一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑及其制備方法

專利名稱：一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑及其制備方法。
目前，治療艾滋病和腫瘤是醫(yī)學(xué)上一個亟待解決難題，雖然有很多醫(yī)學(xué)家為此做了很多有價值得工作，但是，還沒有一種能有效治愈艾滋病和腫瘤的藥物。
本發(fā)明的目的就是要解決這一醫(yī)學(xué)難題，提供一種效果突出，使用安全，配方獨特，制取工藝科學(xué)得治療艾滋病和腫瘤的藥劑及其制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑，其特征在于其方劑由蓖麻、商陸、甘草、松果組成。
一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其特征在于工藝步驟如下(一)、蓖麻毒蛋白提取工藝先剝?nèi)ケ吐橥庥矚?，將白色仁杵成糊狀，除去蓖麻?1)在12℃以下加入3倍量乙醇浸4小時后離心，取其沉淀，以水捏溶，水溶液冰凍干燥即得粗制品，粗制品水溶液濾除不溶物，加適量酒精，放置片刻，濾除沉淀，母液再加入少量乙醇至微顯混濁，放冰箱里析出結(jié)晶，必要時再重結(jié)晶；(2)、酒精分級沉淀法蓖麻糊加3倍量乙醇，有沉淀析出，離心除去；再于此母液加1倍量乙醇，離心收集此部分沉淀，但仍含雜質(zhì)，再于此母液加1倍量乙醇，則析出的蛋白質(zhì)較純，沉淀用水溶解，冰凍干燥即得成品；(3)、注射用乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶的制取要求前述蛋白質(zhì)純度達99．9％以上時，以水溶解，用DEAE—纖維素柱層析的方法純化二次即得純品結(jié)晶，加半乳糖酸真空冷凍干燥即得；所得純品蓖麻毒蛋白，須100％不含蓖麻因和蓖麻堿；(二)、(1)．商陸皂甙提取工藝商陸根薄片加水提取三次，第一次加8倍量，煮沸4小時過濾，第二、三次加4倍量水，煮沸2小時，過濾、濾液合并，濃縮止藥的五倍量，取濃硫酸慢慢加到濃縮液中，邊加邊攪拌，濃縮液1000ml加硫酸40g，加完后，煮至微沸4小時，放冷，倒入等量冷水中，攪勻，放置過夜，棄去上清液，殘液即沉淀過濾，沉淀用水洗至PH值為6左右，濾集沉淀，抽干，至60℃以下干燥，既得粗品商陸皂甙元；(2)．商陸多糖提取工藝商陸片加75％乙醇5倍量0．5NNaoH，加熱回流2小時，同法提取三次；合并濾液濃縮成膏，加95％乙醇遂攪拌至沉淀，過夜，過濾，回收乙醇，連續(xù)2次；加水2倍量，用DEAE纖維素柱層析純化，連續(xù)柱層析純化2次，得純商陸多糖PEP—1；(三)、注射用甘草酸提取工藝甘草粉用12倍量0．5％氨水滲漏，滲漏液濃縮至原體積1／5過濾，濾液加濃硫酸至PH3，過濾析出的沉淀，水洗3次，60℃以下干燥，得粗甘草酸純品甘草酸提取以前述所得粗甘草酸400g，加4倍量工業(yè)酒精，加熱回流三小時，過濾，濾液加2倍量乙醇回流2次，合并回流液加10g活性炭，回流脫色半小時冷卻、過濾，濾液通氨氣至PH7—7．5，無固體析出為止；濾集沉淀，以少量乙醇洗滌，室溫干燥，得甘草酸銨250g，繼續(xù)用4倍量的80％乙醇，加熱溶解并用活性炭脫色，冷卻過濾，濾液濃縮，析出白色結(jié)晶，即為純甘草酸。
(四)、松果酸性多糖提純(1)、松果洗凈晾干，粉碎粗粉，500g加0．5NNaoH溶液4000ml，浸泡半小時，煎煮1小時，用4層紗布過濾，得第一次液；(2)、將藥渣加0．5NNaoH蒸餾水3000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第二次液；(3)、藥渣加0．5NNaoH蒸餾水溶液2000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第三次液；
(4)、前述三次的濾液合并濃縮成糖漿狀，放置，加95％乙醇，隨加隨攪拌至沉淀完全，放置過夜，回收乙醇，將所得液體再放置4小時后過濾，濾液縮成膏；(5)、提取物即為酸性多糖，若作靜脈注射用，再以水溶解，用DEAE纖維素柱層析二次純化既得純品；(五)、針劑制劑工藝(1)乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶，精制蓖麻毒蛋白純品每支含20mg另加等量0．1M半乳糖真空冷凍干燥即得；(2)、治療艾滋病和腫瘤的針劑制劑每瓶含商陸酸性多糖500mg，松果酸性多糖2000mg，甘草酸2500mg，用注射用水加至100ml，滅菌既得；(六)、緩釋膠囊制取蓖麻毒蛋白純品人用量1ml／kg／日，商陸皂甙純品，1mg／kg／日，商陸多糖10mg／kg／日，商陸毒蛋白純品，1mg／kg／日，松果酸性多糖40mg／kg／日，甘草蛋白50mg／kg／日；按人50kg體重計算以提取6種成份，每人日需蓖麻毒蛋白50mg／50kg／日，商陸皂甙50mg／50kg／日，商陸多糖500mg／50kg／日，商陸毒蛋白50mg／50kg／日，松果酸性多糖2000mg／50kg／日，甘草酸2500mg／50kg／日，共合計5150mg，分12個1號膠囊裝，每個膠囊裝429mg。
