專利名稱：亞單位抗原微乳劑疫苗的制造方法
技術領域：
本發明涉及生物制品一疫苗制造領域，一種用于亞單位抗原的微乳劑疫苗制造技術。
亞單位抗原是指由病原微生物提取或通過生物工程技術制備的一種有效保護性抗原成份。由于在制備過程中除去了對保護性免疫無效的成份，用其制備的疫苗能夠產生更為特異的免疫反應，是目前疫苗研究的方向之一。但是，由于亞單位抗原一般是分子量較小的純化抗原成份，雖然能夠產生更為特異的免疫反應，但由于抗原性較弱，必須與有效的佐劑配合使用，才能獲得理想的免疫效果。目前對亞單位蛋白抗原效果較好的佐劑是用Qui/A制備的免疫刺激復合物。這種佐劑雖然有良好的佐劑效果，但由于其原材料Qui/A來源于南美的一種樹皮，產量有限，而且價格昂貴。另外在制備免疫刺激復合物疫苗時，必須加入去污劑，而且要經超速離心進行純化，工藝過程繁雜，不適于大批量工業化生產。
本發明的目的是為了研制更為有效、而且來源方便、制造工藝簡便的亞單位疫苗佐劑用于生產疫苗。
本發明的實施方案是采用由中國的一種植物提取的植物糖苷作為主要成份與膽固醇經超聲處理制備成功一種微乳劑佐劑。將該微乳劑與提取的病原微生物亞單位抗原按一定比例混合，制成亞單位微乳劑疫苗，并通過對新城疫病毒外膜蛋白及禽巴氏桿菌亞單位抗原的試驗，來驗證其免疫增強和佐劑作用。
本發明的具體實施步驟為，由中國草藥皂角用水浸法提取皂角苷，經澄清后，經噴霧干燥(出口溫度為80～120℃)為皂角苷粉。在制備微乳劑基質時，將皂角苷粉用蒸鎦水配成5mg/ml的皂角苷溶液；將膽固醇用氯仿配成100mg/ml的膽固醇溶液。在超聲過程下，按照1∶100(V/V)將以上膽固醇溶液緩慢加到皂角苷溶液中，繼續超聲至混合液呈白色乳狀液。再于減壓條件下抽除氯仿，并以5000r/min離心20min，除去沉淀物后的上部液體再經20000r/min離心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液將沉淀稀釋至原溶液體積而成微乳劑，按終濃度1/萬加入硫柳汞防腐。
在制備亞單位微乳劑疫苗時，將提取的亞單位抗原按2mg/ml的濃度加入微乳劑中，即成為亞單位微乳劑疫苗。
在對新城疫病毒外膜蛋白制備的新城疫亞單位微乳劑疫苗的試驗中，將新城疫病毒外膜蛋白加入制備的微乳劑中，使蛋白(即亞單位抗原)濃度為2mg/ml，免疫小白鼠，免疫后90天，亞單位微乳劑疫苗組，HI抗體效價仍可達到1∶128。而僅注射同樣劑量外膜蛋白組，在免疫后20天HI抗體效價只有1∶8，30天后即轉為陰性。
在3批禽霍亂亞單位微乳劑疫苗的安全實驗中注射10日齡無特定病原(SPF)雞，每只胸部肌肉注射1ml禽霍亂亞單位微乳劑疫苗，未見任何不良反應。在效力試驗中，用該禽霍亂亞單位微乳劑疫苗免疫1月齡SPF雞，每只肌肉注射1ml，并于10天后再用相同劑量和方法進行第二次免疫接種。經第二次免疫后30天，用禽源多殺性巴氏桿菌強毒進行攻擊，保護率可達到100％，而同樣劑量的油佐劑滅活疫苗免疫組只有60％。在免疫期試驗中，經兩次免疫的雞，于第二次免疫后60天用禽源多殺性巴氏桿菌強毒攻擊，保護率為80％～100％，免疫后6個月，保護率仍可達到60％。
在對禽源大腸桿菌的試驗中，將禽源大腸菌菌毛抗原與制備的微乳劑基質制成亞單位微乳劑疫苗。用此疫苗免疫SPF雞后15天采血測定凝集抗體，免疫組100％轉為陽性，而油佐劑免疫組只有66％轉為陽性。
