酶催化的治療劑的制作方法

專利名稱：酶催化的治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物發現領域，具體地講，是涉及一種細胞內酶之底物并通過所述細胞內酶可轉變成細胞毒素的前藥的設計，所述細胞內酶對于病理性細胞的治療耐藥性是至關重要的。
背景在本發明說明書中，各種文獻均以第一作者和日期、專利號或公開號作為參考。在本說明書中或在本申請結尾，權利要求之前，可以找到每一引用的完整書目。這些文獻的內容均摻入本說明書作為參考以便更充分地描述本發明所屬的現有技術的狀態。
癌細胞的特征是無限生長、去分化和遺傳不穩定性。這種不穩定性表現為染色體數異常、染色體缺失、重排、丟失或者多于正常二倍體數的雙聯。Wilson，J．D等人(1991)。這種遺傳不穩定性是由多種因素引起的。描述最清楚的一個特征是在腫瘤抑制基因功能丟失后發生，基因組可塑性提高(例如Almasan，A等，(1995))。基因組可塑性使得腫瘤細胞可以適應其不斷變化的環境，因此可有更經常的突變、基因擴增以及形成染色體外元件(smith，K．A．等(1995)and Wilson，J．D．等(1991))。這些特征提供了導致更具侵略性的惡性腫瘤的機制，因為這種特征可以使腫瘤迅速地發展對天然宿主防御機制、生物治療(Wilson，J．D．等(1991)和Shepard，H．M．等(1988))以及化療的抗性。(Almasan，A．等(1995)和Wilson，J．D．等(1991))癌癥是世界上最常見的使人致死的疾病之一。用抗癌藥物治療是一種日益重要的方法，特別是對于全身性惡性腫瘤或者已過了用外科手術治愈狀態的轉移癌。不幸的是，今天，可以治愈的癌癥仍然很少(Haskell，C．M．eds(1995)，p32)。在可治愈人類癌癥之藥物開發方面的進展很慢。惡性腫瘤在其遺傳學、生物學和生物化學方面的異質性以及對治療的原發性或治療誘導的抗性降低了癌癥治愈的可能性。此外，許多抗癌藥物選擇性很低，經常造成嚴重的甚至威脅生命的毒副作用，從而抑制了采用足以殺死所有癌細胞的高劑量。尋找對治療抗性的疾病、惡性細胞選擇性增強的抗癌劑仍是藥物開發的中心任務。另外，對抗生素的廣泛抗藥性已成為日益重要的世界范圍內的健康問題。(Segovia，M．(1994)和Snydman，D．R．等(1996))。化療劑的種類化療劑的主要類型包括烷化劑、抗腫瘤抗生素、植物生物堿、抗代謝劑、激素激動劑和拮抗劑以及各種的其他藥物。參見Haskell，C．M．編(1995)和Dorr，R．T．和Von Hoff，D．D．，編(1994)。
經典的烷化劑是能夠用烷基取代某些有機化合物的氫原子的高活潑性的化合物。核酸、主要是DNA的烷基化是大部分這些化合物的主要的細胞毒性作用。它們引起的損傷干擾了DNA的復制和RNA的轉錄。經典的烷化劑包括氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷酰胺、異環磷酰胺、噻替派和白消安。大量非經典的烷化劑也可以損傷DNA和蛋白質，但是是通過與經典烷化劑不同的復雜機制，例如甲基化或氯乙基化。非經典烷化劑包括達卡巴嗪、卡莫司汀、羅氮芥、順鉑、碳鉑、丙卡巴肼和六甲蜜胺。
許多臨床上有用的抗腫瘤藥物是土壤真菌鏈霉菌不同菌株的天然產物。它們通過一種或多種機制產生殺腫瘤作用。所有抗生素均能夠與DNA結合，通常是通過插入，隨后使螺旋解旋。這種扭曲損害了DNA作為DNA合成、RNA合成或這兩種合成之模板的能力。這些藥物還通過自由基的形成乙基重要金屬離子的螯合作用損壞DNA。它們還可作為拓撲異構酶Ⅱ(對細胞分裂很重要的酶)抑制劑起作用。這類藥物包括阿霉素、柔紅霉素、去甲氧柔紅霉素、米托蒽醌、博萊霉素、放線菌素D、絲裂霉素C、plicamycin和鏈佐星。
植物已提供了一些最有用的抗腫瘤劑。這種藥物中的三種是長春花屬生物堿(長春新堿和長春花堿)，表鬼臼毒素(依托泊苷和鬼臼噻吩苷)和紫杉醇(太平洋紫杉素)。長春花屬生物堿與正在分裂的細胞和神經系統中的微管蛋白結合。這種結合改變了有絲分裂紡錘體末端微管蛋白加入或丟失的動力學，最終導致抑制有絲分裂。類似的蛋白質組成了神經組織的重要部分；因此，這些藥物是有神經毒性的。表鬼臼毒素抑制拓撲異構酶Ⅱ，因此，對細胞功能有深遠的影響。紫杉醇對微管有復雜的影響。
抗代謝劑是細胞功能和復制所需的正常代謝物的結構類似物。它們通過通過與細胞酶的相互作用來發揮作用。已經開發并經臨床檢測的各種抗代謝劑是甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(FUDR)、阿糖孢苷、6-巰基嘌呤(6-MP)、6-硫代鳥嘌呤、去氧助間型霉素、氟達拉濱、2-氯脫氧腺苷和羥基脲。
對于數種形式的腫瘤疾病，內分泌操作是一種有效的治療方法。為了可能用于癌癥學，已開發了各種各樣的激素和激素拮抗劑。已有的激素類藥物是己烯雌酚、他莫昔芬、甲地孕酮乙酸酯、地塞米松、潑尼松、氨魯米特、利普安、性瑞林、氟利坦和醋酸善得定。現有化療劑的缺陷目前與利用化療劑治療癌癥有關的問題是需要高劑量的所需化療劑；對正常細胞的毒性，即缺乏選擇性；免疫抑制作用；繼發的惡性腫瘤和藥物抗性。
現有用于癌癥化療的大部分試劑是通過抗增殖機制來發揮作用。因為許多正常細胞(例如結腸上皮細胞、造血細胞)有高增殖率，因此有毒性產生。由于宿主毒性，不得不在殺死所有活腫瘤細胞所需的劑量以下的劑量水平中斷治療。
與現有治療方法有關的另一種副作用是化療對最快速分裂的正常宿主組織如骨髓、腸粘膜和淋巴系統細胞的毒性作用。所述化療劑還有許多其他的不利影響，包括神經毒性；對性和生殖腺功能的負面影響；心、肺、胰和肝毒性；血管和超敏反應以及皮膚反應。

摘自Smith等JNCl74341-347(1985)。
對于臨床中所用的許多抗腫瘤藥物來說，血液毒性是最危險的毒性。最常見的形式是中性白細胞減少癥，伴隨著高度的感染危險，盡管也會發生血小板減少和出血并會威脅生命。化療還包括多形核白細胞和血小板功能上的性質缺陷。已開發了造血生長因子來克服這些副作用。Wilson，J．D等(1991)和Dorr，R．T．和Von Hoff，D．D．編(1994)。
大部分常用的抗腫瘤劑能夠抑制細胞和體液免疫。感染常常導致晚期癌癥患者的死亡，受損傷的免疫會加劇所述死亡。慢性的延遲的免疫抑制也是由癌癥化療引起的。
神經毒性的主要形式是蛛網膜炎；脊髓病或腦脊髓病；慢性腦病和瞌睡綜合征；急性腦病；外周神經病；和急性小腦綜合征或共濟失調。
許多常用的抗腫瘤藥物是致突變的和引起畸形的。某些抗腫瘤藥物包括丙卡巴肼和烷化劑是致癌的。這種致癌作用在用多功能烷化劑和拓撲異構酶Ⅱ抑制劑如依托泊苷和蒽環素類抗生素治療的患者中主要是作為延遲的畸形白血病而觀察到。化療還與延遲的非何杰金氏病淋巴瘤和實體腫瘤有關。本發明將使這些影響達到最小的程度，因為僅在腫瘤細胞內激活所述前藥。
惡性腫瘤細胞對所用藥物的抗性的出現嚴重限制了化療劑的臨床應用。許多細胞機制都可能與藥物抗性有關，例如改變的藥物代謝機制、細胞對活性化合物的不可通透性獲知使藥物從所述細胞中加速消失、受抑制的酶的特異性改變、靶分子的生產增加、細胞毒性損傷的修復增加或者通過其他生化途徑發生抑制作用。在某些情況下，對一種藥物的抗性可能賦予在生化上對其他不同藥物的抗性。對癌癥化療劑的另一種抗性機制是通過腫瘤抑制基因，特別是p53、RB和p16的功能喪失而引起的。這些基因產物功能的喪失導致通常由抗癌藥物靶向之酶(例如5FU／胸苷酸合成酶和氨甲喋呤／二氫葉酸還原酶)的表達的去阻遏。(Lee，V．等(1997)，Exp．Cell Res．234270-6；Lenz，H．J．等(1998)，ClinicalCancer Res．41227-34(1998)，Fan，J．和Bertino，J．(1987)，Oncogene141191-200)。特定基因的擴增與對生物和化療的抗性有關。編碼二氫葉酸還原酶之基因的擴增與氨甲喋呤抗性有關，而編碼胸苷酸合成酶之基因的過表達／擴增與用5-氟嘧啶治療的抗性有關。Simth(1995)。表2總結了與生物和化療抗性有關的顯著的酶。

用前藥作為提高化療劑選擇性的解決方法了解抗癌劑的選擇性差已有很長的時間，而且在改進選擇性并使給藥劑量增大方面所作的努力很大。一種方法是開發前藥。前藥是毒性溫和并可在體內被轉變成治療活性產物的化合物。在某些情況下，通過經抗體(“ADEPT”或者抗體依賴的酶前藥治療(美國專利4975278))或基因靶向(“GDEPT”或基因依賴性酶-前藥治療)而傳遞到靶細胞的非內源酶的作用來激活(Melton，R．G．和Sherwood，R．F．(1996))。就其脫離血液并滲透腫瘤的能力而言，這些技術有嚴重的限制。Connors，T．A．和Knox，R．J．(1995)。
因此，需要可滲透腫瘤并抑制增殖和／或殺死已發展了治療抗性的癌細胞。本發明滿足了這種需要并提供了相應的優點。
發明綜述本發明提供了通過將靶或待測細胞與是所述細胞中靶酶的選擇性底物的侯選治療劑或前藥接觸來鑒定潛在的治療劑的方法。將所述新方法命名為“ECTA”，即酶催化的治療劑。在一個實施方案中，靶酶是內源的細胞內酶，該酶被過表達并賦予對生物和化療劑的抗性。在另一實施方案中，由于腫瘤抑制功能的喪失(Smith，K．A．等(1995)和Li，W．等(1995))和／或因前述與化療接觸而引起的選擇，所述酶的活性在腫瘤細胞中已被大大提高(Melton，R．G．和sherwood，R．F．(1996)和Lonn，U．等(1996))。在另一實施方案中，靶酶是細胞中感染劑的表達產物。
將細胞在體外和／或體內與候選前藥接觸后，通過記錄所述試劑是否引起細胞增殖的降低或是否殺死所述細胞來檢測所述細胞中所述試劑的效力。在本發明的一個方面，所述前藥通過靶酶從前藥釋放有毒副產物殺死所述細胞或抑制細胞增殖。在本發明的另一方面，可用一種或多種“靶酶”激活所述前藥以便使其釋放有毒副產物。
本發明的另一方面包括用于檢測新前藥的試劑盒，所述新前藥具有本文所述的對靶酶的特征。所述試劑盒包括完成所述檢測和分析結果所必需的試劑和說明。
本發明還提供了通過將病理性細胞與是靶酶，如上述內源細胞內酶之選擇性底物的前藥接觸來選擇性殺死所述細胞的方法和分子的實例。所述底物通過所述細胞內靶酶被特異性地轉變成細胞毒素。在本發明的另一方面，初始反應的產物隨后通過常見的細胞酶如酰基轉移酶、磷酸酶或者其他“管家”酶(Voet等(1995))或常見的細胞組分(例如水)被完全激活以便從所述前藥釋放有毒副產物。
本發明還提供了通過給個體施用前藥來治療以個體病理性過度增殖細胞為特征之疾病的方法，所述前藥是靶酶的選擇性底物并通過所述酶在所述過度增殖細胞中被選擇性地轉變成細胞毒素。本發明的前藥可以單獨使用或者與其他化療劑或者其他抗癌治療如照射聯用。
本發明的另一方面是制備用于通過給個體施用前藥來治療以個體病理性過度增殖細胞為特征之疾病的藥物，所述前藥是靶酶的選擇性底物并通過所述酶在所述過度增殖細胞中被選擇性地轉變成細胞毒素。
本發明的另一方面是用于鑒定適用于個體的最佳治療的方法，所述方法通過分離過表達內源細胞內酶的細胞，然后將所述細胞與至少一種本發明前藥接觸，接著鑒定哪一種或幾種前藥抑制增殖或殺死細胞，由此鑒定適用于個體的最佳治療。
附圖的簡要描述

圖1表示細胞中對抗癌方式的抗性的發展和結果。
圖2說明本發明前藥的激活途徑。
圖3說明用于篩選被在藥物抗性中重要的細胞內酶激活的前藥的高效方法。
圖4說明用TS-陰性大腸桿菌作為細胞靶如何發現前導人胸苷酸合成酶(TS)前藥。
圖5舉例說明用所述篩選方法如何同時優化與兩種靶酶反應的前藥。
圖6說明用于產生胸苷酸合成酶(TS)-可激活前藥的分成多塊底物的實施方案。
方框1代表掩蔽或沒有的磷酸基團的R7。當被掩蔽時，它是促進細胞進入并在細胞內被加工成與TS結合的單磷酸的氨基磷酸酯或者類似的衍生物。參見Fries，K．M等(1995)。當沒有時，R7是氫原子，所述前藥是細胞胸苷激酶(TK)的底物，在體內產生必不可少的單磷酸。
方框2是2’-脫氧呋喃核糖基團或者其他類似糖、硫代糖、碳環的或者無環的基團，所述基團以支持所述前藥與TS功能結合，而當R7是氫原子時，與TK結合的方式將所述單磷酸與嘧啶環相連。該基團不需利用氧原子與方框1的R7基團相連。因此，糖磷酸的膦酸類似物是可接受的。
方框3表示連接基團，其中n是0-10，該基團是一個單或多不飽和的電子導管，其作用是當TS作用于前藥時，它可以將電子導離嘧啶環并導向離去基R4。該連接基團由0-10個可以隨意混合或匹配的不飽和的部分如非環的乙烯基、乙炔基、亞胺或偶氮單元或環狀不飽和的、芳族或雜芳族的部分組成，只要它們的連接可以產生所需的導電導管即可。
方框4表示連接連接基團和離去基R4的間隔單元X，其中m是0-1的整數。如果方框3的n等于0，則方框4的m等于1。在優選的形式中，X是帶或不帶取代基的亞甲基(CH2)單元。此外，X可以是氧、硫、氮或其它可以形成至少兩個共價鍵的原子。當X不存在時(方框4，m等于0)，在TS對前藥的加工過程中離去基R4的離去留下了基于嘧啶核苷酸的烷基化實體。參見Barr等(1983)。當X存在時(方框4，m等于1)，離去基R4的離去在TS對前藥的加工過程的早期離去。
方框5表示在TS對前藥的作用下釋放的離去基R4，其本身是有毒的抗代謝劑或烷化劑或是易于在體內產生有毒的抗代謝劑或烷化劑的實體。例如，在TS的作用下釋放時，離去基R4可以以抗癌劑Tepa或賽替派、磷酰胺氮芥、N-乙酰基鞘氨醇(C2神經酰胺，一種腫瘤抑制劑類脂)或羥基脲(核糖核苷酸還原酶抑制劑)的活性代謝物形式離去。離去基R1還可以是α，α-二鹵代的醚，在該情況下，當由TS釋放的α，α-二鹵代醇經歷水解時可以提供羧酸基團。因此，離去基R4可以以氟代乙酸酯、氟代檸檬酸酯、丙二酸、甲基丙二酸或3-硝基丙酸的前體的形式離去，所有這些物質均是氧化磷酸化的有效抑制劑。
圖7表示用編碼新霉素抗性的帶有或不帶有HER-2原癌基因的質粒轉染的細胞系的TS Western印跡。道(1)MCF7／HER2；(2)MCF7／neo；(3)MDA-MB-435／HER2；(4)MDA-MB-435／neo；(5)BT-20／HER2；(6)BT-20／neo。
圖8表示前藥化合物與酶胸苷酸合成酶的反應產物。
發明詳述通過研究與癌細胞的生物和化療抗性密切相關的一些關鍵基因組和表型變化完成了本發明。本發明提供了體內選擇性抑制細胞生長和／或殺死細胞的手段，所述細胞通過暴露于癌癥治療(包括生物治療如腫瘤壞死因子(TNF)或化療)而經過了選擇。(參照表2)。結果，已通過突變或基因擴增激活的特定酶對所述試劑的初始或進一步治療有抗性。與有關產生更強的內源、細胞內酶抑制劑的現有治療方法不同，本發明利用與治療抗性疾病細胞和組織相對正常細胞和組織有關的更高的酶活性而且不依賴于抑制所述酶。在一個方面，用本發明前藥成功治療的腫瘤細胞的特征是靶酶活性提高，因此比沒有過表達靶酶的正常細胞有更高許多的將所述前藥轉變成其毒性形式的潛力。本文所用術語“靶酶”有一種或多種上述特征的酶。