前述治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其中蓖麻毒蛋白提取工藝中第2步驟還可以是鹽分級沉淀法原糊狀物加硫酸銨至40％的飽合度，所以沉淀顏色較深，離心除去；母液加硫酸銨至50％的飽合度，收集此部分沉淀，但不純；母液再加硫酸銨至75％飽和度，所得蛋白質(zhì)沉淀較純。
前述治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其中注射用甘草酸提取工藝中粗甘草酸的提取也可用甘草浸膏提取，方法如下甘草浸膏3kg，加熱溶解于36升水中，冷至室溫，過攪拌邊滴加145ml濃硫酸；加完以后靜置數(shù)小時，濾集沉淀，用水充分洗滌，在60℃以下烘干，得粗甘草酸1．2kg，含量約為55％。
本發(fā)明效果如下
1、本藥創(chuàng)新組方合理由蓖麻毒蛋白、商陸多糖、松果酸性多糖、甘草酸銨，從各種文獻檢索從未見蓖麻毒蛋白用于臨床治人癌癥和艾滋病的報導(dǎo)，而臨床治顯效率、有效率很高，毒副作用很小。
2、該方所有藥物提取工藝先進純度高，所有毒副作用極小，特別蓖麻毒蛋白除乙醇反復(fù)提取外，并用DEAE纖維素柱層析兩次分級純化提取純度在99．9％以上。又經(jīng)2次反復(fù)檢驗，100％不含蓖麻因和蓖麻堿。由于用0．1M半乳糖阻礙蓖麻毒蛋白S—S鏈裂解后釋放出B結(jié)合鏈與細胞表面的碳水化合物受體結(jié)合，對無關(guān)癌細胞無抑制和殺傷作用。
另外商陸皂甙雖有很強抑制腫瘤活性，但有溶血反應(yīng)，所以只作膠囊口服，不用作針劑輸入。但商陸酸多糖提取物有抗腫瘤活性，作針劑輸注。所提取酸性多糖均經(jīng)乙醇反復(fù)提取并用DEAE纖維素(磷酸鹽型)柱層析兩次分級純化，純度達99．9％以上，所以副作用極小。
3、新的中藥提純合理組合乳糖酸蓖麻素蛋白干凍結(jié)晶由于蓖麻毒蛋白遇熱失去活性，所以低溫提取、干凍結(jié)晶，安瓶裝、密閉低溫保存。加半乳糖阻礙蓖麻毒蛋白S—S鏈裂解后釋放B鏈和細胞表面碳水化合物受體結(jié)合。對人正常細胞，無抑制和殺傷作用。商陸酸性多糖、松果酸性多糖、甘草酸銨三種多糖類提取物均有很強抗腫瘤和抗艾滋病活性，抗HIV—1逆轉(zhuǎn)錄和翻譯。三種多糖類而且無配伍禁忌，所以三種多糖同裝一液瓶，藥效穩(wěn)定，有協(xié)同作用。注射前將乳糖酸蓖麻毒蛋白干凍結(jié)晶，用水溶解后，加入艾瘤康注射液中搖勻后輸注。這樣藥物同進體內(nèi)，使甘草酸能阻止蓖麻毒蛋白熱源和過敏反應(yīng)，但抗腫瘤和抗HIV—1病毒作用更強。但注射乳糖酸蓖麻毒蛋白干凍結(jié)晶前，還需作皮試，陽性者勿用。單純的該治療艾滋病和腫瘤的注射液還可輸入體內(nèi)。
4、強有力的抑制殺傷腫瘤細胞作用，在治癌瘤方面，蓖麻毒蛋白、松果酸性多糖、甘草酸銨、商陸酸性多糖，均有很強的抗腫瘤活性抑制癌細胞的蛋白質(zhì)合成，核糖核酸延伸因子減少，脫氧核糖核酸失活，抑制和殺傷腫瘤靶細胞。有較強選擇性殺傷作用，特別是蓖麻毒蛋白在半乳糖存在時10—9—10—10M，免疫毒素(79Ricin)能殺死99．9％Nalm—1靶細胞。對卡波濟氏肉瘤有強的殺傷作用，但對人體正常細胞無明顯抑制和殺傷作用。
5、很強抗HIV作用在治療艾滋病(HIV—1)方面松果酸性多糖、甘草酸銨、商陸酸性多糖、蓖麻毒蛋白，均有很強的殺傷和抑制HIV—1復(fù)制、增殖。特別是松果提取多糖，PC6能抑制CEM細胞中HIV—1蛋白的表達，PC6能夠抑制HIV—1在CEM細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。PC6誘導(dǎo)HIV—1抑制因子是一種新的免疫活性物質(zhì)。甘草酸抑制和殺傷HIV細胞，0．5mg／ml可使98％HIV—1增殖受到抑制。
6、本方藥力強勁，對免疫系統(tǒng)有很強的調(diào)節(jié)作用有細胞免疫和體液免疫抑制作用和免疫增強作用，雙方調(diào)節(jié)作用，能誘生r—干攏素(IFN—r)白細胞介素Ⅱ(IL—2)，白細胞介素—3(IL—3)，a腫瘤壞死因子(TNF—a)、B—轉(zhuǎn)化因子(TBF—B1)，HTV—1抑制因子，自然殺傷細胞(NK細胞)，這些免疫活性物質(zhì)對調(diào)節(jié)免疫，抑制癌瘤，抑制HTV有顯著作用。
