專利名稱：新型免疫疾病預防劑/治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型的免疫疾病預防劑／治療劑。更具體地說，本發明涉及諸如類風濕性關節炎、變應性疾病等免疫疾病的新型預防劑／治療劑，它包含作為活性成分的天然葡萄球菌腸毒素B(下文中也稱之為“SEB”)(被認為是一種超級抗原)的修飾物，或其衍生物。
背景技術：
自身免疫疾病分為兩種類型器官非特異型自身免疫疾病，諸如類風濕性關節炎(下文中也稱作“RA”)，和器官特異型自身免疫疾病，諸如潰瘍性結腸炎。它們是由T細胞對自身抗原的反應引起的，通常在免疫耐受之下的所述T細胞在自身組織中因某些原因而激活，對自身抗原產生反應，導致連續的炎癥反應，由此損害了組織。在這類情況下，自身抗原分別是構成自身關節的II型膠原或腸粘膜的主要成分。
患有這些疾病的人數每年都有稍許增加，但仍未發現有效的治療劑或預防劑(“因藥物導致的免疫缺陷”，Men-eki Kagaku(免疫科學)，第9卷，285-289頁(1984年)，Yuichi Yamamura，Chuzo Kishimoto，RobertA．Good編輯)。目前，為了治療這些疾病，已采用了藥物療法，包括給藥柳氮磺吡啶，5-氨基水楊酸，硫唑嘌呤，6-MP，曲尼司特，甲氨蝶呤，環孢菌素A，或甲硝唑，和給藥過量的7S-免疫球蛋白；還采用了手術療法，諸如胸腺切除術或更換人工關節；或癥狀療法，諸如營養療法〔YoichiIchikawa等，“長期給藥甲氨蝶呤和柳氮磺胺吡啶對類風濕性關節炎的功效的研究”，《風濕病》第35卷，663-670頁(1995年)；SadaoKashiwazaki，“金諾芬和甲氨蝶呤聯合用藥對類風濕性關節炎功效的研究”，《風濕病》第36卷，528-544頁(1996年)；Takefumi Furutani等，“用低劑量甲氨蝶呤治療類風濕性關節炎中的有害事件”，《風濕病》第36卷，746-752頁(1996年)；Nobuo Watanabe，“對幼年型類風濕性關節炎的藥物治療”，《風濕病》第36卷，670-675頁(1996年)；TakayasuYakura，“免疫抑制療法自身免疫疾病的治療”，《Sogo Rinsho》第30卷，3358頁，(1981年)；Shin Totokawa等，“有關甲氨蝶呤治療類風濕性關節炎的研究尋找更有效的給藥策略”，《風濕病》第37卷，681-687頁(1997年)〕。然而，這些療法都沒有根除疾病，并且存在會由于長期服藥而引起嚴重的副作用的缺點。因此，需要開發更有效的預防劑／治療劑和療法。
眾所周知，SEB是一種細菌超級抗原(White J．等，《細胞》第56卷，27-35頁，1989年)。與II類主要組織相容性復合體(下文中也稱作“MHC”)復合的正常抗原被T細胞抗原受體(下文中也稱作“TCR”)識別。這種識別受到II類MHC的單元型的限制，叫做“MHC限制”。相反，超級抗原則不論單元型如何都與II類MHC分子結合，并且進一步與TCR的特異性β鏈可變區(Vβ鏈)結合。當這樣一種連結形成時，與超級抗原結合的T細胞被瞬間激活，從而促進其分裂和繁殖，并產生炎性細胞因子(Micusan V．V．＆ Thibodean J．，《免疫學研討》第5卷，3-11頁，1993年)。
SEB是一種導致食物中毒的毒素。當對動物靜脈給藥SEB時可以看到食物中毒的癥狀，這提示毒性通過上面所提到的SEB的生物學活性產生(Micusan V．V．＆ Thibodean J．，《免疫學研討》第5卷，3-11頁，1993年)。
但是，當對新出生的小鼠靜脈或腹膜內給藥超級抗原時，具有對該超級抗原敏感的Vβ鏈的T細胞亞群被清除，使得所述小鼠變得對所述抗原不敏感，即，免疫耐受(White J．等，《細胞》第56卷，27-35頁，1989年)。另一方面，當對成年小鼠給藥SEB時，如上所述瞬間激活后，具有反應性Vβ7，Vβ8 TCR的T細胞亞群變得對另一種SEB的刺激不敏感，即，變成無反應性的，由此導致免疫耐受。由于SEB具有這種活性，暗示其可能是頑固性自身免疫疾病諸如類風濕性關節炎或潰瘍性結腸炎或免疫疾病的潛在預防劑／治療劑(日本專利公開第9-110704號)。由于SEB是引起葡萄球菌食物中毒的腸毒素，當其給藥到活體中時，其致病性就成為一個問題。按照日本專利公開第9-110704號，通過連續給藥高純度的SEB可避免這種毒性，給藥劑量應不會使SEB通過口服途徑長時間給藥時成為致病的，由此有效地誘導免疫耐受而沒有SEB的致病性。
另一種避免SEB毒性的方法是Kappler J．和Marrack P．等在日本專利公開第8-500328號中公開的“突變超級抗原的保護作用”。他們的發明可概述如下制備SEB突變體并將其純化，挑選出可與人II類MHC分子和TCR結合的那些SEB突變體。然后，動物在接觸SEB之前，將與II類陽性細胞結合到幾乎不能與天然型SEB的突變體區別開來但卻不會刺激T細胞增殖的SEB突變體注射到動物體內。結果，注射后的動物顯示出了對SEB毒性的完全保護。
日本專利公開第8-500328號的最重要的教導是有關可以用于消除SEB毒性的SEB結構的研究。Swaminathan S．等報道了SEB的三維結構(《自然》第359卷，801頁，1992年)。SEB分子由兩個結構域組成，即，由殘基1-120組成的第一結構域和由殘基127-239組成的第二結構域。在SEB的N末端，已確定了可影響II類MHC細胞結合和／或TCR結合的三個區域，即，區域1(殘基9-23)，區域2(殘基41-53)和區域3(殘基60-61)。
本發明的公開基于上述發現，本發明人完成了本發明，本發明提供了用于免疫疾病的新型預防劑／治療劑，它包含作為活性成分的、能有效地用于預防和治療免疫疾病同時毒性降低的SEB修飾物或其衍生物。