除非特別說明，本發明的實踐將使用常規分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術，這些技術是本領域技術人員熟知的。參見例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊，第二版(1989)；分子生物學的現有工具(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(F．M．Ausubel等編(1987))；酶學方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(Academic Press，Inc．)PCR2一種實用方法(M．J．MacPherson，B．D．Hames和G．R．Taylor編(1995))和ANIMAL CELL CULTURE(R．I．Freshney，編(1987))。
本說明書和權利要求書中所用的單數形式“一個”和“某個”除非特別清楚地說明，否則包括復數關系。例如，術語“個細胞”包括許多細胞，包括其混合物。
“有效量”指實現有益的或所需結果的量。可將有效量以一次或多次給藥、應用或者劑量施用。
本文所用術語“宿主細胞”、“靶細胞”和“過度增殖的細胞”包括其特征在于基因突變或細胞內酶的內源過表達而激活的細胞。在一些實施方案中，所述酶的過表達與起藥物抗性功能的腫瘤抑制基因產物的喪失或者與疾病表型相關的遺傳不穩定性有關。許多細胞機制都與藥物抗性有關，例如所述藥物的代謝機制發生改變，細胞對活性化合物的不通透性或者藥物從所述細胞中加速消除、細胞毒性損傷的修復增加或者通過另外的生化途徑繞開受到抑制的反應。激活的或過表達的以及與藥物抗性有關的酶包括，但不限于胸苷酸合成酶(TS)(Lonn，U．等(1996)；Kobayashi，H．等(1995)；Jackman，A．L．等(1995))，二氫葉酸還原酶(Banerjee，D．等(1995)和Bertino，J．R．等(1996))，酪氨酸激酶(TNF-α，Hudziak，R．M．等(1988))和多藥物抗性(Stuhlinger，M等(1994))；Akdas，A．等(1996)和(Tannock，I．F．(1996))；以及ATP-依賴的多藥物抗性相關蛋白(Simon，S．M．和Schindler，M(1994))，而且在包括結腸和前列腺癌的一些疾病中，拓撲異構酶I(Husain等(1994))。或者，對一種藥物的抗性可賦予對其他生化上完全不同的藥物的抗性。盡管本申請具體涉及癌癥，但相似的方法可適用于由人和動物病原體編碼的酶，其中由于抗性的產生而使抑制劑無效。
特定基因的擴增與化療抗性有關。二氫葉酸還原酶(DHFR)與氨甲喋呤抗性有關，而編碼胸苷酸合成酶之基因的擴增與用5-氟嘧啶治療腫瘤的抗性有關。通過Kashini-Sabet等(1988)，美國專利5085983或本文所述的改進的聚合酶鏈發應(PCR)可以檢測和監測與藥物抗性有關的基因的擴增。通過檢測細胞遺傳異常例如均與基因擴增有關的均勻染色體染色區和雙微小染色體可監測獲得的藥物抗性。其他檢測方法包括直接或間接的酶活性檢測，兩者均與基因擴增有關(例如Carreras &Santi(1995))；其他方法(例如聚合酶鏈反應，Houze，T．A．等(1997))或免疫化學法(Johnson，P．G．等(1997))。
或者，靶細胞的特征為含有失活的腫瘤抑制功能，例如已知提高TS(Li，W．等(1995))或DHFR(Bertino，等(1996)和Li，W．等(1995))表達的成視網膜細胞瘤(RB)或p53的喪失或失活。
本發明的前藥用于治療或緩解疾病，其中所述疾病-相關的酶與對化療的藥物抗性有關，不論是由于腫瘤抑制劑功能的喪失，體內化療選擇性還是這兩種情況的結合。這包括其中所述酶，例如TS酶在相對于正常細胞的疾病細胞中被過表達、過度積累或者激活的情況。特別排除的是已表明在一些人類腫瘤中偶爾升高的谷胱甘肽-S-轉移酶。Morgan，A．S．等(1998)。在相對于正常細胞的疾病細胞中，本發明的靶酶通常被過表達、過度積累或激活，在此基礎上，可以辨別本發明的前藥。本發明區別于其他方法的最重要的原理是(1)本發明描述了酶例如胸苷酸合成酶底物的合成。所述過表達的酶將優先在疾病細胞中產生毒素。以前的方法依賴于抑制劑。所述抑制劑導致所述酶的擴增的表達，因而隨后對治療產生抗性(參見例如Lonn，U．等(1996))。
(2)本發明的方法還區別于其他“底物-前藥”方法，例如谷胱苷肽-S-轉移酶(參見，例如Morgan A．S等(1998))。細胞為了對毒性攻擊作出反應而以提高的水平表達GST家族的酶。GST家族的酶具有重疊的底物特異性，這使得很難設計僅與一種在癌細胞中表達水平提高的酶反應的底物(Morgan A．S等(1998))。由于本發明的每種酶(例如胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和胸苷激酶)就其結構和底物特異性而言均是獨一無二的，因此容易設計獨一無二的底物。在本申請說明書中提供了胸苷酸合成酶的數種底物的例子。
(3)在一些情況下，編碼靶酶(例如胸苷酸合成酶)的基因可經突變對抑制劑產生抗性(Barbour，K．W．等(1992)和Dicken，A．P．等(1993))，但仍能夠與非抑制劑底物前藥進行反應。
(4)本方法進一步的優點是腫瘤抑制功能的喪失對于惡性腫瘤的發展是至關重要的。大部分腫瘤細胞喪失了p53、RB或p16腫瘤抑制劑功能之一。所述喪失導致抗性酶(例如胸苷酸合成酶)表達的增加，不依賴于以前與化療接觸。本文所述的前藥將用于治療早期惡性腫瘤以及以前用化療治療的疾病。酶例如GST的底物需要事先將腫瘤暴露于化療以便產生足夠的過表達，從而甚至提供中等治療指數的可能性。藥物檢測本發明提供了用于鑒定有治療過度增殖或腫瘤疾病例如癌癥的治療潛力之試劑的方法。所述方法還鑒定抑制過度增殖細胞例如癌細胞之細胞生長或細胞周期的試劑。所包括的其他細胞是導致由于在患者體內的不適當增殖而引起疾病的細菌、酵母或寄生蟲細胞。如果相對于對照樣品中的細胞，細胞增殖、復制或細胞周期降低，則認為所述試劑是潛在的治療劑。最佳是所述細胞被所述試劑殺死。所述細胞可以是原核細胞(細菌例如大腸桿菌)或者真核細胞。所述細胞可以是哺乳動物或非哺乳動物細胞例如小鼠細胞、大鼠細胞、人細胞、引起疾病的真菌(例如酵母)或者寄生蟲(例如肺囊蟲或利什曼原蟲)。
本文所用“過度增殖細胞”包括去分化的、無限增殖的、瘤性的、惡性的、轉移的或轉化的細胞。所述細胞的實例包括但不限于肉瘤細胞、白血病細胞、癌細胞或者腺癌細胞。更具體地講，所述細胞可以是乳腺癌細胞、肝細胞瘤細胞、可檢測的癌細胞、胰腺癌細胞、食管癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、肝癌細胞或者胃癌細胞。在另一實施方案中，所述靶細胞可以是對藥物或化合物有抗性的，所述藥物或化合物用于抑制或殺死經感染劑感染的對常規抗生素有抗性的細胞。感染劑包括細菌、酵母和寄生蟲例如錐蟲。
在表2(上述)或表3(下文)中列出了是本發明主題的靶酶的具體實例。這些酶與化療抗性有關，在對癌癥治療有抗性的細胞中是經內源激活的、過表達的或過度積累的，且與疾病有關，包括但不限于例如酪氨酸激酶超家族的成員或者ATP-依賴的MDR相關蛋白、CAD、胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和核糖核苷酸還原酶。表3提供了在感染性疾病中可通過本方法靶向的酶的目錄。

用本發明方法鑒定的潛在治療劑是前藥，它是酶的底物并在細胞內轉變成細胞內毒素。本文所用“前藥”是與藥物代謝產物相比，對靶或過度增殖的細胞有較低細胞毒性并能夠經酶激活的或轉變成更有活性的形式的藥物學活性劑或物質的前體或衍生形式(參見Connors，T．A．(1986)和Connors，T．A．(1996))。所述試劑的毒性是針對產生有效量轉變酶的細胞，所述轉變酶的數量足以在疾病細胞中產生治療濃度的細胞毒素。
本發明還提供了一種快速簡單的篩選方法，所述方法能夠初步鑒定具有至少某些所需特征的化合物。為了達到本發明的該目的，在圖3中列出了一個實施方案的一般方案。此圖描述了如何安排此檢測以及其中所需的材料。如圖3所示，所述檢測需要兩種細胞類型，第一種是其中不表達或者以很低的水平表達靶酶的對照細胞。第二種是檢測細胞，其中以可檢測的水平，例如高水平表達靶酶。例如，內源不表達靶酶TS的原核細胞大腸桿菌是適宜的宿主細胞或靶細胞。所述細胞可含有對照對應物(沒有靶酶)，或者，在另一實施方案中含有遺傳工程修飾的對應物以便有差別地表達靶酶或者酶(合適宜種類的靶酶的)。可以用一種以上的酶分別轉導不同的宿主細胞，以便可以將候選藥物對靶酶的作用同時與其對另一種酶或來自另一種的對應酶的作用進行比較。
在另一實施方案中，用第三種靶細胞作為對照，因為它接受了有效量的化合物，例如下列所示的已表明是有效前藥的化合物。本實施方案對篩選通過胸苷酸合成酶激活的新藥是特別有用的。
在另一實施方案中，對轉化的細胞系例如ras-轉化的NIH 3T3細胞(ATCC，10801 University Blvd．，Manassas，VA20110-2209，USA)進行工程加工以便從編碼所述酶的克隆的cDNA表達不定量和增加數量的所需靶酶。轉染是利用本領域熟知的和Chen，L等(1996)，Hudziak，R．M等(1988)或Carter，P等(1992)以及下文實驗節所述的方法完成的瞬時或永久轉染。用于插入cDNA的適宜載體可從Stratagene，La Jolla，CA和其他供應商處購買。用預先產生的針對免疫檢測的酶的單克隆或多克隆抗體，用細胞裂解產物通過免疫印跡和酶檢測可以監測在各轉染細胞系中的酶表達水平。參見例如Chen，L等(1996)所述的。通過將表達盒導入細胞的拷貝的數量或改變啟動子的用法可以調整表達量。按Carreras，C．W．和Santi，D．V．(1995)的綜述或者在下文試驗節中描述的方法可以完成用于檢測被表達之酶的數量的酶檢測。可以選擇腫瘤細胞系以表達提高水平的胸苷酸合成酶(例如結腸腫瘤細胞，按Copur等(1995)所述)。
如上所述，可從冷泉港、農業研究服務培養物保藏中心(theAgricultural Research Service Culture Collection)或者美國典型培養物保藏中心得到含所需遺傳缺陷的細胞。還可按照Miller(1992)，Sambrook等(1989)和Spector等(1998)所述的標準方法，通過將編碼靶酶的基因插入細胞來制備適宜的株。按照Miller(1992)，Sugarman等(1985)和Spector等(1998)所述的標準方法，可完成生長檢測。
本領域技術人員應理解，圖3中所示的篩選方法可廣泛地適用于發現抗生素。例如，在圖4中，可以用來自酵母的胸苷酸合成酶取代大腸桿菌的。這可以發現靶向酵母相關的病原體的特定的抗真菌抗生素。另外，可對其他酶進行這種處理。例如，可以選擇特異性地靶向感染劑例如卡氏肺囊蟲的二氫葉酸還原酶活性的前藥。利用圖3中所描述的篩選方法選擇這些試劑對靶酶的特異性，可以表明這些試劑不激活天然宿主中的酶。對照細胞構建體會含有相應的正常人酶以便表明僅當存在正常人酶時沒有毒性。
例如并如圖4所示，可將外源基因例如編碼TS的人基因插入到宿主細胞中以便表達人TS。這種遺傳工程細胞在圖3中是“檢測細胞”。“對照細胞”不表達靶酶。在一些實施方案中，需要用靶酶的蛋白質產物補充培養基。
在其他實施方案中，野生型細胞是缺陷型的或者不表達一種以上的所需酶。如圖4所示，所述宿主細胞內源不產生胸苷激酶(TK)或胸苷酸合成酶(TS)。將編碼這些酶的人對應物的基因導入宿主細胞以便得到所需水平的表達。通過本文所述的方法，例如利用預先得到的抗免疫檢測酶的單克隆或多克隆抗體，通過細胞裂解產物的免疫印跡和酶檢測，監測在各轉染細胞系中的酶表達水平。參見例如Chen，L等(1996)所述。還可按照Carreras，C．W．和Santi，D．N．(1996)所述，用可檢測的標記的取代基例如氚標記的取代基完成酶檢測。“兩酶”系統可能具有的優點是通過優先在腫瘤細胞中過表達的兩種酶進行激活的要求將給正常細胞提供更高的安全性。
使待測細胞生長在小的多孔平板中并用所述細胞檢測待測前藥的生物活性。為了達到本發明的目的，成功的候選藥物將會阻斷待測細胞的生長或者殺死所述細胞，但是使對照細胞不受傷害。
可將候選前藥直接加到培養基中或預先與細胞表面受體特異性的配體結合，然后加到培養基中。用于細胞特異性傳遞的結合方法是本領域熟知的，參見例如美國專利5459127；5264618和公開的專利說明書WO 91／71424(1991年11月14日公開)。可將候選前藥的離去基團例如用氚可檢測地標記。然后檢測靶細胞或培養基從候選前藥釋放的標記數量。或者，利用Lasic，D．D．(1996)所述的方法通過將前藥包裝到脂質體中或者按Lewis，J．G．等(1996)所述與細胞轉染劑混合可提高細胞的攝入。
在另一實施方案中，按上述方法鑒定過表達所需酶，即靶酶的培養的人腫瘤細胞。在有利于治療劑摻入到細胞內室的條件下，將細胞與潛在的治療劑接觸。然后檢測細胞對細胞增殖的抑制作用或殺死細胞的情況。
應理解，盡管并不總是明確地予以了說明，但是通過提供不同的靶細胞作為對照，接受有效量的已表明是有效前藥的化合物例如下列所列的化合物可進一步修飾各實施方案。
在圖3、4和5中列出了用于鑒定生物活性化合物的高效(highthroughput)篩選方法。該檢測的基礎是遺傳操作和大腸桿菌以及類似單細胞生物(例如酵母)生長容易，參見Miller(1992)和Spector等(1998)。關鍵的步驟是除去對應于前藥設計的靶酶的內源酶活性。這可通過Miller(1992)、Sambrook等(1989)和Spector等(1998)描述的任何方法完成。這些方法包括化學和生物(例如病毒或轉座子插入)誘變，然后是適宜的選擇方法。TS陰性(TS-)細胞然后變成用于鑒定前藥的陰性對照，當通過胸苷酸合成酶作用后，該前藥變成細胞毒素。用其他細胞類型例如其他細菌、酵母或其他可選擇的單細胞生物可完成類似的方法。在該檢測中，對照和重組生物對待測化合物的敏感性均需比較。如本領域技術人員所理解的，從該方法也可得到區別不同種酶的前藥。例如可用表達人和酵母酶的其它相同細胞檢測僅對表達酵母酶的細胞有優先毒性的抗生素前藥。用這種方法可發現新的和特異性的抗生素。
