一種男性不育、弱精癥的治療藥物的制作方法

專利名稱：一種男性不育、弱精癥的治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種治療男性不育、弱精癥藥物——尿激酶，具體地講，本發(fā)明涉及的是尿激酶藥物、制備這種藥物的方法及其在治療男性弱精癥、男性不育障礙方面的用途。
50年代初，Williams最先在人尿液中發(fā)現(xiàn)尿激酶，70年代末期Propping和Asted等人從精液中分離出兩種溶酶原激活因子(uPA)，并用生化的方法證實(shí)人精子中存在尿激酶型纖溶酶原激活因子，其在免疫學(xué)和生物活性上類似尿激酶。后來(lái)研究者們用尿激酶免疫動(dòng)物生產(chǎn)出uPA多抗和單抗，用來(lái)進(jìn)一步研究uPA，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)尿激酶實(shí)際上就是現(xiàn)在的uPA。自早期在人尿液中發(fā)現(xiàn)尿激酶和從精液中分離出兩種溶酶原激活因子(uPA)至今，在現(xiàn)有技術(shù)中，尿激酶(Urokinase)主要用于治療血栓，給藥途徑為注射，見國(guó)家藥典，從沒(méi)有人將尿激酶同改善精子的質(zhì)量聯(lián)系在一起。
發(fā)明人在新藥研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，尿激酶(Urokinase)有治療男性不育障礙、弱精癥的新用途，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道和使用。
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效治療男性不育障礙、弱精癥的藥物——尿激酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供多種制備尿激酶制劑的配方及制備工藝，包括口服含片、口服膠囊、注射液和栓劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是研究精子和精漿中尿激酶的活性同男性不育障礙和弱精癥的關(guān)系，從而提供一種通過(guò)檢驗(yàn)精子和精漿中尿激酶的活性而確定男性不育障礙和弱精癥的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是將尿激酶應(yīng)用于治療男性不育障礙和弱精癥。
為了完成上述任務(wù)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為首先研究人精子和精漿中尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子uPA和尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子受體uPAR，以及弱精癥患者精子和精漿中uPA酶活性與含量的變化。尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(uPA)是一種絲氨酸蛋白水解酶，它將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶；尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子受體(uPAR)是一種分子量為55-66,000的單鏈糖蛋白，它通過(guò)糖磷酯酰肌醇附著于質(zhì)膜上，人精漿和精子中uPA的生理作用尚未完全明了。
另外，本發(fā)明主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究①觀察正常男子精漿中尿激酶的含量及酶的生物學(xué)活性和精子中尿激酶的含量、活性及分布。
②觀察精子活力不足，精液常規(guī)其它各項(xiàng)基本正常的不育癥男子精漿和精子中尿激酶含量及生物學(xué)活性變化。
③對(duì)精子活力不足，其它條件同上的不育男子體內(nèi)應(yīng)用尿激酶后，觀察精液中精子活力變化。
④對(duì)上述條件患者離體精液中加入尿激酶后，觀察精子活力變化。
具體地講，本發(fā)明主要采用了免疫組織化學(xué)方法，對(duì)人精子中uPA及uPA受體進(jìn)行定位觀察。用瓊脂糖-纖維蛋白-平板法+免疫阻抗對(duì)人精子和精漿中uPA的活性進(jìn)行測(cè)定，用ELISA-雙抗夾心法對(duì)人精子和精漿中uPA的含量進(jìn)行了測(cè)定。此外對(duì)弱精癥不育男子和精液參數(shù)正常的男子，體外加uPA后，30、60、90和120分鐘時(shí)，光鏡下觀察精子活力的改變1.免疫組化方法包括免疫膠體金染色光鏡觀察和免疫膠體金染色(單抗隆抗體+多克隆抗體雙標(biāo)記法)，不復(fù)染，進(jìn)行電鏡觀察，同時(shí)設(shè)立對(duì)照染色進(jìn)行比較觀察，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿意。
