分子量標記物。引物序列HPRT5′GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT G3′(SEQ ID NO:1)5′GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C3′(SEQ ID NO:2)IL-55′ GAC AAG CAA TGA GAC GAT GAG 3′(SEQ ID NO:3)5′ GTT ATC CTT GGC TAC ATT ACC 3′(SEQ ID NO:4)
IL-105′ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT T3′(SEQDNO:5)5′ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG GTT T3′(SEQ IDNO:6)IFN-γ5′TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG3′(SEQ ID NO:7)5′CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG3′(SEQ ID NO:8)支氣管肺泡的灌洗液(BAL)和糞便提取物的收集為了收集BAL，殺死小鼠并且將其氣管暴露，利用0.58mmOD聚乙烯導管(Becton Dickinson,Sparks,MD)保溫。將肺用含有5mMEDTA的PBS浸泡至2-3倍。每個小鼠獲得約1.5毫升的浸泡液并且利用Hemastix(Bayer公司，Elkhart,IN)監測血污染。以12000g在4℃離心5分鐘回收的BAL體液，在-70℃儲存上清液直到使用。通過deVos和Dick[deVos,T.,等人，免疫方法學雜志，141:28S-288(1991)]的方法制備糞便提取物。簡單地說，將來自于各個小鼠的0.1克的糞便材料于1毫升的PBS混合，并且置于室溫下保溫5分鐘。隨后將樣品渦旋5分鐘并且以12,000xg離心10分鐘。然后在-70℃儲存上清液。采用ELISA檢測抗體和異型的水平如下所述[Buchanan,3.M.,等人，國際免疫學，7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,歐洲免疫學雜志，27:1958-1965(1997)]。采用ELISA測定抗-DNP和抗-OVA抗體水平。
簡單地說，用溶于PBS的10微克/毫升DNP-牛血清白蛋白(BSA)或100微克/毫升的OVA包被微滴板(Nalge NuncInternational,Rochester,N□)。用含有0.1％(w/v)明膠和0.05％(v/v)吐溫20的PBS洗滌該平板。然后加入連續稀釋的血清或BAL體液并且在將該平板在室溫下保溫2小時。再次將該平板洗滌并且與偶合到堿性磷酸酶(Southern生物技術協會，Birmingham,AL)的羊抗小鼠IgG1,IgG2a,IgG2b或IgG3一起保溫1小時。洗滌該平板和加入p-硝基苯磷酸酶底物獲得最適的顯色反應。在405nm用ELISA微滴板(Bio-Tek Instruments,Winooski,VT)對該平板讀數。為了檢測IgA，將該孔用偶合到生物素(Sigma,St.Louis,MO)的羊抗小鼠IgA一起保溫，在加入底物之前用偶合到鏈霉抗生物素(Biorad,Richmond,CA)的堿性磷酸酶一起保溫。在相同的模式測量總的免疫球蛋白，不同的是用10微克/毫升的親和純化的羊抗小鼠Ig(Southern生物技術協會)[Buchanan,J.M.等人，國際免疫學雜志7:1519-1528(1995)]包被該平板。在所有的情況下，利用純化的已知的異型的mycloma蛋白質(Sigma,St Loius,:MO)測定第二抗體偶合物的合適的工作釋放液和異型特異性。此外，利用僅僅以BSA包被的平板建立測試的抗原特異性。利用兩端加尾的StudentⅠ-測試測定統計學顯著性。如果p值＜0.05認為從統計學上說該數據是顯著的。結果鼻內IL-1釋放誘導肺和脾臟的Th1類的應答。為了測定鼻內抗原+IL-12是否調節肺的細胞因子mRNA的表達，以DNPOVA和CTB+/-IL-12免疫接種小鼠，在6和24小鼠之后通過RT-PCR分析單個動物的肺中細胞因子mRNA水平。發現在以IL-12治療之后6小時小鼠中IFN-γmRNA的表達急劇增加，并且與沒有與IL-12接觸的免疫接種的小鼠相比，該表達的增加至少保持24小時。在6小時之后以IL-12治療的小鼠的肺中IL-10mRNA的表達沒有差異，但是在接種之后24小時觀察到表達增加。由于已經發現IFN-γmRNA下調Th2型細胞因子例如IL-5[Mosmann,TIL,等人，免疫性綜述年報7:145-173(1989)；Coffman,ILL.,等人，免疫性綜述.,123:189-207(1991)]，也監測了IL-5mRNA的表達并且到6小時強力較低，在24小時之后仍然明顯。