也就是，本發明提供了用于免疫疾病的預防劑／治療劑，它包含作為活性成分的葡萄球菌腸毒素B(SEB)的修飾物，所述修飾是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被取代，或其衍生物，其中所述SEB修飾物或其衍生物對于T細胞的活化具有抑制活性，它們與T細胞受體(TCR)的特異性Vβ成分相互作用，但它們對SEB的免疫反應性降低了，同時沒有導致具有特異性Vβ成分的T細胞被消除，這種消除通常由天然型SEB或重組野生型SEB引起。
在本發明的第一個方面，SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在9位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通過位點特異性誘變被除了天冬氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選天冬酰胺。
在本發明的第二個方面，SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在23位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通過位點特異性誘變被除了天冬酰胺以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選酪氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸或賴氨酸。
在本發明的第三個方面，SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在41位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通過位點特異性誘變被除了異亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選被精氨酸或蘇氨酸取代；外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選纈氨酸；或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選纈氨酸。
在本發明的第四個方面，SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在44位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通過位點特異性誘變被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，優選被絲氨酸取代。
附圖的簡要說明
圖1顯示了制備本發明的各種SEB修飾物時用于氨基酸取代的各種PCR引物的核苷酸序列。
圖2顯示了制備本發明的各種SEB修飾物時用于氨基酸取代的各種PCR引物的核苷酸序列。
圖3顯示了人外周血單核細胞(PBMC)用野生型SEB和SEB修飾物刺激而產生的TNF-α的量。
圖4顯示了SEB修飾物的T細胞抑制活性。
圖5顯示了有效病例中，口服給藥SEB修飾物對膠原誘導的關節炎的治療作用，其中縱坐標軸指示試驗小鼠的疾病嚴重程度。縱坐標軸指示試驗小鼠的疾病嚴重程度，橫坐標軸指示SEB修飾物開始給藥后的天數。
圖6顯示了無效病例中，口服給藥SEB修飾物對膠原誘導的關節炎的治療作用。縱坐標軸指示試驗小鼠的疾病嚴重程度，橫坐標軸指示SEB修飾物開始給藥后的天數。
圖7顯示了口服給藥SEB修飾物對膠原誘導的關節炎的預防作用。縱坐標軸指示試驗小鼠的疾病嚴重程度，橫坐標軸指示SEB修飾物開始給藥后的天數。
本發明的最佳實施方式按照本發明，為了制備SEB修飾物，對于影響與II類MHC分子結合的那些修飾物進行了全面研究，但在涉及與TCR結合的部位沒有引入修飾。既然超級抗原與II類MHC分子間的鍵對于超級抗原激活T細胞來說是不可缺少的，因此可預期抑制SEB與II類MHC分子的結合將降低T細胞對SEB的反應性，即，未對TCR結合位點修飾而誘導了無變應性。
對于定義為氨基酸殘基9-23的區域1來說，特別研究了可阻斷與II類MHC分子結合的、23位為天冬酰胺的修飾物，包括N23D、N23K、N23Y和N23I。還研究了9位為天冬氨酸的修飾物諸如D9N和17位為苯丙氨酸的修飾物諸如F17S。本文中所用的對于修飾物的指示是這樣的，即，修飾之前和之后的氨基酸分別顯示在發生了修飾的氨基酸殘基位置序號的前面和后面。例如，“N23D”的意思是從N末端開始第23位上的“N”(Asn天冬酰胺)被“D”(Asp天冬氨酸)取代。
在所有的葡萄球菌腸毒素中，定義為氨基酸殘基40-53的區域2對于介導與II類MHC分子的結合來說是最重要的。對于區域2，研究了在41、44、45和53位上的突變。這些氨基酸殘基對于與II類MHC分子的結合是特異性的。修飾物通過在殘基的41、44、45和53位以及另外的59位的位點特異性誘變通過引入點突變而制備。制得的修飾物是I41T L45V，I41R F44V，F44S，F44L I53N，和F44L I53N G59W。