7、抗菌、抗真菌、抑制病毒作用能抑制金葡菌、鏈球菌、真菌和病毒作用，特別對癌瘤合并細菌、病毒、感染和HIV—1合并各類細菌、真菌、病素感染有很強抑制殺傷作用。HTV—1卡氏肺囊蟲性肺炎有強的治療作用。
8、本方藥有很強解毒作用、抗過敏作用能解除各種癌瘤產(chǎn)生的毒素，細菌感染引起的外毒素和內(nèi)素毒素、HIV—1卡氏肺囊蟲性肺炎有強的治療作用。另甘草酸能解除蓖麻毒蛋白對人體毒副作用，并有抗過敏作用。
9、中藥服法的創(chuàng)新四種藥物組成的膠囊，按50kg體重計算日需藥量，日一次或分次服用，由于按癌細胞和HTV生長增殖周期，所以2—3天服藥1天，或2—3天靜脈輸注一天，這樣用藥既減少毒性反應(yīng)，使間歇期1—2天正常細胞又恢復(fù)活性、增殖、分泌IFN—r、IL—2、NK、TNF—a等，又增強了免疫功能。
10、該藥藥源廣，價格低廉，而療效高，毒副作用小，便于推廣應(yīng)用。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例一
備好蓖麻、商陸、甘草、松果按以下工藝步驟制取治療艾滋病和腫瘤的藥劑(一)、蓖麻毒蛋白提取工藝先剝?nèi)ケ吐橥庥矚ぃ瑢咨疏瞥珊隣?，除去蓖麻?1)、在12℃以下加入3倍量乙醇浸4小時后離心，取其沉淀，以水捏溶，水溶液冰凍干燥即得粗制品，粗制品水溶液濾除不溶物，加適量酒精，放置片刻，濾除沉淀，母液再加入少量乙醇至微顯混濁，放冰箱里析出結(jié)晶，必要時再重結(jié)晶；(2)、酒精分級沉淀法蓖麻糊加3倍量乙醇，有沉淀析出，離心除去；再于此母液加1倍量乙醇，離心收集此部分沉淀，但仍含雜質(zhì)，再于此母液加1倍量乙醇，則析出的蛋白質(zhì)較純，沉淀用水溶解，冰凍干燥即得成品；(3)、注射用乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶的制取要求前述蛋白質(zhì)純度達99．9％以上時，以水溶解，用DEAE—纖維素柱層析的方法純化二次即得純品結(jié)晶，加0．1M半乳糖酸真空冷凍干燥即得；所得純品蓖麻毒蛋白，須100％不含蓖麻因和蓖麻堿；(二)、(1)．商陸皂甙提取工藝商陸根薄片加水提取三次，第一次加8倍量，煮沸4小時過濾，第二、三次加4倍量水，煮沸2小時，過濾、濾液合并，濃縮止藥的五倍量，取濃硫酸慢慢加到濃縮液中，邊加邊攪拌，濃縮液1000ml加硫酸40g，加完后，煮至微沸4小時，放冷，倒入等量冷水中，攪勻，放置過夜，棄去上清液，殘液即沉淀過濾，沉淀用水洗至PH值為6左右，濾集沉淀，抽干，至60℃以下干燥，既得粗品商陸皂甙元；(2)．商陸多糖提取工藝商陸片加75％乙醇5倍量0．5NNaoH，加熱回流2小時，同法提取三次；合并濾液濃縮成膏，加95％乙醇遂攪拌至沉淀，過夜，過濾，回收乙醇，連續(xù)2次；加水2倍量，用DEAEN纖維素柱層析純化，連續(xù)柱層析純化2次，得純商陸多糖PEP—1；
(三)、注射用甘草酸提取工藝甘草粉用12倍量0．5％氨水滲漏，滲漏液濃縮至原體積1／5過濾，濾液加濃硫酸至PH3，過濾析出的沉淀，水洗3次，60℃以下干燥，得粗甘草酸純品甘草酸提取以前述所得粗甘草酸400g，加4倍量工業(yè)酒精，加熱回流三小時，過濾，濾液加2倍量乙醇回流2次，合并回流液加10g活性炭，回流脫色半小時冷卻、過濾，濾液通氨氣至PH7—7．5，無固體析出為止；濾集沉淀，以少量乙醇洗滌，室溫干燥，得甘草酸銨250g，繼續(xù)用4倍量的80％乙醇，加熱溶解并用活性炭脫色，冷卻過濾，濾液濃縮，析出白色結(jié)晶，即為純甘草酸。
(四)、松果酸性多糖提純(1)、松果洗凈晾干，粉碎粗粉，500g加0．5NNaoH溶液4000ml，浸泡半小時，煎煮1小時，用4層紗布過濾，得第一次液；(2)、將藥渣加0．5NNaoH蒸餾水3000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第二次液；(3)、藥渣加0．5NNaoH蒸餾水溶液2000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第三次液；(4)、前述三次的濾液合并濃縮成糖漿狀，放置，加95％乙醇，隨加隨攪拌至沉淀完全，放置過夜，回收乙醇，將所得液體再放置4小時后過濾，濾液縮成膏；(5)、提取物即為酸性多糖，若作靜脈注射用，再以水溶解，用DEAE纖維素柱層析二次純化既得純品；(五)、針劑制劑工藝(1)、乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶，精制蓖麻毒蛋白純品每支含20mg另加等量0．1M半乳糖真空冷凍干燥即得；(2)、治療艾滋病和腫瘤的針劑制劑每瓶含商陸酸性多糖500mg，松果酸性多糖2000mg，甘草酸2500mg，用注射用水加至100ml，滅菌既得；
