含有合成肽的復合免疫原的制作方法

專利名稱:含有合成肽的復合免疫原的制作方法
本發明涉及一種含有一個或多個獨特合成多肽的復合免疫原。尤其涉及一種含有皂素衍生物的核心結構，它含有幾個類似乙型肝炎病毒外殼蛋白的合成多肽。
要使人工合成的病毒蛋白的多肽類似物具有疫苗一樣的潛能，即誘出保護性抗體，它不僅應該含有這些抗體的結合位點，而且還必須具有與T細胞受體和Ia抗原反應的功能區(J.Berzofsky，“Antigenic Structural Requirements foz MHC-Restricted Helper T Cell Recognition，”《Modern Approaches to Vaccines”，21-23，Edited by R.Chanock，R.lerner & F.Broun，Codl Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory，(1985);J.Berzofsky，“Intrinsic，and Extrinsic Factors in Protein Antigenic Structure”，《Science》229，932-940(1985);T.Watts，J.Gariepy，G.Schoolnik，H.Mcconnell，“T-Cell Activation by Peptide AntigenEffect of Peptide Sequence and Method of Antigen Presentation”，《Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，82，5480-5484，(1985))。
與對蛋白質的免疫應答相比較，對合成肽類的免疫應答具有較窄的遺傳限制性，因而合成肽類作為自動免疫的免疫原的可用性很可能受到限制。(A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，D.Stark.和P.Sproul，“Genetic Restriction of Immune Responsiveness to Synthetic Peptides Corresponding to Sequences in the Pre-S Region of the Hepatitis B Virus(HBV)Enuelope Gene”，《Journal of Medieal Virology》，17，119-125，(1985))。
本發明也涉及不適合于作人體疫苗的蛋白質載體和佐劑(即完全和不完全弗氏佐劑)，它們在很多實驗中用于幫助證實合成多肽的預防作用。
克服這些問題是有益出的。本發明的一個目的就是通過制備聚合的合成免疫原來克服這些問題，這些免疫原含有多拷貝的幾個明顯不同的合成肽。這些多聚物很可能具有與T細胞受體和Ia抗原反應的位點。人們也指望著對于含有幾個不同的多肽類似物的多聚物的免疫應答要比對于單個肽的應答受到的遺傳限制少。而且，多聚免疫原應該具有固有的佐劑性，且不需要蛋白質載體(A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Location and Chemical Synthes is of a pre-S Gene.Coded lmmunodominant Epitope of Hepat it is B Virus，Science，224，392-395，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Antiboclies to Hepat it is B Surface Antigen(H Bs Ag) E cited by lmmunization with a Synthetic Peptide Covalently Linked to Liposomes”，The Journal of General Virology，65，1009-1014，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Immune Respose to Hepat it is-Virus Determinants Coded by the Pre-S Gene”，Vaccines，85，185-189，Edited by R.A.Lerner，R.M.Chanock & F.Brown，Colel Spring Harbor，NY Cold Spring Harbor Laboratory，(1985))。