對上述SEB修飾物的安全性和有效性進行評估。結果，我們發現，下列具體的SEB修飾物可以用作新型的免疫疾病諸如類風濕性關節炎的預防劑／治療劑，它們是安全且具優良活性的(1)在天然型SEB的基礎上在9位有氨基酸取代的SEB修飾物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是被天冬酰胺取代；(2)在天然型SEB的基礎上在23位有氨基酸取代的SEB修飾物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬酰胺以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是被酪氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸或賴氨酸取代；(3)在天然型SEB的基礎上在41位有氨基酸取代的SEB修飾物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了異亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是被精氨酸或蘇氨酸取代，外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是纈氨酸，或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是被纈氨酸取代；和(4)在天然型SEB的基礎上在44位有氨基酸取代的SEB修飾物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，特別是被絲氨酸取代。
我們還發現，當這些SEB修飾物通過口服途徑給藥時，可以令人驚奇地產生優良效果。
首先，用誘導的重量損失作為指數來研究SEB修飾物的降低的毒性。重量損失用BALB／c小鼠評估。對小鼠腹膜內給藥300μg SEB的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)溶液，其中除去內毒素直到不會對該實驗造成影響的濃度。第二天開始對每只小鼠稱重。結果，野生型SEB和D9N顯示到給藥后的三天重量損失了7-9％，而所有其他SEB修飾物沒有顯示出任何重量損失。
另外，本發明人研究了這些SEB修飾物的由D-半乳糖胺誘導的致死毒性。據報道，給藥D-半乳糖胺可導致小鼠對SEB的敏感度顯著增加，例如，當對雌性BALB／c小鼠給藥D-半乳糖胺時，SEB的LD50下降到2μg／小鼠，給藥20μg／小鼠SEB時，觀察到100％死亡(Miethke T．等，《實驗醫學雜志》第175卷，91-98頁，1992年)。
利用該實驗系統，本發明人研究了SEB修飾物的致死毒性。結果，48小時后，野生型SEB和D9N顯示出致死率分別為9／10和8／10，而I41TL45V顯示為3／10，I41R F44V為1／10，F44S為0／10，F44L I53N為0／10，F44L I53N為1／10，F44L I53N G59W為0／10。因此，我們發現，這些SEB修飾物大大降低了致死毒性。這清楚地表明，按照本發明的修飾物不僅可如日本專利公開第8-500328中所述降低毒性，而且可消除致死毒性。
如上所述，預期SEB將是潛在的免疫疾病預防劑／治療劑。但是，也有報道說，SEB本身與免疫疾病的發作有關(Omata S．等，《細胞免疫學》第179卷，138-145頁，1997年)。因此，我們利用一種人類風濕性關節炎的模型-膠原誘導的關節炎(下文中也稱之為“CIA”)研究了SEB本身以及本發明的SEB修飾物與免疫疾病的發作之間的關系。通過給藥膠原誘導小鼠發生關節炎，對這些小鼠給藥天然型SEB和本發明提供的SEB修飾物。在小鼠給藥天然型SEB的情況下，關節炎的發病率相當高，且疾病的嚴重程度也非常高，這提示了SEB與疾病的發作之間的關系。相反，當給藥SEB修飾物時，沒有觀察到嚴重的關節炎發作。
SEB的某些毒性看來是由于單核因子，尤其是SEB刺激的白細胞產生的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。事實上，人外周血淋巴細胞與SEB反應時產生大量TNF-α。然而，由SEB修飾物產生的TNF-α的濃度非常低，對N23Y的刺激活性是最低的。
如上所述，SEB顯示出對增殖、細胞因子的產生等的降低的刺激活性。據估計，這種降低的刺激活性與小鼠的致死毒性的降低密切相關，或者與誘導關節炎的能力的喪失密切相關。不過，令人感興趣的是，SEB修飾物顯示出對T淋巴細胞活化的抑制活性，盡管它們大大降低了對T淋巴細胞的刺激活性。當在抗原呈遞細胞存在下用抗原刺激T細胞時，它導致T細胞增殖或T細胞產生細胞因子諸如γ-干擾素(γ-IFN)。但是，向該系統中加入SEB修飾物抑制了這些反應。也就是說，我們發現SEB修飾物與天然型SEB相比不僅顯示出降低的毒性，而且獲得了天然型SEB未顯示出的抑制T細胞活化的附加活性。
在體內也觀察到了對T細胞活化的這種抑制作用。在上述實驗系統中，當本發明的SEB修飾物在給予與關節炎的發作密切相關的天然型SEB之前給藥時，嚴重關節炎的發作可受到保護，證實了SEB修飾物給藥的優良效果。
我們利用膠原誘導的關節炎(CIA)系統研究了本發明的SEB修飾物是否可以通過口服給藥用作自身免疫疾病的治療劑。結果，我們發現，野生型SEB和I41T L45V、I41R F44V、F44L I53N G59W、F44S、N23Y、N23I和N23D修飾物抑制了關節炎的惡化，從而證實了這些SEB修飾物的有效性。在這些修飾物中，N23Y是最強的CIA抑制劑。
因此，按照本發明的包含SEB修飾物的藥物可以用作類風濕性關節炎的預防劑／治療劑，特別是用于口服給藥，基于與常規藥物相比的對T細胞活化的抑制活性，它們具有降低的毒性和更強的有效性。還預期本發明的SEB修飾物顯示出像天然型SEB一樣的對炎性腸疾病的預防作用，天然型SEB的作用在日本專利公開第9-110704中公開。
本發明的口服給藥的免疫疾病預防劑／治療劑的特征在于與用于另外的給藥途徑的藥物相比，它含有極低量的SEB修飾物。這些SEB修飾物，與SEB一樣，特異性誘導對帶有SEB結合VβTCR的T細胞亞群的弱耐受。另一方面，當它們口服給藥時抑制T細胞的炎性活性。