肺中細胞因子的表達相當于以抗原+IL-12鼻內接種之后脾臟。以IL-12治療之后6小時脾臟的IFN-γmRNA表達增加。這種增加延續到24小時，而未治療的小鼠在此時IFN-γmRNA幾乎沒有可檢測的增加。在IL-12治療的小鼠的脾臟中也監測了IL-10mRNA水平的增加，與未治療的對照相比在24小時有最大的增加。靜脈IL-12給藥誘導IL-10表達的能力以前已經由其他人證明[Me□aard,L.,等人，免疫學雜志156:277&2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫學雜志，157:12-20(1996)；Gerosa,F.,et aL,J Eq,Meci,183:255902569(1996)]。最后，與肺的情況相反，在IL-12處理的或對照小鼠的脾臟沒有檢測到IL-5，而在鼻內抗原處理之后檢測IL-5mRNA，但是受IL-12共給藥的抑制。HPRT mRNA同時擴增證實在所有RT-PCR反應中使用等量的RNA。這些結果清楚地證明I在粘膜和全身性腔室中IL-12鼻內給藥可以調節抗原衍生的細胞因子反應，導致IFN-□和IL-10mRNA的表達顯著加強。這些結果也為鼻內釋放的IL-12具有負調節Th2-相關的細胞因子，IL-5的表達的能力提供了強有力的證據。鼻內IL-12給藥調節呼吸道抗體應答以前的研究工作[Buchanan,R.I.,等人，國際免疫學雜志，7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美國科學院年報年報795:100-115(1996)；McKnight,AJ.,等人，免疫學雜志152:2172-2179～994)；Morris,S.C.,等人，免疫學雜志152:1047-1056(1994)；Germann,T.,等人，歐洲免疫學雜志，25:823-829(1995)；W□m,TA.等人，歐洲免疫學雜志157:40684078(1996)；Bliss,3.,等人，歐洲免疫學雜志156:887-89～(1996)]證明非腸道釋放IL-12加強了血清IgG2a抗體應答蛋白質和半抗原載體抗原的能力。IL-12也暫時抑制了IgG1的產生[Buchanan,3.M.,等人，免疫學雜志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美國科學院年報795:100-115(1996)]。如本文所述，現在已經證實鼻內IL-12給藥以相同的方式調節呼吸道抗體應答。在免疫應答的35天收集BAL體液并且通過ELISA分析。與沒有與IL-12接觸的免疫接種的小鼠(附圖1A-1C)相比，以DNP-OVA免疫接種和以IL-12鼻內治療的小鼠顯示IgG2a抗-OVA抗體水平急劇增加(p＜0.05)。對于對照和實驗組IgG1或IgA抗-OVA抗體水平之間沒有差異。在呼吸道分泌沒有白蛋白存在下排除血液污染。這些結果提供了鼻內釋放IL-12改變呼吸道抗體應答的能力的第一證據。鼻內IL-12給藥調節血清抗體應答ELISA分析第14天的血清顯示與接收DNP-OVA和載體的(附圖2A-2E)對照小鼠相比，小鼠的DNP-OVA和IL-12鼻內接種也導致血清IgG2a抗-DNP抗體水平顯著增加(p＜0.05)。另外，在IL-12治療之后血清IgG2b和IgA抗-DNP抗體水平顯著增加(p＜0.05)。重要的是，在鼻內IL-12治療之后28天，血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗-DNP應答仍然增加。在IL-12治療的小鼠第14天血清IgG1抗-DNP抗體的產生受到抑制，但是IgA抗-DNP抗體水平幾乎沒有改變。但是，到第28天免疫應答失去了用IL-12治療的觀察到的起始的IgG1抑制，顯示IgG1的抑制僅僅是臨時的作用。也檢查了鼻內IL-12治療對血清總(非特異性)IgG1和IgG2a水平的影響。發現治療之后14天，IL-12治療的小鼠血清IgG2a有相應的增加，IgG1降低(附圖3A-3B)。IL-12接種之后4星期仍然觀察到該模式。IL-12對糞便抗體的影響檢查鼻內或靜脈給藥IL-12對糞便抗體應答的影響。與沒有接觸IL-12的小鼠相比(附圖4AAF)，采用任一途徑給藥的抗原和IL-12的小鼠糞便IgG2a抗-DNP抗體水平顯著提高(p＜0.05)。事實上，僅僅非腸道接收抗原的小鼠糞便提取物沒有可檢測的IgG2a。當以抗原和IL-12非腸道治療時也導致糞便IgA水平增加(p＜0.05)，鼻內釋放IL-12導致IgA抗體水平r降低(p＜0.05)。在非腸道和鼻內免疫接種之后IL-12治療的和導致IL-12治療的和對照組之間糞便的IgG1抗體水平顯著不同。這些結果顯示與非腸道注射IL-12所看到的結果類似，鼻內釋放IL-12和抗原誘導IgG產生的變化。但是，僅僅IL-12非腸道給藥導致粘膜IgA抗體水平增加。利用純化的來源于流感病毒的血凝素和神經氨酶檢測IL-12對全身性抗體應答的影響利用純化的來源于流感病毒(HANA)的血凝素和神經氨酸酶檢測鼻內IL-12給藥對全身性抗體應答的影響。在0天以HANA鼻內免疫接種小鼠和在0,1,2和3天以IL-12或PBS載體鼻內治療小鼠。采用異型-特異性ELISA，利用HAHA包被的微滴板測定第14天血清抗HANA抗體水平，參見附圖5A-5B。另外，在0天以HANA免疫接種小鼠，和在0,1,2和3天以IL-12或PBS載體鼻內治療小鼠，在第14天加強接種。在第28天，利用HAHA包被的微滴板，采用異型-特異性ELISA測定血清抗HANA抗體水平。參見附圖6A～6B。鼻內IL-12給藥對呼吸道粘膜應答的影響檢測鼻內IL-12給藥對呼吸道粘膜應答的影響。在0天以HANA免疫接種小鼠和在0,1,2和3天以IL-12或PBS載體治療小鼠，在14和28天加強接種。在第28天小鼠接收IL-12或載體。在第35天殺死小鼠，利用HAHA包被的微滴板，通過ELISA分析BAL體液中抗-HANA抗體水平。參見附圖7A-7B。