現有研究表明，對合成肽的免疫應答可以通過將合成肽整合進脂質體來增強(A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Antibodies to Hepat it is B Surface Antigen(H Bs Ag)Elicited by lmmunization with a Synthetic Peptide Covalently Linked to Liposomes”，The Journal of General Vieology，65，1009-1014，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，”，lmmune Response to Hepat it is-B Virus Determinants Coded by The Pre-S Gene”，Vaccines’85，185-189，edited by R.A.Lerner，R.M.Chanock和F.Brown，Cold Spring Harbor，NY∶Cold Spring Harbor Laboratory)或是整合進膠粒(T.P.Hopp，“lmmunogenicity of a Synthetic H Bs Ag Peptide∶Enhancement by Conjugation to a Fatty Acid Carrcer”，Molecular lmmunology，21，13-16，(1984))，并且可以不需要蛋白質載體。但是，為了獲得好的抗體應答，在兩種情況下都使用了弗氏佐劑。
最近有人敘述過免疫刺激復合體(iscoms)，其中病毒膜蛋白以多聚物的形式存在于皂苷衍生物Quil A之表面(Spikoside)(R.Morein，B.Sundquist，S.Hoglund，K.Dalsgaard和A.Osterhaus，“Iscom，A Novel Structure for Antigenic Presentation of Membrane Proteins From Enveloped Viruses”，Nature，308，457-460，(1984);A.Osterhaus，K.Weijer，F.Uytdehaag，O.Jarrett.B.Sundquist和B.Morein，“Induction of Protective Immune Response in Cats by Vaccination with Feline Leukemia virus Iscom”，The Journal of Immunology，135，591-596，(1985))。整合進免疫刺激復合體中的病毒蛋白質在缺乏佐劑的條件下變得具有高度免疫原性。這兩篇文章是用去垢劑裂解病毒而不是用人工合成的肽。將裂解的病毒放入一個含有皂苷衍生物Quil A的容器中進行離心。然后進行透析。
本發明涉及一個復合免疫原，它由多拷貝的一個或多個不同的共價地連接到核心結構上的合成肽組成，而這種核心結構又是由一種皂苷衍生物和一種有機化合物或是具有12-24個碳原子和一個活性部分的疏水肽組成，該活性部分是-COOH，-CHO，-NH或-SH基。
此合成肽類可以是乙型肝炎病毒外殼蛋白的合成肽類似物。乙型肝炎病毒外殼蛋白的合成肽類似物可以從下列的乙型肝炎病毒(HBV)外殼蛋白的三個不同區得到(1)前S1區(2)前S2區(3)S區圖1是本發明的一個復合體的顯微照片。
圖2a和圖2b是用本發明的復合體免疫家兔的抗體應答曲線圖。
圖3是表示用本發明的復合體免疫家兔的抗體應答的時間過程(動力學)曲線圖。
圖4顯示從HBV DNA序列推斷出的前S基因區翻譯產物的氨基酸序列。該序列以一字母氨基酸密碼詞表示(這些密碼詞的規定如下)。它列出了五個不同的HBV亞型的序列。底下的第6行顯示了所有五個亞型所共同的氨基酸殘基定義氨基酸密碼詞(如圖4所示)D Asp 天冬氨酸N Asn 天冬酰胺T Thr 蘇氨酸S Ser 絲氨酸E Glu 谷氨酸Q Gln 谷氨酰胺P Pro 脯氨酸
G Gly 甘氨酸A Ala 丙氨酸C Cys 半胱氨酸V Val 纈氨酸M Met 甲硫氨酸I Ile 異亮氨酸L Leu 亮氨酸Y Tyr 酪氨酸F Phe 苯丙氨酸W Trp 色氨酸K Lys 賴氨酸H His 組氨酸R Arg 精氨酸合成肽一非自然存在的肽本發明涉及一種含有一個或多個下列活性基團的皂苷衍生物和一種有機化合物(即脂族化合物或芳香族化合物)或疏水肽組成的復合體核心結構)。這些活性基團是羧基、醛基、烷基胺和/或硫醇基。只要它們含有上述任一活性基團且在與水混溶的有機溶劑如二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、乙醇等中是可溶的，任何脂族化合物或芳香族化合物或疏水肽都可以使用。將該復合體進行凝膠過濾以除去有機溶劑和過量的皂苷衍生物。然后將一個或多個不同的合成肽共價地連接到該復合體上。肽類是特異地共價連接到脂族化合物的活性基團上。本發明所使用的較好皂苷衍生物是Quil A。
