專利名稱：細胞粘連分子表達抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有有效成分組胺加免疫球蛋白的新型藥物，詳細的說本發明涉及含有有效成分組胺加免疫球蛋白的細胞粘連分子表達抑制劑。
免疫球蛋白和組胺的復合體作為組胺加免疫球蛋白制劑是已知的，由于其具有使變態反應患者或哮喘患者降低的組胺固定能力得以恢復的作用，作為非特異性減敏療法劑可以用于支氣管哮喘、變應性鼻炎、血管運動性鼻炎或蕁麻疹、慢性濕疹、變應性皮炎等變態反應性皮膚病的治療。另外，發現該藥物有抑制組胺游離的作用，它沒有作為對癥療法劑使用的抗組胺劑或腎上腺皮質激素等具有的副作用，作為安全性較高的藥物得到了廣泛的使用。〔《醫療藥日本醫藥品集》(1996年10月版，日本醫藥情報中心編，藥業時報社發行)的第463、464頁〕。
另外，除上述之外還有報告指出組胺加免疫球蛋白具有抑制嗜酸性粒細胞增多的作用和免疫調節作用，以及組胺免疫加球蛋白即使口服給藥也顯示同樣的藥理作用(特開平7-53406號公報、特開平9-31311號公報等)。但是，在以前任何一篇文獻中均沒有關于組胺加免疫球蛋白具有抑制細胞粘連分子表達作用的記載。
本發明的目的在于提供一種副作用少、安全性高的新型細胞粘連分子表達抑制劑。
本發明者對上述組胺加免疫球蛋白繼續進行了悉心的研究，結果發現本藥物可以抑制細胞粘連分子的表達。本發明提供一種含有有效成分組胺加免疫球蛋白的新型細胞粘連分子表達抑制劑。
本發明藥物組合物的有效成分組胺加球蛋白為組胺與免疫球蛋白的復合體，可以將免疫球蛋白成分與組胺成分適當混合制備而成。在本發明中使用的免疫球蛋白作為用于人的藥品當然能夠以人免疫球蛋白為原料使用，人免疫球蛋白可以由血清或胎盤血漿等采用常規方法制得。為了確保其作為藥物的安全性，應當符合通常對血漿成分制劑制定的標準。例如，使用HBs抗原、HCV抗體及HIV抗體呈陰性的人血漿作為原料血漿并進行加熱處理，可以避免混入肝炎病毒或艾滋病病毒等的危險性。加熱處理一般用于病毒的惰性化，例如在血漿成分制劑中通常可以使用60℃-10小時液態加熱處理、60℃-10小時蒸汽化加熱處理、65℃-96小時干燥加熱處理等。
在適用于人以外的場合，相應于作為對象的動物的種類，免疫球蛋白可以從人以外的動物制備后再使用。免疫球蛋白由IgG、IgA、IgM等種類組成，本發明的免疫球蛋白可以使用各種免疫球蛋白中的一種或數種。
組胺成分可以使用游離的組胺或其鹽酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽等可藥用鹽。優選的組胺成分例如組胺二鹽酸鹽。
在制備本發明的藥物組合物時，例如可以將免疫球蛋白1至200mg(優選5至50mg)和組胺成分0.01至2μg(優選0.05至0.5μg)適當溶解于生理鹽水、蒸餾水等合適的溶劑中，攪拌、混合制得，可以通過冷凍或冷凍干燥保存。
以下給出本發明藥物組合物的一個配方例，但本發明并不僅限于此。
本發明的藥物組合物可以與適當的藥用載體或稀釋劑組合制成藥物，可以采用本領域使用的常規方法配制成用于口服或非口服給藥的固體、半固體或液體劑型。根據配方可以單獨使用本發明藥物組合物作為有效成分，也可以與其它藥物活性成分制成復方制劑。
注射劑優選使用注射用蒸餾水或生理鹽水等制成等滲溶液后制得的制劑。另外，配制成制劑時除本發明藥物組合物之外還可以適當加入溶解輔助劑、等滲劑、穩定劑、緩沖劑、防腐劑等添加劑，例如可以使用檸檬酸、苯甲酸鈉、甘氨酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、磷酸鹽、抗壞血酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉等。另外，本發明藥物組合物也可以制成使用時再溶解的注射劑，可以將干燥粉末填充在小瓶中，或將溶液型藥物制劑注入到小瓶中后冷凍干燥制得。這種場合下，除上述添加劑之外必要時還可以加入葡萄糖、甘露醇、山梨醇等賦形劑等。