實施例2鼻內IL-12是保護粘膜免疫學的有效的佐劑方法小鼠從國家癌癥研究院(Bethesda,MD)獲得6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。C57BL/6 IgM缺陷(μMT)是從Jackson實驗室(BarHarbor,ME)購買的。將小鼠圈養于Ohio醫學院的動物飼養器中，并且隨時提供食物和水。Ohio醫學院動物護理和實驗程序按照國家動物護理和使用委員會(IACUC)的規定。免疫接種靜脈用鹽酸氯胺酮(Fort Dodge實驗室，Fort Dodge,10)和X□lazine鹽酸賽拉嗪(Bayer公司，Shawnee Mission,KA)麻醉的小鼠進行鼻內治療。在0天以反應1微克亞單位流感疫苗的25 M1of無菌PBS免疫接種小鼠，所述疫苗由可溶性的血凝素亞型1(HI)和從Dr.Doris提供A□PR8134流感病毒純化的神經氨酸酶亞型1(N1)(Bucher，紐約醫學院，紐約)組成。在0,1,2和3天以溶于含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS的重組小鼠IL-12的lpg鼻內接種或僅僅以PBS-NMS接種的對照小鼠。在14和28天以相同量的疫苗鼻內加強接種小鼠。在第28天，小鼠還接收溶于PBS-NMS IL-12或僅僅接收PBS-NMS。以這種治療方式沒有觀察到毒性。通過從小鼠的眼眶采血制備血清。RNA分離和RT-PCR根據制造商的說明用Ambion總RNA分離試劑盒(Austin,TX從速凍的脾臟和肺部分離總RNA。簡單地說，用臼和缽勻漿冷凍的組織，立即轉移到含有1毫升的變性溶液的試管。以苯酚和氯仿提取之后。以12000g在4℃離心勻漿的樣品10分鐘。將上清液進行另一輪的苯酚-氯仿提取，獲得的RNA以異丙醇沉淀，用75％乙醇洗滌兩次，溶于DEPC治療的水，通過在260納米處以分光光度計測定總RNA的濃度。利用逆轉錄試劑盒(Life Technologies,Gaithersburg,MD)，利用寡聚(dT)16-18引物將3微克的總RNA逆轉錄為cDNA。利用特異于IFN-γ和IL-10的引物次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)引物作為對照擴增獲得的cDNA。利用具有下列序列的有義和反義引物IFN-γ5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′(SEQ ID NO:7) 和5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG-3′(SEQ ID NO:8)；IL-1051-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTT-3′(SEQ ID NO:5)和51-ATTTCGGAGAGAGGTACAAACGAGGTTT-3′(SEQ ID NO:6)；
HPRT5′-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3′(SEQ ID NO:1)和5′-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3′(SEQ ID NO:2)。
通過將溶于60mM Tris-HCl(pH8.5),15mM(NH4)2SO4,0.4mM MgCI2的終體積為50微升的2微升的cDNA，0.25mM dNTPs(Invitrogen公司，San Diego,CA),0.8微摩爾濃度引物和2.5U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)混合進行PCR擴增。在95℃保溫該混合物5分鐘，然后進行下面的擴增在95℃1分鐘，56℃1分鐘和在72℃1分鐘，持續35個循環。隨后在72℃延伸最后的10分鐘。在2.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，用溴化已啶染色，通過UV透射觀察。核糖核酸酶保護分析利用RiboQuant多探針核糖核酸酶保護系統(Pharmingen,SanDiego,CA)，根據制造商的說明，測定細胞因子mRNA水平。簡單地說，在56℃10微克的總RNA與32p標記的RNA探針過夜雜交。