(3)、將前述乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶20—60mg，加注射用水2—6ml，或按需要量加入治療艾滋病和腫瘤的針劑中；(六)、緩釋膠囊制取蓖麻毒蛋白純品人用量1ml／kg／日，商陸皂甙純品，1mg／kg／日，商陸多糖10mg／kg／日，商陸毒蛋白純品，1mg／kg／日，松果酸性多糖40mg／kg／日，甘草蛋白50mg／kg／日；按人50kg體重計算以提取6種成份，每人日需蓖麻毒蛋白50mg／50kg／日，商陸皂甙50mg／50kg／日，商陸多糖500mg／50kg／日，商陸毒蛋白50mg／50kg／日，松果酸性多糖2000mg／50kg／日，甘草酸2500mg／50kg／日，共合計5150mg，分12個1號膠囊裝，每個膠囊裝429mg。
實施例二其它步驟相同，區(qū)別處為前述蓖麻毒蛋白提取工藝中第2步驟是鹽分級沉淀法原糊狀物加硫酸銨至40％的飽合度，所以沉淀顏色較深，離心除去；母液加硫酸銨至50％的飽合度，收集此部分沉淀，但不純；母液再加硫酸銨至75％飽和度，所得蛋白質(zhì)沉淀較純。
前述注射用甘草酸提取工藝中粗甘草酸的提取用甘草浸膏提取，方法如下甘草浸膏3kg，加熱溶解于36升水中，冷至室溫，過攪拌邊滴加145ml濃硫酸；加完以后靜置數(shù)小時，濾集沉淀，用水充分洗滌，在60℃以下烘干，得粗甘草酸1．2kg，含量約為55％。
按前述實施例制取的治療艾滋病和腫瘤的藥劑，其藥理、監(jiān)床應(yīng)用、素副作用如下一、本方劑藥理作用1、抗腫瘤作用能抑制腫瘤、癌蛋白質(zhì)的合成，抑制腫瘤靶細胞合成，對癌細胞有先擇性殺傷用用，對白血病、宮頸癌U14、肉瘤S180，艾氏腹水癌、腹水肝癌、肺癌細胞株HIV—1引起卡波濟肉瘤(Kaposi)均有抑制和殺傷作用。
2、抗艾滋病毒(HIV—1)作用該藥對HIV—1的增殖和復(fù)制有很強抑制作用，能抑制CEM細胞HIV—1的表達，又能抑制HIV—1在CEM細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平對LTR引導(dǎo)DNA基因表達也有很強抑制作用。
3、對免疫系統(tǒng)作用(1)抗過敏作用甘草酸能抑制蓖麻毒蛋白引起過敏反應(yīng)和對肝、脾、心、腎的損害。
(2)對免疫有雙向調(diào)節(jié)作用。
(3)有很強的免疫抑制作用。
(4)增強和誘生淋巴細胞分沁白細胞介素—2(IL—2)和r—干攏素(IFN—r)。促進脾細胞DNA和蛋白質(zhì)合成，和脾細胞產(chǎn)生IFN—r。
(5)能誘生巨噬細胞激活因子(GM—CSF)白細胞介素—3(IL—3)。B—轉(zhuǎn)化因子(TGF—B1)，a—腫瘤壞死因子(TNF—a)。
二、單味藥理作用(一)1．商陸對免疫系統(tǒng)影響(1)刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用①商陸有絲分裂原能促進淋巴T細胞和B細胞轉(zhuǎn)化、分裂、增殖。②商陸糖蛋白(PWM)、T和B細胞在巨噬細胞存在下，對PHA和PWM都有反應(yīng)產(chǎn)生干擾素(IFN)。③商陸多糖—1或商陸多糖—2(PEP—1)能誘導(dǎo)淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖。
(2)誘生干擾素作用①商陸有絲分源，刀豆素A能誘導(dǎo)白細胞產(chǎn)生干擾素(IFN)。②商陸糖蛋白(PWM)、T和B細胞在巨噬細胞存在下，對PHA和PWM都能反應(yīng)產(chǎn)生干攏素(IFN)。③商陸皂甙(ES)對脾細胞胞誘生干擾素—r(IFN—r)。④商陸多糖Ⅰ(PEP—Ⅰ)能誘生巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素Ⅰ(IT—Ⅰ)。能誘生脾細胞產(chǎn)生白細胞介素Ⅱ(IL—2)、PEP—Ⅰ或Ⅱ刺激脾細胞產(chǎn)生集落刺激因子(CSF)(CSF為IL—3)。
(3)對肝脾組織3H胸腺嘧啶核苷體內(nèi)摻入影響商陸皂甙(SE)是一種激活核苷酸還原酶的生物活動物質(zhì)，PWM亦能刺激B細胞對胞腺核苷的活力。因而促進DNA的代謝。增強細胞免疫功能。
2、抗腫瘤作用
(1)商陸皂甙誘生r—干擾素(IFN—r)白細胞介素—2及淋巴毒素(IT)。含這些淋巴因子制品，對人肺癌細胞株(SPC—3)。人T淋巴細胞白血病細胞株(Jurkat及Moit—4細胞)，人宮頸癌細胞株(Hela細胞)、人肝癌細胞株(SMMC—7721)等均有細胞毒作用。對人正常細胞(WISH)無毒性作用。