舉例性的細胞系是ras-轉化的NIH 3T3細胞(從ATCC得到的)并將其進行加工以便從克隆的cDNA表達增加數量的人胸苷酸合成酶(HuTS)。在瞬時或永久基礎上完成轉染(參見Chen，L等(1996)，Hudziak，R．M．等(1988)和Carter，P．等(1992))。NIH-000(ras-轉化的親本細胞系)；NIH-001(HuTS的低水平表達者)；NIH-002(HuTS的中等水平表達者)；NIH-003(HuTS的高水平表達者)。用細胞裂解產物的免疫印跡和酶檢測，使用抗用于免疫檢測的HuTS蛋白的抗體監測各細胞系中的TS表達水平(例如按照Chen，L．等(1996)所述)。按照Carreras和Santi(1995)的綜述完成酶檢測。
篩選人結腸直腸和乳腺腫瘤細胞系的HuTS酶表達。按上述對NIH3T3細胞系的描述，將表達低、中和高水平HuTS的細胞系與藥物候選物接觸。按上述監測生長抑制作用和細胞毒性。對表1中所列的酶進行類似的檢測。
在腫瘤細胞中利用TS過表達的前藥的另一實施方案是脫氧尿苷氨基磷酸或與治療放射性核素結合的其他修飾物(本文引用的)。治療放射性核素的一個實例是錸188。可基本按照Callahan等(1989)所述合成該同位素。或者，例如從Mallicrodt Medical BV，荷蘭購買該同位素。可將治療放射性核素通過標準方法(例如Lin，W-Y等(1997)所述)與脫氧尿苷或者脫氧尿苷5’-氨基磷酸或者其他衍生物結合。含放射性核素的脫氧尿苷氨基磷酸將被優先攝入到過表達胸苷酸合成酶的腫瘤細胞的DNA中，并因β和γ射線的集中發射而引起死亡。其他的放射性核素包括錸186和其他的放射性核素(Troutner，D．A．(1987))。體內給藥用帶有人腫瘤或用抗生素抗性微生物感染的動物模型確定體內效力以確認體外檢測。
本發明的另一方面是用于治療以個體內過度增殖的細胞為特征的疾病的方法，該方法包括給所述個體施用治療量的前藥，所述前藥經本文所述的內源細胞內酶可在過度增殖的細胞內轉變成毒素。在一優選的實施方案中，從下文“前藥”節中定義的化合物中選擇所述化合物。
當將所述前藥施用給個體例如小鼠、大鼠或人患者時，可將所述試劑加到可藥用載體中，通過全身或局部施用給所述個體。
為了確定可被有益治療的患者，從所述患者體內取腫瘤樣品，然后檢測細胞表達所需酶的水平。如果表達水平高于在正常細胞中的水平以致毒性量的前藥的給藥不會引起不需要的副作用，然后確定腫瘤或細胞得到了有益的治療，因此，患者適用本發明的治療。例如，如果以比正常細胞高至少約2倍，優選約3倍的水平表達所述靶酶，則患者適合本發明的所述治療方法。治療量是以經驗確定的并且隨待治療的疾病、待治療的個體以及所轉變的前藥或細胞毒素的毒性而定。
當傳遞給動物時，該方法用于進一步確定所述前藥的效力。作為一個動物模型的實例，給裸小鼠(Balb／c NCR nu／nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)組分別皮下接種約105至約109本文所述的過度增殖的癌或靶細胞。建立了腫瘤時，例如通過在腫瘤周圍皮下注射施用前藥。一周兩次用游標卡尺測量兩次腫瘤以確定腫瘤大小的減小。酌情還可使用其他動物模型。Lovejoy等(1997)和Clarke，R．(1996)。
在治療過程中可以一次、連續或者間歇地進行體內給藥。確定最有效方式的方法以及給藥劑量是本領域技術人員熟知的，而且隨用于治療的組合物、治療的目的、待治療的靶細胞以及待治療的個體而定。可按照醫生所選的劑量水平和方式進行一次或多次給藥。下文給出適宜的劑型和施用藥物的方法。
本發明的試劑和組合物可用于制造藥物和按照常規方法例如用在藥物組合物中的活性成份給藥用于治療人和其他動物。
所述藥物組合物可經口、鼻內、不經腸道給藥或者通過吸入治療，并可采用片劑、錠劑、顆粒劑、膠囊、粒劑、安瓿、栓劑或氣溶膠的形式。它們還可采用活性成份在水或非水稀釋劑、糖漿、顆粒或粉末中的懸浮劑、溶液劑和乳劑形式。除本發明的化合物外，所述藥物組合物還可含有其他藥物學活性化合物或者多種本發明的化合物。
更具體地講，本發明分子式的化合物，也指活性成份，可通過任何適宜的途徑包括口、直腸、鼻、局部(包括經皮的、氣溶膠、頰和舌下)、陰道、非腸道(包括皮下、肌肉內、靜脈內和皮內)和肺給藥用于治療。還應理解，優選的途徑將隨受體的狀況和年齡以及待治療的疾病而改變。
總之，適用于上述化合物的適宜劑量為約1-約100mg／kg受體體重／天，優選約1-約50mg／kg受體體重／天，最佳為約1-約25mg／kg受體體重／天。除非特別說明，所有活性成分的重量均按照本發明結構式的母體化合物計算，對于其鹽或酯，重量應成比例地增加。所需劑量優選以兩個、三個、四個、五個、六個或多個亞劑量在一天內以適宜的間隔給藥。這些亞劑量可以以單位劑量形式給藥，每單位劑量形式可以含有例如，約1至約100mg，優選約1至約25mg，首選約5至約25mg活性成分。可以理解，本發明化合物和組合物的適宜劑量取決于疾病的類型、嚴重程度和階段，并且在不同患者之間可以不同。最佳劑量的確定通常涉及本發明治療方法的治療益處和危險性或不利副作用水平之間的平衡。
理想的，給藥的前藥應能在疾病的部位達到活性化合物的峰濃度。這可以通過，例如靜脈內注射前藥(任選地溶于生理鹽水中)或口服給藥含有活性成分的片劑、膠囊或糖漿等來達到。前藥的理想的血液水平可以通過連續輸注來維持，以在疾病組織內提供治療量的活性成分。可以采用有效的組合以提供使各抗病毒劑的總的劑量低于各治療化合物或藥物單獨使用時所需的劑量的治療組合，從而減少副作用。
盡管可以將前藥成分單獨給藥，但優選將其以含有至少一種上文定義的活性成分和一種或多種可藥用載體以及任選的其它治療劑的藥物制劑的形式提供。就與制劑中其它成分的相容性而言，每一載體必需是“可接受的”并且對患者無害。
制劑包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括經皮、頰和舌下)、陰道、非腸道(包括皮下、肌肉內、靜脈內和皮內)和肺給藥的制劑。制劑可以方便地單位劑量形式存在并且可以通過制藥領域熟知的各種方法制備。所述方法包括將活性成分與載體混合的步驟，所述載體由一種或多種輔助成分組成。通常，制劑可以通過將活性成分與液體載體或細分散的固體載體或同時兩種載體均勻緊密地混合進行制備，然后根據需要將產品成型。
適于口服給藥的本發明制劑可以是含有預定量活性成分的不連續的單元如膠囊、扁囊劑或片劑；散劑或顆粒劑；在含水或非水液體中的溶液或混懸液；水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。活性成分還可以是大丸劑、干藥糖劑或糊劑。
片劑可以任選地用一種或多種輔助成分通過壓片或模壓進行制備。壓制的片劑可以通過將自由流動形式的活性成分如粉末或顆粒在適宜的機器中壓片進行制備，可將活性成分選擇性地與粘合劑(例如聚維酮、明膠、羥丙甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉甘醇酸鈉、交聯聚維酮、交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。模壓片劑可以通過將用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀化合物的混合物在適宜的機器中模壓進行制備。可將片劑選擇性地包衣或刻痕，并可用各種比例的例如羥丙甲基纖維素進行配制以緩釋或控釋其中的活性成分，從而提供所需的釋放曲線。還可對片劑選擇性地進行腸溶包衣，以在除胃之外的腸道部分進行釋放。
適于在口腔中局部給藥的制劑包括，在矯味基質、通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠中含有活性成分的糖錠；在惰性基質如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中含有活性成分的軟錠劑；在適宜的液體載體中含有活性成分的漱口水。
用于局部給藥的本發明的藥物組合物可以配制成軟膏、霜劑、混懸液、洗劑、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油。此外，制劑還包括貼劑或敷料，例如浸滲了活性成分和任選的一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或粘性硬膏劑。
對于眼或其它外部組織如口腔或皮膚的疾病，優選將制劑以含有約0．075至約20％w／w，優選約0．2至約25％w／w，首選約0．5至約10％w／w活性成分的局部用軟膏或霜劑的形式涂抹。當配制成軟膏時，可將前藥與石蠟或與水混溶的軟膏基質一起使用。或者，可將前藥成分用水包油霜劑基質配制成霜劑。
如需要，霜劑基質的水相可以包括，例如至少約30％w／w的多元醇，即含有兩個或多個羥基的醇如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它們的混合物。局部制劑優選含有可以促進前藥成分吸收或穿透皮膚或其它感染部位的化合物。所述透皮促進劑的例子包括二甲亞砜和相關的類似物。
本發明乳液的油相可以用已知成分按照已知方式構成。盡管該相可以僅含有乳化劑，但優選含有至少一種乳化劑與脂肪或油或脂肪和油二者的混合物。優選在含有親水性乳化劑的同時還含有親脂性乳化劑，后者起穩定劑的作用。還優選同時含有油和脂肪。乳化劑(一種或多種)加或不加穩定劑(一種或多種)構成了所謂的乳化蠟，蠟與油和／或脂肪一起構成了所謂的乳化軟膏基質，該基質形成了霜劑的油分散相。
適用于本發明制劑的乳化劑(Emulgent)和乳液穩定劑包括吐溫60、斯盤80、鯨蠟基硬脂醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
對用于制劑的適宜的油或脂肪的選擇是以獲得所需的化妝品特性為基礎，因為活性化合物在大部分常用于藥物乳劑的油中的溶解度非常低。因此，霜劑優選是不油膩、不染色并且可以洗掉的產品，其具有適宜的稠度以避免從管或其它容器中漏出。可以使用直鏈或支鏈的一元或二元烷基酯如二-異已二酸酯、異鯨蠟基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕櫚酸酯或稱為Crodamol CAP的支鏈酯的混合物，后三種是優選的酯。根據所需的性質，可將其單獨使用或組合使用。或者，可以使用高熔點的類脂如白凡士林和／或液體石蠟或其它礦物油。
適于對眼局部給藥的制劑還包括滴眼劑，其中的活性成分溶解或懸浮于適宜的載體中，特別是用于前藥成分的含水溶劑。前藥成分在所述制劑中的濃度優選為約0．5至約20％，更優選約0．5至約10％，特別優選約1．5％w／w。
用于直腸給藥的制劑可以是栓劑的形式，適宜的基質包括，例如可可脂或水楊酸酯。
適于陰道給藥的制劑可以是栓劑、棉塞、霜劑、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧劑的形式，除前藥成分外，制劑中還含有本領域已知的適宜載體。
其中的載體是固體的適于鼻給藥的制劑包括粒度在約20至約500微米范圍內的粗粉，其通過使用鼻吸藥的方式給藥，即，從靠近鼻子的粉末容器中通過鼻通道迅速吸入。其中的載體是液體的用于例如鼻噴霧、滴鼻或通過噴霧器以氣霧劑給藥的適宜制劑包括前藥成分的含水或油溶液。
適于胃腸外給藥的制劑包括，含水和非水的等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與使用者的血液等滲的溶質；含水和非水無菌混懸液，其可含有助懸劑和增稠劑；以及用于將化合物靶向于血液成分或一個或多個器官的脂質體或其它微顆粒系統。制劑可以存在于單劑量或多劑量密封容器中，例如安瓿和小瓶中，也可以在冷凍干燥條件下保存，在臨用前僅需加入無菌液體載體如注射用水。可以從前述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備臨時的注射溶液和混懸液。
優選的單位劑量制劑是含有每日劑量或單位、以上所述的每日亞劑量或其適當部分的前藥成分的制劑。
應當理解，除以上具體提到的成分外，本發明的制劑還可含有本領域常用于所述制劑類型的其它試劑，例如，適于口服給藥的制劑可含有甜味劑、增稠劑和矯味劑等其它試劑。
本發明的式的前藥和組合物還可以是獸用藥物制劑的形式，該制劑可以通過本領域的常規方法制備。
以下將簡要描述用于活化本發明前藥的細胞和目標酶。酪氨酸激酶酪氨酸激酶超家族包括EGF受體(EGFR)、巨噬細胞集落刺激因子(CSF-1)受體(v-fms)和胰島素受體，所述超家族與ros癌基因產物有30-40％的同一性。更具體地講，該超家族的成員包括v-src，C-src，EGFR、HER2、 CSF-1受體、c-fms、v-ros、胰島素受體和c-mos。參見Burck，K．B．等(1988)的圖8．5。在許多類型的癌癥中均報道過酪氨酸激酶超家族1型受體的過表達成員(Eccles，S．A．等(1994-5))。酪氨酸激酶的過表達與暴露于α-癌生物學因子TNF-α(Hudziak，R．M．等(1988)和Hudziak，R．M．等(1990))和化療有關(Stuhlinger等(1994))。
Rous肉瘤病毒的轉化基因，v-src，編碼使蛋白質上酪氨酸磷酸化的酶。在染色體20上發現了c-src原癌基因。來自具有神經表型的神經外胚層的組織和細胞系表達高水平的c-src并有高度特異性的激酶活性。
數組研究人員已報道了c-erbB-2／neu(HER2)癌基因在癌細胞中的過表達。Brison(1993)注意到在大多數情況下，erbB原癌基因在人腫瘤中被擴增同時伴有過表達。已報道了c-erbB-2／neu癌基因在人乳腺腫瘤(Slamon，等(1987)，van de Vijver等(1987)，Pupa等(1993)和Andersen等(1995))和膀胱腫瘤(Sauter等(1993))中擴增，而且在每種情況下，擴增均伴有過表達。還報道過c-erbB-2／neu在卵巢組織樣品(Slamon，等(1989)，Meden等(1994)和Felip等(1995))以及在外周神經系統腫瘤中的過表達。Sukumar和Barbacid(1990)。