皂苷(C32H54O18;分子量＝726.5)是得自皂草、尤其是來自Mora excelsa(英屬圭亞那)的心材的一種植物糖苷。每一皂苷是由一個組成該分子的algucon部分的皂苷配基和一個糖組成。此皂苷配基可以是甾類或三萜，糖部分可以是葡萄糖、半乳糖、戊糖或甲基戊糖。
該脂族化合物有7-24個碳原子，12-18個碳原子更好，最好是14-18個碳原子，并且有一個或多個選自-COOH、-CHO、-NH和-SH基團的活性部分。用于本發明的脂肪酸(飽和的和非飽和的)的非限定例子包括硬脂酸、油酸軟脂酸和豆蔻酸，它們可用碳化二亞胺例如N-乙基-N’(二甲氨基丙基)碳化二亞胺活化。較好的脂族化合物是十八烷硫醇。
肽是結合到脂族化合物的活性部位上。例如，肽的一個末端的-NH基(N-末端)可以與該復合體的-COOH或-CHO活性部位相結合。或者，肽的-COOH末端可與復合體的-NH2活性部位結合。進而，肽的C-末端高絲氨酸內酯端可以與復合體的氨基部位結合(T.Kempe，S.B.H.Kent，F.Chow，S.M.Peterson，W.I.Sundfuist和J.J.L’ Italien，《基因》，39卷，239，(1985))。此外，肽中的巰基(＝半胱氨酸)也可與復合物(例如含有十八烷硫醇)中的巰基結合。
本發明特別針對含有多拷貝的三個不同的合成肽的復合免疫原，它們分別得自乙型肝炎病毒(HBV)外殼蛋白的前S1、前S2和S區。本發明的申請者已經發現，本發明的刺激復合體在沒有附加佐劑的情況下在家兔中誘出了識別天然HBV外殼蛋白的抗體。
本發明的含有幾個不同肽類似物的復合體使以下情況成為可能(1)克服了在單個肽免疫原中所固有的潛在問題，即在免疫應答過程中T-B細胞協同作用的不足和免疫應答的遺傳限制較窄;(2)含有參與病毒中和反應和抗感染保護作用的主要抗原決定基的疫苗的設計;(3)研究對于遺傳限定的動物的不同抗原決定基的免疫應答的調節以及評價單個抗原決定基對于位點特異性抗體應答的相互影響。
在本發明中尤其適用的肽是前S(120-145)(A.R.Neurath，S.B.H.Kent，K.Parker，A.M.Prince，N.Strick，B.Brotman和P.Sproul，“Antibodies to a Synthetic Peptide from the Pre-S(120-145)Region of the Hepat it is B Virus Enoelope are Virus-Neutralizing”，Vaccine，4，35-37，(1986))。較合適的肽類還有分別得自HBV外殼蛋白的前S和S序列的前S(21-47)和S(135-155)。
幾個乙型肝炎病毒(HBV)分離的基因組的克隆和序列化闡明了該病毒DNA的遺傳結構(P.Tiollais，P.Charnay，G.N.Vyas，Science，213，406，(1981))。
乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫學標記物包括表面抗原(HBs Ag)(它包括S蛋白如前S蛋白)、核心抗原(H Bc Ag)、“e”抗原以及它們相應的抗體。抗H Bs Ag的S蛋白和前S蛋白的抗體具有抗感染的保護作用。
HBV和直徑大約為22毫微米的亞病毒顆粒的幾個抗原亞型(乙型肝炎表面抗原;H Bs Ag)已被鑒定出來。(G.Le Borvier，A.Williams，Am.J.Med.Sci，270，165(1975))。所有這些亞型(例如ayw、adyw、adw2、adw和adr)具有共同的(基團特異性)外殼抗原決定基和免疫應答，這種免疫應答表現足夠的抗由任何一種該病毒亞型引起的感染的保護作用(W.Szmuness，C.E.Stevens，E.J.Harley，E.A.Zang、H.J.Alter P.E.Taylor，A.Dcvem、G.T.S.Chem、A.Kellner.等，N.Engl.J.Med.，307，1481，(1982))。
HBV基因組由兩條DNA鏈組成，分別稱為長(L)鏈和短(S)鏈。L鏈轉錄本有四個開放閱讀骨架區，分別稱作(S+Pre-S)、C、P和X。
開放閱讀骨架區(S+Pre-S)對應于HBV DNA的外殼(env)基因，編碼在HBV外殼和與病毒相關的顆粒中發現的蛋白質族。
HBV DNA的env基團具有潛在活性的翻譯產物的圖解表示如下前S區 S區 4001 12 120 174 175 400前S(1) 前S(12) 前S(120) 前S(174) S(1) S(226)175 400單獨的S區S(226)400前S(120) S(226)400前S(12) S(226)400前S(1) S(226)上面圖解中的數字是指氨基酸(AA)的數目。Metl處的翻譯起始點僅是用于adw和adr亞型。而其它亞型的第一個氨基酸對應于前S12位置。