(2)商陸皂甙辛(EH)和脂多糖(IPS)能分泌腫瘤壞死因子(TNF)是一種殺傷腫瘤細胞的細胞因子。
(3)商陸多糖(PEP—1)激活巨噬細胞(Mφ)和啟動誘生TNF是其抗腫瘤作用，抑瘤率達51．7％。通過增強T細胞功能來抑制腫瘤生長。
3、抗炎、抗菌、抗病毒(1)①商陸抗病毒蛋白(PAP)能顯著改善和增強IgG作用。②商陸皂甙對多種急慢性炎癥有明顯抑制作用，并能降低毛細血管通透性。③商陸提取三萜酸消炎作用強度與氫化可的松相似。④皂甙E及加利果酸有明顯的抗炎作用。
(2)抗病毒作用商陸所含抗病毒蛋白(PAP)和糖蛋白(PWM)對艾滋病毒、脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型病毒、抗煙花葉病毒有較強的抗病毒活性。
4、商陸有解熱、鎮(zhèn)痛、肌肉松弛作用。
5、商陸藥代動力學(xué)研究小鼠4天腹腔注射商陸多糖Ⅰ，誘生腫瘤壞死因子(TNF)的達峰時間是二次注射后的第8天，商陸皂甙辛誘導(dǎo)的TNF分泌隨時間延常而逐漸增多，于24小時左右達峰。
6、商陸毒副作用垂序商陸提取的酸性甾體皂甙，小鼠腹腔注藥LD50為65mg／kg。煎劑小鼠灌胃每日5g／kg連續(xù)3周，動物體重及狀態(tài)無明顯變化，動物處死后，心、肝、肺、腎未歲明顯改變。
(二)蓖麻子所含蓖麻毒蛋白(蓖麻毒素)(1)、抗腫瘤作用蓖麻毒蛋白可強烈抑制各種癌細胞的蛋白質(zhì)合成，中等強度抑制DNA合成，而對RNA合成抑制作用輕微，而是強烈抑制真核生物核蛋白體的蛋白質(zhì)合成。具有針對B細胞類1a抗原特異反應(yīng)性Mab—737蓖麻毒蛋白通過二硫鍵連接成免疫毒素蓖麻毒蛋白—737蓖麻毒蛋白通過二硫鍵連接成免疫毒素蓖麻毒蛋白—737(ricin—737)體外0．1M乳糖存在時，此免疫素素(IT)對含B細胞抗原的Burkitt氏淋巴瘤細胞系Rajj細胞表現(xiàn)出選擇性地強力殺傷，不含靶抗原的無殺傷作用。免疫毒素1h就可抑制靶細胞增殖，隨時間延長殺傷更顯著。對腫瘤靶細胞顯示選擇性殺傷作用，對靶細胞蛋白質(zhì)合成抑制率71％。蓖麻毒蛋白對小鼠艾氏腹水癌，腹水肝癌，宮頸癌U14、肉溜S180，白血病等移植性腫瘤均有一定治療作用；于接種后1，3b腹腔注射7．5mg／kg，能夠完全抑制艾氏腹腔水癌細胞生長；1次腹腔腔注射25mg／kg，48小時后可使癌細胞減少90％，96小時后幾乎所有癌細胞形態(tài)改變細胞核膨脹，核心出現(xiàn)空泡，有絲分裂停止，胞漿暗染，周圍出現(xiàn)不規(guī)則空泡等。
蓖麻毒蛋白具有二個肽鏈，由S—S鏈組成，發(fā)生作用前有一個裂解過程，裂解后釋放出A鏈——效應(yīng)鏈，B鏈為結(jié)合鏈；A鏈或整個毒蛋白分子通過質(zhì)膜進入胞漿，與核蛋白60—S亞基發(fā)生作用，抑制氨基酰t—RNA與核蛋白體的酰結(jié)合，使核酸的延伸因子減少，核酸失活，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細胞死亡，B鏈可與細胞表面的碳水化合物結(jié)合；B鏈用0．1M半乳糖封閉其B鏈的細胞結(jié)合點后，具有高度特異的強靶細胞殺傷活性。
免疫毒素(IT)是較理想的一類腫瘤定向治療藥物蓖麻素蛋白與阿霉素偶聯(lián)到一個抗人膀胱癌單克隆抗體分子上構(gòu)建了第一個具有雙彈頭的抗腫瘤導(dǎo)向藥物，在0．1mol／L半乳糖存在下，對無關(guān)癌細胞無殺傷作用，對人膀胱癌BIU—87及E—J細胞的殺傷用用比McSb—Ricin強10倍，比McAb—Abuiamycin強3萬倍。具有高度特異強殺傷腫瘤靶細胞活性。
(2)、對免疫功能影響對體液免疫和細胞免疫有很強的抑制作用。
(3)、致敏作用蓖麻毒蛋白有嚴重過敏反應(yīng)，其發(fā)生率85．11％。
(4)、毒副作用蓖麻子所含蓖麻因(ricin)7mg或蓖麻堿(ticinine)0．16g既可使成人死亡。此二種成份加熱既被破壞。但經(jīng)柱層析反復(fù)純化得到純品蓖麻毒蛋白99．9％以上，無此毒性成份。
急性亞急性毒性作用蓖麻毒蛋白對小鼠1次靜注LD50為6—12mg，但對小鼠的LD50報導(dǎo)各異，多數(shù)報導(dǎo)較上述LD50為大，乃是樣品純度差異所致，經(jīng)DEAE纖維素分級純化的蓖麻毒蛋白各樣、品，對大鼠一次毒脈注射的LK50為50—150mg／kg，另報導(dǎo)蓖麻毒蛋白對小鼠一次靜注的LD50為47．97mg／kg，對家兔一次靜注的MTK為3．2mg／kg，對家兔靜注每日一次連續(xù)16次的MTD為1．6mg／kg。
