一種新的人金屬硫蛋白及其編碼序列的制作方法

專利名稱：一種新的人金屬硫蛋白及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人金屬硫蛋白L(Metallothionein-L，簡稱為“MTL”)的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是MT的異構體之一。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
金屬硫蛋白(MT)是一個低分子量的、與重金屬結合的蛋白家族，每個MT含有兩個金屬硫簇，能與7至12個重金屬原子結合，其半胱氨酸含量高，并且不含芳香族氨基酸，分子量一般小于10kDa。MT廣泛存在于動物和植物中，在原核生物中也有發現。在哺乳動物中，MT的半胱氨酸殘基極度保守，通過硫醇鍵與鋅、銅、鈣、鉻等重金屬原子結合。在人中，至少有10到12個基因編碼MT，這些基因被分為兩類MT-Ⅰ和MT-Ⅱ(分類標準是依據基因編碼的蛋白在DEAE-纖維素上的洗脫位置，與結構或功能上的相似無必然聯系)，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多數組織中表達。后來又發現MT-Ⅲ、MT-Ⅳ，分別只在腦和復層鱗狀表皮中表達(Masters．B．A．et al Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1994，91584-588)。MT具有很強的可誘導性，可被金屬、糖皮質激素、某些毒物、細胞因子及應激因素誘導合成(周杰昊等，1995．生理科學進展2629-34)MT能解毒金屬，在發育過程中調節鋅和銅的體內平衡，參與金屬代謝和解毒，MT在消除自由基方面也有作用，在門克氏綜合癥(Menkes disease)、鼠花斑狀表型、肝豆狀核變性(Wilson’s disease)中，MT可能保護機體免受銅毒害。另外MT與某些抗腫瘤化療藥物，特別是順二胺二氯鉑(cDDP)相互作用，可減輕其細胞毒性。
MT的克隆工作開展順利，在人中就有多個MT基因的異構體被克隆。1982年，Karin等人首先克隆到MT的cDNA序列(Karin，M．et al．1982，Nucl．Acid Res．103165-3173)。人MT-IIA(Karin，M．et al． 1982．Nature 299797-802)、MT-IA(Richards，R．I．et al．1984．Cell 37263-272)、MT-IE、MT-IF(Schmidt，C．J．etal．1985 J．Biol．Chem．2603672-3675)的基因組序列也陸續分離克隆，還有人的一些假基因克隆工作(ψMT-IIB、ψMT-IC、ψMT-ID、ψMT-IG、ψMT-I、φMT-IH)也被報道。其他物種中的MT cDNA(小鼠MT-Ⅰ、大鼠MT-Ⅰ、猴MT-Ⅰ和MT-Ⅱ、中國倉鼠MT-Ⅰ和MT-Ⅱ、綿羊MT-Ⅰ)和基因組DNA(小鼠MT-Ⅰ和MT-Ⅱ)的克隆也進展順利(see ref．Hamer，D．H．1986．Ann．Rev．Biochem．55914-951)。
然而在本申請之前，還沒有分離和公開過本發明的MTL。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸被命名為人金屬硫蛋白L(human Metallothionein-L，簡稱為“人MTL”或“hMTL”)。
本發明的另一個目的是提供一種新的人MTL蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人的MTL多肽的方法。
本發明還提供了這種人的MTL核酸序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人MTL蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人MTL蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人MTL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人MTL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人MTL蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人MTL蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為247個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO．3，其中開放讀框位于35-220位核苷酸。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“人MTL蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO．3中35-220位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO．3序列的編碼框35-220位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO．3中35-220位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO．4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人MTL相同功能的蛋白的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-60個，較佳地1-30個，更佳地1-15個，最佳地1-6個)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加數個(通常為30個以內，較佳地為15個以內，更佳地為9個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“人MTL蛋白多肽”指具有人MTL蛋白活性的SEQ ID NO．4序列的多肽。該術語還包括具有與人MTL相同功能的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個或數個(通常為15個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人MTL蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人MTL DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人MTL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人MTL多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人MTL多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人MTL多肽序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約40個連續氨基酸，更佳地至少約50個連續氨基酸，最佳地至少約60個連續氨基酸。
發明還提供人MTL蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人MTL多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人MTL保守性變異多肽”指與SEQ ID No．4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發明還包括人MTL多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內人MTL的表達。
本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人MTL多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人MTL的核酸分子。
