專利名稱：流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗的制作方法
“流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗研究”屬國家95醫學科技攻關專題(編號96-906-03-14)。由中國預防醫學科學院病毒學研究所牽頭，中國藥品生物制品檢定所和衛生部蘭州生物制品研究所參加。本發明涉及的病毒株、Vero細胞生產庫、生產工藝流程和質量控制標準及檢定方法均由病毒學研究所獨家完成。
流行性出血熱(國際上統稱腎綜合征出血熱)是危害我國人民最嚴重的自然疫源性傳染病，由某些漢坦病毒(Hanta Virus)引起，我國主要是漢灘病毒(Hantaan Virus，即上述的野鼠型或稱Ⅰ型)和漢城病毒(Seoul Virus，即上述的家鼠型或稱Ⅱ型)，安全有效的疫苗是減少發病率，控制爆發流行的關鍵之舉。雖然我國已有三種動物原代細胞和乳鼠腦純化滅活疫苗，并取得良好的近期防病效果，但是由于要建立大量正常的動物種群，不僅費時費力，質量也難以保證，而且由于原有疫苗每劑量的抗原含量有限，全程免疫后的抗體反應水平及陽轉率偏低，長期的防病效果有待考驗。隨著改革開放后我國人民文化、生活水平的提高，必須要有更安全、更有效的高質量疫苗，以滿足日益增長的防病需要。
通過四年來的努力，從病毒株的選育和培養適應，Vero細胞庫的建立、生產工藝及質量標準的制定和實施等，已經連續研制出了三批上述純化疫苗，完成了全部臨床前的實驗研究，各項結果指標均符合WHO和我國有關疫苗的質量標準。
一個安全有效的疫苗的關鍵是要有好的疫苗毒株、合適的細胞培養系統、穩定易行的生產工藝流程和一套嚴格完整的質量控制標準及方法。1．毒株的選育及在Vero細胞上的傳代適應出血熱病毒是優劣不等的群體，在Vero細胞上利用終末稀釋或空斑篩選及乳小白鼠腦中交替傳代的方法，可以獲得繁殖力強(即病毒毒力滴度高)，抗原性和免疫原性好的疫苗候選株。我們用地鼠腎細胞傳代12次的疫苗株病毒L99，再經Vero細胞連續3代，終末稀釋5代，再經乳鼠腦3代及Vero細胞2代的病毒作為疫苗種子病毒，再連續2～4代作為Ⅱ型疫苗生產用毒種。另外用84Fli毒株Vero細胞傳代連續3代，終末稀釋5代，再在乳鼠腦3代及Vero細胞2代作為疫苗種子病毒，再連續2～4代作為Ⅰ型疫苗生產用毒種。種子病毒的滴度始終保持在107TCID50/ml以上。其他毒株包括R22、A9、PS-6、FT-14、H5和C4等采用上述類似的方法，均可達到上述目的[說明書附
圖1．我國流行性出血熱病毒流行株L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5、C4等在Vero細胞上的傳代適應(圖中滴度為IFAT測定結果)傳代適應條件1、原始滴度；2、在Vero細胞連傳三代；3、用終末稀釋法連續傳5代，可以較好地提高病毒毒力滴度；4、回傳乳鼠，即腹腔接種，收取乳鼠腦，鼠腦懸液毒方滴度可達8.0LogTCID50/ml；5、再在Vero細胞上適應傳代，毒力一般均達7.0LogTCID50/ml以上，再傳至4～6代，可用于疫苗的試制。]為了保證使用毒株的正確性，進一步用特異引物作RT-PCR擴增分型{說明書附圖2．在Vero細胞傳代適應的L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株為，用型特異引物進行RT-PCR，以進一步確定它們的基因型。表明L99和R22毒株為Ⅱ型，而A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株為Ⅰ型。[用上述毒株感染的Vero細胞提取全RNA，先用共用引物合成cDNA第一鏈，再用Ⅰ和Ⅱ型分型引物進行擴增。