為了制備用于本發明的SEB修飾物，可以不受限制地使用任何方法。例如，可以用下述方法制備SEB修飾物用基因工程技術生產產生SEB的細胞，并從其分離出所產生的SEB修飾物。
例如，按照下面的簡單描述制備野生型SEB(即，用基因工程技術制備的、具有與來自金黃色葡萄球菌的SEB相同的氨基酸序列的SEB)，從該野生型SEB可以推出用于本發明藥物的SEB修飾物。
由于SEB的染色體DNA是已知的(Ranelli D．M．等，《美國國家科學院院報》第82卷，5850-頁，1985年)，可以用DNA合成儀等制備5’-有義和3’-反義引物。用這些引物與商業上可獲得的SEB DNA文庫中存在的染色體DNA進行噬斑雜交而得到噬斑。然后用有義引物進行PCR并從所形成的條帶提取出DNA。再將提取出的DNA插入到適宜的克隆載體中用于克隆。
克隆化SEB編碼基因用限制酶切割，所述限制酶是諸如SacI，HindIII，EcoRI，BamHI，XbaI，SalI和PstI，所得片段加入到用限制酶諸如XmnI，HindIII，EcoRI，BamHI，XbalI和PstI切割的載體中，從而得到重組DNA(Sambrook等，《分子克隆》第二版，第9章，1989年，紐約，Cold spring Harbor Laboratory Press出版)。至于載體，可以適當地使用pTrc99A等的分泌表達載體。
所得重組DNA可以引入到適宜的宿主諸如大腸桿菌中而得到轉化體。所述轉化體以常規方式培養，培養完成后分離細胞。然后將分離出的細胞以常規方式破裂，從懸浮液中可以得到所需的野生型SEB。在合適的條件下，將野生型SEB方便地分泌到培養物上清液中。在這種情況下，培養物上清液可以用作起始物質。起始物質用純化方法進行純化，諸如象帶有吸收劑的免疫親和層析法，抗SEB單克隆抗體結合到該吸收劑上。在不同實驗中用于最終制劑的緩沖液優選包括Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液等。
本發明的SEB修飾物可以用上述制備野生型SEB的類似方法制備，但條件是與II類MHC分子結合的位點基于SEB的X射線結構分析數據來進行分析，確定要進行修飾的氨基酸序列的特異性位點，制備適宜的引物，并經PCR引入點突變。
為了保持所制得的野生型SEB或SEB修飾物的活性，使用新鮮制備的產品，或者如果在4℃下儲存的話，優選在儲存后的大約5天內使用。作為選擇，本發明的SEB修飾物可以在合適的明膠、鹽、糖、糖醇或氨基酸等環境下儲存。
按照本發明，SEB修飾物或其衍生物可以與已知的適宜賦形劑結合并用已知方法配制成本發明的免疫疾病預防劑／治療劑。本發明藥物的劑型可以是適于口服給藥的任何劑型，諸如粉末(固體)、溶液或糖漿的形式。例如，在一個優選的實施方案中，SEB修飾物或其衍生物與適宜的賦形劑一起冷凍干燥制成固體制劑，其中賦形劑是例如碳水化合物、糖、糖醇或氨基酸等。在另一個優選的實施方案中，SEB修飾物或其衍生物溶解于生理鹽水或具有可接受的緊張性離子強度的適宜緩沖液中制成液體制劑。也可以想到將SEB修飾物或其衍生物溶解于商業上可獲得的飲用水中并口服攝取該溶液。至于藥物中的內含物，SEB修飾物或其衍生物優選以每次給藥0．05μg-50mg(0．001-1，000μg／kg體重)的量存在，優選0．5μg-0．5mg(0．01-10μg／kg體重)。
一劑有效的、包含作為活性成分的SEB修飾物或其衍生物的免疫疾病預防劑／治療劑可以根據例如受治療者的年齡、癥狀或病情嚴重程度等而改變，并最終可由醫師考慮后確定。例如，以SEB修飾物計算，對于成人的有效劑量一般是0．05-50，000μg／天，優選每天口服給藥一次或兩次總共0．5-500μg。本發明的SEB修飾物可以可選地與其他藥物諸如象硫唑嘌呤、環磷酰胺等結合，或者與高分子量抗炎劑諸如抗TNFα抗體結合。
可用本發明的包含SEB修飾物的免疫疾病預防劑／藥物治愈的免疫疾病主要是自身免疫疾病，諸如類風濕性關節炎或潰瘍性結腸炎。不過，除了自身免疫疾病以外，本發明的免疫疾病預防劑／藥物也可用于骨髓移植后的移植物抗宿主疾病，或I型、II型或III型變應性疾病。
本文中所用的本發明的SEB修飾物的“衍生物”是指被進一步修飾的如上所述至少有一個氨基酸殘基取代的SEB修飾物。本發明包括在天然型SEB的氨基酸序列內在除了上述SEB修飾物中的特定氨基酸殘基以外的任何氨基酸殘基上有取代、缺失或插入并且仍然具有與SEB修飾物同等活性的那些SEB衍生物。
工業實用性按照本發明，可以提供新型的免疫疾病預防劑／治療劑，所述免疫疾病包括自身免疫疾病如類風濕性關節炎，該預防劑／治療劑一直是被長期熱切需求的。
實施例本發明利用下列制備和實施例作了更詳細的說明，但不應理解為將其限制于此。
制備1(重組SEB修飾物的制備和表達)1-1 SEB基因的克隆從CLONOTECH購得金黃色葡萄球菌腸毒素A+B+D的DNA文庫并進行噬斑雜交。使用合成反義DNA或PCR片段作為探針。在引物的兩端加上SalI切割位點，用于促進隨后的克隆過程。