在下文中，對應于前S區(env 1-174)的氨基酸序列用詞頭“Pre-S”表示，對應于S區(env 175-400)的氨基酸序列用“S”表示，與“單獨的S區”表示法中的1至226氨基酸相比，env基因產物表示法中的S區橫跨175至400氨基酸。
在上面的圖解中，前S區是由前S1-174位置的氨基酸序列確定。S區是由S1位置的序列(開放閱讀骨架的175氨基酸且鄰近前S174)至S266位置的序列(開放閱讀架的400氨基酸)確定。S基因產物(S蛋白)是由這266氨基酸序列組成。
前S1區包括前S1至前S119，前S2區包括前S120至前S174。
天然產生的乙型肝炎病毒的外殼蛋白包括(1)HBV的env基因的全長翻譯產物。即，對于adw和adr，前S(1-174)+S(175-400)＝400氨基酸;對于ayw、adyw和adw，前S(12-174)+S(1-226)＝389氨基酸(env12-400);
(2)前S(120-174)+S(175-400)＝281個氨基酸(env 120-400)＝前S區的末端55個氨基酸+組成整個S區的226個氨基酸(對應的蛋白質其大小約為33和36KD(P33和P36)，且彼此糖基化的程度不同);
(3)S(1-226)＝226個氨基酸，即整個S區(env 175-400);代表了HBV外殼(P22和P26)的非糖基化和糖基化形式的約22和26KD的主要成分(“S-蛋白”)。
除前面提到過的前S(21-47)、前S(120-145)和S(135-155)外、本發明較好的肽包括(1)前S(12-32)，其中對于adw2亞型，該序列是MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP(見圖4);
(2)前S(120-145)，其中對于adw2，該序列是MQWNSTAFHQTLQDPRVGLYLPAGG(見圖4);
(3)前S(32-53)，其中對于adw2亞型，該序列是PAFGANSNNPDWDFNPVKDDWP(見圖4);
(4)前S(117-134)，其中對于adw2亞型，該序列是PQAMQWNSTAFHQTLQDP(見圖4);
(5)前S(94-117)，其中對于adw2亞型，該序列是PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP(見圖4);
(6)前A(153-171)，其中對于adw2亞型，該序列是PAPNIASHISSISARTGDP(見圖4);
(7)前S(1-21)，其中對于adw2亞型，該序列是MGG WSSKPRKGMGTNLSVPNP(見圖4);
(8)前S(57-73)，其中對于adw2亞型，該序列是QVGVGAFGPRLTPPHGG(見圖4);
(9)前S(1-11)，(a)對于adw2，其中該序列是MGGWSSKPRKG(見圖4);
(b)對于adr，其中該序列是MGGWSSKPRQG(見圖4)。
只要能夠誘發辨別HBV前S蛋白或乙型肝炎表面抗原的抗體，由本發明的前S和S基團編碼的序列的類似物都可以使用，包括氨基酸缺失、氨基酸取代例如被其它的氨基酸取代或被等配物(經修飾的與蛋白質氨基酸具有密切的結構和立體相似性的氨基酸)取代、氨基酸加入和等配物加入。
從天然來源獲得一段肽，是將含有所需氨基酸序列的蛋白質進行選擇性蛋白水解，如化學試劑或酶裂解蛋白質。肽的人工合成是用化學方法合成所需氨基酸鏈。
最好能夠確保該肽基與乙型肝炎病毒的前S或S基因編碼區中的至少六個連續氨基酸相對應，且具有被乙型肝炎病毒的抗體所識別的立體構型。為此，作為氨基酸鏈的一部分的一個或多個附加氨基酸可以在兩邊之中任一邊或兩邊與已知的氨基酸鏈結合。這些附加氨基酸可以作為增強氨基酸鏈穩定性的輔助氨基酸，以便它能夠很容易地被乙型肝炎病毒抗體所識別。附加氨基酸可以是與天然蛋白質具有同樣序列的氨基酸，也可以是其它的氨基酸。
本發明的一種類型就是，具有最小六個氨基酸鏈長的肽可以在其任一邊與附加氨基酸結合，例如，在其任一邊接上三個氨基酸，以形成一種較長的氨基酸鏈。該氨基酸鏈可以含有與乙型肝炎病毒表面抗原的前S區的至少六個連續氨基酸相對應的一個以上的氨基酸序列。
單個氨基酸序列的長度可能依賴于產生該序列的方法。如果該序列是通過化學手段將單個氨基酸連接起來的話，那么該序列的長度大致不會超過50個氨基酸，最好不超過40個氨基酸。如果合成肽是通過DNA途徑獲得，鏈的長度可以較長，例如100或100個以上的氨基酸。但是，它通常比天然前S蛋白質短。在最佳條件下則比天然前S蛋白質更短些，這樣，在一個肽具有S區和前S區成分的實施方案中，它的對應于S區的肽部分要比天然S蛋白質短，例如，小于100個氨基酸，更可取的是小于40個氨基酸，而通常少于30個氨基酸。在這些情況下，對應于前S區的肽部分可能具有與整個前S區相對應的長度，但是通常要比整個前S區短。
如果氨基酸序列是長鏈的一部分，例如有一個以上的氨基酸序列時，該鏈可以含有各種組成部分的殘基，如多聚氨基酸或多糖的片段。