用核糖核酸酶在30℃消化單鏈核酸45分鐘，進行苯酚-氯仿的提取，在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。在Storm 840Phosphorlmager(Molecular Dynamics,Sunnyvale；CA)定量測定轉錄物水平。將總RNA標準化為管家基因甘油醛3-磷酸脫氫酶和將相對的細胞因子mRNA水平以任意值表達支氣管肺泡灌洗液的收集為了收集BAL體液，殺死小鼠，利用0.58mmOD聚乙烯導管(Becton Dickinson,Sparks,MD)保溫其氣管。將肺用含有5mMEDTA的PBS浸泡至2-3倍。以12,000g在4℃離心5分鐘回收的BAL體液，在-70℃儲存上清液直到使用。采用ELISA檢測抗體和異型的水平基本上按照所述(Buchanan,3.M.,等人，國際免疫學，7:1519-1528(1995)；Buchanan,O R.M.,等人，免疫學雜志161:5525-5533(1998))采用ELISA測定血清和BAL中抗-H1N1水平，僅僅進行了微小的改變。
簡單地說，用溶于PBS的10微克/毫升H1N1包被微滴板(Nalge Nunc International,Rochester,NA)過夜。該微滴板用含有0.3％Brij-35(Sigma,St.Louis,MO)的PBS洗滌并且在室溫下用含有5％胎牛血清(Hyclone實驗室，Logan,UT)和0.1％的Brij-35的PBS在室溫下封阻1小時。然后加入連續稀釋的血清并且在將該平板在室溫下保溫2小時。將該平板洗滌并且與偶合到堿性磷酸酶(Southern生物技術協會，Birmingham,AL)的羊抗小鼠IgG1,IgG2a一起保溫。保溫1小時之后，洗滌該平板和加入p-硝基苯磷酸酶底物獲得最適的顯色反應。在405nm用ELISA微滴板(Bio-TekInstruments,Winooski,VT)對該平板讀數。為了檢測IgA，將該平板用偶合到生物素(Sigma,St.Louis,MO)的羊抗小鼠IgA一起保溫，，然后洗滌并且用偶合到鏈霉抗生物素(Biorad,Richmond,CA)的堿性磷酸酶一起保溫。在相同的模式測量總的免疫球蛋白，不同的是用10微克/毫升的親和純化的羊抗小鼠Ig(Southern生物技術協會)(Buchanan,3.M.,等人，國際免疫學雜志7:1519-1528(1995))包被該平板。在所有的情況下，利用已知異型的(Sigma)骨髓瘤蛋白質測定第二抗體偶合物的合適的工作稀釋液和異型特異性。利用兩頭加尾的Student t-測試測定統計學差異。如果p值＜0.05統計學上認為該數據是顯著的。病毒攻擊為了進行保護研究，在第0天以含有1微克H1N1亞單位流感疫苗的25微升的PBS免疫接種小鼠。隨后在0,1,2和3以鼻內接種溶于PBS-NMS的1微克的IL-12Ⅰ或僅僅以PBS-NMS接種。一些小鼠僅僅接收溶于PBS-NMS的IL-12或僅僅以PBS-NMS(非H1N1亞單位疫苗)。在初次接種4-5星期之后，利用(由Dr.DorisBucher提供的)感染性A1PR8134流感病毒通過鼻內給藥在40微升無菌的PBS中麻醉小鼠進行病毒攻擊。每天稱重小鼠并且檢測發病率和死亡率。血清和BAL體液的被動轉移對于被動轉移實驗，在鼻內用H1N1亞單位疫苗免疫接種之后在第28天獲得血清。用儲存的血清的100微升的1∶10稀釋液靜脈注射小鼠并且5小時以后用感染性病毒鼻內攻擊。在鼻內用H1N1亞單位流感疫苗免疫接種之后第35天從小鼠收集的BAL體液離心去除細胞并且將上清液與病毒一起以40微升的總體積給麻醉的小鼠給藥。結果在免疫接種的小鼠的肺和脾臟中鼻內IL-12給藥誘導Th1型細胞因子的表達已經證明了通過其較好地激活Th1和NK細胞，IL-12非腸道給藥對免疫系統具有調節作用，并且誘導IFN-γ的產生[Trinchieri,G.,等人，免疫學研究，146:423431(1995)；Gately，等人，免疫學綜述年報16:495-521(1998)]。如本文所述，現在已經檢查了IL-12鼻內給藥對呼吸道細胞因子基因表達的影響。在單獨的鼻內接種IL-12或PBS載體和H1N1亞單位流感疫苗之后分析單獨的小鼠(每組3個)的肺中細胞因子mRNA的表達。治療之后24或48小時殺死小鼠，通過RT-PCR分析總肺RNA中指示的細胞因子的表達IL-10(455bp),IFN-γ(459bp)和HPRT(162bp)。發現與僅僅用疫苗免疫接種相比，在24小時內以流感H1N1亞單位疫苗和IL-12鼻內治療對肺JFN-γmRNA水平具有加強作用。IL-12接種48小時之后仍然有證據證明IFN-γmRNA水平的增加。
以前已經證明(Meyaard,L.,等人，免疫學雜志，1s6:277～2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫學雜志，157:12-20(1996)；Gerosa,F,等人，實驗方法雜志183:2559-2569(1996))用IL-12治療加強了IL-10mRNA的表達。如本文所述，H1N1疫苗+IL-12的鼻內釋放也導致肺IL-10mRNA的表達水平的急劇增加，相反，在僅僅接收疫苗的小鼠中沒有IL-10mRNA。在48小時之后，與僅僅接收疫苗的動物相比IL-12治療的小鼠的肺中IL-10mRNA表達顯著增加。也檢查了IL-5mRNA的表達并且在IL-12治療之后沒有發現差異。