收集引物與之結合的那些噬斑。用有義引物進行PCR，從所得條帶中提取出DNA并將其克隆到PCR-II載體(Invitrogen)中。表1中描述了上述雜交中使用的引物。表1反義5’-AAG TCG ACA ATA TTA GAA AAG GCA GGT ACT-3’(SEQ ID NO1) SalI有義5’-ATG TCG ACT TAA TTG AAT ATT TAA GAT TAT-3’(SEQ ID NO2) SalI隨后，用自動測序儀確定DNA的核苷酸序列。所得SEB基因含有啟動子區(SEB-Pro)。為了得到沒有啟動子區的SEB基因，進一步用表2中所列的引物進行PCR，并將所得DNA片段克隆到PCR-II載體中。表2有義5’-AAG TCG ACA AAA AAT GTA TAA GAG ATT ATT-3’(SEQ ID NO3) SalI反義5’-AAG TCG ACT TTC ACT TTT TCT TTG TCG TAA-3’(SEQ ID NO4) SalI用自動測序儀確定所得SEB基因的DNA的核苷酸序列。我們發現，由此所得的SEB基因不含任何突變。該沒有啟動子區的SEB基因用SalI切割并克隆到具有相同切割位點的分泌表達載體pTrc99A(PharmaciaBiotech)中。使用該基因以正確方向插入的載體，用IPTG誘導表達，從而確認SEB的表達和分泌。
1-2聚合酶鏈式反應(PCR)如Saiki等在《科學》1988年第239卷，第487頁中所述，用Taq聚合酶和Perkin Elmer Cetus(Norwalk，CT，USA)的DNA熱循環儀進行PCR。每個循環由用于變性和釋放復制模板DNA的變性過程(94℃下1分鐘)、用于將引物和模板退火的退火過程、以及用于合成的延伸過程(72℃下2分鐘)組成。總共重復30-35次循環。模板以1-10M的濃度存在，寡核苷酸引物以1mM的濃度存在。dNTP的濃度為200mM，但當引入突變時，一個dNTP的濃度降低至20mM。
1-3重組SEB修飾物的制備和表達利用基因重組技術制備并表達僅帶有氨基酸殘基取代的SEB修飾物。按照Marrack P．等(《實驗醫學雜志》第171卷，第445頁，1990年)的教導，對SEB的與II類MHC分子結合有關的區域進行修飾。表3顯示了引入氨基酸殘基取代的位點。表3要修飾的位點改變標識D9 Asn→Asp D9NF17 Phe→Ser F17SN23 Asn→Asp N23DN23 Asn→Tyr N23YN23 Asn→Ile N23IN23 Asn→Lys N23KD9，N23 Asp→Asn D9N N23DAsn→AspF44 Phe→Ser F44SF44，I53 Phe→Leu F44L I53NIle→AsnF44，I53，G59 Phe→Leu F44L I53N G59WIle→AsnGly→TrpI41，F44 Ile→Arg I41R F44VPhe→ValI41，L45 Ile→Thr I41T L45VLeu→Val1-4氨基酸取代的引入將插入到PCRII載體中的SEB-Pro基因用作模板DNA，利用PCR分別在5’和3’末端引入SfiI和NotI位點。將所得DNA片段插入pTrc99ApelB載體中，通過測序確定核苷酸序列。制備用于PCR的在有義和反義位點上的每種引物，在核苷酸序列中產生突變，以使所需位點上的天然氨基酸殘基轉變為每種SEB修飾物所需的氨基酸殘基。首先將反義位點上的引物(D9N，N23I，N23Y，N23D，N23K，F17S，F17S N23D)-SEB用于制備。然后，利用引入SfiI位點的引物作為有義引物進行PCR。
圖1和圖2顯示了用于制備SEB修飾物的PCR引物的核苷酸序列(SEQID NO5-19)。
隨后，利用先前用有義引物制得的引入NotI位點的引物作為反義引物進行PCR。然后利用所得到的兩種DNA片段進行PCR。將所得DNA片段克隆到pTrc99A中。然后該載體用SfiI和NotI處理，以研究該載體是否被切割成所需大小的DNA片段。測定具有所需大小的那些DNA片段的核苷酸序列，以確認正確地引入了突變。
1-5 SEB修飾物的表達和所述修飾物的制備用插入到pTrc99A載體中的修飾基因表達SEB修飾物。帶有摻入基因的大腸桿菌細胞在培養基中在37℃下培養18小時，其中培養基中溶解有4％CORCLEGROW(BIO IOI公司，Vista，CA，USA)和氨芐青霉素(50mg／ml)。收集細胞并將它們懸浮于相同的培養基中至550nm下光密度為0．3-1．0。向其中加入2mM異丙基-B-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，該混合物在37℃下振搖過夜而誘導表達。誘導完成后，通過離心除去宿主大腸桿菌細胞，上清液通過0．45μm濾膜過濾。
由此制得的上清液通過Sepharose 4B柱，抗SEB單克隆抗體SA58-2-6IgG固定在該層析柱上，所以上清液中的SEB修飾物被吸附。該柱用0．1M Tris HCl(pH8．0)洗滌，然后用4M MgCl2洗脫。洗脫的級分用20倍體積的生理鹽水透析三次，然后用20倍體積的PBS透析兩次。本文中制得的所有SEB修飾物都可用上述單克隆抗體柱純化。
實施例1(小鼠致死毒性試驗)天然型SEB不提供小鼠致死毒性。但是，如Miethke T．等報道(《實驗醫學雜志》第175卷，91-98頁，1992年)，已知當事先給藥D-半乳糖胺時，靜脈或腹膜內給藥20μg／小鼠SEB可導致小鼠死亡。因此，為了研究SEB修飾物是否能降低死亡率，對事先接受了D-半乳糖胺的小鼠給藥SEB或SEB修飾物。
首先研究對內毒素的敏感度。對BALB／c小鼠給藥20mg／小鼠D-半乳糖胺后，對該小鼠靜脈給藥來自大腸桿菌B4菌株的LPS(脂多糖)，24小時后測定死亡率。結果，在不超過1ng／小鼠LPS的劑量下未觀察到死亡(表4)。
表4劑量 死亡數／總數1μg／只7／9100ng／只 8／910g／只 5／91ng／只 0／90．1ng／只 0／9降低SEB修飾物樣品中的內毒素含量，使最終劑量成為不超過10ng／小鼠，將雄性小鼠用于實驗。在雄性小鼠的情況下，給藥D-半乳糖胺后SEB的致死毒性不少于100μg／小鼠。因此，SEB修飾物以100μg／小鼠的劑量給藥。如表5中所示，天然型SEB、野生型SEB和D9N-SEB顯示出較高的死亡率，指示此劑量有致死毒性。然而，在其他SEB修飾物中，致死毒性大大降低。本文中所用的“天然型SEB”是指來自金黃色葡萄球菌的腸毒素。本文中所用的“野生型SEB”是指與天然型SEB具有相同氨基酸序列并利用基因工程技術制備的SEB。