蓖麻毒蛋白對小鼠有劇毒，對遺傳物質(zhì)也有影響。
(三)甘草所含甘草酸(甘草甜素)甘草皂甙、甘草黃酮。
1、對免疫系統(tǒng)影響(1)抗過敏反應(yīng)作用甘草所提取復(fù)合體(LX)含有蛋白質(zhì)、核酸、多糖、甘草酸有較好的抗過敏作用，對小鼠過敏性休克也有保護作用，對過敏性休克和死亡抑制率在95％以上。甘草酸25～50mg／kg能顯著抑制過敏反應(yīng)，能阻止過敏介質(zhì)釋放。
(2)對非特異性免疫功能影響①甘草甜素能增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)活性，使白細胞總數(shù)增加嗜中性白細胞，單核細胞增加更明顯，有刺激巨噬細胞吞噬作用。②對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)及自然殺傷細胞活性有顯著增強。
(3)對抗體產(chǎn)生的影響①甘草酸能使抗體顯著增加，30mg／kg可使抗體產(chǎn)生顯著增強。②對抗體產(chǎn)生抑制作用，甘草抑制1gE合成是T細胞介導(dǎo)的，且與CD8+細胞有關(guān)。③甘草對抗體產(chǎn)生雙向作用即對正常病源的反應(yīng)有增強作用，對反常的過敏反應(yīng)則呈抑制作用。
(4)對補體影響甘草酸肌注對CP50和AP50均能抑制50％溶血，能抑制補體反應(yīng)，相關(guān)炎癥過程緩解和靜止。
(5)對白細胞介素—2的產(chǎn)生和誘生干擾素作用甘草酸100ug／ml明顯促進刀豆蛋白A(ConA)活化的脾細胞DNA和蛋白質(zhì)的生物合成，DNA合成高峰48小時。對白細胞介素2(IL—2)產(chǎn)生明顯增強作用，甘草酸能增強ConA誘導(dǎo)淋巴細胞分泌IL—2。并可增強ConA誘導(dǎo)淋巴細胞分泌r—干擾素(IFN—r)，可提高脾細胞產(chǎn)生IFN—r為主。
(6)對前列腺素對前列腺素有雙向調(diào)節(jié)作用。
(7)對自然殺傷細胞(NK)活性有顯著增強作用，對機體免疫有重要調(diào)節(jié)作用。
2．抗艾滋病毒(HIV)的作用(1)甘草皂甙0．5mg／ml對HIV的增殖抑制98％以上，50％空斑形成抑制值0．125mg／ml，但不能抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄，是通過恢復(fù)T細胞發(fā)揮作用。
(2)甘草甜素抑HIV增殖抑制率78．81％，能破壞HIV細胞。
(3)甘草酸0．5mg／ml可使98％HIV增殖受到抑制，0．125mg／ml溶液可使50％HIV增殖受到抑制。
(4)甘草黃酮類抗HIV作用有極好的抗HIV作用，甘草中有3種黃酮成份對HIV增殖的抑制作用是甘草甜素的25倍。
(5)甘草多糖有抗水泡性口炎病毒、腺病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒。
3．抗菌作用甘草酸和次酸對金葡菌、結(jié)核桿菌、大腸桿菌、阿米巴原蟲、滴蟲均有抑制作用，6．25—12．5ug／ml能完全抑制細菌生長。
4．抗腫瘤、抗癌作用(1)甘草酸對大鼠腹水肝癌及艾氏腹水癌，吉田肉瘤均有抑制作用。
(2)甘草次酸對骨髓瘤、腹水肝癌、白血病有抑制作用。
(3)甘草甜素有明顯抑制黃曲霉素所致肝癌、吉田肉瘤、腹水肝癌、艾氏腹水癌。
(4)甘草皂甙對鼠腹水肝癌、艾氏腹水癌均有抑制作用。
5．抗腫瘤作用機理甘草甜素有增強小鼠巨噬細胞中一氧化氮產(chǎn)生作用，這種作用對抑制腫瘤增殖有明顯作用，甘草甜素引起巨噬細胞，以脂多糖(LPS)進行刺激產(chǎn)生一氧化氮，而抑制腫瘤增殖。
6．甘草復(fù)合體(LX)對心、肝、腎、內(nèi)分泌腺均有保護和解毒作用，各種毒素和藥物所致心律失常有保護作用，使心臟收縮力加強，對各種藥物和毒素所致肝腎損傷有保護作用，防傷害作用。
(四)油松果所含活性的酸性多糖類。
1．對免疫系統(tǒng)的影響Parvifiorb Sieb et Zucc的提取物具有多種免疫活性，多糖類物質(zhì)能夠激活小鼠巨噬細雨胞，熱水提取物能提高FC受體活性，酸性多糖能顯著刺激小鼠、大鼠離體脾紅胞DNA的合成，對白細胞DNA合成也有一定刺激作用。酸性多糖有免疫促進作用。