為了測定IL-12原位粘膜釋放調節遠距離的全身性腔室，檢查了免疫接種的小鼠的脾臟中細胞因子mRNA模式。在單獨的鼻內接種IL-12或PBS載體和H1N1亞單位流感疫苗之后分析單獨的小鼠(每組3個)的脾臟中細胞因子mRNA的表達。治療之后24或48小時殺死小鼠，通過RT-PCR分析總肺RNA中指示的細胞因子的表達IL-10(455bp),IFN-γ(459bp)和HPRT(162bp)。發現與僅僅用疫苗免疫接種相比，在24小時內以流感H1N1亞單位疫苗+IL-12鼻內治療對脾臟JFN-γmRNA表達顯著增加。在IL-12治療之后24小時和48小時內脾臟IL-5mRNA水平仍然保留增加。最后，在IL-12治療的或對照動物的脾臟中沒有檢測到。HPRT mRNA同時擴增證實在所有的RT-PCR反應中利用等量的RNA。為了進一步對流感疫苗免疫接種之后觀察到的細胞因子mRNA轉錄物進行定量測定，通過核糖核酸酶保護測試分析肺和脾臟中細胞因子mRNA的水平。發現與僅僅接收疫苗的小鼠相比，以H1N1+IL-12治療的動物的肺中IFN-γmRNA水平增加2倍(參見表)。此外，在IL-12治療之后肺中IL-10mRNA的表達增加5倍。在這些動物的脾臟中，在IL-12治療之后24小時IFN-γmRNA提高5倍，48小時之后提高2倍。類似地，IL-12治療之后24小時脾臟IL-5mRNA提高8倍，48小時之后提高5倍。表用流感亞單位疫苗免疫接種的小鼠的的肺和脾臟中IFN-γ和IL-10mRNA水平*肺
脾臟
*在用H1N1亞單位流感疫苗±IL-12治療之后24小時和48小時殺死小鼠。分離總RNA通過多個核糖核酸酶保護測試分析IFN-γ和IL-10轉錄物水平。在phosphorimager定量檢測相對的RNA水平和標準化為甘油醛3-磷酸脫氫酶。細胞因子mRNA水平以任意單位+SE表示。鼻內疫苗+IL-12共給藥對全身性抗體應答具有潛在的影響以前已經證明IL-12非腸道給藥改變了對雞蛋白溶菌酶的異型限制的抗體應答[Buchanan,J.M.,等人，免疫學雜志，7:1519-1528(1995)]。另外，如實施例1描述的，鼻內釋放的IL-12調節粘膜和全身性對DNP半抗原的免疫學。在該實施例中，已經證明鼻內釋放的與H1N1流感疫苗具有類似的影響。以疫苗本身或與IL-12一起免疫接種14天之后，可檢測的IgG1和H1N1抗體幾乎沒有(附圖8A-8B)。相反，與僅僅接收疫苗的小鼠相比，IL-12治療后IgG2a抗-H1N1抗體水平顯著增加。因此，鼻內IL-12治療導致血清IgG2a抗體應答早期激活。
在第35天進行類似的分析以測定鼻內IL-12治療的長期作用。關于這一點，IL-12治療的小鼠比僅僅用疫苗接種的小鼠總抗H1N1血清抗體水平增加6倍(附圖9A-9E)。此外，鼻內IL-12治療之后，(非特異性)總Ig增加。在接收IL-12的小鼠內IgG2a抗體水平仍然僅僅增加，此外，與僅僅接收疫苗的小鼠相比在實驗和對照組中IgG1抗-H1N1抗體中等增加，該結果與我們以前的發現一致(Buchanan,3.M.,等人，國際免疫學7:1519-1528(1995))。的任何小鼠的血清中沒有檢測到IgA。該結果清楚地證明IL-12以作為佐劑共給藥和以非侵入性方式釋放具有增加血清抗體水平的能力。鼻內IL-12釋放加強呼吸道抗體水平對來自于免疫接種的小鼠的BAL體液的抗體應答進行評估。在免疫應答的第35天收集的BAL體液分析顯示IL-12處理的小鼠對H1N1亞單位流感疫苗的粘膜抗體應答加強。作為一個組，與僅僅以疫苗免疫接種的小鼠相比，鼻內IL-12治療導致總的抗H1N1呼吸道抗體的產生增加15倍(附圖10A-10D)。另外，在鼻內接收H1N1+IL-12t的小鼠的BAL體液中總的非特異性Ig增加13倍。重要的是，與沒有與IL-12接觸的動物相比，以IL-12免疫接種的和治療的動物顯示BAL體液中IgA抗-H1N1抗體水平提高。該結果與這些小鼠的循環中沒有可檢測的IgA形成鮮明的對比。還發現與僅僅接收疫苗的小鼠相比，BAL體液中IgG1和IgG2a抗H1N1抗體水平急劇加強。該結果堅定地證實鼻內釋放的IL-12對呼吸道抗體水平的作用。IL-12給藥增加了流感亞單位疫苗的保護作用也對用流感病毒攻擊之后IL-12和H1N1鼻內共給藥對成活率和臨床缺陷的影響。在0天用H1N1疫苗鼻內免疫接種小鼠，在0,1,2和3以1微克的IL-12或PBS載體給小鼠免疫接種。一些小鼠僅僅接收IL-12或PBS載體。免疫接種之后4-5周用感染性A/PR8134流感病毒接種小鼠，并且每天監測發病率和死亡率。在第一個實驗中，利用一個劑量的病毒，以便在小鼠僅僅與疫苗接觸之后有50％的存活(附圖11A-11B)。發現與僅僅接收疫苗的小鼠相比在免疫接種期間包含Ⅰ了2導致100％存活和發病率明顯降低，如由重量損失證明的。在病毒攻擊之后11天內僅僅用IL-12或PBS-NMS(沒有H1N1亞單位疫苗)預處理的小鼠顯示逐漸的重量損失和所有的顯示死亡。