為了完成藥物篩選檢測，檢測腫瘤細胞系中癌基因的表達或者將腫瘤細胞系進行工程處理以表達不同水平的酪氨酸激酶。培養所選的細胞系并加入不同濃度的候選藥物。按Hudziak，R．M．等(1988)和Hudziak，R．M．等(1990)所述檢測細胞的細胞殺死情況或細胞增殖的抑制作用。二氫葉酸還原酶氨甲喋呤是一種強二氫葉酸還原酶抑制劑，二氫葉酸還原酶是一種細胞內葉酸代謝所必需的酶。二氫葉酸還原酶從二氫葉酸再生四氫葉酸，一種胸苷酸合成酶反應的產物(Voet，等(1995)，p813)。已確立細胞的氨甲喋呤抗性的重要機制是由于DHFR基因的擴增而提高了DHFR活性。Banerjee，D．等(1995)，Schimke，R．T．等(1988)。Lonn，U．等(1996)報道DHFR基因的擴增發生在手術后曾接受輔助化療(環磷酰胺，氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶(CMF))的乳腺癌患者中。沒有成視網膜細胞瘤(Rb)可能也會導致MTX抗性提高，這是沒有基因擴增的DHFR mRNA表達活性提高的結果。Li，W．W．等(1995)。已表明帶有突變的p53的細胞系有基因擴增，并通過化療選擇細胞抗性。Banerjee，D．等(1995)，Yin，Y．等(1992)和Livingston，L．R．等(1988)。為了完成本發明的檢測，Schimke，R．T．等(1992)描述了數種小鼠、倉鼠和人細胞系。另外，用LonnU等(1996)的PCR方法檢測DHFR基因擴增并鑒定可用于完成本文所述的鑒定治療劑之方法的細胞。Masters，J．N．和Attardi，G．(1983)提供了編碼人二氫葉酸還原酶的cDNA的核苷酸序列，可將細胞進行工程處理以使其表達不同水平的本文所述的酶。Dicken，a．P．等(1993)描述了通過化療選擇的突變型DHFR基因。Nakano，T等(1994)中描述了DHFR的純化以及與酶功能有關的檢測。另外，將編碼DHFR的cDNA轉染到NIH 3T3細胞中。加入不同濃度的候選藥物，然后檢測殺死細胞的情況和增殖的抑制作用。
通過例如將烷基化基團連接到二氫葉酸的N5或者C6位可以合成依賴二氫葉酸還原酶活性的抗代謝劑。DHFR還原N5-C6鍵將會釋放烷基化劑。除烷基化基團外，通過DHFR的釋放會產生毒素或抗代謝劑的任何部分均可用于實現本發明。通過加入磷酸酯(phosphatese)或者氨基磷酸酯部分可進一步修飾這些化合物。多藥物抗性腫瘤多藥物抗性(MDR)是一個用來描述腫瘤細胞用于逃避抗癌藥物的細胞毒作用的各種策略的總術語。MDR的特征在于腫瘤腫瘤細胞對用于化療的藥物的敏感性降低，而且對既沒有明顯的結構同源性也沒有共同靶的光譜藥物的敏感性也降低。這種多效抗性是成功治療腫瘤的主要障礙之一。MDR可能是由于在質膜或胞質內、細胞區室或核的結構或功能發生變化而引起的。從解毒作用和DNA修復途徑的修飾、藥物螯合作用的細胞位點的改變、藥物-靶親和性的降低、細胞內特異性藥物抑制劑的合成、蛋白質的尋靶發生改變或者不適當以及藥物的加速去除或分泌來討論MDR的分子機制。
與MDR有關的一種機制是由藥物篩選細胞系中稱為ATP-依賴的多藥物抗性相關蛋白質(MRP)之基因的擴增和過表達引起的。有關MDR機制的綜述參見Gottesman，M．M．等(1995)和Noder等(1996)。
為了建立MDR細胞系，如Gottesman，M．M．等(1995)和Simon，S．M．和Schindler，M．(1994)以及本文引用的參考文獻所述，用一步或多步完成藥物篩選。編碼各種哺乳動物MDR的DNA序列的分離方法在Gros，P．等(1986)，Gudkov，A．V．等(1987)和roninson，I．B．等(1984)中有描述，并在Gottesman，M．M．等(1995)中有綜述，可按上文所述對細胞進行工程處理以使其表達不同水平的該酶。前藥靶向的MDR是基于這種轉運蛋白的ATPase活性。核糖核苷酸還原酶核糖核苷酸還原酶將核糖核苷二磷酸還原為相應的脫氧核糖核苷二磷酸。這種酶是由兩個α亞單位和兩個β亞單位組成的四聚體。羥脲通過與β2-底物復合物的酪氨酰自由基(Tyr-122)相互作用而特異性地阻斷該反應。Voet等(1995)。靶向該反應的目的是積累自由基產物O2-，其是高細胞毒性。將該技術應用于其他疾病盡管本發明的主要焦點是針對癌癥，但是應認識到該技術可廣泛地用于其他疾病，特別是抗生素抗性的細菌感染。由于β內酰胺酶的過表達而使β內酰胺抗生素在細菌中遇到抗性。Hamilton-Miller，J．M．T．和Smith，J．T．編(1979)，443頁。誘導其他酶例如Ⅲ型氨基糖苷磷酸轉移酶并在用氨基糖苷抗生素例如卡那霉素治療后對所述酶進行篩選。McKay，G．A．等(1994)。為了達到本申請的目的，將制備不阻斷酶活性，但將利用高酶活性對感染性因素產生細胞內毒素的來自已知底物的前藥底物。胸苷酸合成酶胸苷酸合成酶的過表達與結腸癌、乳腺癌、胃癌、頭頸癌、肝癌和胰腺癌有關。目前用抗代謝劑藥物(尿嘧啶基的、葉酸基的或喹唑啉基(參見表1))治療這些疾病。在每種情況下，腫瘤抑制喪失和／或5-氟尿嘧啶治療可能會導致TS活性增加，或者選擇該酶的藥物抗性形式，由此導致疾病復發的藥物抗性。Lonn，R等(1996)報道TS基因的擴增發生在手術后曾接受輔助化療(環磷酰胺、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶[CMF])的乳腺癌患者中。這種TS表達的提高是除因腫瘤抑制劑功能喪失而引起的TS基本增加以外的。正常情況下由TS完成的主要反應是從脫氧尿苷一磷酸(dUMP)和N(5)，N(10)-亞甲基-四氫葉酸(THF)合成脫氧胸苷一磷酸(dTMP)。在一個實施方案中，將尿嘧啶或THF提供給表達TS的細胞。就本發明目的而言，“尿嘧啶”(僅堿基)和“尿苷”(堿基和糖)交換使用并且是同義詞。表4(下文)總結了受TS表達增加之影響的許多癌癥。

平均數的倍數差異＞2．5衍生物或“前藥”通過所述酶轉變成高度細胞毒性的代謝產物。在正常細胞中表達的低水平TS將不產生毒性量的轉變的毒素。在疾病組織中表達的高水平TS產生更多的毒素，由此導致細胞增殖的抑制作用和／或細胞死亡。例如，目前的治療使用5-氟脫氧尿苷酸抑制TS活性。在與底物反應的過程中，氟原子不可逆的與TS酶相連并抑制該酶。在一個實施方案中，建議的新治療方法使TS完成反應，但產生一種修飾的產物，當摻入DNA時引起毒性作用。酶產物還可以阻斷其他重要的細胞功能(例如蛋白質合成或者能量代謝)。前藥的轉變還可釋放代謝產物，例如對細胞有毒的CN-。可以合成尿嘧啶／dUMP和N(5)(10)-THF的衍生物，所有這些化合物都有可能在通過TS代謝轉化后產生毒性產物。
一級序列表明TS是一種高度保守的酶。Perry，K．等(1990)。已經確定了來自數種原核種，干酪乳桿菌(Hardy，L．W．等(1987)；Finer-Moore，J．等(1993))和大腸桿菌(Perry，K．等(1990))和真核生物大型利什曼原蟲(Knighton，E．R．等(1994))以及T4噬菌體(Finer-Moore，J．等(1994))的TS的晶體結構，并表明四級結構也是非常保守的。Schiffer，C．A等(1995)確定并描述了三維結構的TS的種的序列排列。從這些氨基酸序列，可以用本領域技術人員熟知的方法推導或分離DNA序列。Sambrook等(1989)。另外，來自不同生物的一些29TS序列已被克隆并保存到Carreras，C．W．和Santi，D．V．(1995)所述的DNA數據庫中。Takeish，K等(1985)，Davisson，V．J．等(1989)和Davisson，V．J．等(1994)提供了人胸苷酸合成酶基因序列、其克隆、表達和純化。用本領域技術人員熟知的方法構建編碼TS蛋白質并含必需的調節序列的基因。通過電穿孔、轉化或者轉染方法將編碼TS的基因導入靶細胞。Sambrook等(1989)。另外，用本領域技術人員熟知的方法，例如按Carreras，C．W．和Santi，D．V．(1995)，Miller(1992)和Spector等(1998)所述的方法將所述基因插入到適宜的表達載體中。表達載體將TS基因插入到細胞中。然后使細胞在有利于TS蛋白質表達和生產的條件下生長。
在上述檢測中可以使用人胃癌細胞系，MKN-74、MKN-45、MKN-28和KATO-Ⅲ以鑒定是TS的選擇性底物的潛在治療劑。分別從良好和不良分化的腺瘤建立MKN-74和MKN-45。在Osaki，M等(1997)和本文引用的參考文獻中描述了這些細胞系和培養條件。另外，可以使用已用5-FU選擇過的過表達胸苷酸合成酶的腫瘤細胞系，例如由Copur，S．等(1995)描述的那些。
用本領域技術人員熟知的酶生物化學檢測方法可以對TS進行定量分析。為了對來自人腫瘤組織樣品的TS蛋白質水平和TS基因表達進行定量分析，由Johnston，P．G．等(1991)和Horikoshi，T等(1992)報告的方法提供了敏感性檢測。另外，用Lonn，U等(1996)的PCR方法檢測TS基因擴增并鑒定用于本文所述的鑒定治療劑之方法的細胞。
對于本領域技術人員來說顯而易見的是，還需檢測不含藥物以及分別含參照藥物如下文舉證的化合物的對照細胞培養系統。前導化合物是以比對正常細胞高約2倍優選高約3倍的活性優先殺死靶細胞的化合物。本發明還提供了通過本文所述方法鑒定的試劑。
在另一方面，本發明通過首先完成上述檢測提供了抑制過度增殖之細胞增殖的方法。將用所述檢測方法鑒定的前藥與細胞接觸然后通過上述內源細胞內酶在細胞內轉變成有毒的代謝產物。按Miller等(1992)，Sugarman等(1985)和Spector等(1998)所述監測細菌、酵母和其他種類細胞的生長或細胞毒性。TS前藥在一優選的實施方案中，本發明涉及兩類由TS激活的化合物，各自是5-取代的脫氧尿苷一磷酸或者保護的5-取代的尿嘧啶或者脫氧尿苷一磷酸的衍生物。保護的5-取代脫氧尿苷一磷酸衍生物是其中已通過連接適宜的化學保護基團封閉了磷酸部分的那些化合物。5-取代脫氧尿苷一磷酸衍生物的保護可以提高溶解度，有利于細胞穿透、有利于跨過血-腦屏障并防止可能另外導致磷酸基團丟失的細胞或細胞外磷酸酶的作用。在另一實施方案中，將5-取代的尿嘧啶或者尿苷衍生物施用給含核苷激酶活性的細胞，其中5-取代的尿嘧啶／尿苷衍生物被轉變成5-取代的尿苷一磷酸衍生物。還可以修飾尿苷衍生物以提高其溶解度、細胞穿透作用和／或跨過血-腦屏障的能力。
胸苷酸合成酶作用于5-取代尿苷一磷酸衍生物可釋放與嘧啶環5位相連的取代基(離去基團)。然后釋放的取代基本身能夠或者與另一細胞組分相互作用后能夠作為毒素或者細胞增殖抑制劑發揮作用。Ⅰ化合物的一般合成方法Ⅰ化合物的L和D異構體具有如下結構 在以上結構式中，R1(位于5位)是離去基或含有離去基，所述離去基是具有與通過胸苷酸合成酶從嘧啶環上釋放相適應的分子大小和親電性的化學實體，所述離去基在由胸苷酸合成酶從嘧啶環上釋放后，可以抑制細胞的增殖或殺死細胞。
在以上結構式中，Q是含有選自糖基團、硫代糖基團、碳環基團及其衍生物的化學實體的磷酸或氨基磷酸衍生物。糖基團的例子包括但不僅限于單糖環狀糖基團，例如從氧雜環丁烷類化合物(4元環的糖)、呋喃糖(5元環的糖)和吡喃糖(6元環的糖)衍生的單糖環糖基團。呋喃糖的例子包括蘇呋喃糖基(來自蘇糖，一種四碳糖)；赤呋喃糖基(來自赤蘚糖，一種四碳糖)；核呋喃糖基(來自核糖，一種五碳糖)；阿拉伯呋喃糖基(來自阿拉伯糖，一種五碳糖)；木呋喃糖基(來自木糖，一種五碳糖)和來蘇呋喃糖基(來自來蘇糖，一種五碳糖)。糖基團衍生物的例子包括“脫氧”、“酮基”和“脫氫”衍生物以及取代的衍生物。硫代糖基團的例子包括其中的環氧被硫原子所代替的上述糖基團的硫類似物。碳環基團的例子包括C4碳環基團、C5碳環基團和C6碳環基團，這些基團還可含有一個或多個取代基，例如-OH基團。
在一個實施方案中，Q是下式的β-D-呋喃核糖基團 其中R7選自磷酰基、氨基磷酸根及其衍生物，其中的R2和R3相同或不同并且彼此獨立地是-H或-OH。
在某些實施方案中，R1是鏈烯基，即(-CH=CH)n-R4，其中n是0-10的整數，R4是鹵素如I-或Br-、CN-或汞；其中R2是H并且R3是-OH；其中R2是OH并且R3是H；其中R2和R3是H；或者其中R2和R3是OH。
另一方面，R1是鏈烯基，即(-CH=CH)n-R4，其中n是0-10的整數，R4是或含有選自H、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、羥基、-O-烷基、-O-芳基、-O-雜芳基、-S-烷基、-S-芳基、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯鹵代乙烯基(a cyanide，cyanate and thiocyanate halovinyl group)、鹵代汞基、-S-雜芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-和NHNH2基團。在這些實施方案中，另一方面包括其中R2和R3是H；其中R2是OH并且R3是H；其中R2是H并且R3是OH；或者其中R2和R3是OH。
R1位上取代基的一個優選實施方案中可以經歷圖8所示的烯丙型互換的基團。
又一方面，候選的治療劑是下式的化合物 其中n是0-10的整數；其中A是磷酰胺衍生物，或下式化合物 其中Q選自H、以上所定義的未取代或取代的糖以及以上所定義的取代或未取代的碳環。
在其它實施方案中，上述化合物被具有如下結構式的Q修飾 其中R7選自H、磷酰基、氨基磷酸酯及其衍生物，其中R2和R3相同或不同并且彼此獨立地是-H或-OH。在一個實施方案中，R7不是H。對于這些實施方案，R1還可以具有-(CH=CH)n-R4的結構，其中n是0-10的整數，R4選自H、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、羥基、-O-烷基、-O-芳基、-O-雜芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-雜芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯鹵代乙烯基化合物(a cyanide，cyanate and thiocyanate halovinyl compound)、鹵代汞化合物、-NHOH、-NHO-烷基、NHNH2和NH2CONHO-。
此外，在另一方面，候選的治療劑是下式化合物 其中R=2＇-脫氧-5-尿苷酰基(uridyl)，m是0或1，n是0-10的整數。
適當的時候，化合物可以是其對映體、非對映體或立體異構體的形式，包括，例如D-或L-形式，并且可以是任何立體化學構型，包括，例如α-或β-異頭物的形式。
