專利名稱：靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)，涉及一種用于抗腫瘤成分的提取及部分純化的生產(chǎn)方法。
應(yīng)用先進(jìn)的提取技術(shù)對(duì)中草藥中有效成分進(jìn)行提取和初步分離是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要發(fā)展方向之一，一些中草藥的單方或復(fù)方的粗提液經(jīng)粗分后已經(jīng)用于臨床并取得了較好的治療效果，這既承襲了傳統(tǒng)中醫(yī)藥標(biāo)本兼治的文化思想，同時(shí)也體現(xiàn)了西醫(yī)治療中見(jiàn)效快、目的性強(qiáng)的特點(diǎn)，重要的是克服了西藥治療中的各種毒副作用及藥物依賴性的缺憾。靈芝作為一種傳統(tǒng)的中草藥，是中草藥中的上品，已在我國(guó)民間及日本、韓國(guó)等地應(yīng)用了上千年，目前，對(duì)靈芝中有效成分的分析已引起了國(guó)際上的關(guān)注。隨著靈芝研究的深入，對(duì)靈芝的生殖細(xì)胞即孢子的研究也在加強(qiáng)。但靈芝孢子中的抗腫瘤成分進(jìn)行提取和分離還未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于從靈芝孢子中提取和分離抗腫瘤成分。
該靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)的實(shí)施方案如下A．所用原料為靈芝孢子粉；B．有機(jī)溶劑浸提，投料比即孢子粉重量g數(shù)與溶劑體積ml數(shù)之比為1∶5～1∶15，浸提3次，每次2-5小時(shí)，得浸提液；C．浸提液用普通離心機(jī)離心沉淀，轉(zhuǎn)速2000～40000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；D．上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得到油狀物，溫度維持在45～55℃并回收乙醇；E．油狀物用硅膠柱層析進(jìn)行分離，所用的柱層析填料為無(wú)機(jī)吸附劑-硅膠，160-200目，在105-110℃恒溫加熱0．5-1小時(shí)后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10，具體操作是1)裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2)上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當(dāng)于20．0g孢子粉；3)洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進(jìn)行洗脫得到3種洗脫液；F．上述3種洗脫液均用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸干，得到3種樣品；G．細(xì)胞毒性檢測(cè)，用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)3種樣品對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響。
靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離方法用于浸提的有機(jī)溶劑為乙醇或氯仿。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)1 本技術(shù)可得到天然抗腫瘤成分，得率高達(dá)1．6％，該成分在很低濃度(0．08mg／ml)時(shí)具有明顯的活性，應(yīng)用價(jià)值極大。
2 整個(gè)工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，所用儀器均為實(shí)驗(yàn)室或藥廠常用的普通儀器，成本低。
實(shí)施例1．100g破壁孢子粉用1000ml無(wú)水乙醇分3次浸泡提取，每次3小時(shí)，得到浸提液；2．浸提液用普通離心機(jī)離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸干(50℃)后，得到油狀物重約25g；3．油狀物用硅膠柱層析進(jìn)行分離。所用的柱層析填料為無(wú)機(jī)吸附劑-硅膠，160-200目，在105℃恒溫加熱1小時(shí)后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10。具體操作是1)裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2)上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當(dāng)于20．0g孢子粉；3)洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進(jìn)行洗脫，得到3種洗脫液；各洗脫液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸干，氯仿洗脫液減壓蒸干后重約3．0g，得率為72％(即A101樣品)；乙酸乙酯洗脫部分重約1．2g，得率為24％(即A102樣品)；甲醇洗脫洗脫液減壓蒸干后重約0．08g，得率為1．6％(即A103樣品)。然后用乙醇溶解后可直接用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。
4．細(xì)胞毒性檢測(cè) 按常規(guī)方法檢測(cè)各部分樣品對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的毒性，以此為依據(jù)確定它們的抗腫瘤活性大小。結(jié)果表明，A101樣品不具有細(xì)胞毒性；A102樣品在濃度為2．5mg／ml時(shí)有明顯的細(xì)胞毒性；A103樣品在濃度為0．08mg／ml時(shí)有明顯的細(xì)胞毒性。
權(quán)利要求
1．一種靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)，其特征在于A．所用原料為靈芝孢子粉；B．有機(jī)溶劑浸提，投料比即孢子粉重量g數(shù)與溶劑體積ml數(shù)之比為1∶5～1∶15，浸提3次，每次2-5小時(shí)，得浸提液；C．浸提液用普通離心機(jī)離心沉淀，轉(zhuǎn)速2000～4000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；D．上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得到油狀物，溫度維持在45～55℃并回收乙醇；E．油狀物用硅膠柱層析進(jìn)行分離，所用的柱層析填料為無(wú)機(jī)吸附劑-硅膠，160-200目，在105-110℃恒溫加熱0．5-1小時(shí)后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10，具體操作是1) 裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2) 上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當(dāng)于20．0g孢子粉；3) 洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進(jìn)行洗脫得到3種洗脫液；F．上述3種洗脫液均用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸干，得到3種樣品；G．細(xì)胞毒性檢測(cè)，用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)3種樣品對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響。
2．如權(quán)利要求1所述的靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離方法，其特征在于用于浸提的有機(jī)溶劑為乙醇或氯仿。
全文摘要
本發(fā)明是一種靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)。靈芝孢子粉用有機(jī)溶劑浸泡,浸提液用離心方法得以分離并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓濃縮得油狀物,后者經(jīng)普通的硅膠柱層析進(jìn)行分離,用氯仿、乙酸乙酯和甲醇依次洗脫,分別蒸干后得一系列的膏狀物,用人宮頸癌HeLa細(xì)胞檢測(cè)其毒性。本技術(shù)可得到天然抗腫瘤成分,得率高,該成分在很低濃度(0.08mg/ml)時(shí)具有明顯的活性,應(yīng)用價(jià)值極大。整個(gè)工藝過(guò)程簡(jiǎn)單,成本低。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1282611SQ99111169
公開(kāi)日2001年2月7日 申請(qǐng)日期1999年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者楊新林, 趙東旭, 朱鶴孫, 徐建蘭 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)