表5SEB修飾物 死亡率(100μg／只) (死亡總數／總數)24小時后 48小時后天然型 8／10 8／10野生型 7／10 9／10D9N 6／10 7／10I41T L45V 3／10 3／10I41R F44V 0／10 0／10F44L I53N 0／9 0／9F44L I53N G59W 0／10 0／10F44S 0／10 0／10N23I 0／10 0／10N23D 0／10 0／10N23Y 0／10 0／10N23K 0／10 0／10PBS0／10 0／10用雌性BALB／c小鼠進行相同實驗。在雌性小鼠的情況下，當給藥40mg／小鼠D-半乳糖胺時，用20μg／小鼠SEB觀察到了高致死毒性。在天然型SEB、野生型SEB和D9N-SEB的情況下產生了較高死亡率。然而，其他SEB修飾物顯示出較低的死亡率，證明致死毒性降低了。
實施例2(人外周血單核細胞(PBMC)用SEB或SEB修飾物刺激后TNF-α產生情況的比較)利用淋巴細胞分離試劑(Pharmacia)從健康成人采集外周血單核細胞(PBMC)，并將其懸浮于含有10％FCS的RPMI1640培養基中，使濃度為1×106細胞／ml。將該細胞懸浮液(100ml)加入到96孔微量滴定板(Falcon)中，然后加入SEB或SEB修飾物溶液(100ml)，該滴定板在37℃下溫育24小時。24小時后，收集培養物上清液，用人TNF-α的酶免疫測定試劑盒(Biosource)定量分析上清液中的TNF-α。結果顯示在圖3中。當PBMC用SEB刺激時，產生了大量TNF-α。相反，當PBMC用SEB修飾物刺激時，TNF-α的產生顯著降低。其中，N23Y顯示是最低的，即，與SEB相比的特異性活性為千分之一或更小。
實施例3(SEB修飾物對T細胞的抑制活性)用對純化肽衍生物(PPD)有反應的小鼠T細胞系PPD914來評價SEB修飾物對T細胞的抑制活性。該T細胞系是Vβ8 TCR陽性的，不僅對其抗原PPD有反應，而且對SEB有反應。1×104PPD914和來自DBA／1J的5×105絲裂霉素處理的脾細胞在96孔微量滴定板(Falcon)上培養并加入0．5mg／ml PPD刺激。向該系統中加入SEB修飾物(1mg／ml)并在37℃下繼續培養48小時。48小時后，以0．5mCi／孔的濃度加入氚胸苷，再繼續培養16小時，測定增殖情況。通過與不存在SEB修飾物時得到的結果進行對比來評估SEB修飾物的抑制活性。結果顯示于圖4中。SEB修飾物N23Y和F44S抑制了T細胞由其抗原PPD誘導的增殖。
實施例4(在膠原誘導的關節炎(CIA)中對SEB修飾物安全性的評價)對DBA／1小鼠真皮內給藥200μg／小鼠的牛II型膠原和弗氏完全佐劑，從而誘導小鼠產生膠原誘導的關節炎(CIA)。牛II型膠原給藥21天后，對小鼠腹膜內給藥各50μg／小鼠的SEB、F44S或N23D。一周后(最初給藥膠原后28天)，比較關節炎的發病率。表6總結了關節炎的發病率和嚴重程度的結果。用SEB給藥的8只小鼠中有5只觀察到重度關節炎。相反，用F44S或N23D給藥的小鼠未發現關節炎。
表6初次免疫接種 增強 發病率嚴重程度膠原 SEB 5／8 6．2膠原 F44S 0／8 -膠原 N23D 0／8 -實施例5(SEB修飾物對SEB誘導的關節炎的預防作用)對如實施例4中所述用膠原誘導的小鼠給藥牛II型膠原18天后，腹膜內給藥各50μg／小鼠的F44S或N23D和作為對照的磷酸鹽緩沖液。三天后，對小鼠腹膜內給藥50μg／小鼠的SEB。如表7中所示，給藥磷酸鹽緩沖液的8只小鼠中有4只觀察到了關節炎(發病率50％)。相反，事先給藥F44S或N23D使發病率分別降低至13％和25％。
表7初次免疫 預處理 加強 發病率 嚴重程度膠原 PBS SEB 4／8 6．5膠原 F44S SEB 1／8 5．0膠原 N23D SEB 2／8 2．5實施例6(SEB修飾物經口服給藥后對膠原誘導的關節炎(CIA)的治療作用)如實施例4中所述對DBA／1小鼠進行CIA誘導，21天后腹膜內給藥牛II型膠原進行加強。通過測量關節炎得分來觀察CIA的發作。比較CIA的嚴重程度，而實驗開始時疾病的嚴重程度是相同的。對于口服給藥，測定每天每只小鼠攝取的水的量并計算其平均值。將小鼠分成數組，以使每組中小鼠攝取的水的平均量可以適當地分開。
分成幾組后，實驗開始，其中小鼠可以不受限制地飲水，由此攝取SEB修飾物并觀察疾病的減少情況。一周對每只小鼠的疾病打分一次，記錄疾病嚴重程度的變化。這些結果顯示于圖5和圖6中。至于CIA癥狀的減少和對CIA惡化的抑制活性，I41R F44V、I41T L45V、D9N、N23K、F44S、N23I和野生型SEB顯示是有效的。基于各實驗組中的關節炎得分，利用給藥PBS的各組(CIA發作的組)和給藥SEB修飾物的各組之間的Wilcoxon檢驗進行顯著性檢驗。結果發現，在疾病發作后的25-75天內，在小于0．05的置信度下，上述所有SEB修飾物都是顯著的，因此可以減輕CIA的癥狀。因此，具有降低的毒性和對CIA保持功效的SEB修飾物的功效得到了證明，這提示這些SEB修飾物將是潛在的用于口服給藥的人類風濕性關節炎的治療藥物，它們具有低得多的毒副作用。
另一方面，在Wilcoxon檢驗中，與PBS給藥組對比，在置信度為0．05時，D9N N23D、F17S E22D和N23Y F208L不是顯著的。