上述5-取代的嘧啶核苷和5-取代的嘧啶核苷單磷酸的合成可以通過本領域熟知的方法來完成。例如，將5-氯汞基-2＇-脫氧尿苷用鹵代烷基化合物、鹵代乙酸酯或鹵代烯烴在Li2PdCl4的存在下處理，經過有機金屬鈀中間體分別生成5-烷基、5-乙酰基或5-烯烴衍生物。Wataya等(1979)和Bergstrom等(1981)。嘧啶核苷和核苷酸C5-修飾的另一個例子是將未保護的核苷酸用乙酸汞處理然后在Li2PdCl4的存在下加入苯乙烯或環取代的苯乙烯形成C5-反-苯乙烯基衍生物。Bigge等(1980)。嘧啶脫氧核苷三磷酸通過用乙酸汞在乙酸鹽緩沖液中于50℃處理3小時在嘧啶環的5位用汞衍生化。Dale等(1973)。預期所述處理還可以有效地修飾單磷酸酯；或者，可將修飾的三磷酸酯通過酶轉變成修飾的單磷酸酯，例如用堿性磷酸酶進行有控制的處理然后純化單磷酸酯。可以用與汞具有類似的分子特性但藥理學特性較為優選的其它部分(包括有機的或無機的)進行替換。合成取代嘧啶的一般方法可以參見，例如美國專利427544、4267171和4948882和Bergstrom等(1981)。以上方法還可用于合成含有除核糖或2＇-脫氧核糖之外的其它糖如2＇，3＇-二脫氧核糖、阿拉伯糖、呋喃糖、來蘇糖、戊糖、己糖、庚糖和吡喃糖的5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物。5-位取代基的例子是鹵代乙烯基，例如E-5-(2-溴乙烯基)-2＇-脫氧尿苷酸。Barr，P．J．等(1983)。該化合物按照如下實驗部分的描述合成。
或者，5-溴脫氧尿苷、5-碘脫氧尿苷及它們的單磷酸酯衍生物可以從Glen Research，Sterling，VA(USA)、Sigma-Aldrich Corporation，St．Louis，MO(USA)、Moravek Biochemicals，Inc．，Brea，CA(USA)、ICN，Costa Mesa，CA(USA)和New England Muclear，Boston，MA(USA)購買到。市售的5-溴脫氧尿苷和5-碘脫氧尿苷可以通過化學方法或酶方法，通過激酶的作用用可從Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)購買到的試劑轉變成它們的單磷酸酯。這些鹵代衍生物可與其它取代基組合形成新的、更有效的抗代謝劑。
Ⅱ類化合物的一般合成方法另一方面，與過表達胸苷酸合成酶的細胞接觸的前藥是下式化合物的L或D異構體 在以上結構式中，R1是下式的部分 在以上結構式中，R2是或含有二價的電子導管部分。在一個實施方案中，R2是或含有單或多不飽和的電子導管，其作用是將電子導離嘧啶環并導向離去基R1。在一個實施方案中，R2選自不飽和的烴基；含有一個或多個不飽和烴基的芳香族烴基以及含有一個或多個不飽和烴基的雜芳基團。
在一個實施方案中，R2是不飽和烴基，其具有選自如下的結構 在一個實施方案中，R2和R3合在一起形成選自如下的結構 在一個實施方案中，R2是芳香族烴基，其具有選自如下的結構 在一個實施方案中，R2是雜芳族烴基，其具有選自如下的結構
其中J是雜原子如-O-、-S-或-Se-或雜原子基團如-NH-或-NRALK-，其中RALK是含有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或含有3-10個碳原子的環烷基。
在以上結構式中，R3是二價間隔基部分，也稱為間隔基單元。在一個實施方案中，R3是具有選自如下結構的二價間隔基部分 其中R5相同或不同并且彼此獨立地是含有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或含有3-10個碳原子的環烷基。
在一個實施方案中，R3是具有選自如下結構的二價間隔基部分 在以上結構式中，n是0-10的整數，m是0或1。在一個實施方案中，n是0-10的整數，m是1．在一個實施方案中，n是0并且m是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則n不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則m不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則n不是0并且m不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則R4不是鹵素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一個實施方案中，當R7是-H并且m是0時，則R4不是鹵素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一個實施方案中，當R7是-H，m是0并且n是0時，則R4不是鹵素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。
在以上結構式中，R4是發毒團。本文所用術語“發毒團”是指是或含有是具有與通過胸苷酸合成酶從嘧啶環上釋放相適應的分子大小和親電性的化學實體的離去基，其在由胸苷酸合成酶從嘧啶環上釋放后，可以抑制細胞的增殖或殺死細胞。
在一個實施方案中，發毒團是或含有可被細胞內過表達的細胞內的酶激活或釋放的離去基。在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 其中X是-Cl、-Br、-I或其它有效的離去基(包括但不僅限于-CN、-OCN和-SCN)；Y相同或不同并且彼此獨立地是-H或-F；Z相同或不同并且彼此獨立地是-O-或-S-。
在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有具有如下結構的基團 在一個實施方案中，R4是或含有選自如下一組的化學實體-Br、-I、-O-烷基、-O-芳基、-O-雜芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-雜芳基、-CN、-OCN、-SCN、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-、NHNH2、-N3和順鉑衍生物，例如 在以上結構式中，Q是或含有支持前藥與酶例如TS或TK功能結合的糖部分或類似的部分。在一個實施方案中，Q選自 其中R6相同或不同并且彼此獨立地是-H、-OH、-OC(=O)CH3或其它保護的羥基(包括但不僅限于苯甲酰基，-COC6H5和甲苯酰基-COC6H4CH3)；R7是氫、磷酸酯基團、氨基磷酸酯基團或其它含磷基團。
在一個實施方案中，Q是
在一個實施方案中，Q是 在一個實施方案中，R7是氫。在一個實施方案中，R7不是氫。在一個實施方案中，R7是磷酸酯基團或氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是磷酸酯基團或氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是氨基磷酸酯基團。
在一個實施方案中，R7是從氨基酸衍生的氨基磷酸酯基團，所述氨基酸包括20種天然的氨基酸。在一個實施方案中，R7是從丙氨酸衍生的氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或含有具有如下結構的基團 以上基團及其制備方法記載于McGuigan等(1993)和McGuigan等(1996)。
在一個實施方案中，R7是從色氨酸衍生的氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或含有具有如下結構的基團
以上基團及其制備方法記載于Abraham等(1996)。
在一個實施方案中，R7是磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或含有具有如下結構的基團 以上兩種基團中的第一種及其制備方法記載于Freed等(1989)；Sastry等(1992)；Farquhar等(1994)和Farquhar等(1995)。以上兩種基團中的第二種及其制備方法記載于Valette等(1996)和Benzaria等(1996)。
在一個實施方案中，R7是或含有具有如下結構的基團(其中R是芳香族取代基) 以上兩種基團中的第一種及其制備方法記載于Meier等(1997)；Meier等(1997)和Meier等(1997)。以上兩種基團中的第二種及其制備方法記載于Hostetler等(1997)和Hostetler等，公開的國際專利申請WO 96／40088(1996)。
在一個實施方案中，R7在Q內形成環狀基團。其中的一個實施方案及其制備方法如下所示(其中DMTr是4，4＇-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔丁氧羰基，DCC是1，3-二環己基碳化二亞胺，4-DMAP是4-二甲氨基吡啶) 在一個實施方案中，化合物可以是任何對映體、非對映體或立體異構體形式，包括D-構型、L-構型、α-異頭物形式和β-異頭物形式。
在一個實施方案中，化合物可以是鹽的形式，或是保護的或前藥的形式或它們的組合，例如，是鹽、醚或酯的形式。
在一個實施方案中，前藥是下式的化合物 在一個實施方案中，前藥是下式的化合物 在一個實施方案中，前藥是下式的化合物 在一個實施方案中，前藥是下式的化合物 在一個實施方案中，前藥是下式的化合物 在另一個實施方案中，以上結構被進一步修飾以含有硫代磷酸二氮雜環丙烷而不是磷酸二氮雜環丙烷，所用方法如下所述。Ⅱ類化合物的一般合成策略尿嘧啶5位上的結構被稱為連接基，因為它們將計劃的離去基(發毒團)與雜環相連接。基于與人TS內的Cys-195反應使雜環激活，負電荷從尿嘧啶的6位被導向連接基團。該機制曾被用于描述5＇-單磷酸化形式的(E)-5-(溴乙烯基)-2＇-脫氧尿苷(BVDU)，Barr等，(1983)和(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2＇-脫氧尿苷(TFPe-dUrd)，Wataya等，(1979)、Santi(1980)和Bergstrom等(1984)。
毒素和dNMP之間的連接“間隔基”必需是不飽和的以便能夠傳遞由TS-Cys-巰基攻擊所提供的活化毒素的負電荷。在可用于該目的的許多不飽和有機功能基中，乙烯基、烯丙基和炔丙基單元簡單、體積小并且易于合成。乙烯基和烯丙基單元的優點在于它們可以制成兩種不能互換的幾何異構體形式中的任何一種。因此，它們可以用作通過TS活性位點的前藥適應的“探針”。另一方面，炔丙基單元的優點在于是圓柱形對稱的，從而TS-催化的從該類型連接基上釋放毒素不取決于其相對于dUMP的尿嘧啶環的取向，這與乙烯基和烯丙基分子的情況不同。
采用了兩種不同的途徑來設計本發明的基于核苷酸的前藥。一種是基于BVDU單磷酸酯的結構，其特點是離去基／毒素直接連接在dUMP的C5上的(聚)乙烯基取代基的末端。這是乙烯基連接途徑。這些化合物在“Ⅰ類”化合物部分進行定義。另一種是基于TFPe-dUMP的結構，其與第一種類似，但有隔離離去基／毒素和不飽和單元的亞甲基單元，從而包括烯丙基或炔丙基單元，以下將作為“Ⅱ類”進行描述。這是烯丙基連接途徑。
各種類型的5＇-氨基磷酸酯變型的結構如下所示 烯丙基連接途徑的炔丙基變型的活化機制的先決條件是5-乙炔基-2＇-脫氧尿苷5＇-單磷酸酯(EdUMP)和5-(3-羥基-1-丙炔基)-2＇-脫氧尿苷5＇-單磷酸酯(HOPdUMP)都與TS的相互作用(Barr等，1981，Barr和Robins，1983)。EdUMP是TS的強效抑制劑(Ki=0．1μM)，并且可能在活性位點形成了基于丙二烯的物質。HOPdUMP(Ki=3．0μM)顯示與眾不同的抑制動力學，可能是由于在活性位點形成了基于累積烯的物質。
最近合成了在結構上與乙烯基和烯丙基連接途徑機制的共同中間體類似的5-亞烷基化的5，6-二氫尿嘧啶(Anglada等，1996)。它們顯示出高的親電性。它們易于和乙醇反應生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是圖8所示的機制中水加成反應再生有催化能力的TS的先決條件。最近，通過捕捉法研究證實了由TS產生的長的難以捉摸的C5亞甲基中間體的存在(Barrett等，1998)。
帶有C5炔丙基和烯丙基醇的2＇-脫氧尿苷可以簡單地合成。在文獻中報道了許多這些類型化合物及其衍生物，甚至有一些聯同TS進行了研究。例如，對5-炔基-dUMP，包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羥基-1-丙炔基)酮作為TS抑制劑進行了實驗(Barr等，1981)，已證實其中的一些摻入到TS-缺乏的癌細胞的DNA中(Balzarini等，1985)。
5-汞-(Ruth等，1978)和5-碘尿苷(Robins等，1981)均很容易在鈀催化劑的存在下與烯烴和炔烴縮合形成帶有C5連接基的尿苷。后一種方法最為常用(Robins等，(1982)，Asakura和Robins(1988)和(1990))。已經實現了保護的5-碘-2＇-脫氧尿苷與叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚(Graham等，(1998)，De Clercq等(1983))、甲基炔丙基醚(Tolstikov等(1997))甚至炔丙醇本身(Chaudhuri等(1995)，Goodwin等，(1993))的高產率的縮合。后一反應引入的3-羥基-1-丙炔基取代基還可以通過用DIBAL-H還原甲基丙烯酸酯基團得到(Cho等，(1994))，后者本身可以從用于合成BVDU的相同的Heck反應得到。這些鈀催化的反應用途如此廣泛，以致于可用于將非常長而復雜的功能基化的基于炔丙基的連接基與5-碘-2＇-脫氧尿苷縮合(Livak等，(1992)，Hobbs，(1989))。基于(Z)-烯丙基的連接基通過用Undiar催化劑部分氫化炔丙基前體產生(Robins和Barr(1983))，而基于(E)-烯丙基的連接基則最好通過(E)-三丁基錫烷基化的乙烯的Heck偶聯反應制備(Crisp(1989))。
按照文獻的方法，制備帶有叔丁基二甲基硅烷基炔丙基醚的3＇，5＇-二-O-保護的2＇-脫氧尿苷(Graham等，(1998)，De Clercq等(1983))并將其轉變成相應的(Z)-烯丙基醚的一部分還原(Robins和Barr(1983))。由于TBAF-介導的TBDMS基團的脫除可產生就地發揮功能的氧陰離子，這些TBDMS保護的炔丙基-和(Z)-烯丙基連接的核苷可以方便地作為某些帶有發毒團的靶的前體。對于帶有(E)-烯丙醇的核苷，可以通過文獻中描述的(E)-三丁基錫烷基化的乙烯的Heck偶聯反應制備已知的O-四氫吡喃基醚衍生物(Crisp(1989))。 采用兩步文獻中描述的方法(Phelps等(1980)，Hsiao和Bardos(1981))，將炔丙基及(E)和(Z)-烯丙醇轉變成其相應的二-氮雜環丙烷基氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，從而TS對5＇-單核苷酸變型的加工將分別釋放出細胞抑制藥物TEPA或硫代TEPA的活性代謝物(Dirven等，(1995))。