微乳狀液是一種具有高度穩定性的溶液，其物理性狀介于乳狀液與膠團溶液之間，其質點直徑小于0.1μm，除穩定性高外，由于表面積的增加，對溶液中的溶質有更高的分散能力和吸附性。采用的皂角苷本身具有免疫增強作用，將其與膽固醇經超聲處理制成微乳劑后，對于蛋白抗原具有很強的吸附性能，從而使蛋白抗原分子聚集成具有多個抗原決定簇的顆粒、增加對免疫細胞的有效刺激。在本發明的有關驗證試驗中將新城疫病毒外膜蛋白抗原、禽源多殺性巴氏桿菌裂解后的可溶性蛋白抗原及禽源大腸桿菌菌毛抗原分別加入該微乳劑溶液中制備成的各自亞單位微乳劑疫苗均取得安全有效的結果即形成的新城疫病毒外膜蛋白微乳劑免疫小白鼠后，直至90天，HI抗體價仍可達到1∶128，而蛋白抗原單獨免疫鼠在免疫后30天HI抗體即轉為陰性。禽源多殺性巴氏桿菌是一種免疫原性較弱的致病菌，目前使用的氫氧化鋁膠滅活疫苗和油佐劑滅活疫苗的免疫效果均不理想，免疫保護率僅為50％～80％。將禽霍亂微乳劑疫苗免疫雞，二次免疫攻毒保護率可達到80％以上。免疫期已測到2個月。大腸桿菌微乳劑疫苗免疫SPF雞后15天采血測定凝集抗體，免疫組100％轉為陽性。而油佐劑免疫組只有66％轉為陽性。根據以上對不同亞單位抗原的試驗，可以認為發明的微乳劑佐劑對于亞單位抗原有良好的免疫增強作用，是一種完全新型的佐劑。
實施例及實驗實施例1 微乳劑基質的制備將皂角苷粉用蒸鎦水配成5mg/ml的皂角苷溶液；將膽固醇用氯仿配成100mg/ml的膽固醇溶液。將1ml 100mg/ml膽固醇氯仿溶液在超聲過程中(250W)逐滴加到100ml 5mg/ml皂角苷溶液中，繼續超聲(約10min)至混合液呈白色乳狀液。再于減壓條件下抽除氯仿，并以5000r/min離心20min，除去沉淀物后的上部液體再經20000r/min離心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液將沉淀稀釋至100ml而成為半透明的微乳劑，按終濃度1/萬加入硫柳汞防腐。實施例2 新城疫(ND)微乳劑疫苗的制備將新城疫病毒(NDV)以40000r/min離心3h，棄上清，將沉淀病毒用1/400原病毒液體積的pH7.2 PBS溶解成濃縮400倍的病毒液，加入2％Triton X100室溫作用30min，將裂解病毒液置于40％蔗糖溶液上以40000r/min超速離心10h。收取上層蛋白帶，即為NDV外膜蛋白，紫外法測定蛋白濃度為60mg/ml。
取100ml微乳劑基質，分別加入提取的蛋白抗原，使終濃度為2mg/ml，即為新城疫微乳劑疫苗。實施例3 禽霍亂微乳劑疫苗的制備將禽巴氏桿菌C48-1株強毒菌馬丁瓊脂培養菌膜用pH7.2 PBS洗下，配制成100億/ml菌液，經超聲處理30min破碎菌體后，再反復凍融2次，使菌體充分裂解；以5000r/min離心30min，收取上清蛋白溶液，即為禽源多殺性巴氏桿菌裂解亞單位抗原。蛋白濃度為20mg/ml。
取100ml微乳劑基質，分別加入提取的禽源多殺性巴氏桿菌裂解亞單位抗原，使終濃度為2mg/ml，即為微乳劑疫苗。實驗1 新城疫微乳劑疫苗免疫試驗將新城疫微乳劑疫苗免疫10只小白鼠，每只肌肉注射0.5ml，同時將NDV外膜蛋白溶液配制成2mg/ml，也注射10只小白鼠作為對照組。免疫后20天、30天、60天采血測定其血凝(HI)抗體價。
新城疫病毒外膜蛋白微乳劑苗免疫小白鼠后20天、30天、90天，HI抗體價均達到1∶128，而同批外膜蛋白抗原免疫組，免疫后20天HI抗體價僅為1∶8，免疫后30天以后一直為陰性，結果見表1。
表1新城疫病毒外膜蛋白微乳劑苗對小鼠的免疫
禽巴氏桿菌微乳劑苗的安全試驗將3批禽霍亂微乳劑疫苗各肌肉注射5只小白鼠，每只0.5ml；各注射10只10日齡SPF雞，每只1ml，觀察10天進行安檢。試驗結果表明以上3批禽霍亂微乳劑疫苗接種10日齡SPF雞和小白鼠后，均未見任何不良反應，說明該疫苗安全性好。實驗3 禽巴氏桿菌微乳劑苗效力試驗將3批禽巴氏桿菌微乳劑苗與9801批同批抗原的油佐劑苗分別免疫1月齡SPF雞，每只肌肉注射疫苗1ml。10天后第二次免疫，每只肌肉注射1ml，第二次免疫后30天每組取5只雞，用C48-1強毒菌進行攻擊。
經3批微乳劑苗二次免疫的免疫組雞，在免疫后30天，攻毒保護率均達到100％，而同批抗原的油佐劑苗免疫組為60％，對照組100％發病死亡，結果見表2。
表2三批禽巴氏桿菌微乳劑苗的效力試
實驗4 禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫劑量測定將9803批微乳劑苗按2ml/只、0.5ml/只、0.2ml/只免疫1月令SPF雞，進行免疫劑量測定，免疫后30天用禽源多殺性巴氏桿菌C48-1強毒菌株進行攻擊。其試驗攻毒保護率分別為100％、100％、50％，說明最小有效免疫劑量為0.5ml/只，使用劑量采用1ml/只比較合理，結果見表3。
表3禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫劑量測定
實驗5 禽霍亂微乳劑苗的免疫程序及免疫期試驗將3批禽霍亂微乳劑苗分別免疫20日齡未經任何禽霍亂疫苗免疫過的雞(以下稱非免疫雞)，每只胸肌注射1ml，第一次免疫(以下或稱首免)后30天每組取5只進行強毒攻擊，剩余雞每只胸肌注射1ml同批微乳劑苗進行第二次免疫(以下可稱二免)。二免后60天，每組取5只用禽源多殺性巴氏桿菌強毒菌進行攻擊試驗。結果為首免后30天，攻毒保護率9801、9802、9803批苗分別為80％、80％、100％，二免后60天攻毒保護率分別為100％、80％、100％，結果見表4。
表4禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫程序及免疫期試驗
權利要求
1.一種亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于用由中國皂角提取皂角苷作為主要成份與膽固醇經超聲處理制備成一種微乳劑。將該微乳劑作為佐劑與制備疫苗用微生物亞單位抗原按一定比例混合，制成免疫用亞單位微乳劑疫苗。
2.權利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于微乳劑是由中國草藥皂角提取制成的皂角苷粉為其主要成分之一。
3.權利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于制備疫苗用微生物亞單位抗原是復制后的疫苗病毒經處理制成的具有免疫活性的成分——即亞單位抗原。
4.權利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于制備疫苗用微生物亞單位抗原是繁殖后的制苗用細菌經處理制成的具有免疫活性的成分——即亞單位抗原。
全文摘要
本發明涉及的是一種亞單位抗原微乳劑疫苗制備技術,用提取的皂角苷和膽固醇制成微乳劑,經分別與提取的新城疫病毒外膜蛋白、禽源多殺性巴氏桿菌裂解產物和禽源大腸桿菌菌毛抗原制成亞單位微乳劑疫苗,免疫鼠和雞。新城疫病毒外膜蛋白微乳劑疫苗免疫鼠HI抗體可達到1∶128。顯著高于外膜蛋白單獨免疫鼠的1∶8。禽霍亂微乳劑疫苗免疫雞,經兩次免疫接種,免疫后30天和60天,攻毒保護率可達到80%以上。用大腸桿菌亞單位微乳劑疫苗免疫SPF雞后15天采血測定凝集抗體,免疫組100%轉為陽性,而油佐劑免疫組只有66%轉為陽性。
文檔編號A61K47/46GK1265327SQ99126278
公開日2000年9月6日 申請日期1999年12月23日 優先權日1999年12月23日
發明者支海兵, 劉倩, 宋立 申請人:中國獸藥監察所