共用引物為P1CCGGATCCTAGTAGTAGACACCGC(+)；Ⅰ型引物為P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P3TGTTAACCGGAATCG(-)；Ⅱ型引物為P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P4GCCCTGAAACTGG(-)]}。2．在合適的Vero細胞上生產疫苗原液，半成品和成品的檢定內容及方法以中國藥品生物制品檢定所引入早代Vero細胞種(130代左右)，每3～4天傳一代，至第135代建立生產用種子細胞庫，傳至140～145代可以獲得足夠量的細胞用于生產。
對疫苗原液，半成品及成品檢定，采用如下方法(1)疫苗原液無菌試驗，無細菌、真菌及支原體污染；病毒毒力測定，達到6.5～7.0LogTCID50/ml；免疫熒光(IFAT)+++以上；感染細胞中的外源因子檢查陰性。
(2)半成品的檢定濃縮和純化滅活樣品，分別測定蛋白含量，以確定純品中蛋白及其他雜質的去除率；純品中殘余牛血清蛋白的含量應＜50ng/ml(檢定所試劑盒)細胞DNA含量應＜100pg/針(分子克隆技術)；安全試驗(在E6或Vero細胞上盲傳3代，IFAT檢測陰性)；β-丙內酯殘留量(疫苗研制過程中可完全水解去除)。
(3)疫苗成品的全面檢定無菌試驗(需增菌檢定)；毒性試驗(用3周小白鼠)；熱原試驗(用2kg重大白兔)；效力試驗(0,7天免疫2kg重大白兔，28天后測中和抗體，四只兔子中必須有三只抗體≥1∶20以上)；Al(OH)3含量＜0.7mg/ml；硫柳汞含量＜0.01(g/ml)；總蛋白含量＜4mg/針；外觀(白色、微混濁)；pH值(6.5～7.8)。
上述各項檢定，均符合規程要求的指標，以保證疫苗的安全和有效性。3、通過上述疫苗的試制，形成一套易行而又穩定的生產工藝流程經全面檢定合格的Vero細胞懸液分別接種經嚴格檢定的Ⅰ、Ⅱ型生產用毒種，分裝至轉瓶中培養，2～3天成片后，用Hanks液噴淋，加含0.2％人白蛋白的199維持液，而后每3～4天收獲一次，經無菌試驗和毒力測定合格，合并。合并的原液10000r/m連續流離心，超濾濃縮，硫酸魚精蛋白沉淀，7000r/m 30分鐘離心，吸去上清，柱層析(BPG)純化，滅活，半成品檢定合格，稀釋除菌，加入白蛋白、硫柳汞及Al(OH)3，分裝后進行成品全面檢定[說明書附圖3流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗生產工藝流程。(所謂多價，即包括不同型的流行性出血熱病毒，至少含有Ⅰ和Ⅱ型病毒兩種)]4、上述生產工藝流程圖(即生產過程)中，我們作了如下改進(1)病毒生產Ⅰ、Ⅱ型種子病毒分別與細胞混種的方法，縮短了生產周期及污染率；(2)一定間隔的充分的噴淋，以盡可能去除殘存牛血清；(3)增加了疫苗原液連續流離心，去除更多的細胞雜質；(4)純化時，改變了洗脫液的pH值，提高了Al(OH)3對病毒抗原的吸附度，有可能提高其免疫原性；(5)病毒樣品純化后再進行β-丙內酯滅活，可減少污染及可能的抗原損失；(6)單價疫苗單獨進行濃縮和純化，然后按抗原量稀釋，配制成單價苗，而后適量合并成多價純化疫苗，這樣有更多調配抗原含量的余地。
以下的優先實施例對本發明或者實用新型作補充說明，但不意味著限制本發明的內容，在這些實施例中，為說明本發明，我們采用了自己分離的并在地鼠腎細胞生產的L99疫苗株，及第四軍醫大學唐都醫院分離由我們在Vero細胞和乳小白鼠適應的84Fli毒株，分別在Vero細胞(從檢定所引進)制備出原液苗，再經市售Millipore PELLICON 300K M.W.超濾濃縮器及Amersham Pharmacia Biotech公司Sepharose 4FF介質組裝的BPG柱，作為原液疫苗濃縮及純化的重要手段，對于純品疫苗的質量控制除常規檢測外，還進行一些特殊的檢測。實施例1，為合適疫苗毒株的選育；實施例2，為原液疫苗的生產；實施例3，為原液疫苗的濃縮及純化；實施例4，疫苗原液半成品及成品檢定；實施例5，純化樣品的特殊檢定。實例1．選育繁殖力強，抗原譜廣，免疫原性及抗原性強的病毒株是疫苗成敗的關鍵。