為了避免從炔丙基或烯丙基醇衍生的酯潛在的水解不穩定性，將發毒團的羧酸部分如3-硝基丙酸通過與醇以α，α-二氟代醚的形式連接進行“掩蔽”。為此，將正常的酯用Lawesson’s試劑處理先制得炔丙基或烯丙基硫代酯連接基(Cava和Levinson)，然后將硫代酯按照公認的方式用四丁基銨二氫三氟化物轉變成α，α-二氟代醚(Kuroboshi和Hoyama(1991)和(1994))。然后將基于α，α-二氟代醚的連接基與保護的5-碘-2＇-脫氧尿苷按照常規方法縮合。作為α，α-二氟代醚，掩蔽的發毒團將是穩定的，直至TS將其以潛伏的活潑酰氟的形式釋放。隨后發生的迅速水解將就地產生基于羧酸的發毒團。 含有CS炔丙基以及(E)和(Z)-烯丙基醇的2＇-脫氧尿苷的對-硝基苯基醚衍生物提供了體外TS酶試驗的良好試劑，因為釋放的對-硝基苯酚的分光光度、動力學測定將可以鑒定那些與TS以易于從連接基的末端催化釋放離去基的方式結合的連接的dUMP平臺。所需的對-硝基苯基醚可以直接從醇通過與4-氟硝基苯的堿催化的縮合制得，或通過適宜的對-硝基苯基炔丙基或烯丙基醚的Heck偶聯從頭合成。TS試驗所需的5＇-單磷酸酯可從核苷通過酶學方法生成，或按照公認的區域選擇性的5＇-單磷酸化方法化學合成(Imai等，(1969))。 許多5-取代的2＇-脫氧尿苷不是人TK的底物，但有趣的是，發現5-(4-羥基-1-丁炔基)-2＇-脫氧尿苷是個例外(Barr等(1981))。因此，預期某些帶有發毒團的核苷也可以具有適宜的TK底物活性，因此將檢測它們抑制腫瘤生長的活性。此外，根據新開發的區域選擇性的方法，5＇-氨基磷酸酯的制備現在已是很簡單的事，因此對這些前藥變型也進行了制備和測試。組合合成一種迅速獲得先導化合物的途徑是采用組合化學方法。由于對胸苷酸合成酶作用機制的大量了解(Schiffer等，(1995))，預定了如下主題前藥的細胞進入、胸苷激酶對前藥的磷酸化以及胸苷酸合成酶使前藥(尿苷衍生物)向活性藥物的轉化。就細胞進入而言，可采用改良的磷酸化的核苷酸(參見，例如美國專利5233031和5627165)。此外，由于腫瘤抑制劑基因喪失所引起的大部分腫瘤細胞內胸苷激酶的過表達促進了前藥在腫瘤細胞內的優先磷酸化(Hengstschlager等(1996))。類似地，由于伴隨腫瘤抑制物喪失(Li，W．等，(1995))和化療(Peters，G．J．等，(1995))的胸苷酸合成酶的過表達，在腫瘤細胞內將會發生磷酸化的前藥或氨基磷酸酯衍生物的優先活化。靶向于尿苷環的5-位(可以由此產生細胞毒素)或戊糖的5＇-位(促進與胸苷酸合成酶的結合)的組合化學，將可以通過優化尿苷環上離去基(細胞毒素)的結構以及促進戊糖的5＇-位上能磷酸化基團的優化而大大加快先導化合物的發現。為了圖3、4和5所示的篩選目的，進行測試的化學實體可以通過針對單一位點的化學方法產生(圖4)，也可以在分子上的兩個位點同時產生(圖5)。結合圖3所示的篩選，已經開發了用于發現靶向于胸苷酸合成酶的前藥的強有力的系統。所用的組合化學途徑與Lam，K．S．(1997)描述的類似。在一個實施方案中，提供毒性離去基的前藥如圖6所示。圖6所示的尿苷底物利用磷酰胺酶(phosphoramidase)(存在于所有細胞中)和腫瘤細胞中升高的胸苷酸合成酶(TS)。本領域技術人員可以理解，合理化的藥物設計可廣泛用于合成本文所定義的其它前藥。
本領域技術人員應當理解，圖3所示的篩選可廣泛用于發現抗生素。例如，可用來自酵母的胸苷酸合成酶代替圖4所示的大腸桿菌的胸苷酸合成酶。這將可以發現靶向于與酵母有關之疾病的特異性抗真菌劑。此外，對其它酶也可進行該處理。例如，可以選擇出特異性地靶向于傳染物如卡氏肺囊蟲的二氫葉酸還原酶活性的前藥。針對靶酶的特異性選擇這些傳染物，并且可以通過圖3所述的篩選試驗證實不會激活自然宿主的酶。對照細胞構成物可以含有相應的正常人的酶，以證實僅存在正常人的酶時沒有毒性。
可以通過各種化學修飾的方法使本發明或本文所述的前藥或試劑穿透細胞膜和血腦屏障的通透性更強。這包括，在其磷酸酯部分連接各種能夠改善膜通透性的功能基。所述功能基包括但不僅限于，美國專利5233031和5627165；Fries，K．M．等(1995)和McGuigan，C．等(1984)中所描述的那些。某些二脫氧尿苷(ddU)的氨基磷酸酯衍生物對HIV有活性并可以成功地繞過胸苷酸合成酶。McGuigan，C．等(1984)。這些化學修飾還可以保護取代的嘧啶單磷酸酯衍生物防止細胞和細胞外的磷酸酯酶的作用。盡管汞或鹵素衍生物是有效的，但預期可以釋放烷基化或抗代謝化合物的修飾是優選的。優選的實施方案如圖6所示。Ⅰ類和Ⅱ類化合物的衍生物本文所公開的上述化合物的鹽、酯和醚也包括在本發明的范圍內。本發明前藥的鹽可以從無機和有機酸和堿衍生得到。酸的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸如草酸，盡管本身不是可藥用的，但可用于制備用作中間體的鹽以得到本發明的化合物及其可藥用酸加成鹽。堿的例子包括堿金屬(例如鈉)氫氧化物、堿土金屬(例如鎂)氫氧化物、銨和式NW4+的化合物，其中W是C1-4烷基。
鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、葡萄糖酸氫鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、flucoheptanoate、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。鹽的其它例子包括本發明化合物的陰離子與適宜的陽離子如Na+、NH4+和NW4+(其中W是C1-4烷基)的鹽。
對于治療應用，本發明化合物的鹽應是可藥用的。但是，也發現不可藥用的酸和堿的鹽可用于制備或純化可藥用化合物。
本發明方法所鑒定的前藥或化合物的酯包括通過將2＇-、3＇-和／或5＇-羥基酯化得到的羧酸酯(即-O-C(=O)R)，其中R選自(1)直鏈或支鏈的烷基(例如正丙基、叔丁基或正丁基)、烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)、芳烷基(例如芐基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(例如，被例如鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基選擇性取代的苯基)；(2)磺酸酯，例如烷基磺酰基(例如甲磺酰基)或芳烷基磺酰基；(3)氨基酸酯(例如L-纈氨酰基或L-異亮氨酰基)；(4)膦酸酯和(5)單、二或三磷酸酯。磷酸酯還可以被例如C1-20醇或其活潑衍生物酯化，或被2，3-二(C6-24)酰基甘油酯化。在所述酯中，若無例外說明，所存在的所有烷基部分均優選含有1-18個碳原子，特別是1-6個碳原子，更優選1-4個碳原子。所述酯中所存在的所有環烷基部分均優選含有3-6個碳原子。所述酯中所存在的芳基部分優選含有苯基。本發明的來蘇-呋喃糖基(lyxo-furanosyl)前藥的例子包括，例如羥基被化學保護(例如用O-乙酰基)的那些，例如2＇-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；3＇-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；5＇-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；2＇，3＇-二-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基和2＇，3＇，5＇-三-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基。
本發明化合物的醚包括甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基和仲丁基醚。
在其它的實施方案中，底物可能在化學上與嘧啶化合物或葉酸化合物無關，而是在合理藥物設計的已知參數基礎上進行了合成。參見Dunn，W．J．等(1996)。
按照以下實施例或Barr，P．J．等(1983)的描述對例如其中的反應產物是dUMP的溴乙烯基-衍生物的抗代謝劑的產物的產物進行化學檢測。
診斷應用本發明的另一方面涉及篩選治療劑的方法，該方法包括將靶細胞與本發明的前藥化合物接觸。
在一個實施方案中，用于檢測胸苷酸合成酶的細胞內水平的診斷目的，前藥是下述Ⅱ類化合物，其中R4是 靶細胞傾向于將其摻入到靶細胞內。
實施例以下實施例是具體涉及靶酶TS。本領域技術人員可以理解，可以對以下方法進行改良以發現針對本文所定義的靶酶的其它前藥，或在發現TS和其它細胞內酶的其它前藥時用作對照。前藥的合成合成了5-氟-2＇-脫氧尿苷(5-FUdR)的氨基磷酸酯衍生物，和(E)-5-(2-溴乙烯基)-2＇-脫氧尿苷(BVDU)和BVDU的氨基磷酸酯衍生物。
BVDU按照文獻中的方法(Dyer等，(1991))從2＇-脫氧尿苷制備。按照標準的方法，首先在O5＇-位用二甲氧基三苯甲基(DMTr)基團保護，然后在O3＇-位用叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)基團保護，然后用酸處理除去5＇-O-DMTr基團(見下)。

將得到的3＇-O-TBDMS-保護的核苷與L-甲氧基丙氨酰基氯代磷酸苯酯(PMPC)反應(McGuigan等(1992))得到3＇-O-TBDMS-保護的BVDU-PA。但是，出人意料的是，經1H核磁共振(NMR)波譜證實，氨基磷酸酯功能基在非常溫和的脫硅烷基化條件下(用四丁基氟化銨在硅膠上)是不穩定的。對弱堿性條件敏感的觀察結果為目前所報道的除了一個阿拉伯糖核苷(McGuigan等(1998))外的其它所有核苷5＇-氨基磷酸酯衍生物均沒有3＇-羥基功能基(參見McGuigan等(1996)；McGuigan等(1993)；McGuigan等(1994)；Balzarini等(1997)；Balzarini等(1996))提供了一個可能的解釋。開發了一種新的合成方法來解決這個問題。
為了合成(E)-5-(溴乙烯基)-2＇-脫氧-5’-尿苷酰基(-5’-uridyl)苯基L-丙氨酰基(L-alaninyl)氨基磷酸酯(BVDU-PA)，將BVDU(420mg，1．26mmol)的2ml無水DMF溶液在氮氣氛下用咪唑(103mg，1．51mmol)處理，然后滴加L-甲氧基丙氨酰基氯代磷酸苯酯(350mg，1．26mmol)(McGuigan等(1992))。將反應混合物在氮氣氛下于23℃攪拌24小時。經硅膠TLC(洗脫劑為10％甲醇的二氯甲烷溶液)證實，已經開始從BVDU(Rf0．53)生成BVDU-PA(Rf0．70)，但僅進行到部分程度(約15％)，于是補加咪唑(52mg，0．75mmol)和PMPC試劑(175mg，0．63mmol)并將混合物在氮氣氛下于23℃繼續攪拌12小時。經TLC證實，反應進程有所增加(約30％完成)。通過旋轉蒸發將溶液的體積減少至0．75ml，然后將其用等體積的二氯甲烷稀釋并直接上到干燥的4mm硅膠Chromatotron板上。進行徑向色譜，用250毫升二氯甲烷洗脫殘余的DMF，然后用10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脫產物和原料得到144mg(20％)BVDU-PA和294mg未反應的BVDU，以未回收的原料計，BVDU-PA的收率為67％。如果產物的1H NMR波譜證實有咪唑(δ7．65和7．01)和DMF(δ7．95，2．89和2．73)存在，則再次進行徑向色譜純化。按照該方法，可以得到油狀或發泡粉狀的BVDU-PA，經TLC和1HNMR證實，純度至少為98％。1H NMR((CD3)2SO)δ11．4(bs，與D2O交換，1，3＇OH)，8．28(t，1，H6)，7．35(m，2，Ph)，7．31(d，1，乙烯基1H)，7．20(m，3，Ph)，6．89(d，1，乙烯基2H)，6．19(假t，1，H1＇)，6．08(t，與D2O交換，1，丙氨酰基NH)，5．45(bs，與D2O交換，1，3’OH)，4．32(m，1，H4＇)，4．22(m，2，5’CH2)，3．97(m，1，H3’)，3．86(t，1，丙氨酰基CH)，3．58(s，3，CO2Me)，2．15(m，2，2＇CH2)，1．23(t，3，丙氨酰基CH3)。J乙烯基CH-乙烯基CH=13．5，JH1＇-H2＇～6．8，JH2＇-H3＇～5，JH3＇-H4＇～0，alaCH-Ala-NH3NH～6Hz。1H／1H COSY 2D NMR波譜證實了光譜的歸屬。
按照類似的方式制得了5-氟-2＇-脫氧-5＇-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(5-FUdR-PA)，經TLC和1H NMR證實，純度至少為98％。1H NMR((CD3)2SO)δ11．9(bs，與D2O交換，1，N3H)，7．88(t，1，H6)，7．36(m，2，Ph)，7．19(m，3，Ph)，6．15(假t，1，H1＇)，6．07(t，與D2O交換，1，丙氨酰基NH)，5．42(bs，與D2O交換，1，3＇OH)，4．21(m，3，H4＇和5＇CH2)，3．98(m，1，H3＇)，3．84(t，1，丙氨酰基CH)，3．58(s，3，CO2Me)，2．08(m，2，2＇CH2)，1．22(t，3，丙氨酰基CH3)。JH6-5F=7．1，JH1＇-H2＇～5．2，JH2＇-H3＇～2，JH3＇-H4＇～0，J丙氨酰基CH-丙氨酰基NH～6Hz。1H／1H COSY 2D NMR波譜證實了光譜的歸屬。低分辨質譜(DCI-NH3)，m／z505(MNH4+)，488(MH+)。
推測未保護的2＇-脫氧核糖核苷與PMPC的直接縮合可以非常好地進行，生成所需的氨基磷酸酯，并且當縮合反應是在不存在堿但存在所生成的HCl的清除劑的條件下進行時，反應以5＇-O-區域選擇性的方式進行。BVDU和5FUdR均可與McGuigan試劑在咪唑的存在下在無水DMF溶液中縮合，分別生成所需的BVDU-PA和5FUdR-PA(見下)。未對反應條件進行優化，盡管反應沒有進行完全，但在兩種情況下，經薄層色譜(TLC)證實，易于分離的產物混合物均主要由所需的產物和原料組成。合成方案如下所述。
(E)-5-(溴乙烯基)-2＇-脫氧-5＇-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(BVDU-PA)TLC監測(洗脫劑為10％甲醇的二氯甲烷溶液)證實了從BVDU(Rf0．53)生成BVDU-PA(Rf0．70)。以該方法得到BVDU-PA，經TLC和1HNMR證實，純度至少為98％。1H NMR((CD3)2SO)。1H／1H COSY 2DNMR波譜證實了光譜的歸屬。用NH3直接化學解離(DCI)的低分辨質譜，m／z 593／591(M·NH4+)，576／574(M·H+)。
5-氟-2＇-脫氧-5＇-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(5FUdR-PA)按照類似的方式得到5FUdR-PA，經TLC和1H NMR證實，純度至少為98％。1H NMR((CD3)2SO)。1H／1H COSY 2D NMR波譜證實了光譜的歸屬。低分辨質譜(DCI-NH3)，m／z 505(M·NH4+)，488(M·H+)。
因此，一方面，本發明涉及制備呋喃糖基核苷的2＇-脫氧，3＇-羥基，5＇-氨基磷酸酯的方法，該方法包括，將未保護的呋喃糖基核苷(2＇-脫氧，3＇-羥基，5＇-羥基)與氯代磷酸酯在HCl清除劑的存在下反應。在一個實施方案中，氯代磷酸酯含有從氨基酸如丙氨酸衍生的磷取代基。在一個實施方案中，氯代磷酸酯是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯代磷酸酯。因此，在另一個實施方案中，本發明涉及形成下式化合物的方法 其中“堿”是指核酸的堿基(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤，但優選尿嘧啶，或其衍生物)；所述方法包括，將下式的化合物 與下式的化合物 在HCl清除劑的存在下反應。
在一個實施方案中，呋喃糖核苷是尿苷核苷。在另一個實施方案中，呋喃糖核苷是尿苷呋喃核糖核苷。在另一個實施方案中，呋喃糖核苷是尿苷β-D-呋喃核糖核苷。因此，在一個實施方案中，本發明涉及形成下式化合物的方法 其中R1是取代基(包括，例如以上R1中所描述的那些)；該方法包括，將下式化合物 與下式化合物 在HCl清除劑的存在下反應。
在一個實施方案中，反應在不存在堿但存在HCl清除劑如咪唑的條件下進行。在另一個實施方案中，反應在非水介質中進行。在另一個實施方案中，反應在含有無水二甲基甲酰胺(DMF)的非水介質中進行。以化學物質和細胞為基礎的檢測在這些檢測中使用兩個細胞系，H630R10(Copur，等(1995))和正常結腸上皮細胞CCD18co(ATCC)。根據對10μM 5-FU的抗性篩選H630P(Copur，等(1995))細胞系，得到H630R10。這些細胞系的特征是表達較高水平的TS酶。比較正常結腸上皮細胞CCD18co(可從ATCC獲得)與H630R10對待測化合物的敏感性。按Pegram等(1997)所述制備僅表達p185-HER2或新霉素標記的細胞系，通過Western印跡分析表明，H630R和H630R10表達的胸苷酸合成酶比CCD18co高10倍。
通過結晶紫方法(Sugarman等(1985)和Antelman等(1995))確定待測化合物阻斷細胞增殖的能力。
將化合物溶解于二甲亞砜中達到1M的濃度。將其按照需要稀釋到DMEM細胞培養基中，隨機放到96孔微滴定板的第一排孔中。在靶細胞系上，每個濃度檢測3份。將細胞與化合物保溫72小時，洗滌平板，用甲醇固定細胞，然后按Sugarman等(1985)和Antelman等(1995)所述用結晶紫染色。Western印跡分析細胞系中的TS水平用人正常結腸上皮細胞CCD18co(可從ATCC，Manassas，VA獲得)、結腸腺癌細胞系H630R10(從耶魯大學的S．Copur博士處獲得)和HER2轉染的乳腺癌細胞系(Pegram等(1997))完成Western印跡試驗。將細胞裂解于RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7．5，150mM NaCl，0．5％Triton X-100，0．1％SDS和0．5％脫氧膽酸、鈉鹽和蛋白酶抑制劑)中。用BCA-200蛋白質檢測試劑盒(從Pierce，rockford，IL獲得)確定蛋白質的濃度。用12％SDS-PAGE分辨來自各細胞系的10微克蛋白質。將分離開的蛋白質轉移到PVDF膜(從amersham，England)上，然后用人胸苷酸合成酶單克隆一級抗體和抗微管蛋白單克隆抗體(NeoMarkers，Fremont，CA制造的)免疫印跡。用辣根過氧化物酶結合的山羊抗小鼠Ig作為二級抗體(Amersham)。用ECL加試劑盒(Amersham)檢測免疫反應。對對應于胸苷酸合成酶的帶進行定量分析，然后通過成像分析(Molecular Dynamics Storm)標準化成微管蛋白的量。RT-PCR分析細胞系中的TS mRNA用RT-PCR定量分析在不同細胞系中人胸苷酸合成酶轉錄體的表達水平。按如下設計用于擴增人胸苷酸合成酶和β-肌動蛋白的寡核苷酸引物胸苷酸合成酶有意義引物5’-GGGCAGATCCAACACATCC-3’(對應于胸苷酸合成酶cDNA序列的堿基208-226，Genbank Accession No．X02308)，反義引物5’-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3’(對應于堿基564-583)，β-肌動蛋白有意義引物5’-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3’(對應于β肌動蛋白基因序列Genbank Accession No．M10277的堿基2643-2661)和反義引物5’-CTCCTGCTTGCTGATCCAG-3’(對應于堿基2937-2955)。
用Rneasy mini試劑盒(從Qiagen，Valencia，C獲得A)從CCD18co和H630R10細胞中分離總RNA。為了監測可能的DNA污染，設計用于擴增β肌動蛋白的引物跨外顯子4／內含子5／外顯子5匯合處。基因組DNA模板產生313bpβ肌動蛋白片段，cDNA模板產生210bp產物。
用SuperScript預擴增系統(Gibco／BRL，Gaithersburg，MD)完成反轉錄反應。按制造商的說明，將3微克總RNA加到20微升緩沖液中以完成反轉錄反應。在含3微升來自反轉錄反應的cDNA混合物、3mMMgCl2、50mM Kcl、20mM Tris-Cl，pH8．4、各0．2mMdNTP、0．4μM胸苷酸合成酶有義和反義引物以及3單位Tag DNA聚合酶(從Promega，Madison，WI獲得)的48微升體積中完成PCR反應。將反應混合物在94℃保溫3分鐘，然后以在94℃保溫1分鐘、在58℃保溫1分鐘，在72℃保溫1分鐘進行10個循環。10個循環后，加入2微升人β肌動蛋白引物達到0．2μM的終濃度，使最后的反應物體積為50微升。連續進行28個循環的PCR，然后在72℃保溫7分鐘。
通過在2％瓊脂糖凝膠上電泳，然后用SYBR Gold核酸凝膠染料(從Molecular Probes，Eugene，OR獲得)染色來分辨5微升PCR產物。將對應于胸苷酸合成酶的DNA帶進行定量分析，然后用MolecularDynamics Storm標準化成β肌動蛋白的量。Northern印跡分析從Invitrogen(Carlsbad，CA)得到Northern印跡，然后與克隆的TS cDNA探針雜交。按照作為管家轉錄體的核糖體蛋白S9將雜交信號標準化。如果與正常組織對照相比，如果標準化的信號至少提高2倍，則認為腫瘤過表達TS mRNA。克隆、表達并純化人胸苷酸合成酶用修飾的在pGCHTS中的人TS cDNA構建用于人胸苷酸合成酶(TS)的大腸桿菌質粒表達載體。從Dan Santi博士得到的該克隆含有人TS的完整開放閱讀框。
為了在大腸桿菌中進行表達，將完整的人TSORF亞克隆到T7啟動子表達載體pET28a(Novagen Inc．)中。所得的質粒載體編碼有6個組氨酸然后是凝血酶裂解位點的重組融合蛋白的人TS的合成。該融合蛋白將20個額外氨基酸加到人TS的氨基末端。為了產生重組蛋白，將人TS表達載體導入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，該菌株帶有位于lac操縱基因控制下的插入染色體的T7RNA聚合酶基因。
用金屬螯合親和樹脂(Novagen Inc．)純化人TS-poly-His融合蛋白。蛋白質純化后，在10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。用Pierce BCA蛋白質檢測確定蛋白質濃度。從500毫升大腸桿菌培養物中回收約10毫克人TS融合蛋白。用銀染色肉眼觀察時，僅出現對應于人TS的帶。用抗TS單克隆抗體TS106(NeoMarkers)，通過完成Western印跡確定人TS帶的特性。胸苷酸合成酶酶活性檢測用Wahba和Friedkin(1961)的分光光度檢測測量TS活性。在該檢測中，通過測量在340nm吸收值的增加來監測TS活性，當因dUTP被轉變成dTTP而將輔因子5，10亞甲基四氫葉酸氧化成二氫葉酸時會發生吸收值的增加。用該方法制備的酶的比活性為0．5-0．65單位／mg蛋白質。一單位指每分鐘產生一微摩爾dTNP。該值與用Pedersen-Lane等(1997)制備的相似。試驗結果這些結果確定了在腫瘤細胞中用胸苷酸合成酶作為細胞毒性的可行性。在該檢測中，使用CCD18co細胞(正常結腸上皮細胞)和H630R10，后者是表達高數倍的胸苷酸合成酶的H630P的衍生物(Copur等(1995))。完成各種細胞中TS蛋白質水平的Western印跡分析然后通過與人微管蛋白抗體進行比較在樣品間將所述分析結果標準化(表5)。得到H630R10(13x)和CCD18co(1x)的等級。
另外再比較通過RT-PCR確定的細胞系間的mRNA水平。參見表5。與Western印跡分析相似，當對β肌動蛋白RT-PCR標準標準化后，等級是H630R10(24x)和CCD18co(1x)。

HER2原癌基因表達提高了腫瘤細胞中的TS水平用免疫印跡技術評估在新霉素和HER2／neu-轉染的人乳腺癌細胞中TS的表達水平。結果(見圖7)表明轉染和過表達人HER2／neu cDNA后，TS表達提高。用HER2／neu-轉染的人卵巢癌細胞可以得到相似的結果。MCF7／HER2和MCF7／neo細胞系是本發明檢測的靶細胞，因為在這些細胞中TS的誘導最顯著(約20倍)。
氟嘧啶，5-FUdR經與15-FU類似的機制抑制細胞生長。這包括摻入到核酸中而引起的細胞毒作用以及TS酶活性的抑制作用(Goodman和Gilamn(1996))。因此，期望表達較高水平TS的細胞通常會比表達較低水平該酶的細胞有更強的抗性(有較高的IC50)。表6(第一行)表明這是得到的結果。此外，正如從早期工作所預期的，在該檢測中BVDU幾乎沒有活性(表6，第二行)。這可能是因BVDU對通過人胸苷激酶的單磷酸化無能為力導致的，而這種能力是結合胸苷酸合成酶的需要(Balzarini等(1987)，Balzarini等(1993)，Carreras和Santi(1995))。兩個細胞系對BVDU的敏感性沒有顯著差異。BVDU的活化與核糖部分的5′羥基的氨基磷酸酯化同時發生。BVDU-PA(表6，第三行)對高度表達的H630R10細胞系比對CCD18co細胞有高出10的活性。

1標準誤差低于20％然后將這兩個細胞系就對5-FUdR，和BVDU的氨基磷酸酯衍生物(BVDU-PA)進行比較。由于5-FUdR經與5FU相同的機制抑制細胞生長，因此預期CCD18co比H630R10更敏感(有較低的IC-50)，因為后者細胞系具有較高的胞內水平的胸苷酸合成酶。表7中所列的數據證明這是用上文所述的結晶紫檢測得到的結果。該結果還說明現有癌癥化療的關鍵問題之一，即化療對正常細胞的毒性常常比對癌細胞的毒性高。表7中所列的數據表明正常結腸上皮細胞(CCD18co；IC-50=9．5μM)對5-FUdR的敏感性是H630-R10結腸腫瘤細胞(IC-50=169．8)的約18倍。但是前藥底物BVDU-PA扭轉了這種關系。通過TS轉變成細胞毒部分的BVDU-PA對高水平表達TS的H630R10細胞(IC50=216．7)比對正常結腸細胞(IC50=2810．2)的活性強約13倍。

1．來自數個試驗的代表性數據2．每個濃度用一式三份孔完成的試驗。標準誤差低于20％。
用Alamar Blue檢測(可從ACCUMED Int．，West Lake，OH購買)確認了所述結果。下列表8中的數據表明甚至5-FU也具有對正常和腫瘤細胞均有毒的非選擇性。

X‾=0.57μ&Mgr;X‾=4.10μ&Mgr;]]>本發明的另一種檢測需要在含人胸苷酸合成酶和候選前藥的反應混合物中篩選候選藥物，所述混合物含有和不合有N5N10-亞甲基四氫葉酸。用本領域熟知的方法例如用氚標記候選前藥的離去基團(在嘧啶的5位)。對照底物是在相同的反應條件下類似地標記的(例如5-3H)dUMP。按照Carreras，C．W．和Santi，D．W．(1995)提供的描述和本文引用的參考文獻類似地完成所述檢測。可從含表達的人胸苷酸合成酶的大腸桿菌中純化人胸苷酸合成酶。參見Davisson，V．J．等(1989)和Davisson，V．J．等(1994)。該方法提供了能夠篩選大量候選化合物的規模可調節的檢測方法。確定TS前藥代謝的細胞內產物為了證實提出的活化和作用機制并確定是候選治療劑的試劑，確定TS前藥代謝的細胞內產物是非常重要的。有關芳基磷酸二酯酰胺化物細胞內代謝的一種可接受的觀點涉及酶促轉變成羧酸，磷酸單酯酰胺化物分子內重排成5′-單磷酰基核苷(Valette等(1996))。但是，這種機制不可能描述所有氨基磷酸酯為基礎的核苷酸原的細胞內加工。例如，就芳基磷酸單酯酰胺加工提出了不同的機制，一種涉及將磷酰胺通過磷酰胺hydrolate簡單直接地轉變成單磷酸(McIntee等(1997)和Fries等(1995))。無論暴露核苷一磷酸的機制如何，這種檢測方法可以檢測細胞內單磷酸經TS在細胞內轉變成細胞毒化合物的產物。
在圖8中列出了經TS而得到的前藥化合物的建議的反應產物。為了完成這一工作，將細胞與一定量的誘導高表達TS細胞系的50％生長抑制作用(在上文72H檢測)的前藥化合物一起保溫。使用低和高TS表達者細胞(例如CCD18co對H630R10)。完成時間過程研究，其中將處理的細胞按照McIntee等(1997)所述的方法處理。在-20℃水中，將細胞用60％甲醇裂解，然后離心除去顆粒殘余物。將上清液干燥并于-20℃貯存。先用RP-HPLC，然后用LC-MS評估等份試樣以證明氨基磷酸酯到單磷酸的細胞內轉變，同時確保通過胸苷酸合成酶轉化單磷酸。用純化的胸苷酸合成酶證明底物活性該檢測確定未來TS酶制劑的比活性，以確保所述制劑的活性能夠經過一段時間并確定具有適宜活性的篩選的化合物是否確實在體外反應條件下使TS酶失活。