在第二個實驗中，將較大劑量的病毒用于攻擊以便僅僅用H1N1免疫接種幾乎沒有保護作用(附圖11C-11D)。在這種情況下，發現以H1N1和IL-12免疫接種攻擊以后50％成活率。通過重新獲得體重證明在存活的小鼠中從感染恢復了。正如所預期的，僅僅接收IL-12或PBS-NMS的動物對于病毒攻擊沒有存活下來。因此，c～admihistration of以IL-12和H1N1亞單位流感疫苗鼻內共給藥逐漸了疫苗的效率并且授予抗致死劑量的肝流感病毒的顯著的保護作用。在以H1N1+IL-12免疫接種之后抗流感感染的保護加強是抗體介導的為了確定體液免疫性對免受流感病毒感染的保護作用，檢測對IL-12處理失去了B細胞的微MT小鼠的應答[Kitamura,D.,等人，自然，350:423426(1991)]。發現僅僅以PBS，僅僅疫苗或疫苗+IL-12預處理的微MT小鼠在第10天沒有屈服于感染(附圖12A-12B)。在感染之后12天僅僅以PBS預處理的野生型小鼠死亡。另外，所有小鼠顯示穩定的逐漸的體重的損失。因此，有IL-12治療授予的加強的保護作用是增加的B細胞的功能的結果。
為了進一步確定以疫苗和IL-12接種的小鼠中觀察到的抗流感病毒的保護作用是通過抗體介導的，我們從這些小鼠轉移儲存的血清到天生的動物，然后5小時之后以流感病毒攻擊。接收從以僅僅疫苗或PBS-NMS免疫接種的小鼠的血清的動物所有都屈服于感染(附圖13)。但是在病毒攻擊之后接收來自于以疫苗+IL-12免疫接種的小鼠的血清的動物顯示50％的成活率。
還測定了在免疫接種的小鼠的呼吸道中產生的抗體是否在保護免受流感病毒感染中具有關鍵的作用。將從未免疫接種的動物或以H1N1+IL-12免疫接種的動物回收的BAL體液和活病毒一起鼻內給天生的小鼠給藥。該結果顯示將將病毒與從以僅僅PBS-NMS治療的小鼠被動轉移的BAL體液一起給藥導致到7天時100％死亡(附圖14A-14B)。在僅僅以H1N1免疫接種的小鼠的BAL體液存在下被動攻擊僅僅導致只有1/8的感染的小鼠存活。但是，接收來自于以H1N1+Ⅰ了2的小鼠的BAL體液的動物100％抵抗病毒感染。這些小鼠顯示在感染過程中沒有體重的損失，而其他兩組治療都顯示體重逐漸損失導致死亡。此外，在感染之后4天，僅僅接收來自于僅僅以疫苗免疫接種的動物的BAL體液具有的病毒的肺效價為103pfu，而接收來自于以疫苗+IL-12治療的動物的BAL體液的小鼠具有的肺病毒效價＜100pfu。最后，接收來自于以H1N1+IL-12的BAL體液的病毒攻擊的動物的總體的健康狀況顯著好于接收了來自于僅僅以H1N1免疫接種的動物的BAL體液的小鼠。因此，從以H1N1亞單位疫苗2免疫接種的小鼠的BAL體液鼻內被動轉移提供了抗流感病毒攻擊的急劇的保護作用。討論如本文所述，與流感亞單位藥理一起鼻內釋放IL-12可用作為有效的粘膜佐劑，并且授予抗隨后的病毒感染的增加的保護作用。使用B細胞缺陷的小鼠和被動轉移的血清或BAL體液證明有IL-12誘導的保護作用是由抗體誘導的。
在以IL-12鼻內治療之后分析細胞因子mRNA的產生顯示在24小時內肺和脾臟中IFN-γmRNA病毒增加。IFN-γ具有各種各樣的免疫調節功能，包括誘導Th1細胞的分化和NK細胞的激活[Boehm,U.,等人，歐洲免疫學雜志15:749-795(1998)]。另外，IFN-γ加強調理小鼠抗體例如IgG2a[Buclimiau,J.M.,等人，國際免疫學雜志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，歐洲免疫學雜志27:1958-1965(1997)；McKnight,A.J.,等人免疫學雜志，152:2172-2179(1994)；Wynn,T.A,等人，免疫學雜志157:4068-4078(1996)]的產生。通過以IL-12鼻內治療在肺和脾臟中誘導IL-10mRNA的表達。IL-10主要是由T細胞和單核細胞產生的，并且已經證明抑制Th1細胞分化[Fiorentino,D.F.等人，免疫學雜志，146:3444-3451(1991)；Ding,L.,等人，免疫學雜志14&3133-3139(1992)]。其他人[Meyaard,L.,等人，免疫學雜志156:2776-2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫學雜志157:12-20(1996)；Gerosa,F.,等人，實驗方法雜志，183:2559-2569(1996)]已經證明在以IL-12治療之后誘導IL-10的產生，該結果暗示設計為下調IL-12和IFN-γ的炎性的作用的反饋機理。
在實施例2中，檢查IL-12對應答臨床的相對的流感亞單位疫苗的作用。發現IL-12治療具有對早期啟動的體液應答的急劇作用，如有IgG2a抗-H1N1抗體水平的顯著增加的反應的。比較而言，僅僅接收疫苗的動物沒有產生早期IgG2a應答。在僅僅接收疫苗或疫苗+IL-12的動物的免疫應答的早期幾乎沒有可檢測的IgG1抗體。在35天之后，在IL-12治療的小鼠IgG2a水平仍然增加和IgG1水平也有所增加，該結果與以前在溶菌酶系統中的發現一致[Buchanan,J.M.等人，國際免疫學雜志，7:1519-1528(1995)]。這些結果證明鼻內釋放IL-12具有長期持續的作用并且提供了使用這些給藥途徑用于增加全身性體液免疫性的進一步的證據。