實施例7(SEB修飾物經口服給藥對膠原誘導的關節炎(CIA)的預防作用)如實施例4中所述，在DBA／I小鼠的尾部真皮內給藥懸浮于CFA中的200μg牛II型膠原用于免疫接種。免疫接種20天后，每隔一天給這些小鼠口服溶解于生理鹽水中的各0．5mg／小鼠的SEB修飾物。初次接種后的第30天，腹膜內給藥100μg膠原(加強)。觀察關節炎的消失時間和得分，以評價SEB修飾物的CIA抑制活性。如圖7所示，即使在加強前10天給藥SEB修飾物，它們也抑制了CIA，這證明了SEB修飾物對關節炎的預防作用。在這些SEB修飾物中，N23Y是最好的，它能顯著減輕關節炎。
序列表&#60110&#62Juridical Foundation the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute&#60120&#62新型免疫疾病預防劑／治療劑&#60130&#62661202&#60150&#62JP 10-50137&#60151&#621998-02-15&#60160&#6219&#60210&#621&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#621aagtcgacaa tattagaaaa ggcaggtact 30&#60210&#622&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#622atgtcgactt aattgaatat ttaagattat 30&#60210&#623&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#623aagtcgacaa aaaatgtata agagattatt 30&#60210&#624&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#624aagtcgactt tcactttttc tttgtcgtaa 30&#60210&#625&#60211&#6266&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#625ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaaa cgagttgcac60aaatcg 66&#60210&#626&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#626ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa attatgaaag tttt 104&#60210&#627&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#627ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa aaaatgaaag tttt 104&#60210&#628&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#628ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa tatatgaaag tttt 104&#60210&#629&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#629ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa gatatgaaag tttt 104&#60210&#6210&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6210ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaaa cgagttgcac60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa gatatgaaag tttt 104&#60210&#6211&#60211&#6290&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6211ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac60aaatcgagta aatccactgg tttgatggaa 90&#60210&#6212&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#6212aaatctatag atcaatctct atactttgac tta33&#60210&#6213&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6213taagtcaaag tatagagatt gatctataga ttt 33&#60210&#6214&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#6214tctatagatc aatttgtata ctttgactta ata 33&#60210&#6215&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6215tattaagtca aagtatacaa attgatctat aga 33&#60210&#6216&#60211&#6242&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#6216ataaacgtta