(1)選擇了實驗室收集和分離的多個病毒株或疫苗候選株，包括L99,R22,A9,FT-14,PS-6,H5,84Fli,C4等，在Vero細胞傳代適應；(2)在Vero細胞采用終末稀釋的方法傳代；然后(3)回至乳小白鼠腹腔接種，收取乳鼠腦中病毒傳代；最后(4)Vero細胞繼續傳代，達到相對較高的病毒滴度(如圖1．)，同時對病毒的基因型(用RT-PCR技術)進行進一步確證(如圖2．)。實例2．將液氮凍存的134代Vero細胞復蘇和傳代培養，至138代獲得足夠生產用量的細胞，消化成細胞懸液，與Ⅰ型或Ⅱ型病毒一定比例混合分種轉瓶培養成牢固單層后，用緩沖液充分噴淋(有間隔)，加入0.2％人白蛋白199培養基(pH7.4～7.8)繼續培養7～19天，每3～4大收液一次作無菌試驗及毒力測定，無菌試驗合格，毒力滴度大于6.50LogTCID50/ml，即為合格疫苗原液。實例3．疫苗原液的濃縮及純化上述合格的疫苗原液合并，進行連續流離心機離心(10000r/m)，去除細胞碎片和雜質，然后用Millipore PELLICON 300K M.W.超濾濃縮至少50～100倍，再經裝載有Sepharose 4FF介質的BPG柱(全套由瑞典Amersham Pharmacia生物技術公司生產)，紫外檢測第一峰即為所需要的純化病毒峰，按收集的液量，加入β-丙內酯(1∶4000)滅活，測定有關抗原蛋白含量及ELISA滴度，用PBS(pH7.2～7.4)稀釋至合適量(比疫苗原液高4～8倍)，同時檢測殘余牛血清含量，Vero細胞DNA含量及安全試驗(盲傳3代)，必要時檢測β-丙內酯殘留量，稀釋的樣品中立即加入0.3～0.5％人白蛋白，0.5mg/ml的Al(OH)3及硫柳汞防腐劑等，此為純化疫苗半成品。半成品的檢定，實際是Ⅰ型和Ⅱ型疫苗的分別檢定，內容如下所述。實例4．疫苗原液、疫苗半成品及成品的檢定。
在病毒培養進程中，用免疫熒光檢測來估計病毒在細胞中繁殖狀況，一般IFAT在+++以上為好。收獲的原液應做無菌試驗及病毒毒力滴定。
半成品的檢定半成品分兩類，即在加入白蛋白，Al(OH)3和硫柳汞等以前及以后，以前包括蛋白含量、抗原活性(ELISA滴度)、β-丙內酯含量、殘牛血清蛋白含量及Vero細胞DNA含量的測定，安全試驗；以后做無菌試驗。而對加入成分的含量測定都放在成品的檢定中。
成品的檢定成品是Ⅰ型半成品和Ⅱ型半成品(在加入人白蛋白等以后)適量合并，分裝安瓶后的制品。需作全面檢定，包括無菌試驗，毒性試驗，熱原試驗，效力試驗及Al(OH)3，硫柳汞和總蛋白量等，另外還包括外觀及pH值等理化檢定。實例5．純化樣品的特殊檢定下列檢定，將不一定包括在以后的疫苗生產過程中純化樣品中病毒顆粒形態觀察及病毒蛋白SDS-PAGE電泳，以此判定病毒的特異性及純度。病毒形態由本所形態室用負染色進行[如說明書附圖4純化病毒樣品中的病毒顆粒形態(負染色，30000×)]。電泳按本室常規操作進行[如說明書附圖5、純化病毒樣品的SDS-GAGE電泳圖1、純化樣品84Fli；2、純化樣品L99；3、蛋白Marker，由上至下分子量依次為97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD。]
權利要求