除了含有與乙型肝炎病毒的前S區中的至少6個連續氨基酸相當的一個或多個相同的或不同的氨基酸序列外，例如，含有相當于乙型肝炎病毒的前S區內不同表位(抗原決定簇)一個以上的氨基酸序列，本發明的免疫原還包括含有不同抗原或過敏原的表位氨基酸鏈，以使得它能被用于針對乙型肝炎病毒和一種或多種其它疾病的疫苗中，如麻疹、流感、天花、脊髓灰質炎，白喉。這些附加的氨基酸序列可能有不同的氨基酸鏈長度。
本發明獲得了一個免疫原，它缺乏天然可產生的乙型肝炎病毒外殼蛋白而得以鑒定，即，本發明的免疫原由一個或一個以上肽序列所組成，這種肽相當于乙型肝炎病毒外殼蛋白質的一個限定的部分。本發明的免疫原也不含有在該病毒粒子中發現的其它蛋白質。
肽的化學合成在下列出版物中已有描述，即S.B.H.Kent，Biomedical Polymers，eds.，E.P.Goldberg和A.Nakajima，(Academic Press，New York)，213-242，(1980);A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelhard和R.B.Merrifield;J.Org.Chem.，43，2845-2852，(1978);J.P.Tam，T.-W.Wong，M.Riemen，F.-S.Tjoeng和R.B.Merrifield，Tet.Letters，4033-4036，(1979);S.Mojsov.A.R.Mitchell和R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，45，555-560，(1980);J.P.Tam.R.D.Dimarchi和R.B.Merrifield，Tet.Letters，2851-2854，(1981);S.B.H.Kent.M.Riemen、M.Ledoux和R.B.Merripield，Proceedings of the IV Inter national Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis，(Brookhavan Press，Brookhauen，NY)，1981。
化學合成在所謂的“梅里菲爾德固相法”中，L-氨基酸適當序列是從羧基端到氨基端合成的。開始是通過與樹脂的氯甲基、二苯甲基胺或其它活性基團的化學連接，將氨基酸的適當羧基端接到聚乙烯(或其它適當物質)樹脂上，然后用下述步驟將氨基酸一個個地加上去。肽-樹脂是(a)用二氯甲烷洗滌(b)在室溫下，與溶于二氯甲烷中的5%(v/v)二異丙基乙胺(或其它受阻堿)混合10分鐘而將其中和;
(c)用二氯甲烷洗滌(d)通過與1/2克分子碳化二亞胺如二環己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺)結合的方法，用相當于六倍正在增長的肽鏈克分子濃度的氨基酸于0℃活化10分鐘，以形成氨基酸的對稱酐。所用的氨基酸應是N-α叔丁氧羰基衍生物的形式提供，且帶有側鏈，而這些側鏈是芐基酯(如天冬氨酸或谷氨酰胺)、二芐醚(如絲氨酸、蘇氨酸、半肽氨酸或酪氨酸)、芐氧基羰基或在肽合成中常用的其它保護基團保護的。
(e)將活化的氨基酸與肽-樹脂于室溫反應二小時，結果使新氨基酸加到正在增長的肽鏈末端上。
(f)用二氯甲烷洗滌肽-樹脂;
(g)通過與溶于二氯甲烷中的30至65%(最好是50%)(v/v)三氟乙酸在室溫下反應10至30分鐘，從最后加上去的氨基酸上去掉N-α-(叔丁氧羰基)基團;
(h)用二氯甲烷洗滌肽-樹脂;
(i)重復步驟(a)至(h)，至所需要的肽序列建成。
然后與含有10%(v/v)苯甲醚或其它合適的(芳族的)清除劑的無水氫氟酸反應，以除去樹脂上的肽，同時也除去有保護基團的側鏈。用凝膠過濾、離子交換、高壓液相層析或其它適當方法將肽提純。
在某些情況下，化學合成可在沒有固相樹脂的條件下進行，即合成反應完全在溶液中進行。反應過程相似，工藝已為大家所熟知，且終產物也基本相同。
從天然來源分離如能獲得足夠的整個蛋白質抗原，那么就可采用下面任何一種方法切出帶有所需要的氨基酸序列的該分子的特定部分(a)用蛋白水解酶，特別是它們的底物特異性正好能在最靠近所需氨基酸序列的位點斷裂開的那些酶進行消化，(b)用化學方法使蛋白質斷裂。氨基酸之間的特別鍵可與特殊試劑反應而裂開。這種例子包括;含有甲硫氨酸的鍵可用溴化氰打斷;天冬酰胺酰-甘氨酸鍵可用羥胺打斷;
(c)蛋白水解和化學斷裂相結合。
從天然來源，或用化學方法制備，或同時采用這兩種方法克隆DNA分子的一小部分也是可能的，此部分能編碼由細菌或其它細胞產生的多肽中所需要的氨基酸序列。