aatctcgtga tcaagttcta tactttgact ta 42&#60210&#6217&#60211&#6242&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6217taagtcaaag tatagaactt gatcacgaga tttaacgttt at 42&#60210&#6218&#60211&#6260&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的有義引物&#60400&#6218aaatctatag atcaactgct atactttgac ttaatatatt ctaacaagga cactaagtta60&#60210&#6219&#60211&#6260&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62計劃用于通過PCR擴增制備SEB變體的反義引物&#60400&#6219taacttagtg tccttgttag aatatattaa gtcaaagtat agcagttgat ctatagattt60
權利要求
1.一種免疫疾病預防劑／治療劑，它包含作為活性成分的葡萄球菌腸毒素B(SEB)的修飾物，所述修飾是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被取代，或其衍生物，其中所述SEB修飾物或其衍生物對于T細胞的活化具有抑制活性，它們與T細胞受體(TCR)的特異性Vβ成分相互作用，但它們對SEB的免疫反應性降低了，同時沒有導致具有特異性Vβ成分的T細胞被消除，這種消除通常由天然型SEB或重組野生型SEB引起。
2.如權利要求1所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在9位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代。
3.如權利要求2所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在9位有天冬酰胺取代的SEB。
4.如權利要求1所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在23位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬酰胺以外的蛋白質構成氨基酸取代。
5.如權利要求4所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在23位有酪氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸或賴氨酸取代的SEB，或其衍生物。
6.如權利要求1所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在41位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了異亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代，或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代。
7.如權利要求6所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在41位有精氨酸或蘇氨酸取代、外加或者在44位有纈氨酸取代或者在45位有纈氨酸取代的SEB或其衍生物。
8.如權利要求1所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在44位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了苯丙氨酸以外的蛋白質構成氨基酸取代。
9.如權利要求8所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中所述SEB修飾物或其衍生物是在天然型SEB的基礎上在44位有絲氨酸取代的SEB或其衍生物。
10.如權利要求9所述的免疫疾病預防劑／治療劑，它用于口服給藥。
11.如權利要求10所述的免疫疾病預防劑／治療劑，它是具有生理學上可接受的pH和離子強度的水溶液。
12.如權利要求11所述的免疫疾病預防劑／治療劑，其中有選自下列成員的物質存在碳水化合物、糖、糖醇和氨基酸，它們的量足以使該溶液具有生理學上可接受的緊張性。
13.如權利要求1-12任一項所述的免疫疾病預防劑／治療劑，它用于類風濕性關節炎的預防／治療。
全文摘要
一種用于免疫疾病的預防劑/治療劑,它包含作為活性成分的葡萄球菌腸毒素B(SEB)的修飾物或其衍生物,所述修飾是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被取代,其中所述SEB修飾物或其衍生物對T細胞的活化具有抑制活性,它們與T細胞受體(TCR)的特異性Vβ成分相互作用但它們對SEB的免疫反應性降低了,同時沒有導致具有特異性Vβ成分的T細胞被消除,這種消除通常由天然型SEB或重組野生型SEB引起。
文檔編號A61P37/06GK1291106SQ99802974
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月15日 優先權日1998年2月15日
發明者佐佐木巧, 來海和彥, 副島見事, 木村由美, 野崎周英, 藤山佳秀 申請人:財團法人化學及血清療法研究所, 興和株式會社