2.瓊脂糖-纖維蛋白-平板法+免疫阻抗通過(guò)測(cè)量溶解圈的大小，了解uPA的酶活性，出現(xiàn)的透明圈的直徑與uPA的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)uPA的含量了解酶的活性，該方法準(zhǔn)確，能直接反應(yīng)出酶的活性。
3.ELISA-雙抗夾心法采用雙抗夾心方法進(jìn)行uPA定量測(cè)定，方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，與放射免疫所測(cè)結(jié)果相似，用該法所測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)為0.999，批間和批內(nèi)變異系數(shù)小，分別為10.46％和2.26％。
實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明①正常男子精子中uPA主要分布在精子頂體內(nèi)外膜和頭部漿膜上，意外發(fā)現(xiàn)精子尾部中段線粒體集中的部位也存在uPA。在uPA出現(xiàn)的部位均可發(fā)現(xiàn)uPAR。
②弱精癥患者精子中uPA活性及含量顯著低于正常男子組，uPA活性與含量分別與精子活力和活率呈明顯正相關(guān)。
③體外尿激酶興奮試驗(yàn)表明，加入尿激酶后，30、60、90、120分鐘時(shí)精子的活率均有提高，前向運(yùn)動(dòng)精子的數(shù)目亦有增加。體內(nèi)給藥前后比較，尿激酶明顯提高精子平均活率和前向運(yùn)動(dòng)能力。
④弱精癥和精液液化不良者，精漿中uPA活性和含量顯著低于正常男子組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，歸納為以下幾點(diǎn)①uPA可能與uPAR發(fā)生結(jié)合才發(fā)揮生理作用。由于精子中存在uPA受體，不排除uPA是精子在生殖道運(yùn)行過(guò)程中結(jié)合上去的。
②精子尾部中段uPA和uPAR的存在可能有特殊的生理意義，它與精子頭部uPA的功能可能不同。該部位為線粒體集中的地方，推測(cè)可能與能量利用和精子的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。
③uPA與精子的活力和活率呈正相關(guān)。
④uPA可能參與精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向運(yùn)動(dòng)。
⑤uPA有可能發(fā)展成為一種治療弱精癥患者的藥物。
⑥進(jìn)一步研究uPA，有可能通過(guò)抑制uPA活性，達(dá)到男性抗生育的作用。
綜上所述，我們總結(jié)出本發(fā)明的顯著特征在于1、采用膠體金雙標(biāo)免疫電鏡法，在國(guó)內(nèi)外首次從形態(tài)上直觀、準(zhǔn)確證實(shí)了uPA和uPAR在人精子中的分布。
2、國(guó)內(nèi)外首次提出精子尾部中段存在uPA和uPAR，并從形態(tài)學(xué)上得以證實(shí)，同時(shí)推測(cè)可能的生理意義。
3、國(guó)內(nèi)外首次提出弱精癥患者與精子中uPA含量和活性降低有關(guān)，提出uPA可作為一種治療弱精癥的藥物。
4、提出精漿中uPA可能參與精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向運(yùn)動(dòng)。
由于uPA有提高精子的活力和活率的作用，而且能參與精液的液化和降低精液的粘稠度，有利于精子作前向運(yùn)動(dòng)。因此，uPA可以成為一種治療男性不育障礙和弱精癥的新藥。
一種治療男性不育障礙和弱精癥的藥物，該藥物中主要成分為尿激酶，其特征在于該藥物中含有10000-100000單位的尿激酶，配方如下組分 用量尿激酶10000-100000單位β-環(huán)糊精 0-60mg甘露醇0-100mg酸性介質(zhì) 0-20mg聚乙二醇 0-20mg黏合劑0-25mg淀粉 0-150蔗糖粉0-250mg硬脂酸鎂 0-6mg羧甲基淀粉鈉 0-22吐溫 0-2mg半合成脂肪酸酶0-40mg總計(jì) 10000-100000單位至300mg本發(fā)明的治療男性不育障礙和弱精癥的藥物，其特征在于所述的尿激酶的用量?jī)?yōu)選在12000-80000單位之間。
本發(fā)明的治療男性不育障礙和弱精癥的藥物，當(dāng)包合劑、黏合劑和其它輔料的含量為零時(shí)，尿激酶中加入生理鹽水，可以制成注射液。