2．抗AIDS病毒作用Pinus Parvitora Sieb et Zucc的提取物PC6經(jīng)體外實驗收，能抑制HIV的復(fù)制，對感染的HIV—1的CEM細胞，PC6均能依劑量抑制HIV—1的復(fù)制，使病毒繁殖受到抑制，3mg／ml最小濃度抑制效果達到80％，對U937人淋巴細胞中的HIV—1也顯示明顯的抑制作用，PC6能抑制HIV—1蛋白的表達，但對于轉(zhuǎn)錄后水平的HIV—1蛋白無明顯影響，PC6能抑制HIV—1蛋白的表達，但參于轉(zhuǎn)錄后水平的HIV—1蛋白無明顯影響，PC6能抑制HIV—1在CEM細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平對LTR引導(dǎo)DNA基因表達也有抑制作用。另有報導(dǎo)PC6能誘導(dǎo)T細胞(CEM)產(chǎn)生一種對胃蛋白酶敏感的可溶性物質(zhì)，該物質(zhì)是PC6產(chǎn)生抑制HIV—1復(fù)制作用的原因，這種PC6誘導(dǎo)的HIV—1抑制因子與已知的粒細胞巨噬細胞激活因子(GM—CSF)，細胞介素—3(IL—3)B—轉(zhuǎn)化因子(TGF—B1)與a腫瘤壞死因子(TNF—a)對抗HIV—1均有協(xié)同作用。PC6誘導(dǎo)的這種抗HIV—1物質(zhì)可能是一種新的免疫活性物質(zhì)。
3．抗腫瘤作用Parvifiora Sied et Zucc中提取的酸性多糖有抗腫瘤作用，能依劑量依賴地抑制植入小鼠的肉瘤及腹水癌細胞生長，顯著延常小鼠存活時間，抗腫瘤大小酸性強度有關(guān)，NaoH提取物的酸性多糖，抗腫瘤活性最強，最明顯抑制肉瘤細胞生長，甚至引起腫瘤退化和壞死。油松所含木質(zhì)素類物對小鼠乳腺癌中細胞增生酶系的活性有抑制作用，175mg／0．1Mi＼0．9％鹽水、I、V、對患病的SHV小鼠瘤細胞中胸腺密嘧脫氧核苷酸合成酶、胸腺密喧脫氧核苷激酶等有顯著降低活性作用。同時防止腫瘤潰爛，又有防止乳腺結(jié)節(jié)性增生的生長、發(fā)育。本質(zhì)素有一定搞癌活性。
4．松提取物大劑量使動物睡眠及麻醉用。果實口服有系統(tǒng)性變態(tài)反應(yīng)的報導(dǎo)。
(五)綜上所述1、抗癌作用商陸多糖皂甙蓖麻毒蛋白；甘草酸、皂甙、黃酮、多糖；松果所含活性的多糖類、酸性多糖均有抗癌、抗腫瘤活性的協(xié)同作用，松果酸多糖和甘草酸封閉蓖麻毒蛋白裂解后釋放的B鏈的細胞結(jié)合點后，具有高度特異的強靶細胞殺傷作用。2、抗艾滋病毒(HIV—1)作用四藥的提取成份抗HIV—1有協(xié)同作用。3、有免疫調(diào)節(jié)作用(雙向調(diào)節(jié)、抑制反應(yīng)、免疫增強作用)。4、甘草有解毒作用甘草提取復(fù)合物LX能解除蓖麻毒蛋白對心血管、呼吸系統(tǒng)、皮膚等強過敏返反應(yīng)，甘草提取LX可保護心、肝、腎血管組織、調(diào)節(jié)心律失常和呼吸系統(tǒng)的保護作用，能解除蓖麻毒蛋白對白細胞、淋巴細胞、呼吸功能的抑制，并能降低細胞耗氧量，增加細胞呼吸功能。甘草酸防止蓖麻毒蛋白對肝細胞的破壞和小腸的損傷。甘草酸能保護腦組織，腎上腺、垂體、胸腺、睪丸、卵巢、胰腺及淋巴組織等發(fā)生出血性壞死和退行性變，還能保護網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、神經(jīng)節(jié)、胸壁從的外圍神經(jīng)細胞核染色質(zhì)破壞，并有很強的保腎和防傷害功能。
權(quán)利要求
1.一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑，其特征在于其方劑由蓖麻、商陸、甘草、松果組成。
2.一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其特征在于工藝步驟如下(一)、蓖麻毒蛋白提取工藝先剝?nèi)ケ吐橥庥矚?，將白色仁杵成糊狀，除去蓖麻?1)、在12℃以下加入3倍量乙醇浸4小時后離心，取其沉淀，以水捏溶，水溶液冰凍干燥即得粗制品，粗制品水溶液濾除不溶物，加適量酒精，放置片刻，濾除沉淀，母液再加入少量乙醇至微顯混濁，放冰箱里析出結(jié)晶，必要時再重結(jié)晶；(2)、酒精分級沉淀法蓖麻糊加3倍量乙醇，有沉淀析出，離心除去；再于此母液加1倍量乙醇，離心收集此部分沉淀，但仍含雜質(zhì)，再于此母液加1倍量乙醇，則析出的蛋白質(zhì)較純，沉淀用水溶解，冰凍干燥即得成品；(3)、注射用乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶的制取要求前述蛋白質(zhì)純度達99．9％以上時，以水溶解，用DEAE—纖維素柱層析的方法純化二次即得純品結(jié)晶，加0．1M半乳糖酸真空冷凍干燥即得；所得純品蓖麻毒蛋白，須100％不含蓖麻因和蓖麻堿；(二)、(1)．