模擬H Bs Ag(S區)的抗原決定簇的肽包括如下S(135-155)(A.R.Neurath、S.B.B.Kent和N.Strick所寫的“Specificity of Antibodies Elicited by a Synthetic Peptide Having a Sequenee in Common With a Fragment of a Virus Protein，the Hepat it is B Surface Antigen”一文，見《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，79卷，7871-7875頁，1982年12月;
肽2含有5個附加的氨基酸殘基Ser-Thr-Gly-Pro-Ser-X，117 121
G.R.Dreesma.Y.Sanchez.I.Ionescu-Matiu、J.T.Sparrow、H.R.Six、D.L.Peterson、F.B.Hollinger和J.L.Melnick所寫的“Antibody to Hepat it is B Surface Antigen Afer A Single Inoculation of Uncoupled Synthet ic H Bs Ag Peptides”一文，見《Nature》295卷，158-160頁，1982年;和(2)下列肽位置 序列48-81 Cys-Leu-Gly-Gln-Asn-Ser-Gln-Ser-Pro-Thr-Ser-Asn-His-Ser-Pro-Thr-Ser-Cys-Pro-Pro-Thr-Cys-Pro-Gly-Tyr-Arg-Trp-Met-Cys-Leu-Arg-Arg-Phe-Ile2-16 Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu-Gln-Cys22-35 Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Ser-Trp-Cys38-52 Ser-Leu-Asn-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn47-52 Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn95-109 Leu-Val-Leu-Leu-Asp-Tyr-Gln-Gly-Met-Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu104-109 Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu
本發明復合體可用于結合各種病毒、細菌、過敏原和人與動物寄生蟲蛋白質的合成肽類似物(誘導出保護性抗體)，除了能結合乙型肝炎病毒抗原的合成肽類似物以外，特別是還能與新合成的乙型肝炎表面抗原的肽類似物結合，此新合成肽類似物含有與HBV前S基因編碼的區域中氨基酸序列相當的氨基酸序列。
因此，本發明的復合體也能用于結合下列病毒的合成肽類似物HTLV III/LAV，流感血凝素(A/memphis/102/72株，A/Eng1878/69株，A/NT/60/68/29 C株，A/QU/7/70株，Ao/PR 8/34，Al/CAM/46，A2/Singapore/1/57;B型流感病毒，如B/Lee 40)，真性雞瘟病毒血凝素，牛痘苗病毒，脊髓灰質炎病毒，風疹病毒，巨細胞病毒，天花病毒，單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型，黃熱病病毒，傳染性脫腳病病毒，牛痘病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒，馬鼻-肺炎(馬流產)病毒，牛惡性卡它炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，犬皰診病毒，愛潑斯坦-巴爾病毒(與傳染性單核細胞增多癥和伯基特淋巴瘤有關)，馬立克病病毒，棉羊肺腺瘤病毒，巨細胞病毒，腺病毒組，人乳頭狀瘤病毒，貓粒細胞缺乏病毒，水貂腸炎病毒，非洲馬病病毒(9個血清型)，蘭舌病毒(12個血清型)，傳染性鮭魚胰腺壞死病毒，禽肉瘤病毒(各種株)，禽造白細胞組織增生病毒(內臟的，成紅細胞的和成髓細胞的)，Osteopetrosis病毒，新城疫病毒，副流感病毒1，副流感病毒2，副硫感病毒3，副流感病毒4，腮腺炎病毒，火雞病毒，CANADA/58，犬溫熱病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒如乙型流感病毒(如B/Lee/40);狂犬病毒，東部馬腦脊髓炎病毒;委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒;西部馬腦脊髓炎病毒;黃熱病毒，登革1型病毒(＝6型)，登革2型病毒(＝5型);登革3型病毒，登革4型病毒;日本馬腦脊髓炎病毒，科薩努爾森林病毒;跳躍病病毒;墨累山谷腦炎病毒，鄂木斯克出血熱黃病毒(Ⅰ型和Ⅱ型);圣路易斯馬腦脊髓炎病毒;人鼻病毒，口蹄疫病毒;1型脊髓灰質炎病毒;腸道病毒脊髓灰質炎2，腸道病毒脊髓灰質炎3;禽傳染性支氣管炎病毒;豬可傳染的胃腸炎病毒;淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒;拉沙病毒;馬休波病毒;伯欽特病毒;塔卡里伯病毒;乳頭狀瘤病毒;辛德畢斯病毒等等。