使用尿激酶治療男性不育障礙和弱精癥，可以以傳統(tǒng)的注射方式給藥，但以注射方式給藥，一方面對(duì)于使用者很不方便，另一方面難以克服尿激酶本身的副作用；口服給藥時(shí)，由于胃中酶對(duì)尿激酶的作用，可能使尿激酶失活而影響尿激酶應(yīng)有的作用。為了既方便使用，又同時(shí)保證尿激酶的活性，本發(fā)明利用β-環(huán)糊精分子微囊的特性，采用β-環(huán)糊精包合尿激酶。由于β-環(huán)糊精分子呈環(huán)狀排列，葡萄糖甙基上的羥基均位于環(huán)狀結(jié)構(gòu)的外圍，故外圍為親水性，內(nèi)部為疏水性，形成圓筒狀，尿激酶可以進(jìn)入環(huán)糊精內(nèi)部被保護(hù)，也可以氫鍵連接形式增強(qiáng)其穩(wěn)定性，可以保證尿激酶的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的尿激酶口含片的配方如下組分 用量尿激酶 10000-100000單位β-環(huán)糊精6-60mg甘露醇 30-100mg硬脂酸 2-20mg聚乙二醇 2-20mg纖維素 1.5-15mg蔗糖粉 5-250mg硬脂酸鎂 1-6mg輔料若干 適量合計(jì) 300mg本發(fā)明的尿激酶口含片，其特征在于所述的尿激酶的用量?jī)?yōu)選在12000-80000單位之間。
口服片或膠囊的配方為配方 用量尿激酶 10000-100000單位β-環(huán)糊精0-60mg淀粉 30-150纖維素 5-25mg羧甲基淀粉鈉 0-60mg硬脂酸鎂 0-6mg二氧化硅 0-10mg本發(fā)明配方中的環(huán)糊精可以從β-環(huán)糊精及其多種衍生物中選擇，例如羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、乙基-β-環(huán)糊精(E-β-CD)、二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-環(huán)糊精(TM-β-CD)、單糖基-β-環(huán)糊精(G1·β-CD)、雙糖基-β-環(huán)糊精(G2·β-CD)、麥芽三糖基-β-環(huán)糊精(G3·β-CD)、二單糖基-β-環(huán)糊精(2G1·β-CD)、二雙糖基-β-環(huán)糊精(2G2·β-CD)等。如欲要求進(jìn)一步緩釋，亦可選擇二乙基-β-環(huán)糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-環(huán)糊精(TE-β-CD)等，也可以是兩種或兩種以上的混合物；優(yōu)選二甲基-β-環(huán)糊精、乙基-β-環(huán)糊精(E-β-CD)和三乙基-β-環(huán)糊精。
在上述配方中的酸性介質(zhì)可選擇使用硬脂酸、軟脂酸、棕桐酸、抗壞血酸等等。優(yōu)選硬脂酸，抗壞血酸和棕櫚酸。
在上述配方中的粘合劑可選自如下的一種或組合羥丙甲纖維素、乙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚a-羥乙甲基丙烯酸酯、聚維酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纖維素、糊精、白糊精、微晶纖維素、甲基纖維素、丙烯酸甲酯、丙烯酸樹脂I-IV號(hào)、羥乙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、卡泊姆、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、低取代羥丙基纖維素、淀粉等等，這樣進(jìn)一步增強(qiáng)尿激酶的穩(wěn)定性。優(yōu)選的粘合劑選自羥丙甲纖維素、乙基甲基纖維素和乙基纖維素。
上述配方中的聚乙二醇，也可以用其它各種型號(hào)的聚乙二醇，如聚乙二醇4000，聚乙二醇8000，也可以是聚乙二醇的衍生物或適合本發(fā)明的其它聚合物。
本發(fā)明的上述配方，可以選擇不同的粘合劑、不同的酸性介質(zhì)、不同的環(huán)糊精及其衍生物以及不同的聚合物。
上述配方可以制成口服片劑、口服膠囊、顆粒劑、栓劑以及適合本發(fā)明的其他制劑。
此外，只要達(dá)到相同的血藥濃度，用于本發(fā)明的尿激酶也可以用傳統(tǒng)的方法制成注射劑、口服膠囊、口服片劑、顆粒劑、栓劑以及適合本發(fā)明的其它制劑。
上述輔料、用量及劑型可以有多種變化，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，在此不一一列出。但應(yīng)理解，所有在上述配方范圍內(nèi)及劑型的變化，都應(yīng)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述的尿激酶口含片的制備工藝如下1.先將聚乙二醇6000用溫水溶解，冷卻，加尿激酶攪拌均勻，加β-環(huán)糊精不斷攪拌，約2--6hr使之包合完全，過(guò)濾后，用清水洗凈即得包合物。
2.將甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均勻，加包合物，再充分混合均勻后加3％的羥丙基甲基纖維素，制成軟材，然后用16目篩制顆粒，以40--70℃鼓風(fēng)干燥4--8hr，以16目篩整理顆粒。
3.將整理好的顆粒加硬脂酸鎂，混合均勻即可；用專用模具壓片，片重約為300mg/片。
本發(fā)明所述的口服片劑、膠囊、顆粒的制備工藝如下1.將HPMC加適量EtOH分散后，加60-80℃蒸餾水稀釋至需要濃度，密閉放置過(guò)夜后，過(guò)70-80目篩備用(研磨劑、粘合劑)。
2.將所有輔料加入，攪拌均勻?yàn)楹隣?，加尿激酶制藥軟材?br> 3.將軟材以18目制粒，40-60℃通風(fēng)干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂混合均勻壓片或加二氧化硅制膠囊。