制成口服給藥用制劑時，可以直接或與合適的添加劑適當組合制成片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，其中所述合適的添加劑例如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、檸檬酸鈣等常用賦形劑，以及結晶纖維素、羥丙基纖維素等纖維素衍生物，阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠等粘合劑，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羧甲基纖維素鈣等崩解劑，滑石粉、硬脂酸鎂等潤滑劑，其它增量劑、潤濕劑、穩定劑、緩沖劑、防腐劑、香料等。另外，本發明藥物組合物也可以制成使用時再用蒸餾水溶解的口服液，可以通過將組胺加免疫球蛋白溶液填充到小瓶等后冷凍干燥制得，在制成制劑的時候，必要時還可以加入上述各種添加劑。相應于患者的狀態和疾病的種類，也可以適當制成上述以外的適當劑型進行治療，例如吸入劑、氣霧劑、軟膏、滴眼劑、栓劑等。
本發明藥物組合物優選的給藥量最好是根據疾病的種類、疾病發展程度、患者的年齡·性別、劑型、給藥方法、給藥時間等適當設定。例如為了能夠得到注射劑所預期的效果，對于一般的成人通常可以1至300mg(優選5至150mg)1周1次乃至數次皮下給藥，但本發明并不受其特別限定。
本發明藥物組合物的優選方式如下所述。
(1)含有有效成分組胺加免疫球蛋白的細胞粘連分子表達抑制劑。
(2)如上述(1)所述的藥物組合物，免疫球蛋白成分與組胺成分的比例是相對于免疫球蛋白成分1～200mg組胺成分為0.01～2μg。
(3)如上述(1)所述的藥物組合物，免疫球蛋白成分與組胺成分的比例是相對于免疫成分5～50mg組胺成分為0.05～0.5μg。
(4)如上述(1)～(3)所述的藥物組合物，免疫球蛋白成分與組胺成分的比例是相對于免疫球蛋白成分12.0mg組胺成分為0.15μg。
(5)如上述(1)～(4)所述的藥物組合物，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。
(6)如上述(1)～(5)所述的藥物組合物，組胺成分為組胺二鹽酸鹽。
(7)如上述(1)～(6)所述的藥物組合物，該藥物組合物為注射劑。
以下結合實施例更具體的說明本發明，但本發明并不受其任何限定。實施例下面列出本發明藥物組合物制備方法的一個例子。另外，由于在以下的藥理試驗中使用大鼠作為試驗動物，因而用大鼠免疫球蛋白代替人免疫球蛋白。也就是說，將大鼠免疫球蛋白和組胺二鹽酸鹽按照下述比例溶解于生理鹽水，在室溫下攪拌2小時后冷凍干燥，在使用時用生理鹽水溶解后皮下給藥。〔本發明化合物〕 〔大鼠免疫球蛋白量〕 〔組胺二鹽酸鹽量〕HG50 5.3mg0.10μgHG75 12.0mg 0.15μgHG90 28.8mg 0.30μg由于制得的HG50、HG75和HG90在下述任何藥理試驗中均具有顯著作用，作為代表例給出HG75得到的結果。實施例藥理試驗按照下述進行。1)試驗動物由于ヤ-ルスリバ-ジヤパン購入Lewis大鼠(6～10周齡，雌性，SPF)。在室溫22±2℃、濕度55±10％、1日12小時(上午8點～下午8點)人工照明的動物室預備飼養5日，用健康正常的動物進行實驗。