專利名稱：鴿用免疫球蛋白注射液的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用生物技術制備動物生物制品。
動物病毒性傳染病發病率與死亡率高達50-100％，疫苗對健康動物傳染病的預防是根本，但對臨床上一定比例發病群體的治療至今是一個難題。免疫球蛋白的精制與濃縮在國外僅限于微量或小型實驗階段，多為單一抗病毒免疫球蛋白。規范化、產業化濃縮與精制抗多病毒免疫球蛋白的制作工藝，在國內外幾乎無一家涉足。人類醫學方面曾在破傷風的臨床上采用鹽析沉淀法提取精破抗。目前，國內外濃縮、精制提取免疫球蛋白(Ig)主要采用①離心法；②鹽析沉淀法；③分子篩法；④有機物沉淀法；這四種方法均處于小中型試制階段。
本發明采用鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等復合病毒抗原接種單蹄獸動物后，誘導其體液免疫系統產生高效價免疫球蛋白。通過酶切、鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術精制免疫球蛋白。因而，其制備免疫球蛋白的方法較以往的要簡單、快速、易于掌握，提取回收率理想，經濟效益可觀，適于產業化制作。
本發明的優點1．制備免疫球蛋白所用的動物資源-關中大毛驢，較馬匹與駱駝等其它動物有疫病少，抗病力強，易于飼養，血漿產量高，每月采兩次血后，體質容易恢復，對動物的變態反應低等優點，易于規范化、產業化生產生物制品。
2．本發明生物制品呈透明狀液體，免疫球蛋白含量可檢測、可量化。通過除菌器處理后，可在常溫(2-10℃)存放兩年，不析出、不沉淀、不變質。
3．制備方法中采用酶切-鹽析法，使制劑中平均免疫球蛋白含量提高1-2倍左右，單位體積內的效價穩定。臨床療效顯著，患病動物通過三天救治，基本上可康復，無后遺癥，亦無毒副作用。對如鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等疫病的應急預防與緊急治療，在發病初期，其治愈率達90％以上。
本發明的技術方案采用鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等復合病毒抗原接種單蹄獸動物后，誘導其體液免疫系統產生高效價免疫球蛋白。酶切切除免疫球蛋白結構中的Fc片段(無意義可結晶片段)，以防止對接種動物產生過敏性休克，保留其具有抗病毒與中和病毒的Fab片段(有意義病原結合片段)，通過鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術精制免疫球蛋白。
本發明在制備方法中提供了以酶切與鹽析相結合的新工藝，使單位體積內的效價提高2倍，既避免了異源血漿的變態性反應，又減少了提純過程中免疫球蛋白的丟失(回收量由原來的1500g／10000mL提高到1800g／10000ml)。
本發明在制備方法中還提供了對免疫動物的基礎免疫與強化免疫的抗原組合比例配方，以及接種時機與采血時機，這對充分利用供漿動物、加大采血次數、減少原料投入有一定的意義。
以下結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明制作免疫球蛋白針劑時，采用鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等復合病毒抗原，人工多點免疫接種關中大毛驢。
第一階段基礎免疫(6針)對檢疫合格的關中驢，方可免疫。免疫途徑為頸背皮下或肌肉注射，一般注射抗原6次，間隔時間為3-4天。第一次注射抗原全量的1／4；第二次注射全量的1／3；第三次注射全量的1／3；第四次注射全量的1／2；第五次注射全量的1／2；第六次注射全量。于第六次注射后14天試血，測定免疫球蛋白效價，供以后強化免疫時參考。
第二階段強化免疫(2針)一般注射抗原2次(抗原30毫升／頭·次)，間隔時間為3-4天。免疫后試血測效價。強化免疫后6-7天，即可大量采血(采血兩次)。采血的毛驢休息半月后，即可進行下程常規高免。
常規高免(2針)一般注射2次(抗原30毫升／頭·次)，每次間隔9天(±1天)。免疫結束的第六天進行第一次采血，隔日進行第二次采血。采血量為14-16ml／Kg體重，第二次采血較第一次減少約1／5，均由頸靜脈采血。待采取的血液沉淀形成澄清黃層后，收集吸取血漿。
免疫球蛋白(Ig)的提純將血漿稀釋，按血漿量1∶2加入蒸餾水，置于容器內；對稀釋的血漿水浴加溫至29-31℃。用2mol／L鹽酸調整pH值為3．3-3．4，然后按總量每毫升加入6-9個活力的胃蛋白酶和0．2％的甲苯，攪拌均勻，以水浴加溫30℃±1℃消化2小時。消化期間提純的血漿要不斷攪拌。消化完畢后按血漿總量加入15％的硫酸銨，溶解后用2N NaOH溶液調整pH值為5．3-5．4，用水浴法加溫，以每分鐘升1℃為宜，并不斷攪拌，直至升溫至57-58℃時，再攪拌30min，靜置30min，待血漿冷卻至45℃以下時進行下一步工藝處理。
第一次沉淀濾過，將上述液體用濾布在濾槽內過濾，直至清亮，收集濾液，棄去沉淀物。二次沉淀，收集首次沉淀的濾液，用2N NaOH溶液調整pH值至7．2-7．3，按總量加入21％的硫酸銨，充分攪拌，溶解后靜置30min，然后用25支純棉濾布在不銹鋼濾槽內過濾，收集沉淀，棄去濾液。
將收集的沉淀壓干，稱重，裝入透析袋內，每袋約裝200-250g，放置流水槽內透析24-72小時。收集袋內免疫球蛋白，按180mg／mL稀釋，并按總量加入0．5％氯仿，0．85％氯化鈉和0．5％硫酸慶大霉素粉，充分攪拌溶解后，用2N NaOH溶液矯正pH為6．6-6．8。置5-15℃靜置沉淀48小時，最后以正壓形式用直徑為0．3um硝酸纖維微孔濾膜除菌過濾，所得濾液經半成品檢驗合格后即可組批分裝。經成品檢驗合格后即可。
權利要求
1．鴿用免疫球蛋白注射液，其技術特征是采用鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等復合病毒抗原接種單蹄獸動物后，誘導其體液免疫系統產生高效價免疫球蛋白，酶切切除免疫球蛋白結構中的Fc片段，保留其具有抗病毒與中和病毒能力的Fab片段，通過鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術精制免疫球蛋白。
2．根據權利1要求所述的鴿用免疫球蛋白注射液，其特征是在制備方法中提供了以酶切與鹽析相結合的新工藝(酶切→熱處理→鹽析→純化)。
3．根據權利要求1或2所述的鴿用免疫球蛋白注射液，其特征是在制備方法中，還提供了對免疫動物的基礎免疫與強化免疫的抗原比例配方(卡介苗／抗原10mg／30ml)，以及接種時機(基礎／強化／常規3／4／7)與采血時機(13天)。
全文摘要
鴿用免疫球蛋白注射液,涉及應用生物技術制備動物生物制品,其技術特征是:采用鴿復合病毒抗原接種單蹄獸動物后,誘導其體液免疫系統產生高效價免疫球蛋白。通過酶切、鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術精制免疫球蛋白,使免疫球蛋白的濃縮與精制工藝規范化、產業化,對鴿痘、鴿新城疫、鴿喉氣管炎、鴿馬立克、鴿法氏囊、鴿霍亂、鴿傷寒熱等疫病的應急預防與緊急治療,在發病初期,其有效率達93%、治愈率達88%以上。
文檔編號A61K39/395GK1281728SQ99110858
公開日2001年1月31日 申請日期1999年7月22日 優先權日1999年7月22日
發明者李六金 申請人:李六金