當(dāng)用β-環(huán)糊精包合制備口服片劑或膠囊時(shí)，制備工藝同口含片的制備過(guò)程，所不同的是最后成型的工藝。
本發(fā)明在男性生殖領(lǐng)域，對(duì)uPA和uPAR與精子活力的研究以及由此提出的治療男性不育障礙和弱精癥的藥物------尿激酶，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外空白；本發(fā)明在進(jìn)行制劑學(xué)研究的基礎(chǔ)上，采用β-環(huán)糊精對(duì)尿激酶進(jìn)行包合，加其他原輔料，并配合獨(dú)特的制備工藝，研制成一種治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，藥物的特征為有生理活性的片劑，口含型，使尿激酶本身存在的缺陷得以克服，使尿激酶的療效顯著提高，并減輕了該物質(zhì)的副作用，增強(qiáng)了穩(wěn)定性；可有效地發(fā)揮其治療男性不育障礙、弱精癥的新用途。
由于uPA與精子活力密切相關(guān)，檢驗(yàn)精子和精漿中尿激酶的活性對(duì)部分弱精癥(精子活力低下)或精液液化不良有明確病因和診斷作用，該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，可靠，不要特殊儀器設(shè)備，能在基層醫(yī)院檢驗(yàn)科開展。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該藥物保持了尿激酶的活性，可有效地發(fā)揮其治療男性不育障礙、弱精癥的新用途。引起精子活力低下的病因較多，尿激酶活性降低可能是病因之一，因此分析精子和精漿中尿激酶的活性對(duì)指導(dǎo)弱精癥的治療有一定意義。對(duì)部分精子活力低下或精液液化異常，尿激酶有很好的治療效果，有良好的推廣前景。
實(shí)施例一本發(fā)明的配方及制備工藝的關(guān)鍵，在于β-環(huán)糊精對(duì)主藥成份的包合。在本實(shí)施例中，包合物選擇二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)，其配方如下組分 用量尿激酶 20000單位二甲基-β-環(huán)糊精 10mg甘露醇 46mg硬脂酸 6mg羥丙基甲基纖維素 30mg聚乙二醇6000 3mg硬脂酸鎂 10mg蔗糖粉(不含硫) 220mg合計(jì) 每片重300mg本實(shí)施例所述的尿激酶口含片的制備工藝如下1.先將聚乙二醇6000用溫水溶解，冷卻，加尿激酶攪拌均勻，加β-環(huán)糊精不斷攪拌，約2hr使之包合完全，過(guò)濾后，用清水洗凈即得包合物。
2.將甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉混合均勻，加包合物，再充分混合均勻后加3％的羥丙基甲基纖維素，制成軟材，然后用16目篩制顆粒，以40℃鼓風(fēng)干燥8hr，以16目篩整理顆粒。
3.將整理好的顆粒加硬脂酸鎂，混合均勻即可。用專用模具壓片，片重為300mg/片。實(shí)施例二在本實(shí)施例中，包合物選擇乙基-β-環(huán)糊精，其配方如下組分 用量尿激酶10000單位乙基-β-環(huán)糊精60mg甘露醇100mg軟脂酸17.5mg聚乙二醇6000 20mg乙基甲基纖維素1.5mg蔗糖粉(不含硫)100mg硬脂酸鎂 1mg合計(jì) 每片重300mg
本實(shí)施例所述的尿激酶口含片的制備工藝如下1.先將聚乙二醇6000用溫水溶解，冷卻，加尿激酶攪拌均勻，加β-環(huán)糊精不斷攪拌，約6hr使之包合完全，過(guò)濾后，用清水洗凈即得包合物。
2.將甘露醇、軟脂酸、蔗糖粉混合均勻，加包合物，再充分混合均勻后加3％的乙基甲基纖維素，制成軟材，然后用16目篩制顆粒，以75℃鼓風(fēng)干燥2hr，以16目篩整理顆粒。
3.將整理好的顆粒加硬脂酸鎂，混合均勻即可。用專用模具壓片，片重為300mg/片。實(shí)施例三配方組分 用量尿激酶 100000單位三甲基-β-環(huán)糊精 6mg甘露醇 30mg抗壞血酸 10mg聚乙二醇4000 15mg乙基纖維素 1.5mg蔗糖粉(不含硫) 210mg硬脂酸鎂 6mg合計(jì) 每片重300mg本實(shí)施例所述的尿激酶口含片的制備工藝如下1.先將聚乙二醇4000用溫水溶解，冷卻，加尿激酶攪拌均勻，加β-環(huán)糊精不斷攪拌，約4hr使之包合完全，過(guò)濾后，用清水洗凈即得包合物。
2.將甘露醇、抗壞血酸、蔗糖粉混合均勻，加包合物，再充分混合均勻后加3％的乙基纖維素，制成軟材，然后用16目篩制顆粒，以55℃鼓風(fēng)干燥4hr，以16目篩整理顆粒。
3.將整理好的顆粒加硬脂酸鎂，混合均勻即可。用專用模具壓片，片重為300mg/片。實(shí)施例四口服片劑配方及制備工藝組分 用量尿激酶 20000單位三甲基-β-環(huán)糊精 11mg淀粉 150mg低取代羥丙基纖維素(L-HPC)20mg
羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)11mg硬脂酸鎂(M，S) 3mg其中，乙醇和蒸餾水可以以任意比例混合。