本發明的復合體也可用于與細菌(如引起麻風病、結核病、梅毒和淋病的細菌)的合成肽類似物結合。
本發明的復合體還可用于與下列寄生物的合成肽類似物結合攜帶瘧疾(惡性瘧，卵園癥)，血吸蟲、錐蟲、利什曼原蟲、南美洲錐蟲病、阿米巴病、鉤蟲等等。
本發明的免疫原可用作疫苗的活性成分，且可與生理上可接受的稀釋劑(介質)如磷酸緩沖鹽一起使用。一般而言，在一個生理上可接受的介質中合成肽的濃度一次劑量約為1毫克以下，10微克以上。但無需使用佐劑。
該疫苗可皮下注射、皮肉注射或肌肉注射給予。但哪種途徑更好則取決于特定的疫苗，肌肉注射一般較好。注射次數也因疫苗而異。一般來說，注射一個月，初次免疫后6～12個月加強免疫一次。加強注射要根據初次免疫后血中抗體的水平而定，某些病例可能無需加強免疫。
本發明的疫苗可用于改善免疫應答，以及克服對于某些已知乙型肝炎病毒疫苗(如，不含有相當于前S區中氨基酸序列的肽的疫苗)的無反應性。
現在根據下面非限定例子敘述本發明。
實例將8毫克十八烷硫醇(Fluka，Hauppauge，New York)和20毫克2-巰基乙醇(ME)在20℃溶解于2毫升二甲基亞砜(DMSO)中。30分鐘后，加入8毫克Spikoside(Isotec AB，Lulea，Sweden)，然后將該混合物加到40毫升的“SEPHADEX G-10”柱上(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)，該柱預先已用0.8%的乙酸鈉(PH6.7)洗滌，繼之用2毫升含有2毫克/毫升Spikoside的同樣緩沖液洗滌。樣品上柱后，用同樣緩沖液但含有2微克/毫升Spikoside洗脫。收集和混合相當于外水體積的乳白色部分，并與2毫克合成肽前S(120-145)混合，此合成肽前S來自HBV外殼蛋白adw2亞型的前S2序列(A.R.Neurath等，《Science》，224卷，392-395(1984)上述;R.R.Neurath和S.B.H.Kent，“Antigenic Structure of Hunman Hepat it is Viruses in Immunochemistry of VirusesThe Basis for Serodiagnos is and Vaccines”，325-366頁，由M.H.V.Van Regenmortel & A.R.Neurath，AmsterdamElsevier編輯，(1985))，而且在C-末端有甘-甘-半胱氨酸間隔物。該肽用ME(100微克/毫升)還原并凍干。然后在一小時內，于30℃加入5×40μl鐵氰化鈉(6m M)，但pH要維持在6.7。該混合液用pH7.2 0.14M Na C10.01 M磷酸(PBS)透析。用2，000轉/分離心從適量的PBS中分離出免疫刺激復合體。他們于4℃沉淀，20℃懸浮。用酶聯免疫分析(EL ISA)，系列稀積的合成肽iscoms與連接到β-半乳糖苷酶上的前S(120-145)所進行的競爭性試驗表明，(A.R.Neurath S.B.H.Kent和N.Striclk，Specificity of Antibodies Elicited by a Syjnthetic Peptide Having a Sequence in Common With a Fraqment of a Virus Protein，the Hepat it is B Surface Antigen，”《Proceeding，of the National Academy of Science，U.S.A.》79卷，7871-7875頁，(1982))該肽已完成附著到免疫刺激復合體上。用同樣方法已分別制備出含有獲自HBV外殼蛋白前S1和S序列的前S(21-47)和S(135-155)類似物的復合體(Neurath等，1982，見上述;A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，P.Taylor和C.E.Stevens，Hepat it is B Virus Contains Pre-S.Gene-EncodedDomains，“《Nature》，315卷，154-156頁，(1985);Neurath和Kent，(1985)，文章如前述。不同之處是對于后一種肽，用0.1M磷酸鹽(pH8)進行分子排阻層析，沒有使用鐵氰化鈉，以及該肽與免疫刺激復合體的結合延長至16小時。EL ISA競爭試驗表明兩種肽與復合體的結合都是完全的。