2)組胺加免疫球蛋白的制備與給藥將正常大鼠血清分離出的大鼠免疫球蛋白(コ-ン組分II和III)和組胺二鹽酸鹽溶解于生理鹽水，使其最終濃度分別達到26.6mg/mL和0.333μg/mL，在23℃攪拌2小時，作為HG75使用。從免疫日或細胞植入日開始每隔1日在大鼠背部皮下給藥。對照大鼠按照同樣的時間表投給生理鹽水。3)被動實驗性變應性腦脊髓炎(pEAE)的誘導方法將豚鼠髓磷脂堿性肽(GP-MBP68-84)溶液(400μg/mL)與等體積的完全佐劑(H37Ra)混合，制成乳劑，其中豚鼠髓磷脂堿性肽含有相當于髓磷脂堿性蛋白質(MBP)誘發腦脊髓炎部分的合成肽(MBP68-84)。在用乙醚麻醉的Lewis大鼠左后肢腳踝皮下投給該乳劑0.1mL。10～14日后由大鼠無菌的取出脾臟，制備細胞浮游液。使用0.75％氯化銨/17mM Tris-鹽酸(pH＝7.65)溶液，除去紅細胞。離心分離后，使脾臟細胞浮游在RPMI-1640培養基中，用臺盼藍溶液(0.4％)測定活細胞濃度。用含有滅能胎牛血清(7％)的培養基(含有10mMヘペス緩沖液、20mML-谷氨酸、50μg/mL青霉素、50u/mL鏈霉素、5×10-6M2-巰基乙醇的RPMI-1640)將細胞濃度調節為2×106個/10mL，在2μg/mL刀豆素A存在條件下，將2×107個/10mL在培養皿中，37℃、5％CO2條件下培養3日。培養后回收細胞，離心洗滌3次。濾除凝集塊，用臺盼藍溶液(0.4％)測定細胞濃度，用生理鹽水調節為4×107個/mL。用X線照射裝置(MBR-1520R日立生產)對Lewis大鼠進行800rad的X線照射后，將2×107個/0.5mL細胞植入尾靜脈。4)實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)臨床癥狀的判斷基準大鼠臨床癥狀使用判斷基準值(0～5)記分進行評價。2～5的各臨床癥狀部分發病時，采用減去0.5得到的值。另外，對臨床癥狀的評價使用觀察者不清楚藥物投給組合的盲檢法。判斷值 臨床癥狀0 正常0.5尾部輕度下垂0.75 尾部中度下垂1 尾巴的保持能力消失2 活動性降低3 一側后肢麻痹4 兩側后肢麻痹5 兩側后肢麻痹，并伴有失禁5)組織的獲取方法將活性化脾臟細胞植入Lewis大鼠，第5和第7日使之放血，取得脊髓。從脊髓切出腰錐部分，埋入到0.C.T.復合物中，用液氮冷凍。使用前始終保存在-20℃條件下。6)薄切切片試樣的制備方法和固定方法用恒冷切片機將冷凍保存的脊髓切成6μm的厚度，裝在明膠包衣的載玻片上。將載玻片上的試樣充分風干后，在冷卻到-20℃的丙酮中浸泡10分鐘，再次風干。切片試樣在試樣前始終保存在-20℃條件下。7)蘇木精曙紅染色法將載玻片上的試樣置于流水中洗滌5分鐘。在邁耶的蘇木精液中浸泡10分鐘。在流水中洗滌15分鐘后，在曙紅液中浸泡5分鐘。用流水除去多余的色素，依次用70％、90％、100％乙醇脫水。最后，用二甲苯浸泡3次，每次3分鐘，用エンテラニユ-包埋。8)免疫組織染色法將載玻片上的試樣充分干燥，在冷磷酸緩沖液(PBS)中浸泡3次，每次5分鐘。然后在含有0.3％過氧化氫、0.1％疊氮化鈉的冷PBS中浸泡15分鐘。在冷PBS中浸泡3次洗凈，每次5分鐘，之后為了封閉，在試樣中加入含有1％牛血清白蛋白的PBS(封閉緩沖液)，靜置20～30分鐘。除去封閉緩沖液，在試樣中加入用封閉緩沖液稀釋到20倍的生物素修飾小鼠抗大鼠ICAM-1抗體和LFA-1抗體，靜置1小時。用冷PBS浸泡2次，每次5分鐘，洗滌。在試樣中加入用Elite ABC試劑制備的抗生物素蛋白與生物素的復合體，靜置30分鐘。用冷PBS浸泡2次洗凈，每次5分鐘。