1．流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗，其特征在于(1)使用經Vero傳代細胞長期傳代適應的我國流行性出血熱流行株-至少包括野鼠型(即Ⅰ型，如A9、PS-6、FT-4、84Fli、H5、C4)和家鼠型(即Ⅱ型，如L99、R22毒株)，它們的毒力滴度均達7.0Log/ml以上；具有較好的免疫原性及抗原性。(2)野鼠型(Ⅰ型)和家鼠型(Ⅱ型)毒株分別在Vero傳代細胞(美國ATCC引進，中國藥品生物制品檢定所提供，生產疫苗時代次不超過150代)培養，多次收液，合并即為原液，原液經10000轉/分連續流離心，PELLICON 300K超濾濃縮，Sepharose4 FF(BPG柱)純化，β-丙內酯滅活，再經稀釋除菌，半成品檢定合格，加佐劑及多價配伍，成品檢定合格而成純化疫苗。半成品檢定①無菌試驗陰性，合格；②安全試驗三代盲傳(Vero-E6細胞)，IFAT檢查陰性，合格；③殘余牛血清蛋白含量＜50ng/ml，合格；④蛋白含量＜200ng/ml；⑤細胞DNA含量＜100pg/針。成品檢定①無菌試驗陰性，合格；②毒性試驗陰性，合格；③硫柳汞含量＜0.01％(g/ml)合格；④氫氧化鋁含量＜0.7％mg/ml合格；⑤pH6.5～7.8，合格；⑥過敏原測定陰性，合格；⑦熱原測定陰性，合格；⑧效力試驗每批疫苗免疫家兔4只，對Ⅰ、Ⅱ型病毒的中和抗體分別≥1∶20。(3)上述毒株的生產、檢定已經形成一套系統、合理而穩定的生產工藝流程和質量控制標準，以保證產品(疫苗)的質量。(4)純化疫苗應用于人體，具有更好的免疫效果及更好的安全性，將會得到使用者的歡迎。將會產生良好的社會效益和一定的經濟價值。
2．根據權利要求1(1)使用經Vero細胞傳代的上述我國流行性出血熱病毒流行株(包括L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5、C4等)，可被用于Vero傳代細胞為基質的疫苗生產；
3．根據權利要求1(2)流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗在Vero傳代細胞中的生產，其半成品和成品的全面系統檢定內容及方法，可被用于Vero傳代細胞純化疫苗的質量控制；
4．根據權利要求1(3)流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗在Vero傳代細胞中的生產，全面、系統、合理而又穩定的生產工藝流程及質控標準，可被利用作為Vero細胞純化疫苗的流程及標準。
5．根據權利要求1(4)流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗，由于采用了高速連續流離心機離心，去除了更多的雜質，同時人為地控制了病毒蛋白和抗原含量，因而使本疫苗效價高，對人體的副反應更小，達到既有效又安全的目的。
全文摘要
流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗是屬生物技術領域“九五”國家醫學技術攻關專題研究內容，包括我國流行性出血熱病毒流行株在Vero傳代細胞中的傳代適應，毒株的選育，Vero細胞庫的建立，病毒在Vero細胞中的培養、收獲，超濾濃縮及純化，稀釋配制，分裝，以及對疫苗原液、半成品及成品一系列的檢測和檢定，以保證疫苗的質量，使其既安全又有效，用于流行性出血熱(腎綜合征出血熱)的免疫預防。
文檔編號A61P31/00GK1237456SQ99109199
公開日1999年12月8日 申請日期1999年6月23日 優先權日1999年6月23日
發明者杭長壽, 李德新, 孫世華, 解燕鄉, 霍子威, 張全福, 梁米芳 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所