將三種不同的復合體重新溶于DMSO中，且混合一起(總體積為4毫升)。加入4毫克Spikoside，然后將混合液加到已用含有2微克/毫升Spikoside的PBS洗滌的“SEPH ADEX G10”柱(40毫升)上。收集相當于該柱外水體積的部分，將含有吸附了全部三個不同肽的免疫刺激復合體的部分(圖1)相混合，并于免疫四只兔子。每次免疫的劑量相當于三種不同肽外殼每一種均為125微克，間隔2周。
圖1是含有相當于HBV外殼蛋白的前S1、前S2和S區的合成肽的免疫刺激復合體(已用抗-前S(21-47)凝集的)顯微照片(用250倍的相差物鏡照像;線長＝30微米)。免疫刺激復合體的直徑約為1至3微米。
兔子對所有結合到免疫刺激復合體中的合成肽類似物均產生了應答，因此后來與以完整乙型肝炎表面抗原形式存在的HBV外殼蛋白發生了反應(H Bs Ag);含有前S1、前S2和S區蛋白序列(Neuvath等，《Nature》，315卷，154-156頁(1985)，文章如前述)與胃蛋白酶處理的H Bs Ag也有反應(含有專性的S蛋白，Neurath等，《Nature》，315卷，154-156，(1985)，文章如前述)。如電子顯微鏡所規定到的抗血清將HBV顆粒凝集起來(資料未列出)。兩個最好的應答者所獲得的結果見圖2。
圖2代表免疫刺激復合體初次免疫后10周的抗體應答結果。此合成物含有來自HBV外殼蛋白亞型adw2(Neurath和Kent，(1985)，文章同上)前S1、前S2和S蛋白序列。于抗體用放射免疫分析法測定。
以125I-標記抗-兔IgG作為第二抗體。用于包被固相的抗原在插頁中已指明。從相當于抗-復合物血清的放射計數中減去相當于免疫前血清的放射性計數。圖2沒有顯示抗肽S(135-155)的抗體的應答，因為它們與對S蛋白的應答的關聯很少(Neurath等，(1982)，文章如上述;Neurath等，《The Journal of General Virology》，65卷，1009-1014頁，(1984))。
識別H Bs Ag的抗體水平隨免疫次數而增加(圖3)，提示記憶細胞的產生。
圖3表示一只兔子經圖2所描述方案免疫后抗HBV外殼蛋白抗體應答的動力學。用H Bs Ag包被小球，用于檢測抗體，經Western斑點法和血清學分析(Neurath 等，《Nature》，315卷，154-156頁，(1985)，文章如前述)證明其含有所有外殼蛋白質。終點稀釋代表最高的稀釋，此時相當于抗血清的計數除以相當于相同稀釋的免疫前血清的計數的比值(放射免疫分析比值單位)大于或等于2.1。抗S-蛋白抗體用非稀釋血清籍AUSAB試驗(Alfott實驗室，North Chicago，Illinois)進行測定。因此，圖3中左邊和右邊的縱距的標度是不可比較的。
請注意本說明書和權利要求
可以圖解方式提出，但不限如此，不離開本發明的精神和范圍的情況下可以作各種修正和更改。
權利要求
1.一個復合免疫原，它由一個核心結構和共價地連接到核心結構上的一個或一個以上獨特合成肽的幾個拷貝組成，該核心結構由一個皂苷衍生物和一個具有一個或一個以上活性部分的7至24個碳原子的有機化合物或疏水肽組成，該活性基團選自-COOH、-CHO、-NH2和-SH基。
2.如權利要求
1所述的復合免疫原，其中的有機化合物是一個脂族化合物。
3.如權利要求
2所述的復合免疫原，其中的脂族化合物是十八烷硫醇。
4.如權利要求
1所述的復合免疫原，其中皂苷衍生物是Quil A。
5.如權利要求
1所述的復合免疫原，其中合成肽是乙型肝炎病毒外殼蛋白 合成肽類似物。
6.如權利要求
1所述的復合免疫原，其中所說的合成肽包括(1)至少一種乙型肝炎病毒外殼蛋白的前S1區的肽類似物，(2)至少一種乙型肝炎病毒外殼蛋白的前S2區的肽類似物，(3)至少一種乙型肝炎病毒外殼蛋白S區的肽類似物。
7.如權利要求
6所述的復合免疫原，其中合成肽類似物(2)是前S(120-145)。
8.如權利要求
6所述的復合免疫原，其中合成肽類似物(1)是前S(21-47)。
9.如權利要求
6所述的復合免疫原，其中合成肽類似物(3)是S(135-155)。
專利摘要
本發明涉及一種復合免疫原，它由一核心結構和共價地連接到核心結構上的一個或一個以上獨特合成肽的多個拷貝所組成，該核心結構由一種皂苷衍生物和一種具有12至24個碳原子的有機化合物或帶有選自-COOH、-CHO、-NH
文檔編號C07K1/113GK87103084SQ87103084
公開日1988年2月3日 申請日期1987年4月27日
發明者亞歷山大·羅伯特·紐拉斯, 斯蒂芬B·H·肯特, 內森·斯蒂利克 申請人:紐約血庫公司, 加利福尼亞技術學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan