保護動物免于慢病毒相關疾病的組合物和方法

專利名稱：保護動物免于慢病毒相關疾病的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及一種新的貓免疫缺損病毒(FIV)毒株和該病毒各種突變形式。公開了可用于保護動物免于與慢病毒相關的疾病的組合物和方法。
貓中的貓免疫缺損病毒(FIV)感染導致與人被人免疫缺損病毒-1(HIV-1)感染導致的癥狀類似的疾病癥狀。疾病過程由短暫的急性期(8-10周)開始，接著是延長的無癥狀期(持續數周至數年)和最終的癥狀期(Ishida等，1990日本獸醫科學雜志52645-648)。血漿中的病毒負載被證實與被感染貓的疾病期相關并可被用來預測加速FIV感染的疾病進程(Diehl等，1996，病毒學雜志，702503-2507)。
從結構上來講，FIV原病毒包含兩個長的末端重復(LTRs)，基因組的一個末端一個(Talbott等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA865743-5747)。具有三個大的開放讀框(Gag(群抗原)；Pol(聚合酶)；和ENV(被膜))和編碼調節蛋白的三個小的開放讀框(Rev(病毒體表達的調節物，與存在于所有病毒轉錄物中的“RRE”元件結合并促進其從核轉移至感染的宿主細胞的細胞質中的蛋白)；Vif(病毒體感染性因子)；和ORF(2)(開放讀框2))。FIV的Gag前體多肽被加工成三種成熟的結構蛋白基質蛋白(MA)、殼體蛋白(CA)和核殼蛋白(NC)。Pol基因編碼四種酶蛋白蛋白酶(PR)、逆轉錄酶(RT)、脫氧尿苷三磷酸酶(DU)和整合酶(IN)。最后，ENV前體多肽被加工成兩個被膜蛋白表面蛋白(SU)和跨膜(TM)蛋白。
現已努力來開發一種安全有效的FIV疫苗。Matteucci發現接種了常規固定細胞疫苗的貓被保護免于同源病毒的攻擊，盡管在接種后明顯不存在中和抗體。發現保護為短期的且難于強化(Matteucci等，1996，病毒學雜志70617-622；Matteucci等，1997，病毒學雜志718368-8376)。這些結果可能與Verschoor的相反，在給予固定細胞疫苗后他未觀察到保護作用(Verschoor等，1995，獸醫免疫學與免疫病理學46139-149)。
測試的另一種類型的常規疫苗由完整滅活的FIV病毒組成。Yamamoto報道大于90％的被給予了這種類型的疫苗的貓基本顯示完全的抗同源攻擊的保護和輕微的抗異源病毒的保護(Yamamoto等，1993，病毒學雜志67601-605)。在接種的貓中誘導抗FIV的體液和細胞免疫性，并觀察到高水平的抗ENV、抗核心和病毒中和(VN)抗體。相反，接種了摻入到免疫刺激復合物(ISCOMs)中的滅活的完整FIV的貓未保護動物免于同源攻擊(Hosie等，1992，獸醫免疫學與免疫病理學35191-197)。
另一種疫苗開發方法涉及使用包含重組核心蛋白、合成V3肽和重組ENV蛋白的亞單位疫苗(Elyar等，1997，疫苗151437-1444)。雖然通過該疫苗誘導顯著水平的抗體，但沒有鑒定出可保護貓抗同源FIV攻擊的抗體(Huisman等，1998，疫苗16181-187；Flynn等，1997，病毒學雜志717586-7592；Tijhaar等，1997，疫苗15587-596)。結果表明使用亞單位類型的疫苗獲得抗FIV的保護性免疫可能是困難的。
最近，Cuisinier報道了針對用于FIV的DNA疫苗進行的試驗(Cuisinier等，1997，疫苗151085-1094)。對貓接種攜帶FIV結構基因的質粒，包括ENV和p10。雖然觀察到強的體液免疫應答，但所有貓最終死于同源攻擊。
本發明部分基于在本文稱為FIV-141的一種新的貓免疫缺損病毒毒株的分離和鑒定。病毒的全部基因組序列已被確定，并不同于所有其它已知的FIV序列。編碼FIV-141的質粒被保藏為ATCCNo.203001。A.基于FIV-141病毒的組合物和方法在第一個方面，本發明涉及具有對應于SEQ ID NO1的基因組序列的基本純化的FIV-141病毒，被該病毒感染的宿主細胞以及在宿主細胞中產生的子代病毒。術語“基本純化的”指FIV-141已從所有其它病毒毒株，尤其是從FIV所有其它毒株中分離。可用于培養病毒的宿主細胞包括外周血單核細胞(PBMCs)。可使用如下所述的標準方法分離子代病毒。
FIV-141病毒和被該病毒感染的宿主細胞可被用來感染動物，用于誘導產生優先與一種或多種FIV毒株反應的抗體。如本文所采用的，抗體的“優先結合”指對FIV具有比任何其它病毒或非FIV蛋白高至少100倍的親和性。可在任何通常用于此目的的動物中產生抗體(如小鼠、兔、山羊或綿羊)，但優選在家貓中制備抗體。當病毒被用來誘導抗體產生時，如果需要，可在感染之前將其滅活。滅活方法可包括將病毒用福爾馬林、低聚甲醛、苯酚、乳丙酸、紫外線、加熱、補骨脂、內酯鉑復合物、臭氧或其它殺病毒劑處理。當表達FIV-141的宿主細胞被用來誘導抗體產生時，可在感染前固定細胞。通常，這包括如本文所描述的將細胞用低聚甲醛處理，但也可以常用其它方法。針對FIV-141制備的抗體本身被包括在本發明范圍中，并可使用現有技術熟知的方法純化(參見例如Harlow等，1988，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，N.Y.)。
另一方面，本發明涉及含有滅活的FIV-141病毒的全病毒疫苗。可通過以足以誘導抗隨后的FIV-141感染的保護性免疫的量和持續時間給予該疫苗來誘導貓中的免疫應答。通常，經胃腸外以例如2-8周的間隔進行兩次或多次接種來施用疫苗。本發明還包括固定細胞疫苗，其由被FIV-141病毒感染的宿主細胞組成。該疫苗的施用遵循用于全病毒疫苗所使用的相同的常規方法。本領域熟知的標準方法可用于優化免疫接種程序。B.基于FIV-141基因組核酸的組合物和方法在另一個方面，本發明涉及具有對應于SEQ ID NO1的序列的基本純化的核酸分子(DNA或RNA)。如本文所采用的，“基本純化的”指所需產物基本上不含污染的細胞成分。“基本純化的”核酸通常含有至少85％的樣品，優選更高的百分數。污染物可能包括蛋白、碳水化合物或脂類。用于確定核酸純度的一種方法為在如聚丙烯酰胺或瓊脂糖介質中將制備物進行電泳。通過染色后單一帶的出現來證實純度。用于評價純度的其它方法包括色譜和分析離心。可使用FIV-141核酸取代全病毒來轉染宿主細胞，從而誘導子代病毒或病毒蛋白的產生。
本發明還包括通過將核酸直接注射至動物中或通過施用被核酸轉染的宿主細胞來誘導針對FIV-141的抗體產生的方法。如上面對全病毒所討論的方法，可在施用前固定宿主細胞。可從動物中純化抗體并用于設計用來檢測培養基或生物液體中FIV存在的分析中。
被FIV-141基因組DNA轉染的宿主細胞還可被用在用于免疫貓的疫苗中。如果需要，可將這些細胞固定以降低病毒感染性，例如通過用如低聚甲醛的試劑處理。以這種方法制備的疫苗可被用來誘導貓中的免疫應答。可使用被優化用于誘導抗隨后的被FIV-141，或者如果需要，被FIV的一些其它毒株感染的保護性免疫的標準免疫方法來施用疫苗。C.減毒的FIV-141病毒和疫苗在可將全病毒作為疫苗施用于動物之前，必須將其轉化為非致病形式。如上面所討論的，這可通過滅活病毒或固定宿主細胞來實現。另一種方法包括將突變導入病毒中以將其轉化為減毒形式。如本文所采用的，術語“減毒病毒”指與其野生型對應物相比，具有顯著降低的感染性的病毒。如本文下面實施例部分所描述的，感染性可在PBMCs中測定。
因此，本發明涉及相對于野生型(即非突變的)病毒，顯示對貓T淋巴細胞顯著降低的感染性的減毒FIV-141病毒。通過突變FIV-141基因組中的一個或多個基因來制備減毒病毒，其中這些基因選自Vif、MA、ORF(2)、ENV、CA、NC、SU、TMf、CT、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE。本文描述了其中每一個基因的適宜的突變。可用于制備減毒病毒的一些特定突變的實例包括MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8del、TMF del、CTdel、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、CA del、NC del、IN del、DU del、SU del和RRE del。本發明還包括被減毒病毒感染的宿主細胞和由這些細胞產生的子代病毒。一旦產生，可使用標準方法從宿主細胞中純化減毒病毒。
可通過用減毒病毒感染動物來誘導抗體的產生，或另一方面，可使用感染的宿主細胞。如果需要，可在施用于動物之前，滅活病毒或固定宿主細胞，并可使用標準方法從動物中純化抗體。
此外，本發明包括使用如上所述的減毒的全病毒或被其中一種病毒感染的宿主細胞的疫苗。而且，可滅活減毒病毒并可固定宿主細胞。這些處理可提供疫苗本身不導致感染的附加的保證。基于一種或多種減毒的FIV-141病毒的疫苗可被用來誘導貓中的保護性免疫。在施用疫苗中可遵循標準的免疫方法以優化誘導抗隨后的FIV-141攻擊的保護性免疫。D.基于突變的FIV-141基因組DNA的組合物和方法另一方面，本發明涉及具有對應于SEQ ID NO1的序列，但被突變來編碼減毒病毒的基本純化的FIV-141核酸(DNA或RNA)。突變為選自Vif、MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vifn、Vifc、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE的一個或多個基因，并以在導入宿主細胞中時，相對于野生型病毒，產生對貓T淋巴細胞(或其它敏感的細胞類型)顯著降低的感染性的病毒的方式來進行突變。本文描述了一些產生適宜的減毒病毒的特定突變的實例，包括MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8 del、TMf del、CT del、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、SU del、CA del、NC del、IN del、DU del和RRE del。本發明包括被突變核酸轉染的宿主細胞和由宿主細胞產生的FIV子代病毒。
還包括在本發明范圍中的是一種通過注射如上所述突變的核酸或被核酸轉染的宿主細胞來誘導動物中FIV抗體產生的方法。如果需要，可在施用前固定宿主細胞。可使用標準方法純化產生的抗體并用于設計用來檢測FIV存在的分析中。
突變的核酸，優選DNA可被用于疫苗中，其中它以在施用于貓中時足以誘導保護性免疫的濃度存在。另一方面，疫苗可包括被該DNA轉染的宿主細胞，如果需要，可在病毒蛋白表達后固定宿主細胞。可以足以在貓中誘導免疫應答的劑量和持續時間來施用疫苗，并可優化用于誘導抗隨后的FIV-141感染的保護性免疫的免疫方法。E.制備和使用減毒慢病毒的方法本文公開的方法以及減毒的FIV-141的制備可被有效地用于FIV其它毒株和慢病毒的其它類型的減毒中。可通過突變一個或多個基因來制備相對于其未突變的野生型對應物具有顯著降低的感染性的病毒，其中所述基因選自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、Vif、ORF(2)、Vifn、Vifc、IN、V3/4、V7/8和RRE。突變應被設計為消除或顯著降低基因產物的活性。這可通過缺失整個基因或通過缺失整個基因的大(例如1/4)部分來實現。本發明包括使用所公開的方法制備的減毒的慢病毒，被這些病毒感染的宿主細胞和通過將減毒病毒注射至哺乳動物中來誘導抗體產生的方法。抗體可從感染的哺乳動物中純化并用于免疫分析。另外，純化的抗體或來自被減毒病毒感染的動物的含有抗體的血清可被用來治療哺乳動物的慢病毒感染。
如本文所采用的，術語“保護性免疫的誘導”等被用來廣義地包括對接種產生應答的任何基于免疫的應答的誘導，包括起保護接種的哺乳動物抗特定的慢病毒作用的抗體或細胞介導的免疫應答或兩者。如本文所采用的術語“保護性免疫”，“保護性應答”，“保護”等不僅指對由特定的慢病毒感染導致的哺乳動物中的所有癥狀或疾病的絕對保護，而且指所有該癥狀或疾病啟動的可檢測的延遲，所有被特定慢病毒的感染的程度或速率的可檢測的降低或所有由特定慢病毒感染導致的疾病或癥狀或病情的嚴重性的可檢測的降低。根據本發明的疫苗制劑應以足以減少一種或多種與哺乳動物感染相關的臨床信號和病毒負載的劑量和持續時間來施用。當慢病毒為一種FIV毒株時，被治療的哺乳動物為貓，與感染相關的信號包括免疫異常，如異常低水平的CD4+T淋巴細胞或異常增加數目的CD8+T淋巴細胞。其它臨床信號通常包括脫發、貧血、慢性鼻炎、結膜炎、腹瀉、消瘦、腸炎、齦炎、便血、神經異常和皮炎。
減毒的慢病毒(例如FIV的減毒株)或被該病毒感染的宿主細胞可以當施用于哺乳動物(如貓)時足以誘導免疫性的濃度用于疫苗中。可接著通過以足以誘導抗隨后的被至少一種慢病毒毒株感染的保護性免疫的劑量和持續時間施用該疫苗來誘導免疫應答。F.制備和使用突變的慢病毒核酸的方法本發明還涉及一種制備適用于抗慢病毒，例如FIV感染的疫苗中的核酸的方法。這通過逆轉錄慢病毒的基因組RNA；克隆逆轉錄產物；突變一個或多個選自MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vif、Vifn、Vifc、V3/4、V7/8、IN、DU和RRE；并接著克隆突變的核酸來完成。優選地，突變應為在導入宿主細胞中時，產生相對于通過未突變的野生型核酸產生的慢病毒，具有顯著降低的感染性的減毒病毒。在FIV的情況下，對貓T-淋巴細胞的感染性應被降低或消除。
突變的慢病毒核酸可以如上面對FIV-141描述的相同方式純化并用來轉染宿主細胞，制備子代病毒，以及制備抗體。此外，核酸或被核酸轉染的宿主細胞可被摻入至疫苗中并被用來誘導哺乳動物中的保護性免疫。優選地，核酸編碼在貓PBMC中具有顯著降低的感染性的FIV減毒株，包括T-淋巴細胞，如FeP2細胞。在這些情況下，在貓中將誘導免疫應答。


圖1來自轉染細胞的FIV的產生。將Crandel貓腎(CRFK)細胞用包含全長FIV-141基因組的質粒轉染。在轉染后24小時開始收集細胞懸液并使用酶免疫分析法分析FIVp26殼體蛋白的存在。
圖2通過共培養感染FeP2 T淋巴細胞。將CRFK細胞培養在6孔平板中，并用編碼全長FIV-141基因組的質粒DNA轉染。轉染后48小時，將2×106FeP2細胞加入各孔中。共培養后72小時開始分離FeP2細胞，并通過ELISA檢測它們上清中的FIV p26殼體蛋白的存在。
圖3通過吸附作用感染FeP2細胞。將2×106FeP2細胞懸浮在200ul來自用全長感染性FIV-141克隆轉染的CRFK細胞的含有FIV-141病毒的條件培養基中。在感染后4天開始使用p26 ELISA分析來檢測FeP2細胞上清的FIV-141病毒的存在。
圖4通過缺失克隆表達FIV-141病毒蛋白。制備各種突變缺失FIV基因或調節區的克隆，并轉染至CRFK細胞中。48小時后，通過ELISA分析細胞上清的FIVp26殼體蛋白的存在。顯示了各種缺失克隆以及野生型FIV-141分子克隆的結果。
圖5-10通過FIV-141突變體感染FeP2 T淋巴細胞。將CRFK細胞培養在六孔平板中，并用三種不同FIV-141缺失克隆中的一種感柒；Tmf del、ENV del或NC del。48小時后，將FeP2細胞加入到各孔中，并將共培養物再培養72小時。接著將FeP2細胞與CRFK細胞分離，使用ELISA分析法分析p26抗原的存在。將p26水平的檢測每3-4天重復一次，結果示于圖5中。使用下面克隆重復實驗Vifndel、Vifc del和Vif del(圖6)；MA del和CA del(圖7)；V3/4 del；V7/8 del和CT del(圖8)；ORF(2)del(圖9)；和DU del，SU del，IN del和RRE del(圖10)。A.FIV-141和編碼病毒的DNA的制備本發明涉及一種新的基于其基因組核酸序列和生物功能不同于所有類似毒株的貓疫苗缺陷病毒的毒株(本文稱為“FIV-141”)。雖然FIV-141的基因組由RNA組成，但它被逆轉錄為DNA并整合至感染宿主的基因組中。應理解本文涉及FIV的序列和該序列的突變形式包括逆轉錄的病毒RNA序列以及其對應的DNA。
已熟知如定點誘變的方法可用來將變異導入核酸的結構中。本發明包括通過這種或一些類似的方法導入的FIV-141核酸序列中的突變，只要產生的病毒的至少一個主要生物特性，例如其抗原性基本保持與產生它的病毒相同。在一個優選但非限制性的具體實例中，與野生型毒株比較，可檢測地降低FIV-141感染性的突變落入本發明的范圍內。例如下文描述的產生復制但顯示大大降低的感染性的病毒的ENV基因組中的特定突變。本發明包括導致顯著降低的病毒感染性的這種突變和其它突變。
如實施例部分所討論的，完整的FIV-141基因組已被克隆，含有全長序列的質粒已被保藏，保藏號為ATCC 203001。可使用標準方法來分離該質粒并將其轉染至能支持病毒產生的宿主細胞中。Crandel貓腎(CRFK)細胞已被發現適宜于此目的，但也可使用其它細胞類型，如貓T淋巴細胞。在一些情況下，可直接使用表達病毒的宿主細胞，例如可收集它們并用于產生抗體或以疫苗的形式使用。另外，可使用已知的分離方法，如蔗糖梯度離心以高度純化的形式分離細胞中產生的病毒。這些方法對于野生型病毒和病毒的突變形式均有效。
另一種獲得FIV-141基因組的方法為使用對應于SEQ ID NO1序列部分的引物進行PCR擴增。通常，引物應為約20-50堿基長度。設計擴增完整的FIV-141基因組的方法，或可單獨擴增基因組的某些部分，并接著連接在一起以形成全長序列。下面實施例部分描述了已被發現為有效的具體的引物和方法，但可開發和使用另外的方法。
如果病毒從天然來源分離，那么PCR引物應對應于FIV-141所特有的序列。使用這些引物的成功的擴增表明導致感染的病毒實際上為FIV-141。因此，可診斷性地以及在分離病毒的方法中使用PCR。B.滅活的病毒和固定的宿主細胞的制備FIV-141病毒可被用來在適宜宿主中產生抗體以及用于疫苗中。在每一種情況下，通常可望在對動物施用之前滅活病毒。可通過本領域已知的任何方法完成滅活。例如，可純化病毒，接著通過在0.8％福爾馬林或1.25％低聚甲醛中保溫約24小時來滅活。這些方法可用于野生型或突變型病毒。
還可使用被FIV-141感染的宿主細胞或該病毒的突變形式產生抗體或完成免疫。可使用任何能支持病毒復制的宿主細胞，包括外周血單核細胞(PBMCs)。通常，應在施用于動物之前將細胞固定。可通過在37℃下將細胞用低聚甲醛(例如1.25％)處理約24小時來進行固定。上面討論的其它用于滅活病毒的方法也可用于固定細胞，也可使用現有技術公開的任何其它方法。C.減毒病毒的制備如上面所描述的，可使用滅活的病毒或固定宿主細胞來制備疫苗。另一種方法是使用已通過突變病毒基因組中的一個或多個基因被減毒的病毒。目的是產生當施用于貓時不具有感染性的病毒。在體外可通過用病毒感染細胞(例如PBMCs)，接著測定病毒的水平如何隨時間變化來確定病毒復制的速率。復制之后可使用測定FIV特異性抗原的免疫分析進行定量PCR或測定病毒特異性酶(例如逆轉錄酶)的活性。可通過將貓T淋巴細胞(例如FeP2細胞)暴露于病毒中并測定細胞攝取病毒以及支持復制的程度來確定感染性(參見下面實施例4)。
可通過定點誘變來產生FIV-141基因組的突變。實施它的一種方式是用將變異導入正常基因序列中的引物擴增病毒基因。例如，可在基因組的選定區導入獨特的限制性位點，并且接著可通過限制酶消化切除這些位點之間的序列。切除后，可重新連接基因組DNA的剩余部分，接著導入適宜宿主細胞中以產生突變病毒。制備和檢測突變病毒和突變病毒基因組的詳細描述提供在下面實施例3和4中。可在表1中找到被導入的各種突變的概況。表1FIV-141中的突變
產生適宜于施用于動物以誘導抗體產生或用于疫苗中的減毒病毒的一些具體突變的實例為MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8 del、TMf del、CTdel、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、CA del、NC del、SU del、IN del、DU del和RRE del。因此，在Vif、MA、ORF(2)、ENV、Vifn、Vifc、V3/4、V7/8、TMf、CT、SU、CA、NC、IN、DU或RRE的任一個突變的病毒為減毒的，滅活這些基因的其它核苷酸缺失或改變應產生具有類似特性的病毒。D.FIV-141抗體的產生和被感染貓的治療可在通常用于抗體產生的任何動物中產生FIV-141抗體，包括小鼠、兔等。然而，優選在貓中產生抗體。如果野生型病毒被用作抗原，應在施用前滅活病毒。當使用減毒病毒時，例如被突變以降低或消除其感染性的病毒時，不需要宿主細胞的滅活或固定，雖然如果需要可進行這些步驟。
含有病毒的組合物可通過任何途徑施用于動物，但通常經肌肉內、皮下或靜脈內對動物進行注射。通常，病毒制劑包括佐劑，例如Freund’s完全或不完全佐劑。用于注射、注射方案等的適宜的制劑為本領域所熟知并可被用于FIV-141和其突變體(參見例如Harlow等，1988，抗體，實驗室手冊，冷泉港實驗室，N.Y.；Klein，1982，免疫學自身-非自身分辨的科學)。還可使用單克隆抗體，并可使用標準方法制備(Kennett，等，1980，單克隆抗體和雜交瘤生物分析的新視野；Campbell，1984，“單克隆抗體技術”，在生物化學和分子生物學中的實驗室技術)。
與FIV-141特異性反應的抗體或抗體片段(即具有比任何其它病毒高至少100倍的對FIV-141親和性)也可被用于任何各種免疫分析中。例如，在還被稱為“2-位點”或“夾心”分析法的放射免疫分析法或放射測定分析法中，抗體可被用來檢測FIV-141(參見Chard，1978，“放射免疫分析和相關技術入門”，在生物化學和分子生物學實驗室技術，North Holland Publishing Co.N.Y.)。在常規的免疫測定分析法中，大量未標記的抗體與不溶于被檢測液體，如血液、淋巴、細胞提取物等中的固體載體結合。在抗原與固定抗體的最初結合后，加入大量可檢測的標記二抗(它可與一抗相同或不同)以使得能進行抗原的檢測和/或定量(參見例如Kirkham等(編)，1970，放射免疫分析法，pp.199-206，E&S Livingstone，Edinburgh)。現有技術已知許多修改的這些類型的分析法，并可被用于FIV的檢測。E.常規疫苗和接種方法許多作者已討論了采用不同FIV毒株或極其相關的病毒的疫苗和接種方法(Elyar等，1997，疫苗151437-1444；Yamamoto等，1993，病毒學雜志67601～605；Murphey-Corb等，1989，科學2401293-1297；Jarrett等，1990，AIDS 4S163-S165；和Desrosiers等，1989，Proc.Natl’s Acad.Sci.USA 866353-6357)。在FIV-141的情況下，具有三種類型的可采用的疫苗滅活的全病毒疫苗、固定細胞疫苗和減毒病毒疫苗。
通常，疫苗在約0.5-5ml的體積中包含約1×106-約1×108病毒顆粒。使用如Remington’s藥物科學，1982，Mack 出版公司，Easton，Pa.第16版中描述的標準方法進行配制。制劑可包含滅活的病毒、固定的宿主細胞或減毒病毒以及載體和一種或多種佐劑。疫苗通常被設計用于胃腸外給藥，雖然本發明也包括其它形式的給藥。最優選的疫苗包含當施用于貓時為完全或基本上完全無感染性的減毒病毒。
免疫方法通常包括由3-10周間隔分開的疫苗的數次接種(例如3次接種)。現有技術熟知優化接種方法和其它與免疫相關的參數的方法。F.DNA疫苗描述使用核酸(DNA或RNA)的疫苗和接種方法的參考文獻包括美國專利5,703,055、US專利5,580,859和US專利5,589,466。以該方法送遞的免疫原通常引起體液和細胞免疫應答。
這些方法可被用來產生抗FIV的疫苗，其中對應于減毒的FIV-141的核酸被施用于貓。
編碼減毒FIV-141基因組的DNA或RNA可被用于疫苗中，但通常優選DNA。DNA可以“裸露”的形式存在或可與利于細胞攝取的試劑(例如脂質體或陽離子脂類)一起施用。通常的給藥途徑為通過肌肉內注射約0.1-5ml疫苗。疫苗中的總核苷酸通常應以約0.1ug/ml-約5.0mg/ml存在。多核苷酸可以懸浮液、溶液或乳液的一部分存在，但通常優選含水載體。
使用DNA疫苗免疫貓可以一次或以分開的劑量的多次單獨接種的形式來進行，例如以3-10周的間隔。如果需要，可從接種動物中收集血清并檢測FIV-141或其它FIV毒株的抗體的存在。G.其它慢病毒的方法學的擴展上面討論的用于減毒FIV-141和制備適用于疫苗中的突變病毒核酸的方法可被擴展至FIV的其它毒株和其它類型的慢病毒。在每種情況下，克隆病毒基因組并在一個或多個選自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、ORF(2)、Vif、Vifn、V3/4、V7/8、IN和RRE的基因中突變。突變應被設計成滅活基因產物。這通常可最容易地通過缺失整個基因或基因的重要部分來完成。雖然用于誘導突變的具體的方法將取決于病毒而變化，但基本的方法是現有技術中常用的，并且使用本文公開的方法作為指導，專業的分子生物學家可很容易地進行。抗體的產生，疫苗的制備和施用等可如本文對FIV-141所討論的，在需要時進行極小的修改而完成。
此外，設想某些慢病毒的抗體可被用來提供對病毒感染的動物或人的被動免疫性。純化抗體或包含抗體的血漿可被用于此目的，可在階段性的基礎上施用制劑直至觀察到在一種或多種與病毒感染相關的信號的改善。實施例實施例1感染性FIV原病毒DNA克隆的構建A.FIV-141的分離和克隆病毒的分離從FIV-感染的貓的血漿中分離FIV-141。通過將來自感染貓的血漿施用至特定的無病原體(SPF)的貓中來擴增病毒。通過病毒分離和血清轉變來證實被接種貓的感染。攻擊后12周將貓處死，收集組織，脾被作為用于FIV-141基因組的分子克隆的病毒的來源。根據制造商提供的方法，使用DNA提取試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)從感染脾中分離基因組DNA。將純化的基因組DNA以1ug/ml的濃度溶解在TE緩沖液中，并儲存于-70℃。FIV-141基因組的三個片段的PCR擴增和克隆根據公開的其它 FIV分離物的序列(Talbott等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，865743-5747；Miyazawa等，1991，病毒學雜志651572-1577；Talbott等，1990，病毒學雜志644605-4613)設計三套寡核苷酸。這些核苷酸被用來擴增FIV-141基因組的三個片段，一個位于5‘末端，一個位于3’末端和一個位于基因組的中間。由于在感染組織中的FIV原病毒基因組的低拷貝數目，使用各片段的半重疊引物組進行兩輪PCR擴增。
三個引物被用來克隆來自FIV-141原病毒基因組的5’末端的片段，從核苷酸118至646。該區包括大多數5’長末端重復區、5’長末端重復區與Gag開放讀框之間的間插序列和Gag基因的N末端部分。引物的序列如下正向引物pr-1(117-CCGCAAAACCACATCCTATGTAAAGCTTGC-146，SEQ ID NO2)和兩個反向引物，pr-2(646-CGCCCCTGTCCATTCCCCATGTTGCTGTAG-617，SEQ ID NO3)和pr-8(1047-TTACTGTTTGAATAGGATATGCCTGTGGAG-1018，SEQ IDNO4)。使用200ng各種pr-1和pr-8作為引物和1ug基因組DNA作為模板以及0.5單位的Taq DNA聚合酶(Gibco，BRL Gaithersburg，MD)和1單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)的混合物進行第一輪PCR擴增。94℃下擴增進行1分鐘；接著是30次的94℃下45秒的變性；52℃下退火45秒；接著72℃下延伸2分鐘。使用引物pr-1和pr-2以及2ul第一輪PCR產物作為模板進行第二輪擴增。將第一輪擴增所采用的相同條件用于第二輪中，但在55℃的溫度下進行退火。
三種寡核苷酸也被用來克隆來自FIV-141原病毒基因組3’末端的片段。該片段包括核苷酸8874-9367，其由大部分3’長末端重復區和3’長末端重復區與ENV基因之間的間插序列組成。三種引物的序列如下兩個正向引物，pr-5(8793-GCAATGTGGCATGTCTGAAAAAGAGGAGGA-8822，SEQ ID NO5)和pr-7(8874-TCTTCCCTTTGAGGAAGATATGTCATATGAATCC-8907，SEQ ID NO6)和反向引物，pr-6(9367-TCTGTGGGAGCCTCAAGGGAGAACTC-9342，SEQID NO7)。引物pr-5和pr-6被用來進行首輪擴增，pr-6和pr-7被用來進行第二輪擴增。將與在來自上述FIV-141 5’末端的片段的擴增中相同的條件用于本次擴增中。
為了克隆來自FIV-141基因組的中間部分的從核苷酸5147延伸至5631并包括IN基因的C末端部分和Vif基因的N末端部分的片段，使用正向引物pr-3(4738-ACAAACAGATAATGGACCAAATTTTAAAAA-4767，SEQ ID NO8)和反向引物pr-10(5631-TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT-5604，SEQ ID NO9)。使用正向引物pr-9(5147-TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT-5176，SEQ IDNO10)反向引物10進行第二輪擴增。
在完成第二輪PCR擴增后，將產物加至1％瓊脂糖凝膠中并通過Wizard PCR Preps試劑盒(Promega，Madison，WI)純化所有三個片段的預期帶。根據制造商推薦的方法，將純化的PCR片段克隆至PCR-Script Amp SK(+)載體(Stratagene，La Jolla，CA)中。通過限制酶消化，接著測序質粒DNA(高級基因分析中心，St.Paul，MN)的兩條鏈來證明插入。為了消除在擴增期間通過DNA聚合酶產生的FIV序列中的“錯誤”，測序來自三個獨立的PCR擴增的克隆的每一個區。來自三個獨立克隆的共有序列被認為是真實的FIV-141序列。
結合來自5’和3’末端的片段表明FIV-141的長的末端重復由354個堿基組成，包括U3區的208個堿基，R區的79個堿基以及U5區的67個堿基。末端2-堿基的倒轉重復區，TATA試劑盒，聚腺苷酸化信號和許多推測的順式作用的增強子-啟動子元件相對于其它FIV分離物被完好地保存了。
FIV-141的完整原病毒基因組的PCR擴增和克隆使用上面描述的三個克隆片段獲得的序列信息被用來設計可被用來擴增和克隆為5’一半和3’一半的兩個片段的全部原病毒基因組的FIV-141特異性引物。通過用半重疊的引物組的兩輪擴增來擴增每一半。
為了擴增FIV-141基因組的5’一半(從核苷酸1-5460)，使用正向引物pr-11(1-TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAATA-30，SEQ ID NO11)和反向引物pr-10進行首輪擴增。擴增方法遵循Clonetech的Advantage Genomic PCR試劑盒(Palo Alto，CA)提供的方法。簡單地說，在50ul總體積中進行PCR反應，其中含有1ul基因組DNA模板(1ug/ml)，1ul各種引物(100ng/ul)，5ul 10×Tth PCR反應緩沖液，2.2ul 25mMMg(OAc)2，1ul 50×dNTP混合物(每一種為10mM)，1ul 50×Advantage Tth聚合酶混合物，1ul Pfu聚合酶(2.5U/ul)和36.8ul無菌水。94℃下，將反應混合物加熱2分鐘，接著進行30次擴增94℃，30秒，68℃，6分鐘。使用2ul第一輪PCR產物作為模板，相同的正向引物pr-11和反向引物pr-12(5460-CATATCCTATATAATAATCACGCGTATGAAAGCTCCACCT-5421，SEQ ID NO12)進行第二輪擴增。為了便于構建來自兩半的全長FIV-141基因組，將限制酶位點Mlu I(下化線的)加入到引物pr-12中。在第二輪中使用第一輪擴增采用的相同的PCR條件，導致具有5460堿基對長度的擴增片段的產生。
為了克隆FIV-141原病毒基因組的3’一半，最初用三個引物pr-9、pr13和pr14進行擴增。使用正向引物pr-9和反向引物pr-14(9464-TGCGAGGTCCCTGGCCCGGACTCC-9441，SEQ ID NO13)進行第一輪PCR擴增。使用正向引物pr-13(5421-AGGTGGAGCTTTCATACGCGTGATTATTATATAGGATATG-5460，SEQ ID NO14)和相同的反向引物pr-14進行第二輪擴增。引物pr-13被設計成與在基因組5’一半的擴增中所采用的pr-12重疊。如在pr-12引物中，Mlu限制酶位點(下劃線的)被加入到pr-13中以便于全長FIV克隆的構建。不幸的是，在兩輪PCR擴增后，未觀察到特異性DNA帶。總結出未能擴增FIV-141的3’一半可能是由于引物pr14中的高GC含量以及極穩定的二級結構。因此，設計了新的引物pr-16(9444-CTCCAGGGATTCGCAGGTAAGAGAAATTA-9416，SEQ ID NO15)。該序列在FIV-141基因組中的最后一個堿基的上游20個堿基出結束。使用正向引物pr-9和反向引物pr-16進行首輪PCR擴增。接著使用正向引物pr-13和再次使用反向引物pr-16進行擴增。在第二輪擴增后獲得具有預期大小的DNA片段。
使用Wizard PCR Preps DNA純化試劑盒(Promega，Madison，MI)純化FIV-141基因組的5’和3’一半的DNA片段，并克隆至pCR-ScriptAmp SK(+)克隆載體中(Stratagene，La Jolla，CA)。測序來自三個獨立的PCR反應的三個克隆的每一個5’一半和3’一半的克隆。測序質粒DNA的兩條鏈，通過比較對應三個獨立的克隆所獲得的結果來獲得全部基因組的真正的共有序列。DNAStar程序(DNAStar公司，Madison，WI)被用來進行序列裝配、比較和分析。B.克隆的FIV-141病毒的分子鑒定全部FIV-141基因組的序列結果和分析FIV-141整個原病毒基因組被發現包含9464個堿基。基因組以慢病毒通常的方式構成，并由5’和3’長的末端重復組成；包含Gag，Pol和ENV基因的三個大的開放讀框(ORF)；和包含Vif、Rev和ORF(2)調節蛋白的三個小的開放讀框。長的末端重復分別與FIV-Petaluma(Olmsted等1989，Proc.Natl’Acad.Sci.USA 862448-2452)和FIV-USIL(Sodora等，1995，AID研究和人逆轉錄病毒11531-533)分離物具有78.6％和93.9％的序列同源性。Gag多肽分別與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物具有88.4％和94.4％的氨基酸同源性。
Gag基因編碼基質(MA)蛋白(堿基627-1031)、殼體(CA)蛋白(堿基1032-1724)和核殼(NC)蛋白(堿基1725-1976)。Gag和Pol多肽與PolORF重疊97個堿基，在核苷酸1880處開始，核苷酸5239處結束。七個核苷酸移碼信號(5’-GGGAAAC-3’)位于重疊區的3’末端的上游100個堿基處。作為翻譯中的-1移碼的結果，產生了Gag/Pol的多肽融合。
與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物比較，FIV-141的Pol多肽分別顯示85.7％和92.2％的氨基酸同一性。Pol基因編碼從核苷酸1880-1978的前導序列；從核苷酸1979-2326的蛋白酶(PR)；從核苷酸2327-3994的逆轉錄酶(RT)；從核苷酸3995-4393的脫氧尿苷三磷酸酶(DU)和從4394-5239的整合酶(IN)。
Vif ORF與Pol基因重疊8個堿基，并分別與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物享有80.2％和91.3％的氨基酸同源性。緊接在Vif基因后的ORF(2)基因，從核苷酸5988開始，核苷酸6224結束，其分別與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物享有62％和92.4％的氨基酸同源性。
ENV多肽分別與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物享有79.3％和88.6％的氨基酸同源性。ENV基因編碼表面(SU)蛋白，從核苷酸6262-8088；和跨膜(TM)蛋白，從核苷酸8089-8826。
Rev蛋白由多剪接mRNA的翻譯產生。推測的Rev基因的第一個外顯子顯然與ENV基因享有一個起始密碼子，從核苷酸6262開始，于6505結束。第二個Rev外顯子在核苷酸8947開始，延伸至3’長末端重復的U3區中，于核苷酸9161結束。FIV-141的Rev蛋白分別與FIV-Petaluma和FIV-USIL分離物享有67.3％和83.9％的氨基酸同源性。151個堿基的Rev效應元件(RRE)與ENV基因重疊52個堿基，于核苷酸8775開始，于核苷酸8925結束。
基于與SU糖蛋白的V3區的序列比較，FIV-141為B型分離物，FIV-141顯然與另一種B型FIV分離物FIV-USIL最相關。C.FIV-141的全長分子克隆的構建為了構建全長FIV-141克隆，將基因組3’末端的最末端的20個堿基加至3’一半的克隆中。此外，通過比較來自三個獨立克隆的序列確定共有序列。接著在構建全長病毒克隆之前，定點誘變(SDM)被用來調節5’和3’一半克隆的序列以匹配共有序列。在FIV-141的3’末端的最末端加上缺失的20個堿基為了將20個堿基加入至FIV-141的3’一半克隆，使用5’一半克隆作為模板和正向引物pr-21(5’TTACAAGAATTCAACTGCAGTGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT-3’，SEQID NO16)和反向引物pr-20(5’-TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGGCCC- 3’，SEQ IDNO17)，首先將長的末端重復區進行PCR擴增，并克隆至PCR-ScriptAmp SK(+)克隆載體中。為了便于克隆PCR片段，將兩個限制酶位點EcoRI和PstI(下化線部分)加入到正向引物PR-21中，將兩個位點，SacI和SalI(下化線部分)摻入到反向引物PR-20中。引物中的FIV-141的具體序列以斜體字表示。測序產生的克隆，其被稱為pCR-LTR。將用SacI和NheI消化產生的pFIV-LTR的限制性片段克隆至一個FIV-141的3’一半克隆中。產生的克隆被稱為pFIV3’-2A-1+，并通過核苷酸測序證實FIV-141 3’末端最末端20個堿基的存在。5’和3’一半克隆的共有序列的構建為了建立FIV-141基因組的現有的5’和3’一半克隆的共有序列，進行SDM。為了在基因組的第一半導入序列變化，將一個5’一半克隆(稱為“pFIV5’-D-11”)用作模板。與共有序列相比，在pFIV5’-D-11中具有總共15個核苷酸變化。兩個變化位于5’非編碼區，A602G和A612G，編碼區中的7個核苷酸變化為沉默突變。編碼區的其它6個變化每一個導致一個氨基酸置換，三個位于RT區中(A2890G核苷酸變化，導致I變為M氨基酸的置換；G3461A變化導致E變為K的置換；和G3737變化，導致E變為K的置換)，一個位于DU蛋白中(C4383T變化，導致T變為I的置換)，兩個位于IN蛋白中(A4579G變化，導致I變為M的置換；和A5007T變化，導致Q變為L的置換)。七個寡核苷酸被設計用來產生非編碼區的兩個變化和導致氨基酸置換的編碼區的六個變化。寡核苷酸如下，錯配被下劃線oligo pF-1，設計來修復A602G和A612G錯誤5’-GATTCGTCGGGGGACAGCCAACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATGGGG-3’(SEQ ID NO18)oligo pF-2，設計來修復A2890G錯誤5’-TCAATATATGGATGATATCTATATAGGATCAAAATTTAAGTAA-3’(SEQ IDNO19)oligo pF-3，設計來修復G3461A錯誤5’-GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAAGAGAAGAATCCATTATAAGAATAGG-3’(SEQ ID NO20)oligo pF-4，設計來修復G3737A錯誤5’-CGGGGCAGATGGCAGGTAATGGAAATAGAAGGAAGTAATCAAAAAGC-3’(SEQ IDNO21)oligo pF-5，設計來修復C4383T錯誤5’-AGAAAGGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTCATGGGTGGA-3’(SEQ IDNO22)oligo pF-6，設計來修復A4579G錯誤5’-GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATATGGCAAATGGACTGTACACAC-3’(SEQ ID NO23)oligo pF-7，設計來修復A5007T錯誤5’-GGCTCCTTATGAATTATACATACAACAGGAATCATTAAGAATACAAGAC-3’(SEQID NO24)為了在基因組的3’-半產生序列的改變，3’一半克隆“pFIV3’-2A-1+”被作為模板用于進行SDM。與共有序列相比，pFIV3’-2A-1+克隆中具有9個改變。編碼區的兩個核苷酸改變為沉默的。其它7個改變導致氨基酸的置換1個位于Vif蛋白(T5508C，H改變為Y)；1個位于ORF(2)區(A6041T，D改變為E)；3位于SU蛋白(A6922G，V改變為I；G7007T，T改變為R；和A7814G，S改變為N)；1個位于TM區(A8405T，I改變為N)；1個位于Rev區(A8976G，E改變為K)。7個突變寡核苷酸被設計用于修復這些氨基酸置換oligo pF-8，設計來修復T5508C錯誤5’-CAAAATAGTTTAAGATTGTATGTTTATATAAGCAAT-3’(SEQ ID NO25)oligo pF-9，設計來修復A6041T錯誤5’-CAGAAAAGTTAGATAGAGAAGCAGCTATTAGATTGTTTAT-3’(SEQ ID NO26)oligo pF-10，設計來修復A6922G錯誤5’-TAAAAGCAAATGTTAATATAAGCTTACAAGAAGGACCTAC-3’(SEQ ID NO27)oligo pF-11，設計來修復G7007T錯誤5’-AAAAGCTACAAGGCAATGCAGAAGGGGAAGGATATGGAAG-3’(SEQ ID NO28)oligo pF-12，設計來修復A7814G錯誤5’-AGAGGACCTTATTGTACAATTTAATATGACAAAAGCAGTGGAAA-3’(SEQ IDNO29)oligo pF-13，設計來修復A8405T錯誤5’-CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTATAAATCA-3’(SEQ ID NO30)oligo pF-14，設計來修復A8976G錯誤5’-GACAACGCAGAAGAAGAAAGAAGAAGGCCTTCAAAAAATT-3’(SEQ ID NO31)基本上通過由制造商(Promega，Madison，WI)提供的方法制備用于兩個克隆pFIV5’-D-11和pFIV3’-2A-1+的單鏈DNA模板制備物。簡單地說，將兩個克隆的DNA質粒轉染至大腸桿菌毒株CJ236中。使用輔助噬菌體R408拯救單鏈(SS)DNA并通過苯酚/氯仿提取純化。將純化的SS DNA溶解在TE緩沖液中，通過在1％瓊脂糖凝膠中對2ul模板制備物樣品進行電泳測定其濃度。根據制造商(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)提供的方法將寡核苷酸磷酸化。
在30ul的總反應體積中將寡核苷酸對模板退火。這包含0.2pmol單鏈DNA模板(pFIV5’-D-11或pFIV3’-2-A-1+)，4pmol各種寡核苷酸(即對于pFIV5’-D-11模板的pF-1至pF-7和對于pFIV3’-2-A-1+模板的pF-8至pF-14)，3ul退火緩沖液(0.2M Tris-HCl，pH7.4，20mMMgCl2和0.5M NaCl)。85℃下將混合物保溫5分鐘，并接著以約1℃/分鐘的速率逐漸冷卻至室溫。
為了合成互補DNA鏈，將下面組分加入到退火混合物中3ul合成緩沖液(4mM各種dNTP，7.5mM ATP，175mM Tris-HCl，pH7.4，37.5mM MgCl2，215mM DTT)，3ul T4 DNA連接酶(3U/ul)和3ul稀釋的T7 DNA聚合酶(0.5單位/ml)。37℃下將反應保溫3小時，接著在68℃下加熱滅活10分鐘。將2ul SDM反應混合物用來轉染大腸桿菌DHα-5感受態細胞。
對于5’一半克隆，摻入一個誘變的寡核苷酸，PF-5導致Hinc II位點的加入。用Hinc II的初步篩選導致4個陽性突變的確定，它們被稱為FIV5’-D-11/M-4、FIV5’-D-11/M-22、FIV5’-D-11/M-28和FIV5’-D-11/M-52。將4個突變體進行全長測序以證實其它7個所需突變的摻入。測序結果表明4個克隆中的3個包含所有8個突變。一個克隆，FIV5’-D-11/M-28僅具有7個突變的位置。
克隆FIV5’-D-11/M-52被選擇作為5’誘變克隆以構建全長FIV-141克隆。對于3’一半克隆，用BspH I消化的初步篩選證實了10個突變，其中由于誘變寡核苷酸pF13的摻入而去除了BspH I限制性位點。全長測序表明10個克隆中的8個在所有7個所需位置包含突變。一個突變體“pFIV3’-2-A-1+/M-21”包含全部8個改變，并被選擇作為構建全長FIV-141克隆的3’一半克隆。全長FIV-141克隆的構建為了構建全長FIV-141克隆，將來自5’一半克隆，FIV5’-D-11/M-52的5.5kb Mlul/Xhol片段與被兩個相同的限制酶消化的3’一半克隆pFIV3’-2-A-1+/M-21連接。通過使用針對5’一半克隆的正向引物和3’一半克隆的反向引物的PCR擴增篩選全長連接產物。正向引物pr9具有序列5’-(5147)-TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT-(5176)-3’(SEQ ID NO10)。反向引物pr10具有序列5’-(5631)-TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT-(5604)3’，(SEQ ID NO9)。通過限制性消化和測序證實陽性克隆。其中一個產生的全長克隆被稱為“pFIV-141B-1”，并被選擇用于體外和體內鑒定。實施例2證實全長分子克隆具有感染性轉染將Crandell貓腎(CRFK)細胞培養在6孔平板中至40-60％的鋪滿度。通過加入2ug質粒DNA，并遵循Trans IT Polyamine TransfectionReagents(Mirus，Madison，WI)推薦的基本方法來完成轉染。簡單地說，將10ul TransIT Lt-1(Panvera)與1ml RPMI 1640培養基混合物，并在室溫下保溫15分鐘。將2ug質粒DNA加入到RPMI/Lt溶液中，室溫下再保溫15分鐘。將培養基從孔中除去，將細胞用PBS洗滌一次，并將DNA混合物加入到細胞單層中。37℃，CO2保溫箱保溫4小時后，將DNA混合物從孔中除去，將2ml補充有3％胎牛血清(FS)的RPMI培養基加入到各孔中。轉染后24小時，分析細胞上清中的FIV的產生、逆轉錄酶(RT)的活性和病毒的感染性。來自轉染的CRFK細胞的FIV的產生在轉染后，每天收集轉染的CRFK細胞的上清，并根據制造商推薦的方法，使用FIV抗原檢測試劑盒(IDEXX，波特蘭，ME)檢測。該酶免疫活性法被設計用來檢測主要的FIVp26殼體蛋白的組相關的抗原。轉染后(PT)24小時檢測FIV抗原p26，轉染后72小時到達峰值，轉染后11天降低至本底水平(參見圖1)。
為了證實轉染(CRFK)細胞的病毒的產生，進行逆轉錄酶(RT)活性分析(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)以檢測轉染細胞上清中的與病毒體相關的RT活性。簡單地說，收集200ul細胞上清，在微量離心管中離心5分鐘以沉淀細胞和細胞殘渣。4℃下，在吊桶式轉頭離心機中將上清以20,000g離心20分鐘以沉淀FIV病毒顆粒。將病毒顆粒重新懸浮在40ul來自檢測試劑盒的裂解緩沖液中，如制造商所推薦地進行分析。在轉染后(PT)48小時的細胞上清中證實了來自轉染細胞的病毒的產生。CRFK細胞的感染FIV-141野生型病毒不感染CRFK細胞。為了確定分子克隆病毒是否表現類似的特性，將CRFK細胞培養在6孔平板中，并用200ul來自轉染的CRFK細胞的p26+條件培養基接種。37℃下保溫2小時后，將細胞用PBS洗滌一次，將2ml補充有3％FS的RPMI 1640培養基加入至各孔中。接著轉染后每3-4天，通過FIV p26 ELISA監測上清的病毒的產生。結果發現類似于野生型病毒，FIV-141克隆不感染CRFK細胞。通過與轉染的CRFK細胞共培養感染FeP2細胞將CRFK細胞培養在6孔平板中，并如上所述進行轉染。轉染后48小時，將2×106FeP2細胞加入到各p26+轉染孔中。將細胞共培養72小時后，從CRFK細胞(貼壁)分離FeP2細胞(非貼壁)。收集來自FeP2細胞的上清，每3-4天通過FIV p26 ELISA監測病毒產生。共培養后4天后，在FeP2細胞上清中證實了高水平病毒產生(參見圖2)。轉染后6天病毒效價到達平臺期，表明FIV-141分子克隆病毒在FeP2細胞中具有感染性。結果還表明在病毒感染的早期，即病毒進入細胞時，CRFK細胞的感染被阻斷。
總之，總結出在轉染至CRFK細胞時，FIV-141分子克隆可在細胞中復制，從細胞中釋放的病毒顆粒對FeP2 T淋巴細胞具有感染性。
通過吸附作用的FeP2細胞的感染將FeP2細胞(2×106)懸浮在從轉染的CRFK細胞獲得的200ulp26+條件培養基中，37下保溫2小時。將細胞用PBS洗滌，懸浮在2ml補充有10％加熱滅活的FCS的Opti-MEM培養基中，37℃下保溫。收集上清，每3-4天通過FIV p26 ELISA監測病毒的產生。感染后4天后，監測上清中的來自感染的FeP2細胞的病毒的釋放，感染后3星期到達峰值(圖3)。結果表明FIV-141產生的FeP2細胞的生產性感染可通過吸附作用或用轉染的CCRFK細胞共培養來完成。與共培養的感染比較，當通過吸附進行感染時，病毒產生到達峰值更慢。實施例3突變的FIV-141和其在疫苗中的用途為了開發FIV-141疫苗代表物，感染性的FIV-141野生型克隆被用來構建許多基因缺失克隆。制備突變克隆的通常的標準為1.導入FIV-141基因組中的缺失或突變必須是嚴重的，以致在體外克隆被轉染至培養的細胞中或在體內施用于貓中后病毒的感染性顯著降低(減毒)。2.導入FIV-141基因組中的缺失或突變應不消除病毒基因組的復制能力，或高水平表達病毒蛋白的能力。
被考慮的其它因素是基因缺失的基因組是否整合至宿主染色體中，缺損病毒顆粒是否形成以及將表達的病毒結構蛋白的水平。基于這些考慮，許多基因和元件被靶定用于缺失。由于將維持病毒基因組的復制，因此，FIV-141的RT和PR基因不被突變。A.Gag區中的缺失
Gag多肽包含3個病毒體結構基因，MA、CA和NC。3個基因缺失克隆被構建成在這三種蛋白中的每一種具有一個缺失。MA del突變使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作為模板，誘變引物Mpma-1(5’-AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC-3’，(SEQID NO32)；和Mpma-2(5’-CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC-3’，SEQ IDNO33)，進行定點誘變以在MA蛋白的C末端部分產生兩個Spe I限制位點。
由引物導入的SepI位點在序列中被下化線。如前所討論地進行SDM以修復5’和3’一半克隆中的推測的錯誤。通過SpeI限制性消化篩選突變體，陽性克隆被用來構建缺失的克隆。進行Spe I消化以釋放SpeI片段，克隆的剩余部分自身連接以產生缺失的克隆。通過使用缺失區側翼的引物組的PCR擴增篩選它們，并通過核苷酸測序獲得證實。將具有缺失的5’一半克隆與3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21連接以產生具有缺失的全長克隆。該克隆被稱為FIV-141 MA缺失克隆，并包含從核苷酸879至核苷酸1001的123個堿基的缺失，對應于MAC末端殘基85-125的41個氨基酸。CA del突變使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作為模板，引物Mpca-1(5’-ATTCAAACAGTAAATGGAGCAACTAGTTATGTAGCCCTTGATCCAAAAATG-3’，(SEQ ID NO34)和Mpca-2(5’-ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGGCTACATTAATTATG-3’，SEQID NO35)進行SDM以在FIV-141的CA區中產生兩個Spe I限制位點。在缺失Spe I限制性片段后，將5’一半克隆與pFIV3’-2A-1+/M-21連接以產生具有缺失的全長克隆。該克隆具有從核苷酸1056-1169的114個堿基對的缺失，對應于MA N-末端位置9-46的38個氨基酸。NC del突變5’一半克隆分別在核苷酸1635和1876處具有唯一的Sca I和SmaI位點。將克隆用ScaI和Sma I消化以釋放242個堿基對的片段。5’一半克隆的剩余部分自身連接，接著與3’一半克隆連接以產生基因缺失的全長克隆。缺失由CA區中的63個堿基(21個氨基酸殘基)，CA和NC蛋白之間的27個堿基(9個氨基酸殘基)和NC蛋白的N-末端部分的152個堿基(51個氨基酸殘基)組成。缺失還導致-1閱讀框的移動，因此NC蛋白的C-末端部分不能由該克隆表達。B.ENV區的缺失ENV前體糖蛋白被加工成兩種成熟蛋白SU和TM。在ENV區構建6個缺失克隆。ENV del突變使用3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板，誘變引物Mpenv-1(5’-ACTATAGTCTATTTACTAACTGGTTACCTGAGATATTTAATAAGCCATAG-3’，(SEQID NO36)和Mpenv-2(5’-TACTTATATGCTTGCCTACATTGGTTACCGTATAAGAAACTGTACTAATAAAA-3’，SEQ ID NO35)，進行SDM以在ENV區產生兩個BstE II位點。引物中的BstE II位點以下劃線標出。缺失BstE II片段后，將自身連接的克隆與pFIV5’-D-11/M-52連接。產生的克隆具有從核苷酸6577-8679的2103個堿基的缺失，其對應于ENV蛋白的中間701個氨基酸(殘基106-806)。在缺失克隆中保留了其中大部分重疊Rev蛋白的第一個外顯子的N-末端105個殘基和其中大部分重疊Rev效應元件(RRE)的C-末端45個殘基。SU del突變使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板，誘變引物Mpsu-1(5’-GAGGTATAAAGGTAAACAAAAAACTAGTGCCATTCATATTATGTTAGCCCTTGG-3’，(SEQ ID NO38)；和Mpsu-2(5’-ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTTGAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC-3’，SEQ ID NO35)，進行SDM以在FIV-141的SU區產生兩個SpeI位點。通過SpeI消化缺失SpeI片段，接著大的剩余片段進行自身連接。將產生的克隆與pFIV5’-D-11/M-52連接。該克隆具有核苷酸6577-8085的1509個堿基對的缺失，對應于SU蛋白的503個氨基酸(殘基106-608)。克隆保留了SU蛋白的N-末端105個氨基酸。V3/4 del突變進行SDM以產生兩個在SU蛋白的V3和V4區側翼的SphI位點。使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物Mpenv-5(5’-ATACCGAAATGTGGATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC-3’，SEQ ID NO40)和Mpenv-6 (5’-GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTA-3’，SEQ ID NO41)。Sph I位點以下劃線標出。在消化除去SphI片段后，克隆進行自身連接，接著與pFIV5’-D-11/M-52連接。該克隆具有從核苷酸7339-7770的432個堿基的缺失，對應于SU蛋白的144個氨基酸(殘基360-503)，它覆蓋了V3和V4區。V7/8 del突變SDM被用來產生兩個在TM蛋白的V7和V8區側翼的SphI位點。這通過使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物Mpenv-7(5’-GAATCAATTCTTTTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACT-3’，SEQ ID NO42)和Mpenv-8(5’-GGGAAAATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAGGACTTCTTGGTAG-3’，SEQ ID NO43)來完成。Sph I位點以下劃線標出。用SphI消化導致除去從核苷酸8380-8595的216個堿基，接著為大片段的連接。然后將產生的克隆與5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52連接以產生“V7/8 del”。這包含覆蓋V7和V8區的TM蛋白的72個氨基酸(從殘基98-169)的缺失。Tmf del突變FIV-141的3’一半克隆在核苷酸8145處具有唯一的Age I位點。進行SDM以在位置8071處產生第二個AgeI位點。使用3’一半克隆用作模板和誘變引物Mpenv-3(5’GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC-3’，SEQ IDNO44)。通過限制酶消化，接著通過大的限制性片段的連接來缺失兩個AgeI位點之間的75-堿基片段。將產生的克隆與5’一半克隆連接以產生“Tmf del”。這包含SU與TM蛋白之間的裂解接頭處的25個氨基酸缺失。缺失的氨基酸包括SU蛋白的6個C-末端殘基(其中4個為堿性(K或R)并為SU/TM裂解位點的加工所必需)和TM蛋白的融合肽的19個N-末端殘基(為病毒體被膜與細胞膜之間的膜融合所必需))。CT del突變使用3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物Mpenv-4(5’-CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGACTGATAGGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG-3’，SEQ ID NO45)進行SDM以平截TM蛋白的細胞質尾。通過沉默突變將Sal I限制性位點(下劃線)摻入到寡核苷酸中以便于突變體的篩選。將三個串聯重復翻譯終止區(斜體字)在TM蛋白的跨膜區加入到引物中。將產生的克隆與5’一半克隆連接以產生“CT del”。這具有從核苷酸8686-8823的138-堿基平截(對應于來自TM蛋白細胞質區的46個氨基酸平截)。C.Pol區的缺失Pol多肽由4個酶蛋白組成PR、RT、DU和IN。2個缺失克隆構建在Pol區。DU del突變使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作為模板和誘變引物Mpdu-1(5’-GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAAGATCAGAAGATGCAGGATATG-3’，(SEQ ID NO46)；和Mpdu-2(5’-GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAACTAGTGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTC-3’，SEQ ID NO47)進行SDM以在DU區產生兩個Spe I位點。引物中的Spe I位點以下劃線標出。通過Spe I消化，接著進行大限制性片段的自身連接完成核苷酸4019-4363的345個堿基的缺失。將產生的克隆與克隆pFIV3’-2A-1+/M-21連接以產生“DU del”。克隆包含對應于幾乎整個DU蛋白的115個氨基酸的缺失。IN del突變使用pFIV5’-D-11/M-52作為模板和誘變寡核苷酸Mpin-1(5’-CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGAAAAATTTCACTCAG-3’，(SEQ ID NO48)和Mpin-2(5’-GCAATGGGTGTATTATAAAGACTAGTAAAAAGTGGAAGGGACCAATGAGAGTAG-3’，SEQ ID NO49)通過SDM在FIV-141的IN區產生兩個Spe I位點。引物中的Spe I位點以下劃線標出。SpeI片段缺失和自身連接之后，將產生的克隆與克隆pFIV3’-2A-1+/M-21連接以產生“IN del”。克隆包含對應于幾乎整個IN蛋白的核苷酸4418-5036的669個堿基的缺失(223個氨基酸，從IN的殘基9至231)。D.調節基因或元件的缺失在FIV中確定的3種調節蛋白為Rev、Vif和ORF2。Rev效應元件被報道位于FIV基因組的3’末端。在這些區中構建5個缺失克隆。Vifn del突變將唯一的Mlu位點導入5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52的Vif基因的中間。使用pFIV3’-D-11/M-52作為模板和誘變引物Mpvif-1(5’-AGAAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGATGCCATGTTATACATATCG-3’，SEQ ID NO50)進行SDM以在Vif基因的-末端產生第二個Mlu I位點。引物中的Mlu I位點以下劃線標出。通過Mlu I消化，接著進行大限制性片段的自身連接完成核苷酸5286-5435的150個堿基的限制性片段的缺失。將產生的缺失克隆與克隆pFIV3’-2A-1+/M-21連接以產生“Vifn del”。它包含Vif蛋白的N末端部分的50個氨基酸(殘基19-68)的缺失。Vifc del突變3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21在Vif區中具有唯一的Mlu I位點。使用pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物Mpvif-2(5’-CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG-3’，SEQ IDNO51)通過SDM在Vif蛋白的C-末端產生第二個Mlu I位點。引物中的Spe I位點以下劃線標出。Mlu片段缺失后，將產生的克隆與5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52連接以產生“Vifc del”。這包含從核苷酸5436-5873的438個堿基的缺失，對應于Vif蛋白C-末端部分的146個氨基酸缺失(從殘基69至214)。Vif del突變為了構建“Vif del”，將Vifc del的XhoI/Mlu I限制性片段用5.3kb Xho I/Mlu I片段替代。產生的克隆包含從核苷酸5286-5873的588個堿基的缺失，其對應于幾乎整個Vif蛋白的196個氨基酸(從殘基19-214)的缺失。ORF(2)del突變通過SDM在核苷酸5988和6224(ORF(2)的N-末端和C-末端)產生兩個MluI位點。這通過使用pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物如orf-1(5’-GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG-3’，SEQ ID NO52)和Mporf-2(5’-CTACATTATCCATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG-3’，SEQ ID NO53)來完成。引物中的Mlu I位點以下劃線標出。除開由SDM產生的兩個Mlu I位點外，在克隆的核苷酸5436處存在一個MluI位點。為了構建“ORF(2)del”，將來自5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52的5.4kbMlu I/Xho I片段與3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21的大的Mlu I/XhoI片段連接。接著將來自位置5436-5988的552堿基Mlu I片段插入到產生的克隆中。ORF(2)del包含覆蓋整個ORF(2)基因的237個堿基的缺失。RRE del突變使用pFIV3’-2A-1+/M-21作為模板和誘變引物Mprre-1(5’-GGCATATCTGAAAAAGAGGAGGAATGAACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA-3’，SEQ ID NO54)和Mpree-2(5’-GAGGAGGATGTGTCATATGAATCAAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCTATATTG-3’，SEQ ID NO55)來進行SDM以在RRE區中產生兩個Spe I位點。引物中的Spe I位點以下劃線標出。通過Spe I消化，接著進行大限制性片段的自身連接完成Spe I片段的缺失。將產生的缺失克隆與pFIV5’-D-11/M-52連接以產生“REE del”。它包含從核苷酸8827-8910的84個氨基酸的缺失。實施例4FIV-141基因缺失克隆的鑒定A.病毒蛋白的表達和/或缺損病毒的產生如前所述將各種缺失克隆的質粒轉染至CRFK細胞中。進行FIVp26 ELISA分析以檢測病毒蛋白的表達和/或轉染細胞上清中的病毒顆粒的產生。轉染后48小時后，來自13種構建物的樣品被發現產生與野生型FIV-141分子克隆所觀察的信號相當的陽性信號(參見圖4)。對于ENV區的6種缺失克隆觀察到最高水平病毒顆粒的產生，包括ENVdel、TMF del、SU del、CT del、V3/4 del和V7/8 del。
對于7個其它缺失克隆獲得相當水平的病毒顆粒的產生，包括Vif區的三個缺失克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)、MA del、DU del、IN del和ORF(2)del。結果表明這13個克隆攜帶的缺失不干擾來自轉染細胞的病毒顆粒的形成和釋放。對于NC del檢測到了相對弱的陽性信號，表明該區中的缺失影響病毒顆粒的裝配或釋放。
在被CA del或RRE del轉染的細胞上清中未檢測到病毒顆粒的產生。CA蛋白的C-末端中的缺失可能消除病毒顆粒的形成或導致用于p26 ELISA試劑盒中的被單克隆抗體識別的表位的喪失。如所預期的，RRE區中的缺失導致阻斷未剪接的病毒RNA從核轉移至細胞質，這導致病毒結構蛋白表達的全部喪失或顯著降低。B.檢測病毒RNA表達的細胞內RT-PCR進行細胞內RT-PCR以檢測兩個缺失克隆CA del和RRE del中的病毒RNA的表達。將各克隆的質粒DNA轉染至不同的CRFK細胞中。轉柒后48小時，使用RNeasy試劑盒(Qiagen Chatsworth，CA)從轉染細胞中分離全部RNA。將RNA用50ul DEPC水洗脫，使用SuperscriptII(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和2ul各種RNA樣品來合成cDNA的第一鏈。
使用正向引物Sp-8(5’-TATTATGGTGGGGATTTGAAAC-3’，SEQ IDNO56)和反向引物Sp-20(5’-TAATTAGATTTGATTCCCAGGC-3’，SEQ IDNO57)擴增核苷酸2958-3542的585個堿基對片段。在PCR反應中使用2ul來自各個反應的cDNA和作為對照的2ul來自各個制備物的全部RNA。使用PCR擴增試劑盒(Gibco BRL，Gaithersburg)在100ul的體積中進行各個反應。反應如下進行94℃，30秒，25次循環；55℃，30秒；和72℃，再30秒。將10ul各反應物加至1％瓊脂糖凝膠中。對于CA del和RRE del克隆觀察到具有預期大小的特定的帶，表明病毒RNA的表達發生在被這些克隆轉染的細胞中。結果表明通過ELISA未檢測出CA del的p26蛋白表達可能是由于沒有形成病毒顆粒或缺乏在p26 ELISA分析中使用的抗體識別的表位。對于RRE缺失克隆，通過細胞內RT-PCR證實病毒基因的表達，但使用ELISA分析來檢測到p26蛋白的表達。當與ELISA比較時，誤差可能反應出RT-PCR分析的更高的靈敏性。C.感染性病毒顆粒中的病毒基因組和RT酶的包殼作用CRFK細胞被主要的FIV-141缺失克隆轉染導致感染性病毒顆粒的產生和釋放。為了確定基因缺失病毒基因組和RT蛋白是否被包被至病毒顆粒中，進行與病毒體相關的RT PCR和RT活性分析。簡單地說，轉染后48小時，收集200ul來自各種轉染CRFK培養物的上清，并在微量離心機中離心5分鐘以沉淀細胞和細胞殘渣。4℃下，在吊桶式轉頭離心機以20,000g超離心沉淀上清中的病毒顆粒。為了檢測包殼作用，將病毒沉淀重新懸浮在350ul來自RNeasy試劑盒的RLT緩沖液中，并如制造商推薦的通過用50ul DEPC洗脫來純化病毒RNA。使用Superscript II制備第一鏈cDNA，如前所述，使用Sp-8和Sp-20引物組進行PCR擴增。
RT-PCR擴增后，16個缺失克隆中的14顯示出特定的帶，表明被這些克隆轉染的CRFK細胞產生感染性的病毒顆粒，并且基因缺失病毒基因組被包被。14個克隆由6個來自ENV區的克隆(包括ENV del、TMfdel、SU del、CT del、V3/4 del和V7/8 del)；3個來自Vif區的克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)；2個來自Pol區的克隆(DUdel和IN del)；2個來自調節基因/元件區的克隆(ORF(2)del和RREdel)；1個來自Gag區的克隆(MA del)。與p26 ELISA數據一致，在與病毒體相關的RT-PCR分析中CA del顯示陰性信號。將病毒基因組包被至病毒體中需要NC蛋白，如所預期的，通過對NC del的RT-PCR未檢測到與病毒體相關的基因缺失病毒RNA基因組。對于RRE del，使用p26 ELISA分析，證實存在病毒體相關的基因缺失病毒RNA，但未檢測到病毒顆粒的產生。這些結果的誤差可能再次反映出RT-PCR相對于ELISA更高的敏感性。
為了檢測感染性病毒顆粒中的RT(即逆轉錄酶)酶的包殼作用，將病毒沉淀重新懸浮在40ul來自ELISA試劑盒的裂解緩沖液中，如制造商推薦進行分析。與使用p26 ELISA分析和病毒體相關的RT-PCR分析所獲得的數據一致，可檢測到14個缺失克隆的病毒體相關的RT活性，包括ENV del；SU del；TMf del；V3/4 del；V7/8 del；CT del；MA del；DU del；IN del；Vifn del；Vifc del；Vif del；ORF(2)del和NC del。在CA或RRE缺失克隆中未檢測到病毒體相關的RT活性。D.體外FIV-141基因缺失克隆的感染性如前所述，將CRFK細胞培養在6孔平板中并進行轉染。轉染后48小時，將2×106FeP2細胞加入到各孔中。將細胞共培養72小時后，從CRFK細胞中分離FeP2細胞，收集FeP2細胞培養物上清，并使用FIV p26 ELISA分析，每3-4天監測病毒的產生，長達4-6周。
在監測期間未發現12個缺失克隆具有顯著水平的p26殼體蛋白的表達。這些包括ENV del、TMfdel和NC del(圖5)；3個來自Vif區的缺失克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)(圖6)；MA和CA缺失克隆(圖7)；和V3/4和V7/8和CT缺失克隆(圖8)；和ORF(2)缺失克隆(圖9)。結果表明導入這些克隆中的缺失完全消除了病毒在FeP2細胞中的感染性。檢測到了4個缺失克隆的中等水平的病毒復制，包括DU del；SU del；IN del和RRE del(圖10)。E.結論ENV del在ENV蛋白中部具有701個氨基酸缺失(殘基106-806)的ENV缺失克隆完全喪失了感染FeP2細胞的能力。然而，它保留了裝配和釋放感染性病毒顆粒，包被病毒基因組和逆轉錄RNA的能力。ENV蛋白的主要功能是在感染早期介導病毒進入靶細胞。主要的ENV蛋白的缺失可能阻斷病毒進入以及病毒感染。Tmf del在SU與TM蛋白之間的裂解接頭中包含25個氨基酸缺失的TMf缺失克隆在FeP2細胞中為非感染性的。缺失可能阻斷ENV前體蛋白的裂解加工，這可能導致病毒顆粒不能與靶細胞結合和進入靶細胞。已報道FIV的ENV糖蛋白的裂解位點的去除導致未裂解ENV前體蛋白的表達。然而，如使用蛋白質印跡和放射免疫沉淀分析(Rimmelzwa等，1994，普通病毒學雜志752097-2012)所確定的其與單克隆抗體的相互作用所證實的，表達的重組蛋白保留了它的抗原特性。在轉染至CRFK細胞中時，缺失克隆以可與野生型FIV-141克隆相比的水平產生感染性病毒顆粒。感染性病毒基因組和RT酶被包被在感染性病毒體中。SU delSU del具有SU蛋白的殘基106-608的503個氨基酸缺失。它被發現保留了大約與野生型克隆相等的病毒顆粒產生水平。基因缺失病毒基因組和RT酶被包被。然而，與ENV del相反，SU del轉染的細胞產生在FeP2細胞中具有感染性的病毒顆粒，雖然比野生型病毒小得多。因此，看來FIV-141基因組的SU蛋白的缺失使病毒減毒。認為當與TM蛋白相關時，病毒感染的第一個步驟即FIV與細胞受體的結合通過SU蛋白介導。突變病毒與靶細胞結合和進入靶細胞中的機理不甚了解。突變病毒進入宿主細胞的另一個途徑可能導致觀察的更低的與缺失克隆相關的感染性。V3/4 del和V7/8 del在V3/4 del和V7/8 del中分別缺失SU蛋白的殘基360-503的144個氨基酸(覆蓋V3和V4可變區)和TM蛋白的殘基98-169的72個氨基酸殘基(包含V7和V8區)。在轉染至CRFK細胞中時，各個克隆以類似于野生型所觀察到的水平產生缺損病毒。對于其它ENV相關的缺失克隆，V3/4和V7/8 del將它們的基因缺失病毒基因組和RT酶包被至病毒體中。感染性分析表明SU的V3和V4區的缺失，TM蛋白的V7和V8區的缺失完全消除了病毒在FeP2細胞中的感染性。V3可變區為免疫顯性區，并被報道參與多種功能，包括病毒趨性、病毒致病和中和表位。在這兩個缺失克隆中病毒感染在哪一步被阻斷目前不甚清楚。CT delFIV的TM蛋白具有相對長的細胞質尾(長度為46個氨基酸)。CT del克隆中尾的平截導致FeP2細胞中病毒感染性的喪失。然而，平截對于病毒顆粒的形成和病毒基因組和RT酶的包被沒有影響。已報道了FIV以及HIV-1的MA與TM細胞質尾之間的特定的功能性相互作用。該相互作用被認為對于ENV蛋白摻入到病毒體中是非常重要的。CT del中的細胞質區的平截可能消除MA與TM蛋白之間的功能性相互作用，從而阻斷ENV的摻入。MA delMA del包含MA蛋白C末端的殘基85-125的41個氨基酸缺失。在轉染至CRFK細胞中時，克隆以與使用野生型FIV-141克隆產生的病毒相當的水平產生感染性病毒。這表明C-末端區的缺失對病毒顆粒的裝配和釋放沒有顯著的影響。基因缺失病毒基因組和RT蛋白被包被在感染性病毒顆粒中。當這些病毒顆粒從轉染的CRFK細胞中釋放時，它們對于FeP2細胞沒有感染性。CA del如p26 ELISA分析、病毒體內RT PCR分析和RT活性分析中的陰性信號所證實的，CA蛋白N-末端殘基9-46的38個氨基酸的缺失消除了病毒顆粒的形成。然而，來自轉染CRFK細胞的細胞內RT PCR證實缺失不阻斷病毒RNA的表達。因此，在轉染細胞上清中未能檢測到p26蛋白或感染性病毒的產生是由于病毒顆粒裝配，而非病毒蛋白表達的阻斷。NC del在NC del克隆中缺失了整個NC蛋白。被這種克隆轉染的細胞以與野生型克隆相比顯著降低的水平產生缺損病毒，表明缺失損傷了病毒顆粒的裝配或釋放。已報道HIV-1的NC蛋白不為病毒樣顆粒的裝配所必需。NC克隆中的缺失不影響RT酶包裝至感染性病毒體中。如所預期的，無病毒基因組包被在病毒顆粒中。Vif del、Vifc del和Vifn del在Vif基因中構建3個缺失克隆，即Vifn del、Vifc del和Vifdel。Vifn在Vif蛋白的N-末端部分具有50個氨基酸的缺失。Vifc在蛋白的C-末端部分具有146個氨基酸的缺失，和Vif del具有幾乎整個Vif蛋白的缺失。所有三個克隆顯示類似的特性。被三個克隆的任一個轉染的細胞以可與野生型FIV-141克隆相比的速率產生病毒顆粒。對于所有3個克隆，病毒基因組和RT酶被包被至病毒體中。對于FeP2細胞，從被3個克隆轉染的CRFK細胞釋放的病毒體為非感染性的，表明Vif為T淋巴細胞中的病毒復制所必需。ORF(2)del在ORF(2)缺失克隆中缺失了整個ORF(2)的開放讀框。被克隆轉染的細胞以可與野生型克隆相比的速率裝配和釋放病毒顆粒。雖然病毒基因組和RT酶被包裝至病毒顆粒中，但克隆在FeP2細胞中未復制，表明在這些細胞中ORF(2)的基因產物為病毒產生所必需。RRE del在RRE del中缺失了包括FIV的RRE序列的總共150個堿基中的84個。該缺失嚴重地損傷轉染細胞中的病毒結構蛋白的表達和病毒顆粒的產生。在轉染CRFK細胞上清中未檢測到p26的產生。類似地，未測定出包被的RT活性。這些結果較好地與這種建議一致，即RRE序列為未剪接以及單剪接的病毒RNA從細胞核轉運至細胞質所必需。然而，通過RT PCR證實病毒體相關的病毒基因組RNA存在，并且病毒顆粒在FeP2細胞中具有感染性，雖然與野生型FIV-141克隆相比為顯著降低的水平。從整體上看，這些結果表明RRE序列的缺失顯著降低病毒結構蛋白的表達。然而，看來缺失未全部消除表達，轉染細胞產生少量感染性病毒體顆粒。IN del在IN del克隆中缺失幾乎整個IN蛋白。在轉染至CRFK細胞中時，克隆顯示可與野生型克隆相比的病毒蛋白表達和病毒顆粒產生。病毒體相關的RT PCR和RT活性分析表明病毒基因組RNA和RT酶被包被至病毒顆粒中。出乎意料地，從被克隆轉染的細胞中回收的病毒體具有感染性，并可在FeP2細胞中復制，雖然與野生型病毒細胞為降低的水平。整合是許多逆轉錄病毒，包括HIV-1的生產性感染所需的必需步驟。數據表明與HIV相反，FIV的IN蛋白在FeP2細胞中可能不是病毒蛋白表達和病毒復制的必需要求。DU del在DU del克隆中缺失幾乎整個DU基因。該基因產物將dUTP轉化為dUMP。克隆中缺失DU基因不影響轉染的CRFK細胞中的病毒蛋白的表達或病毒顆粒的產生。病毒基因組和RT酶被包被，轉染細胞產生的病毒體對于FeP2細胞具有感染性。然而，在FeP2中缺失克隆以比野生型FIV-141病毒慢的速率復制。這表明DU基因為病毒最大量復制所必需。數據與DU缺失FIV保留其在T淋巴細胞中復制的能力的報道一致。生物材料的保藏下面的生物材料于1998年7月1日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，被給予了下面的保藏號ATCC保藏號病毒毒株FIV-141VR-2619質粒pFIV-141-B1 203001上面所引用的所有專利、專利申請和公開的文獻被本文全文引作參考。
本發明不局限于所述的具體實施方案，它們旨在簡單地說明本發明的各個方面。功能等同的組合物和方法落在本發明的范圍內。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS，INC.<120>保護動物免于慢病毒相關疾病的組合物和方法<130>PC10173A<140>待給定<141>1999-08-23<150>60/097,645<151>1998-08-24<160>57<170>PatentIn Ver.2.0-beta<210>1<211>9464<212>DNA<213>貓免疫缺損病毒<400>1tgggaagatt attgggatcc tgaagaaata gaaaaaatgc taatggactg aggacgtaca 60taaacaagtg acagatggaa acagctgaat atgactcaat gctagcagct gcttaaccgc 120aaaaccacat cctatgtaaa gcttgccgat gacgtgtatc ttgctccatt ataagagtat 180ataaccagtg ttttgtaaaa gcttcgagga gtctctctgt tgagggcttt cgagttctcc 240cttgaggctc ccacagatac aataaaaaac tgagctttga gattgaaccc tgtcttgtat 300ctgtgtaatt tctcttacct gcgaatccct ggagtccggg ccagggacct cgcagttggc 360gcccgaacag ggacttgaaa aggagtgatt agggaagtga agctagagca atagaaagct 420gtcaagcaga actcctgcag gccttgtatg gggagcagtt gcagacgctg ctggcagtga 480gtatctctag tggagcggac ctgagctctg gattaagtca ctgctcacag gcctagataa 540agattatctg gtgactcttc gcggatcgtc aaaccagggg attcgtcggg ggacagccaa 600caaggtagga gagattctac agcaacatgg ggaatggaca ggggcgagac tggaaaatgg 660ccattaagag atgtagtaat gttgctgtag gggtagggag 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1.基本純化的FIV-141病毒，其中所述病毒具有對應于SEQ IDNO1的基因組核酸序列。
2.被權利要求1的病毒感染的宿主細胞。
3.在權利要求2的宿主細胞中產生的FIV-141子代病毒。
4.一種誘導FIV-141抗體產生的方法，包括用權利要求1的病毒感染動物。
5.權利要求4的方法，其中所述病毒在接種前被滅活。
6.一種誘導FIV-141抗體產生的方法，包括用權利要求2的宿主細胞感染動物。
7.權利要求6的方法，其中所述細胞在感染前被固定。
8.權利要求4-7任一項的方法，進一步包括從所述動物中分離所述抗體。
9.通過權利要求4-7任一項的方法制備的抗體。
10.包含權利要求1的FIV-141病毒的全病毒疫苗，其中所述病毒已被滅活。
11.一種固定細胞疫苗，包含被權利要求1的病毒感染的宿主細胞，其中所述宿主細胞被固定。
12.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后FIV-141感染的保護性免疫的劑量將權利要求10或權利要求11的疫苗施用于所述貓中。
13.基本純化的具有對應于SEQ ID NO1序列的核酸分子。
14.權利要求13的核酸分子，其中所述核酸為DNA。
15.被權利要求13的核酸轉染的宿主細胞。
16.由權利要求15的宿主細胞產生的FIV子代病毒。
17.一種在動物中誘導FIV-141抗體產生的方法，包括對所述動物注射權利要求13的核酸分子。
18.一種在動物中誘導抗體產生的方法，包括用權利要求15的宿主細胞感柒所述動物。
19.權利要求18的方法，其中所述宿主細胞在感染前已被固定。
20.權利要求17-19任一項的方法，進一步包括從所述動物分離所述抗體。
21.通過權利要求17-19任一項的方法制備的抗體。
22.一種固定細胞疫苗，包含被權利要求13的核酸轉染的宿主細胞，其中所述宿主細胞已被固定。
23.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后FIV-141感染的保護性免疫的劑量將權利要求22的疫苗施用于所述貓中。
24.一種減毒的FIV-141病毒，其在進入宿主細胞中時復制，但當與野生型病毒相比時顯示顯著降低的對貓T淋巴細胞的感染性，其中所述減毒病毒通過突變FIV-141基因組中的一個基因產生，所述基因選自Vif、MA、ORF(2)、ENV、CA、NC、SU、TMf、CT、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE。
25.權利要求24的減毒的FIV-141病毒，其中所述基因選自Vif、MA、ORF(2)和ENV。
26.被權利要求24的減毒病毒轉染的宿主細胞。
27.在權利要求26的宿主細胞中產生的FIV-141減毒病毒。
28.一種誘導FIV-141抗體產生的方法，包括用權利要求24的減毒FIV-141病毒感染動物。
29.權利要求28的方法，其中所述減毒的FIV-141病毒在感染前被滅活。
30.一種誘導FIV-141抗體產生的方法，包括用權利要求26的宿主細胞感染動物。
31.權利要求30的方法，其中所述宿主細胞在感染前被固定。
32.權利要求28-31任一項的方法，進一步包括從所述動物中純化所述抗體。
33.由權利要求28-31任一項的方法制備的抗體。
34.一種減毒的全病毒疫苗，包含權利要求24或25的病毒。
35.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后FIV-141感染的保護性免疫的劑量將權利要求34的疫苗施用于所述貓中。
36.一種減毒的宿主細胞疫苗，包含權利要求26的宿主細胞。
37.一種減毒的宿主細胞疫苗，包含被權利要求25的病毒感染的宿主細胞。
38.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后FIV-141感染的保護性免疫的劑量將權利要求36或37的疫苗施用于所述貓中。
39.基本純化的具有對應于SEQ ID NO1的序列的FIV-141核酸分子，但其中所述核酸分子在一個選自Vif、MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vifn、Vifc、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE的基因中發生突變，并且突變的分子在導入宿主細胞中時，產生能復制但相對于野生型FIV-141在PBMCs中具有顯著降低的感染性的病毒。
40.權利要求39的核酸分子，其中所述基因選自MA、Vif、ORF(2)和ENV。
41.權利要求39或40的核酸分子，其中所述核酸為DNA。
42.被權利要求39的核酸分子轉染的宿主細胞。
43.由權利要求42的宿主細胞產生的FIV子代病毒。
44.一種在動物中誘導FIV-141抗體產生的方法，包括對所述動物注射權利要求39的核酸分子。
45.一種在動物中誘導FIV-141抗體產生的方法，包括對動物注射權利要求42的宿主細胞。
46.權利要求45的方法，其中所述宿主細胞在感染前被固定。
47.權利要求44-46任一項的方法，進一步包括從所述動物中純化所述抗體。
48.由權利要求44-46任一項的方法制備的抗體。
49.一種疫苗，包含當施用于貓時足以誘導免疫性的濃度的權利要求39的核酸分子。
50.權利要求49的疫苗，其中所述核酸為DNA。
51.一種疫苗，包含被權利要求39的核酸分子轉染的宿主細胞。
52.權利要求51的疫苗，其中所述宿主細胞已被固定。
53.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后FIV-141感染的保護性免疫的劑量將權利要求49-52任一項的疫苗施用于所述貓中。
54.一種制備在宿主細胞中復制但相對于其野生型對應物具有顯著降低的感染性的減毒慢病毒的方法，所述方法包括突變一個或多個選自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、V3/4、V7/8、Vif、Vifn、Vifc、IN、RRE和ORF(2)的基因。
55.權利要求54的方法，其中所述基因選自MA、ORF(2)和ENV。
56.權利要求54或55的方法，其中所述慢病毒為FIV毒株。
57.由權利要求54或55的方法制備的減毒慢病毒。
58.被權利要求57的減毒病毒感染的宿主細胞。
59.一種誘導慢病毒抗體產生的方法，包括用權利要求57的減毒病毒感染哺乳動物。
60.一種誘導慢病毒抗體產生的方法，包括用權利要求58的宿主細胞感染哺乳動物。
61.權利要求60的方法，進一步包括從所述哺乳動物中純化所述抗體。
62.通過權利要求59或權利要求60的方法制備的抗體。
63.一種治療哺乳動物慢病毒感染的方法，包括對所述哺乳動物以足以減少一種或多種與所述感染相關的癥狀的劑量施用權利要求62的抗體。
64.一種減毒的全病毒疫苗，包含權利要求54或55的病毒。
65.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后至少一種所述慢病毒毒株感染的保護性免疫的劑量將權利要求64的疫苗施用于所述哺乳動物中。
66.一種減毒的宿主細胞疫苗，包含被權利要求58的慢病毒感染的宿主細胞。
67.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后至少一種所述慢病毒毒株感染的保護性免疫的劑量將權利要求66的疫苗施用于所述哺乳動物中。
68.一種制備適用于用于慢病毒感染的疫苗的核酸的方法，包括a)逆轉錄所述慢病毒基因組RNA；b)克隆步驟a)的逆轉錄的RNA；c)突變步驟b)的克隆的核酸中的一個基因，其中所述基因選自MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、V3/4、V7/8、Vif、Vifn、Vifc、IN、DU和RRE。d)克隆步驟c)突變的核酸。
69.權利要求68的方法，其中突變的分子在導入宿主細胞中時，產生能復制但相對于從未突變的野生型核酸制備的慢病毒具有顯著降低的感染性的病毒。
70.權利要求69的方法，其中所述慢病毒為FIV毒株，并且所述減毒病毒能復制，但相對于從未突變的野生型核酸制備的FIV在貓T淋巴細胞中具有顯著降低的感染性。
71.權利要求69或70的方法，其中所述基因選自MA、ORF(2)和ENV。
72.被權利要求71的核酸分子轉染的宿主細胞。
73.由權利要求72的宿主細胞產生的子代慢病毒。
74.一種誘導產生至少一種慢病毒毒株的抗體的方法，包括對所述動物注射權利要求68的核酸分子。
75.由權利要求74的方法制備的抗體。
76.一種疫苗，包含當施用于哺乳動物足以誘導免疫性的濃度的權利要求69的核酸分子。
77.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后所述慢病毒感染的保護性免疫的劑量將權利要求76的疫苗施用于所述哺乳動物中。
78.一種疫苗，包含當施用于貓中時足以誘導免疫性的濃度的權利要求70的核酸分子。
79.一種在貓中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后至少一種FIV毒株感染的保護性免疫的劑量將權利要求78的疫苗施用于所述貓中。
80.包含權利要求72的宿主細胞的疫苗。
81.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括以足以誘導抗隨后所述慢病毒感染的保護性免疫的劑量將權利要求80的疫苗施用于所述哺乳動物中。
82.權利要求81的方法，其中所述哺乳動物為貓，所述慢病毒為FIV毒株，并且所述疫苗以足以誘導抗隨后至少一種FIV毒株感染的保護性免疫的劑量施用。
83.具有ATCC保藏號VR-2619的貓免疫缺損病毒毒株，和從其制備的子代病毒。
84.稱為pFIV-141-B1的具有ATCC保藏號203001的質粒。
全文摘要
本發明涉及一種新的貓免疫缺損病毒,其在本文被稱為FIV－141,以及通過突變病毒基因組的特定區而產生的病毒的減毒形式。該病毒和病毒的突變形式可被用來誘導FIV－141抗體的產生以及被設計用于保護貓免于FIV的疫苗中。
文檔編號A61K48/00GK1253176SQ99118128
公開日2000年5月17日 申請日期1999年8月24日 優先權日1998年8月24日
發明者R·T·鄧, M·G·謝帕德 申請人:輝瑞產品公司