鼻內IL-12給藥也導致呼吸道抗體水平顯著增加，包括IgG1和抗-H1N1抗體水平。IgA是粘膜分泌中的占優勢的抗體，并且被認為在阻止病原體結合到粘膜表皮表面中起主要的作用[Lamm,M.E.,免疫性綜述年報51:311-340(1997)]。
也如本文所述，從以亞單位流感疫苗HIL-12免疫接種的小鼠收集的血清或BAL體液的被動轉移導致從發病率和死亡率看具有顯著的保護作用。在微MT小鼠中完全去除了IL-12增加抗體水平和加強抗流感病毒感染的保護作用的能力。由這里觀察到的BAL體液的被動轉移授予的增加的保護作用幾乎是在IL-12鼻內治療之后觀察到的呼吸道抗體水平的顯著增加的結果。
已經用于加強粘膜免疫應答的佐劑包括微生物產品例如CT和LT，這些已經用于各種各樣的釋放系統[Stasts,H.F.,等人，目前的免疫學觀點6:572-583(1994)；Elson,C.O.,腸道疾病的病原體的機理，Paul,P.S.,等人，eds.,(NY:Plenum出版社)，pages 373-385(1997)]。CT是Th2-型應答的有效的誘導劑，而LT激發混合的Th1和Th2應答[Marinaro,M.,等人，實驗方法雜志，185:415-427(1997)；T8kahashi,，I.,等人，感染性疾病173:627～35(1996)]。但是這些佐劑導致嚴重的腹瀉，不適用于作為人的粘膜佐劑。也有最近的報道暗示CT實際上抑制IL-12的產生和IL-12受體的表達[Braun,M.,等人，實驗方法雜志出版中(1999)]。此外對于呼吸道合胞體表達的感染，Th1應答是保護性的，而Th2應答導致肺發病[Graham,B.S.,等人臨床投資雜志，88:1026-1033(1991)；Graham,B.S.,等人，免疫學雜志151:2032-2040(1991)]。因此鼻內IL-12給藥加強流感疫苗的效率是與粘膜免疫接種的方案直接相關。等同作用參照優選的實施方案特定地證明和描述了本發明，本領域內技術人員將會明白對其形式和具體進行各種變化不會脫離由權利要求定義的本發明的精神和范圍。本領域內技術人員將會認識到或能夠明白利用不止一條的實驗途徑，本文特異性地描述了本發明的特定的實施方案的許多等同代替，這樣的等同代替可用于包括在本發明的范圍內。
權利要求
1．誘導宿主中對病原體的免疫應答的方法，它包括以有效量的白細胞介素-12和病原體的抗原鼻內給藥宿主。
2．根據權利要求1所述的方法，其中病原體選自于包括細菌，病毒，分枝桿菌，寄生蟲和真菌。
3．根據權利要求2所述的方法，其中細菌選自于下列組肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
4．根據權利要求2所述的方法，其中病毒選自于下列組脊髓灰質炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒。
5．根據權利要求2所述的方法，其中寄生蟲選自于下列組利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬。
6．根據權利要求1所述的方法，其中抗原來源于病原體的毒素。
7．根據權利要求1所述的方法，其中免疫應答是Th1-型細胞因子應答。
8．根據權利要求7所述的方法，其中Th1-型細胞因子應答導致IFN-？在宿主中的表達加強。
9．根據權利要求1所述的方法，其中免疫應答是體液免疫應答。
10．根據權利要求9所述的方法，其中體液免疫應答導致特異于抗原的IgG2a,IgG2b and IgG3抗體的表達加強。
11．加強宿主對病原體的免疫應答的方法，包括以有效量的白細胞介素-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
12．根據權利要求11所述的方法，其中病原體選自于下列組細菌，病毒，分枝桿菌，寄生蟲和真菌。
13．根據權利要求12所述的方法，其中細菌選自于下列組肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
14．根據權利要求12所述的方法，其中病毒選自于下列組脊髓灰質炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒。
15．根據權利要求12所述的方法，其中寄生蟲選自于下列組利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬。
16．根據權利要求11所述的方法，其中抗原來源于病原體的毒素。
17．根據權利要求11所述的方法，其中免疫應答是Th1-型細胞因子應答。
18．根據權利要求17所述的方法，其中Th1-型細胞因子應答導致IFN-γ？在宿主中的表達加強。
19．根據權利要求11所述的方法，其中免疫應答是體液免疫應答。
20．根據權利要求19所述的方法，其中體液免疫應答導致特異于抗原的IgG2a,IgG2b and IgG3抗體的表達加強。