本實(shí)施例所述的尿激酶口服片劑的制備工藝如下1.將HPMC加適量乙醇分散，然后加80℃蒸餾水稀釋至需要濃度，密閉放置過(guò)夜，過(guò)80目篩備用(研磨劑、粘合劑)。
2.將β-環(huán)糊精加乙醇和水，HPMC三者的混合液，攪拌均勻?yàn)楹隣?，加尿激酶，研磨包?0分鐘備用。
3.將淀粉、L-HPC混合均勻，加已包合好的主藥，攪拌均勻，加適量的粘合劑制成軟材。
4.將軟材以16目制粒，50℃通風(fēng)干燥，16目整粒。
5.干燥整粒后加羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂混合均勻方可壓片。實(shí)施例五口服片劑配方及制備工藝組分用量尿激酶 70000單位單糖基-β-環(huán)糊精60mg淀粉100mg低取代羥丙基纖維素(L-HPC) 2.5mg羥丙基甲基纖維素(HPMC) 2.5mg-乙醇(EtOH) HPMC 3％濃度蒸餾水 -羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)26mg硬脂酸鎂(M，S) 2mg其中，乙醇和蒸餾水可以以任意比例混合。
1.將HPMC加適量EtOH分散后，加80℃蒸餾水稀釋至需要濃度，密閉放置過(guò)夜后，過(guò)80目篩備用(研磨劑、粘合劑)。
2.將所有輔料加入，攪拌均勻?yàn)楹隣睿幽蚣っ钢扑庈洸摹?br> 3.將軟材以18目制粒，50℃通風(fēng)干燥，18目整粒。
4.干燥整粒后加羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂混合均勻壓片。實(shí)施例六膠囊劑配方及制備工藝組分 用量尿激酶 20000單位
β-CD 10mg淀粉 100mgL-HPC 10mg
SiO25mg本實(shí)施例所述的尿激酶口服膠囊劑的制備工藝如下1.將HPMC加適量EtOH分散后，加60℃蒸餾水稀釋至需要濃度，密閉放置過(guò)夜后，過(guò)70目篩備用(研磨劑、粘合劑)。
2.將-CD加1(HPMC液)攪拌均勻?yàn)楹隣?，加尿激酶，研磨包?60分鐘備用。
3.將淀粉、L-HPC混合均勻，加包合好的主藥攪拌均勻，加適量粘合劑1制藥軟材。
4.將軟材以18目制粒，50℃通風(fēng)干燥，18目整粒。
5.干燥整粒后加二氧化硅，混勻灌裝2#膠囊。實(shí)施例七膠囊劑配方及制備工藝組分 用量尿激酶20000單位淀粉 110mgL-HPC 10mg
SiO25mg本實(shí)施例所述的尿激酶口服膠囊劑的制備工藝如下步驟1-3同實(shí)施例五，步驟4為4.上述物料干燥整粒后加二氧化硅，混勻灌裝2#膠囊。實(shí)施例八栓劑處方及制備工藝組分 用量尿激酶20000單位β-CD 10mg吐溫802mg
36型半合成脂肪酸酶 40mg本實(shí)施例所述的尿激酶栓劑的制備工藝如下1.將β-CD加適量EtOH攪拌均勻?yàn)楹隣?，加尿激酶研磨包?0分鐘備用。
2.將36型半合成脂肪酸酶加熱溶解后保溫38℃，加主藥的包合物，充分混合均勻保溫。
3.將混合均勻、保溫物灌膜冷卻成形。實(shí)施例九尿激酶注射液配方中的其它組份為0，取尿激酶干粉40000單位，使用時(shí)，按比例加入生理鹽水，即成為尿激酶注射液。實(shí)施例十 人精子中尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)和尿激酶型纖溶酶元激活因子受體(uPAR)的定位研究。
70年代末期Propping和Asted等人用生化的方法證實(shí)人精子中存在尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)。爾后，較多學(xué)者對(duì)它存在的生理意義進(jìn)行了追蹤研究，然而對(duì)uPA在精子中存在的部位缺乏了解。早期對(duì)uPA的生化研究多采用纖維蛋白平板法，因該方法受到精液中其它絲氨酸蛋白水解酶的干擾，缺乏特異性。盡管八十年代和九十年代采用酶標(biāo)法和放射免疫方法進(jìn)行測(cè)定，并證實(shí)了uPA的存在，但對(duì)uPA在精子中存在的部位一直只是一種推測(cè)，缺少形態(tài)學(xué)方面的證據(jù)。此外對(duì)精子中uPA的來(lái)源也一直存在爭(zhēng)論，有學(xué)者推測(cè)uPA是在精子通過(guò)生殖道的過(guò)程中結(jié)合上去的。如果是結(jié)合上去的，首先必須證明精子膜上存在uPA的受體，對(duì)精子中是否存在uPA受體的文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道。還有一種認(rèn)為uPA發(fā)揮生理作用是通過(guò)與uPA受體結(jié)合后才表現(xiàn)出生理效應(yīng)的，表明了uPAR存在的重要性。因此要進(jìn)一步了解uPA，開展uPA和uPAR的定位研究有重要意義。
我們先后采用免疫組織化學(xué)的方法，包括免疫膠體金光鏡法和膠體金雙標(biāo)記電鏡法、SABC熒光法等對(duì)正常男子射出體外的精子進(jìn)行了研究。作用的第一抗體分別來(lái)自國(guó)內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所和丹麥Finsen實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，uPA和uPAR主要分布在精子頂體內(nèi)外膜和頭部漿膜上。有趣的是我們還發(fā)現(xiàn)在精子尾部中段有uPA和uPAR的分布，該部位是精子線粒體集中的地方，線粒體主要為精子提供運(yùn)動(dòng)所需能量，以上發(fā)現(xiàn)均為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。根據(jù)uPA和uPAR分布的部位，推測(cè)他們的生理作用可能不同。位于精子頂體部位的uPA和uPAR可能參與頂體反應(yīng)，有助于精子對(duì)卵子的識(shí)別及精子穿過(guò)透明帶和宮頸粘液；位于精子尾部的uPA和uPAR可能與精子運(yùn)動(dòng)有關(guān)，以確保精子在附睪中不與管壁以及精子彼此間發(fā)生粘附，同時(shí)對(duì)精液的液化有促進(jìn)作用。實(shí)施例十一正常男子和弱精癥男子精子中uPA的含量和活性與精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)系。
人精液射出體外后，約5-30分鐘液化，液化后的精子具有運(yùn)動(dòng)能力，包括原地微動(dòng)，緩慢前向運(yùn)動(dòng)，中速運(yùn)動(dòng)和快速運(yùn)動(dòng)，還有一部分精子不活動(dòng)。普通光鏡下觀察這部分不動(dòng)的精子可能是死精子也可以是活精子，因某種原因而不能運(yùn)動(dòng)。通過(guò)對(duì)可動(dòng)和不動(dòng)精子的百分率來(lái)表示精子的活率。把所有運(yùn)動(dòng)的精子根據(jù)它們作前向運(yùn)動(dòng)的速度和百分?jǐn)?shù)來(lái)判斷精子活力的好壞。本研究就是了解uPA與精子活率和前向運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)系。人精子中存在uPA和uPAR在前面已被證實(shí)，但有關(guān)正常男子和弱精癥男子精子中的uPA含量和活性報(bào)道較少，通過(guò)對(duì)弱精癥男子精子中uPA的分析，可以了解到uPA對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的影響。
本研究通過(guò)對(duì)正常男子uPA含量和活性的測(cè)定，同時(shí)對(duì)弱精癥(精子活率低下和前向運(yùn)動(dòng)能力差)的不育癥男子精子中uPA含量與活性進(jìn)行對(duì)照并進(jìn)行相關(guān)分析。uPA活性測(cè)定采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法結(jié)合免疫阻斷法。含量測(cè)定采用ELISA雙抗夾心法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)弱精癥男子精子中uPA含量與活性顯著低于正常生育男子精子中uPA的含量，兩組間有極顯著性意義，經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)uPA的含量與精子活率和活力有明顯相關(guān)性。我們還發(fā)現(xiàn)，正常男子精子中uPA活性也高于弱精癥不育男子組，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有極顯著性差異。精子uPA活性值與精子活率，活力亦呈直線相關(guān)，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為精子中uPA與精子的活率和前向運(yùn)動(dòng)有一定關(guān)系。由于uPA可能參與生殖過(guò)程的許多方面，如精子的成熟、運(yùn)動(dòng)、精液的液化、宮頸粘液的穿透、與卵子的結(jié)合、頂體反應(yīng)、穿透透明帶、胚胎的發(fā)育及著床等。弱精癥男子引起的不育，可能是uPA含量與活性低下而引起精子運(yùn)動(dòng)能力差，不能運(yùn)行到女性輸卵管壺腹部受孕所致，但也不能完全排除因uPA低下而不能參與其它生殖過(guò)程而致不育。總之表明uPA與精子的運(yùn)動(dòng)有相關(guān)關(guān)系。實(shí)施例十二 uPA對(duì)弱精癥患者精子活力影響的實(shí)驗(yàn)研究50年代初Williams最先在人尿液中發(fā)現(xiàn)尿激酶，70年代末期Propping等人從精液中分離出兩種溶酶原激活因子，在免疫學(xué)和生物活性上類似尿激酶。后來(lái)研究者們用尿激酶免疫動(dòng)物生產(chǎn)出uPA多抗和單抗，用來(lái)進(jìn)一步研究uPA，早期發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)尿激酶實(shí)際上就是現(xiàn)在的uPA。