在試樣中加入DAB反應溶液后，用顯微鏡確認顯色的程度，用蒸餾水停止顯色。9)核染色及包埋法為了進行核染色，將免疫組織染色結束后的試樣置于1％甲基綠溶液中浸泡10分鐘。在100％乙醇中浸泡3次，每次1分鐘，然后在二甲苯中浸泡3次每次5分鐘進行脫水后，將試樣用エンテラニユ-包埋。10)組織的評價方法ICAM-1和LFA-1表達的評價是用光學顯微鏡對免疫組織染色后的試樣進行觀察，根據表達的程度記分，即0正常、1輕微、2輕度、3中度、4重度、5十分嚴重11)統計處理用平均值±標準差(S.E.M)表示免疫組織染色的結果，用Mann-Whitney(非參數法)或Scheffe檢驗(共分散法)進行顯著性差異檢驗，危險率(P值)小于0.05時具有顯著性差異。12)本發明藥物組合物對患腦脊髓炎(EAE)時脊髓中細胞粘連分子表達的抑制效果采用免疫組織化學方法考察本發明藥物組合物對主要在血管內皮細胞上表達的ICAM-1與用其counter partner在白血球上表達的LFA-1的表達的抑制效果。結果的一個例子如
圖1所示。在EAE未發病組(Intact)中ICAM-1完全沒有表達(分數0)。在EAE發病組，如圖1所示，ICAM-1表達的程度是相對于發病初期(細胞植入第5天)的發病對照組分數1.8±0.3，本發明藥物組合物的給藥組分數為0.9±0.1，確認其具有顯著的(p＜0.05)抑制效果。另外，相對于發病的峰期(細胞植入第7天)的發病對照組分數2.9±0.1，本發明藥物組合物給藥組的分數為1.7±0.3，確認同樣具有顯著的(p＜0.01)的抑制效果。
另外，相對于發病初期(細胞植入第5天)的發病對照組的分數3.1±0.6，本發明藥物組合物給藥組的分數為1.0±0.0，這一點雖然在圖中沒有表示，但仍可以確認對于LFA-1的表達程度具有顯著的(p＜0.01)抑制效果。另外，相對于發病峰期(細胞植入第7天)的發病對照組的分數3.7±0.5，本發明藥物組合物給藥組的分數為3.1±0.5，具有降低的趨勢。
多發性硬化癥的模型——實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)的特征在于伴有免疫細胞向中樞神經系統浸潤和炎癥的后肢麻痹。對于細胞向中樞浸潤起主要作用的可以認為是形成血腦屏障的內皮細胞與浸潤細胞上的細胞粘連分子之間的相互作用。ICAM-1是屬于免疫球蛋白超家族的代表性細胞粘連分子，通過IL-1、TNF、IFN-γ等炎癥性細胞因子的誘導，主要在血管內皮細胞上表達，與白細胞上的LFA-1或Mac-1結合。上述藥理試驗結果表明本發明藥物組合物可以顯著抑制由EAE誘導的ICAM-1等細胞粘連分子的表達。如上所述，已經明確ICAM-1、IFA-1等細胞粘連分子與炎癥反應有很深的關系，因此本發明的藥物組合物作為可以治療和預防腦炎、腎炎、心肌炎、血管炎、腸炎、肺炎和全身性炎癥反應綜合癥(SIRS)等炎癥性疾病的細胞粘連分子表達抑制劑是有效的。
附圖的簡要說明圖1表示本發明藥物組合物對EAE中細胞粘連分子表達的抑制效果結果的一例。
權利要求
1.細胞粘連分子表達抑制劑，含有有效成分組胺加免疫球蛋白。
全文摘要
提供一種副作用少、安全性高的新型細胞粘連分子表達抑制劑。本發明提供一種含有有效成分組胺加免疫球蛋白的新型細胞粘連分子表達抑制劑。已知本發明藥物組合物的有效成分組胺加免疫球蛋白副作用發生頻率低,因此本發明藥物組合物作為可以治療或預防各種炎癥性疾病的安全性高的細胞粘連分子表達抑制劑是有用的。
文檔編號A61P43/00GK1253833SQ9912348
公開日2000年5月24日 申請日期1999年11月12日 優先權日1998年11月13日
發明者內木充 申請人:日本臟器制藥株式會社