商陸皂甙提取工藝商陸根薄片加水提取三次，第一次加8倍量，煮沸4小時過濾，第二、三次加4倍量水，煮沸2小時，過濾、濾液合并，濃縮止藥的五倍量，取濃硫酸慢慢加到濃縮液中，邊加邊攪拌，濃縮液1000ml加硫酸40g，加完后，煮至微沸4小時，放冷，倒入等量冷水中，攪勻，放置過夜，棄去上清液，殘液即沉淀過濾，沉淀用水洗至PH值為6左右，濾集沉淀，抽干，至60℃以下干燥，既得粗品商陸皂甙元；(2)．商陸多糖提取工藝商陸片加75％乙醇5倍量0．5NNaoH，加熱回流2小時，同法提取三次；合并濾液濃縮成膏，加95％乙醇遂攪拌至沉淀，過夜，過濾，回收乙醇，連續(xù)2次；加水2倍量，用DEAE纖維素柱層析純化，連續(xù)柱層析純化2次，得純商陸多糖PEP—1；(三)、注射用甘草酸提取工藝甘草粉用12倍量0．5％氨水滲漏，滲漏液濃縮至原體積1／5過濾，濾液加濃硫酸至PH3，過濾析出的沉淀，水洗3次，60℃以下干燥，得粗甘草酸純品甘草酸提取以前述所得粗甘草酸400g，加4倍量工業(yè)酒精，加熱回流三小時，過濾，濾液加2倍量乙醇回流2次，合并回流液加10g活性炭，回流脫色半小時冷卻、過濾，濾液通氨氣至PH7—7．5，無固體析出為止；濾集沉淀，以少量乙醇洗滌，室溫干燥，得甘草酸銨250g，繼續(xù)用4倍量的80％乙醇，加熱溶解并用活性炭脫色，冷卻過濾，濾液濃縮，析出白色結(jié)晶，即為純甘草酸。(四)、松果酸性多糖提純(1)、松果洗凈晾干，粉碎粗粉，500g加0．5NNaoH溶液4000ml，浸泡半小時，煎煮1小時，用4層紗布過濾，得第一次液；(2)、將藥渣加0．5NNaoH蒸餾水3000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第二次液；(3)、藥渣加0．5NNaoH蒸餾水溶液2000ml，煎煮40分鐘，4層紗布過濾，得第三次液；(4)、前述三次的濾液合并濃縮成糖漿狀，放置，加95％乙醇，隨加隨攪拌至沉淀完全，放置過夜，回收乙醇，將所得液體再放置4小時后過濾，濾液縮成膏；(5)、提取物即為酸性多糖，若作靜脈注射用，再以水溶解，用DEAE纖維素柱層析二次純化既得純品；(五)、針劑制劑工藝(1)、乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶，精制蓖麻毒蛋白純品每支含20mg另加等量0．1M半乳糖真空冷凍干燥即得；(2)、治療艾滋病和腫瘤的針劑制劑每瓶含商陸酸性多糖500mg，松果酸性多糖2000mg，甘草酸2500mg，用注射用水加至100ml，滅菌即得；(3)、將前述乳糖酸蓖麻毒蛋白干冷凍結(jié)晶20—60mg，加注射用水2—6ml，或按需要量加入治療艾滋病和腫瘤的針劑中；(六)、緩釋膠囊制取蓖麻毒蛋白純品人用量1ml／kg／日，商陸皂甙純品，1mg／kg／日，商陸多糖10mg／kg／日，商陸毒蛋白純品，1mg／kg／日，松果酸性多糖40mg／kg／日，甘草蛋白50mg／kg／日；按人50kg體重計算以提取6種成份，每人日需蓖麻毒蛋白50mg／50kg／日，商陸皂甙50mg／50kg／日，商陸多糖500mg／50kg／日，商陸毒蛋白50mg／50kg／日，松果酸性多糖2000mg／50kg／日，甘草酸2500mg／50kg／日，共合計5150mg，分12個1號膠囊裝，每個膠囊裝429mg。
3.如權(quán)利要求2所述的治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其特征在于所述蓖麻毒蛋白提取工藝中第2步驟還可以是鹽分級沉淀法原糊狀物加硫酸銨至40％的飽合度，所以沉淀顏色較深，離心除去；母液加硫酸銨至50％的飽合度，收集此部分沉淀，但不純；母液再加硫酸銨至75％飽和度，所得蛋白質(zhì)沉淀較純。
4.如權(quán)利要求2所述的治療艾滋病和腫瘤的藥劑的制備方法，其特征在于所述注射用甘草酸提取工藝中粗甘草酸的提取也可用甘草浸膏提取，方法如下甘草浸膏3kg，加熱溶解于36升水中，冷至室溫，過攪拌邊滴加145ml濃硫酸；加完以后靜置數(shù)小時，濾集沉淀，用水充分洗滌，在60℃以下烘干，得粗甘草酸1．2kg，含量約為55％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療艾滋病和腫瘤的藥劑及其制備方法,它由蓖麻、商陸、甘草、松果,組成其主要方劑,采用提取商陸皂甙、提取商陸多糖、提取蓖麻毒蛋白、提取注射用甘草酸、提純松果酸性多糖、等多個工藝步驟,最后制取針劑和緩釋膠囊,對艾滋病毒和腫瘤細胞具有極強的殺傷力,無毒副作用,臨床應(yīng)用效果明顯,使用安全。
文檔編號A61P35/00GK1279107SQ9912755
公開日2001年1月10日 申請日期1999年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月30日
發(fā)明者辛耀祿 申請人:辛耀祿