通過(guò)對(duì)正常健康志愿者精液中加入尿激酶后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)尿激酶有提高精子運(yùn)動(dòng)的作用，證實(shí)uPA的確有提高精子活率和前向運(yùn)動(dòng)能力的作用。我們觀察了28例弱精癥男子。實(shí)驗(yàn)方法為離體精液體外試管法，將兩次精液分析精液參數(shù)除活率和或活力低下其它均正常的標(biāo)本作為研究對(duì)象，待精液液化后分別加入不同濃度的尿激酶，觀察加入尿激酶后30，60，90和120分鐘時(shí)精子活率的變化。另外一種實(shí)驗(yàn)是對(duì)弱精癥男子體內(nèi)給予尿激酶，連續(xù)用10天，觀察用尿激酶前后精子活率和前向運(yùn)動(dòng)能力的變化。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入尿激酶后30，60，90和120分鐘時(shí)對(duì)精子活率均有所提高，前向運(yùn)動(dòng)精子的數(shù)目亦有增加。體內(nèi)給予尿激酶后，精子平均活率由44.64％上升到64.71％，有極顯著性差異。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明尿激酶有提高精子活率和前向運(yùn)動(dòng)能力的作用。這一作用可能與降低精液粘稠度有關(guān)，但不排除有可能通過(guò)其它機(jī)制提高精子運(yùn)動(dòng)能力的可能。實(shí)施例十三 精漿中uPA活性和含量與精子活力的關(guān)系MacGregor等人發(fā)現(xiàn)精漿中纖溶酶原激活因子的濃度比血液中高出60-100倍。精漿中uPA存在的生理作用不是十分明了，推測(cè)可能與精液的液化有關(guān)。液化良好的精液有利于精子作前向運(yùn)動(dòng)。液化不良的精液，精漿中可見到細(xì)長(zhǎng)的纖維蛋白并相互網(wǎng)織使精子運(yùn)動(dòng)空間減少，精子的運(yùn)動(dòng)受到限制。我們測(cè)定了20例精液液化不良男子精漿中uPA活性，并同時(shí)與15例正常男了精漿中uPA活性進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液化不良組精漿中尿激酶活性明顯低于正常男子組，有極顯著性差異。此外我們也對(duì)22例精子活率低下組并無(wú)精液液化不良現(xiàn)象的不育癥男子進(jìn)行尿激酶測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精漿中尿激酶的含量低于精液參數(shù)正常組男子精漿尿激酶的含量，有極顯著性差異。根據(jù)前述的研究，精子活率低下(弱精癥)患者，精子中uPA活性與含量明顯降低，本研究發(fā)現(xiàn)弱精癥患者精漿中uPA含量也同時(shí)表現(xiàn)出低值。關(guān)于精漿中uPA或稱尿激酶的生理意義除降低精液粘稠度，有利精子運(yùn)動(dòng)外，是否還有其它方面的作用，還有待更進(jìn)一步的研究。
權(quán)利要求
1.一種治療男性不育障礙、弱精癥的藥物——主要成分為尿激酶，其特征在于該藥物中含有10000-100000單位的尿激酶，配方如下組分用量尿激酶 10000-100000單位β-環(huán)糊精 0-60mg甘露醇 0-100mg酸性介質(zhì)0-20mg聚乙二醇0-20mg黏合劑 0-25mg淀粉0-150蔗糖粉 0-250mg硬脂酸鎂0-6mg羧甲基淀粉鈉0-60吐溫0-2mg半合成脂肪酸酶 0-40mg總計(jì)10000-100000單位至300mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于尿激酶的用量?jī)?yōu)選在15000-80000單位之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于藥物中其它組份為0，尿激酶用量為10000-100000單位時(shí)，加入適量生理鹽水，制成注射液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于口含片的配方為配方 用量尿激酶10000-100000單位β-環(huán)糊精 6-60mg甘露醇30-100mg硬脂酸2-20mg聚乙二醇6000 2-20mg羥丙基甲基纖維素 1.5-15mg蔗糖粉5-250mg硬脂酸鎂 1-6mg合計(jì) 每片重300mg
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于口服片或膠囊的配方為配方 用量尿激酶 10000-100000單位β-環(huán)糊精0-60mg淀粉 30-150纖維素 5-50mg羧甲基淀粉鈉 0-100mg硬脂酸鎂 0-6mg二氧化硅 0-10mg
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于所述β-環(huán)糊精為羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、乙基-β-環(huán)糊精(E-β-CD)、二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)、三甲基-β-環(huán)糊精(TM-β-CD)、單糖基-β-環(huán)糊精(G1·β-CD)、雙糖基-β-環(huán)糊精(G2·-CD)、麥芽三糖基-β-環(huán)糊精(G3·β-CD)、二單糖基-β-環(huán)糊精(2G1·β-CD)、二雙糖基-β-環(huán)糊精(2G2·β-CD)等，如欲要求進(jìn)一步緩釋，亦可選擇二乙基-β-環(huán)糊精(DE-β-CD)、三乙基-β-環(huán)糊精(TE-β-CD)等，也可以是兩種或兩種以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述β-環(huán)糊精，其特征在于優(yōu)選二甲基-β-環(huán)糊精、乙基-β-環(huán)糊精(E-β-CD)和三乙基-β-環(huán)糊精。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于其中粘合劑選自如下的一種或組合羥丙甲纖維素、乙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚a-羥乙甲基丙烯酸酯、聚維酮、聚醋酸乙烯酯、醋酸纖維素、糊精、白糊精、微晶纖維素、甲基纖維素、丙烯酸甲酯、丙烯酸樹脂I-IV號(hào)、羥乙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、卡泊姆、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣等等，這樣進(jìn)一步增強(qiáng)尿激酶的穩(wěn)定性。優(yōu)選的粘合劑選自羥丙甲纖維素、乙基甲基纖維素、乙基纖維素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療男性不育障礙、弱精癥的藥物，其特征在于所述配方中的聚乙二醇，可以是聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，聚乙二醇7000或其它各種型號(hào)的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。
10.一種治療男性不育障礙、弱精癥的藥物——尿激酶口含片的制備工藝，其特征在于①先將聚乙二醇用溫水溶解，冷卻，加尿激酶攪拌均勻，加β-環(huán)糊精不斷攪拌，約2-6hr使之包合完全，過(guò)濾后，用清水洗凈即得包合物；②將甘露醇、硬脂酸、蔗糖粉等輔料混合均勻，加包合物，再充分混合均勻后加3％的羥丙基甲基纖維素，制成軟材，然后用16目篩制顆粒，以40--70℃鼓風(fēng)干燥4-8hr，以16目篩整理；③將整理好的顆粒加硬脂酸鎂，混合均勻即可；用專用模具壓片，片重約為300mg/片。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備工藝，其特征在于該工藝中的①和②步得到的顆粒，可以用于制備口服片劑和膠囊。
12.一種治療男性不育障礙、弱精癥的藥物——尿激酶口服片或膠囊的制備工藝，其特征在于1.將HPMC加適量EtOH分散后，加60-80℃蒸餾水稀釋至需要濃度，密閉放置過(guò)夜后，過(guò)70-80目篩備用(研磨劑、粘合劑)。2.將所有輔料加入，攪拌均勻?yàn)楹隣?，加尿激酶制藥軟材?.將軟材以18目制粒，40-60℃通風(fēng)干燥，18目整粒。4.干燥整粒后加羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂混合均勻壓片或加二氧化硅制膠囊。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿激酶口服固體制劑、栓劑，在治療男性不育障礙、弱精癥的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種男性不育障礙、弱精癥的治療藥物—尿激酶,尿激酶制劑以及尿激酶制劑對(duì)男性不育障礙、弱精癥治療的新用途,注射和口服制劑可以用傳統(tǒng)的劑型配方,本發(fā)明還采用β－環(huán)糊精對(duì)尿激酶進(jìn)行包含,配合獨(dú)特的制備工藝,研制成有生理活性的口含型藥物片劑,使尿激酶的療效顯著提高,并減輕了該物質(zhì)的副作用,增強(qiáng)了穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該藥物保持了尿激酶的活性,可有效地發(fā)揮其治療男性不育障礙、弱精癥的新用途。
文檔編號(hào)A61K38/49GK1260997SQ9912193
公開日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1999年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者丁釘生, 熊承良 申請(qǐng)人:珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)生物化學(xué)制藥廠