21．誘導宿主對粘膜病原體的免疫應答的方法，其中包括以包括以有效量的白細胞介素-12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
22．根據權利要求21所述的方法，其中病原體選自于下列組細菌，病毒，分枝桿菌，寄生蟲和真菌。
23．根據權利要求22所述的方法，其中細菌選自于下列組肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
24．根據權利要求22所述的方法，其中病毒選自于下列組脊髓灰質炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒。
25．根據權利要求24所述的方法，其中寄生蟲選自于下列組利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬。
26．根據權利要求24所述的方法，其中抗原來源于病原體的毒素。
27．根據權利要求21所述的方法，其中免疫應答導致特異于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗體的表達加強。
28．誘導宿主對病原體產生Th1-類免疫應答的方法，包括以有效量的白細胞介素-12和病原體的抗原鼻內給藥宿主。
29．根據權利要求28所述的方法，其中病原體選自于下列組細菌，病毒，分枝桿菌，寄生蟲和真菌。
30．根據權利要求29所述的方法，其中細菌選自于下列組肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
31．根據權利要求29所述的方法，其中病毒選自于下列組脊髓灰質炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒。
32．根據權利要求29所述的方法，其中寄生蟲選自于下列組利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬。
33．根據權利要求28所述的方法，其中抗原來源于病原體的毒素。
34．根據權利要求28所述的方法，其中Th1-型細胞因子應答導致IFN-γ在宿主中的表達加強。
35．根據權利要求34所述的方法，其中Th1-型免疫應答導致特異于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗體的表達加強。
36．加強宿主對病原體產生粘膜免疫應答方法，包括以有效量的白細胞介素-12和病原體的抗原鼻內給藥宿主。
37．根據權利要求36所述的方法，其中病原體選自于下列組細菌，病毒，分枝桿菌，寄生蟲和真菌。
38．根據權利要求37所述的方法，其中所述的細菌選自于下列組肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
39．根據權利要求37所述的方法，其中病毒選自于下列組脊髓灰質炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞體病毒。
40．根據權利要求37所述的方法，其中寄生蟲選自于下列組利什曼蟲，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形蟲屬，肺囊蟲屬。
41．根據權利要求36所述的方法，其中抗原來源于病原體的毒素。
42．根據權利要求36所述的方法，其中免疫應答是Th1-型細胞因子應答。
43．根據權利要求42所述的方法，Th1-型細胞因子應答導致IFN-γ在宿主中的表達加強。
44．根據權利要求36所述的方法，其中免疫應答是體液免疫應答。
45．根據權利要求44所述的方法，其中體液免疫應答導致特異于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗體表達加強。
全文摘要
本發明涉及利用白細胞介素－12鼻內給藥加強宿主對病原體的免疫應答的方法。在一個實施方案,本發明涉及誘導宿主對病原體的免疫應答,包括以有效量的IL－12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。在另一個實施方案中,本發明涉及誘導宿主對病原體的免疫應答的方法,包括以有效量的IL－12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。在一個特定的實施方案中,本發明涉及誘導宿主對粘膜病原體的免疫應答的方法,包括以有效量的IL－12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。本發明還包括誘導宿主對病原體的Th1型免疫應答的方法,包括以有效量的IL－12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。本發明還涉及誘導宿主對病原體的粘膜免疫應答的方法,包括以有效量的IL－12和病原體的抗原給宿主鼻內給藥。
文檔編號A61P37/04GK1298307SQ99803679
公開日2001年6月6日 申請日期1999年3月4日 優先權日1998年3月5日
發明者丹尼斯·W·梅特澤杰, 伯納德·P·阿魯蘭達姆 申請人:俄亥俄醫學院