為了確定當前藥化合物與純化的重組TS酶一起保溫時產生什么反應產物，用與用TS活性檢測所用類似的反應條件在體外得到反應產物。然后用GC-質譜分析這些反應產物以鑒定形成的實際分子。體內效力研究1．細胞系和細胞培養從Dennis Slamon(UCLA)博士處得到MCF7／NEO和MCF7／HER2轉染的乳腺細胞系。證明MCF7／HER2轉染的乳腺癌細胞以及其他HER-2／neu轉染的細胞系有提高的TS表達(Pegram等(1997))。因此，除CCD18co和H630R10外，這些細胞系也適合檢測對前藥的差別反應。首先用與上述體外試驗相同的方法，在體外確認MCF7／NEO和MCF7／HER2對5-FUdR和BVDU-PA的差別反應。對從Bertino博士(Banerjee等(1998))處得到的HT1080腫瘤細胞系進行同樣的鑒定。2．用于檢測前藥化合物的異種移植模型MCF7／HER2乳腺細胞在無胸腺小鼠中高效率形成異種移植，而且對其生長特性已作了徹底的表征(Pegram等(1997))。該異種移植模型的生長特性如此均勻以致可以預測用不同藥物治療后這些腫瘤的生長軌道的計算機模型已由UCLA醫學院生物數學系的Angela Lopez博士和Elliot Landau博士開放出來(Lopez等正在提交)。由于該模型的均勻性和再現性，它在新試驗治療劑的臨床前試驗中非常有用。例如，該模型形成了Herceptin_的初步體內分析的基礎，該藥物已被美國FDA批準用于治療轉移性乳腺癌(Pegram等(1998))。結腸腫瘤細胞系(HT1080／NEO和HTl080／E2F1．1)有致瘤力(Banerjee等(1998))。
將ras-轉化的NIH 3T3細胞系皮下移植到免疫缺陷小鼠中。開始的治療可以是直接在腫瘤內注射。預期的結果是升高水平的人TS或靶酶導致藥物候選物引起的抗腫瘤活性提高。用表達高水平人TS或靶酶的人腫瘤完成類似的研究，并表明對藥物反應的效力與其人TS表達和靶酶水平有關。任選地，按上述完成試驗，不同的是將藥物靜脈內施用到動物體內以研究藥物候選物的效力、毒性和藥學生物學問題。在另一實施方案中，對照動物將接受有效量在上文“前藥”節鑒定的化合物。
更具體地講，用兩種不同的異種移植模型完成體內研究(見表9)。

按所述(Pegram等(1997))在4-6周齡(20-25克)CD-1(nu／nu)無胸腺小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的脅區，以5X106／位點皮下注射確定表達TS(表9中所說明的)的試驗細胞。每個治療組(載體對照溶液或者前藥化合物)用8只小鼠(每籠4只)。每只小鼠建立了兩個異種移植，這樣減少了每個試驗所需的動物數并改善了組間檢測反應差異的統計力。通過標記耳朵來鑒定每個小鼠以便除分析組平均數外，計算每個小鼠的異種移植軌道。在MCF7乳腺異種移植模型中所用的有有小鼠均是雌性，而且在注射前，皮下施用在生物可降解載體粘結劑中的17B-雌二醇(Innovative Research of America，Toledo，OH)引發所述小鼠以促進腫瘤細胞生長。由單盲觀察者通過系列微米測量每周兩次監測預期的腫瘤體積，按(寬度2×長度)／2計算。將動物分配到每個治療組中，使每組中平均的起始腫瘤體積相同。完成統計學試驗(單因素ANOVA)以確保治療組間起始腫瘤體積的統一。在第一組試驗中，通過一次I．P．注射施用前藥或者同體積載體對照溶液。如果在開始的試驗中鑒定效力，則用每天皮下給藥方案X5天完成另外的研究，總前藥劑量等于在一次I．P．給藥研究中確定的IC50。
對于這些效力試驗，當每組的平均異種移植體積達到50MM3時開始前藥給藥。用圖形分析，用描述性統計說明相對于對照治療動物的前藥治療動物的平均腫瘤體積。將應用統計學試驗(單因素ANOVA)比較治療組間的異種移植體積差異。當說明時，將對數變換應用ANOVA計算，穩定異種移植體積數據組的方差。如果需要，根據異種移植體積數據分布應用非參數統計學檢驗。通過使用所述(Pegram等(1997))統計資料的前藥-處理的／對照處理的腫瘤體積比(T／C比)，將高TS表達的異種移植間的效力差與低TS表達的進行比較。該方法可調節高TS-表達異種移植和低TS-表達異種移植間的內在生長率方面的差異。
按Harris，MP等(1996)和Antelman，D．等(1995)所述完成體內研究。3．用不攜帶腫瘤無胸腺小鼠完成劑量發現研究以確定最大耐受劑量(MTD)經腹膜內(I．P．)給6只CD-1 nu／nu無胸腺小鼠(Charles RiverLaboratories)(3雄，3雌)組注射單劑量前藥。通過能達到等于體外IC50的血清濃度的前藥量的起始劑量來根據經驗開始給藥，假定所述前藥的體積分布限于小鼠的總體水(TBW)(0．6X體重克數TBW小鼠)室。如果在該水平未觀察到毒性，則以半對數間隔逐步升高6只小鼠組的劑量。如果在該經驗劑量水平即觀察到毒性，則同樣從毒性劑量的10％開始重復劑量逐步增加試驗。每天觀察小鼠的活動性、理毛行為以及攝取食物和水的能力。每周測量小鼠體重。將MTD定義為在觀察期間導致體重下降10％或更少的劑量，或者劑量=LD50的90％。如果在某一特定劑量水平發生致死，則重復試驗(假定在該水平未觀察到毒性)。觀察期為60天。如果在一特定劑量水平沒有觀察到毒性，則以3周的間隔在以后的組中進行劑量逐步增加試驗。
盡管參照具體實施方案詳細描述了本發明，但可以進行不偏離本發明精神和范圍的各種改變和修飾，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
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權利要求
1．用于鑒定潛在治療劑的方法，包括(a)在有利于所述藥劑摻入到靶細胞的細胞內區的條件下，將靶細胞與是靶酶之選擇性底物的候選治療的磷酰基或氨基磷酸酯前藥接觸；(b)檢測靶細胞的細胞增殖抑制作用或殺死細胞的情況。
2．權利要求1的方法，其中所述前藥是2’-脫氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物。
3．用于鑒定潛在治療劑的方法，包括(a)在有利于所述藥劑摻入到靶細胞的細胞內區的條件下，將靶細胞與帶有可檢測地標記的毒性離去基團并且是靶酶之選擇性底物的候選治療的磷酰基或氨基磷酸酯前藥接觸；(b)檢測培養基中釋放的標記量并與釋放的標記量進行比較。
4．權利要求3的方法，其中所述前藥是2’-脫氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物。
5．權利要求1-5的任一方法，其中所述靶細胞的特征是對化療藥物有抗性。
6．權利要求1-5的任一方法，其中所述通過化療的體內選擇而使所述靶酶被擴增。
7．權利要求1-5的任一方法，其中所述靶酶是在靶細胞內過表達的內源細胞內酶。
8．權利要求1-5的任一方法，其中所述靶酶是胸苷酸合成酶。
9．抑制過度增殖的細胞的增殖的方法，該方法包括將細胞與磷酰基或氨基磷酸酯前藥接觸，所述前藥通過內源細胞內酶在細胞內被選擇性地轉變成毒素。
10．治療以過度增殖的細胞為特征的疾病的方法，該方法包括對受治者給藥磷酰基或氨基磷酸酯前藥，所述前藥在過度增殖的細胞內被細胞內的內源性過表達或過度積累的細胞內酶轉變成毒素。
11．權利要求9或10的任一方法，其中所述候選治療劑是下式的L-或D-化合物 其中R1是或含有具有與通過胸苷酸合成酶從嘧啶環上分離相適應的分子大小和親電性的化學實體，并且當其由胸苷酸合成酶從嘧啶環上釋放后，可以抑制細胞的增殖或殺死細胞；或是下式的化合物 其中n是0-10的整數；其中A是磷酰基或磷酰胺衍生物，或是下式的化合物 其中Q是磷酰基或氨基磷酸酯衍生物，其含有選自糖基團、硫代糖基團、碳環基團及其衍生物的化學實體。
12．權利要求11的方法，其中的Q具有如下結構式 其中R7選自磷酰基、氨基磷酸酯及其衍生物，且其中的R2和R3相同或不同并且彼此獨立地是-H或-OH。
13．權利要求11的方法，其中R1是鹵素。
14．權利要求11的方法，其中R1是烷基，即(-CH=CH)n-R4，其中n是0-10的整數，R4是選自H、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、羥基、-O-烷基、-O-芳基、-O-雜芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-雜芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯、鹵代乙烯基化合物、鹵代汞化合物、-NHOH、-NHO-烷基和NHNH2。
15．下式化合物 其中R1是下式的部分 R2是二價的電子導管部分，其選自不飽和的烴基；含有一個或多個不飽和烴基的芳香族烴基；和含有一個或多個不飽和烴基的雜芳族基團；R3是二價的間隔基部分，其選自 R5可以相同或不同并且彼此獨立地是含有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或含有3-10個碳原子的環烷基；n是0-10的整數；m是0或1；R4發毒團部分，其選自 X是-Cl、-Br、-I或其它有效的離去基，條件是，當R7是-H、M是0時，則R4不是鹵素，或當m是0并且n是0時，則R4不是鹵素；Y彼此獨立地是-H或-F；Z彼此獨立地是-O-或-S-；Q是糖部分，其選自 R6彼此獨立地是-H、-OH、-OC(=O)CH3或其它保護的羥基；和，R7是氫、磷酸酯基團或氨基磷酸酯基團；并且所述的化合物可以是任何對映體、非對映體或立體異構體形包括D-型、L-型、α-異頭物形式和β-異頭物形式。
16．權利要求15的化合物，其中Q是
17．權利要求15的化合物，其中Q是
18．權利要求15-17中任一項所述的化合物，其中R3是選自如下的二價間隔基部分
19．權利要求15-17中任一項所述的化合物，其中R2是選自如下的不飽和烴基
20．權利要求15-17中任一項所述的化合物，其中R2和R3合在一起形成選自如下的結構
21．權利要求15-17中任一項所述的化合物，其中R2是選自如下的芳香族烴基
22．權利要求15-17中任一項所述的化合物，其中R2是選自如下的雜芳族基團 其中J是-O-、-S-、-Se-、-NH-或-NRALK-，其中RALK是含有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或含有3-10個碳原子的環烷基。
23．權利要求15-22中任一項所述的化合物，其中R7選自
24．權利要求15-22中任一項所述的化合物，其中R7選自
25．權利要求15-22中任一項所述的化合物，其中R7選自
26．權利要求15-22中任意一項所述的化合物，其中R7選自
27．權利要求15-22中任意一項所述的化合物，其中R4選自
28．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4選自
29．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
30．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
31．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
32．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
33．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
34．權利要求15-27中任意一項所述的化合物，其中R4是
35．下式化合物
36．下式化合物
37．下式化合物
38．下式化合物
39．下式化合物
40．制備下式化合物的方法 其中的“堿”是指核酸的堿基；該方法包括，將下式的化合物 與下式的化合物 在HCl清除劑的存在下反應。
41．制備下式化合物的方法 其中R1是取代基；該方法包括，將下式化合物 與下式化合物 在HCl清除劑的存在下反應。
42．權利要求40或41的方法，其中的HCl清除劑是咪唑。
43．權利要求40-42中任意一項所述的方法，其中所述反應在含有二甲基甲酰胺的非水溶劑中進行。
44．篩選治療劑的方法，該方法包括(a)在有利于所述化合物摻入到靶細胞的細胞內區的條件下，將第一種靶細胞與權利要求15或37至39的任一化合物接觸，然后在有利于所述化合物摻入到靶細胞的細胞內區的條件下，將第二種靶細胞與潛在的治療劑接觸；和(b)檢測第二種靶細胞的細胞增殖抑制作用或殺死細胞的情況。
45．權利要求44的方法，其中所述靶細胞的特征是對化療藥物有抗性。
46．權利要求44的方法，其中所述靶細胞的特征是表達因化療的體內選擇而擴增的靶酶。
47．權利要求46的方法，其中所述靶酶是在所述靶細胞中過表達的內源細胞內酶。
48．權利要求47的方法，其中細胞內酶的內源過表達是編碼該酶之基因擴增的結果。
49．權利要求47的方法，其中所述酶是胸苷酸合成酶。
50．權利要求15或37至39的任一化合物用于制備治療或抑制細胞增殖的藥物的用途。
51．抑制過度增殖的細胞增殖的方法，該方法包括將細胞與有效量權利要求15或37至39的任一化合物接觸。
52．權利要求66的方法，其中過度增殖的細胞的特征在于細胞內酶的內源過表達。
53．權利要求52的方法，其中所述酶是胸苷酸合成酶。
54．用于治療以個體內過度增殖的細胞為特征的疾病的方法，該方法包括給所述個體施用權利要求15或37至39的任一化合物。
55．篩選治療劑的方法，該方法包括將靶細胞與權利要求15或37至39的任一化合物接觸，其中R4是 而該靶細胞有利于將其摻入到靶細胞內，用于檢測胸苷酸合成酶的細胞內水平的診斷目的。
全文摘要
本發明提供了鑒定潛在的治療劑的方法,該方法包括將靶細胞與候選的治療劑相接觸,所述候選的治療劑是細胞中內源性細胞內酶的選擇性底物,所述酶由于生物或化療選擇作用的結果其表達增加。本發明還提供了用于選擇性殺死病理細胞的方法和分子的例子,該方法包括,將細胞與是內源性細胞內酶的選擇性底物的前藥相接觸。所述前藥隨后被轉變成細胞毒素。本發明還提供了治療患者的特征在于病理性的過度增殖性細胞之疾病的方法,該方法包括,向患者施用是內源性、過度表達的細胞內酶的選擇性底物的前藥,然后前藥在過度增殖的細胞內被酶轉變成細胞毒素。
文檔編號A61K31/7052GK1291228SQ99803221
公開日2001年4月11日 申請日期1999年1月22日 優先權日1998年1月23日
發明者H·M·謝潑德, M·P·格羅加克 申請人:新生物生物公司