本發明還包括檢測人MTL核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于人MTL多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人MTL DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人MTL基因產物或片段。較佳地，指那些能與人MTL基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人MTL蛋白的分子，也包括那些并不影響人MTL蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人MTL基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No．4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人MTL基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人MTL或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人MTL功能的抗體以及不影響人MTL功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人MTL基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人MTL基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E．Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人MTL核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆人載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施例中，人MTL的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物--A5′-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3′(SEQ ID NO．1)為正向引物，寡核苷酸B5′-ACATCTGGGAGAAGAGCTGTTGC-3′(SEQ ID NO．2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷約為250bp的目的片段(SEQ ID NO3)。
MT能解毒金屬，在發育過程中調節鋅和銅的體內平衡，參與金屬代謝和解毒，MT在消除自由基方面也有作用，在門克氏綜合癥(Menkes disease)、鼠花斑狀表型、肝豆狀核變性(Wilson’s disease)中，MT可能保護機體免受銅毒害。另外MT與某些抗腫瘤化療藥物，特別是順二胺二氯鉑(cDDP)相互作用，可減輕其細胞毒性。
本發明的發現和分離出的這種新的人金屬硫蛋白，是研究金屬硫蛋白的有用工具。此外，由于本發明的人MTL具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與源于其他物種的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發明的人MTL與人MT-1B(sp|P07438)、人MT-1E(sp|P04732)、人MT-1I(sp|P80295)等金屬金屬硫蛋白的共4種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標出，相似的氨基酸用“·”標出。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人MTL的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴增以人肝λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物--A5′-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3′(SEQ ID NO．1)為正向引物，寡核苷酸B5′-ACATCTGGGA GAAGAGCTGTTGC-3′(SEQ ID NO．2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的長度約為250bp的PCR目的片段A／B。
2．PCR產物的測序將上述PCR擴增產物A／B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用SequiThermEXCEL TMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對插入片段進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共247bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于35-220位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出人MTL的氨基酸序列，共61個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較用本發明的人MTL的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數據庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，在核苷酸水平上分別與鼠的MT(emb|V01533)、人MT-IR(emb|X97261)、人MT(emb|X64177)、人MT-IL(ref|NM_002450．1|)等有較高同源，同一性分別為93％、91％、89％、90％。同源蛋白比較也支持此序列的正確，在氨基酸水平上MTL推導蛋白與人MT-1B(sp|P07438)、人MT-1E(sp|P04732)、人MT-1I(sp|P80295)等金屬金屬硫蛋白的同一性分別為86％、86％、85％(四者同源比較見圖1)。
哺乳動物的MT蛋白的特征有由60-68個氨基酸殘基組成，其中半胱氨酸占23-33％，約有20個，分子量小于10kDa，并在氨基端含有一段由19個殘基組成的一致順序C-x-C-[GSTP]-x(2)-C-x-C00-x(2)-C-x-C-x(2)-C-x-K(其中C為半胱氨酸，x為任意氨基酸，數字表示氨基酸數目，[GSTP]表示這四個氨基酸中的任意一個)。本分明MTL符合以上特征由61個氨基酸殘基組成，其中半胱氨酸20個，占33％，分子量約為6kDa，而且位于13-31位的序列13CACTGSCKCKECKCTSCKK31符合一致順序。因此，這表明本發明的人MTL是MT的又一個異構體。
根據結構決定功能，結構相似功能相關的生物學原理，可以根據已知的不同物種中的MT基因及其編碼蛋白的功能來推測本發明MTL的生物學功能。
現有的研究都表明，金屬硫蛋白具有重要的諸如解毒等作用，而且與某些疾病也存在密切的相關性。例如，研究表明MT與金屬代謝有關。早期實驗表明MT對重金屬有解毒作用對動物預給Zn誘導MT合成可產生對Cd細胞毒性的抵抗，喪失MT活性能力的哺乳動物以及缺乏MT的組織對Cd毒性高度敏感。但后來的研究發現Cd-MT具有細胞毒性，血漿中Cd-MT對妊娠期母體血管內皮細胞有損傷作用，引起內皮細胞炎癥、蛋白尿、血管痙攣、水腫等癥狀產生，有人認為血漿中Cd-MT可能是妊娠中毒癥的主要原因(Chisolm，J．C．et a1．3rdInternational Meeting on Metallothionein(Abstract)Dec8-11，1992．94)。
Menke氏病是一種X-連鎖的兒科疾病，其特征是體內銅分布失調，銅以及一些銅依賴性酶水平下降，Cu-MT在除肝臟以外的組織過度積累。鼠花斑狀表型的突變體(一種很好的Menkes氏病動物模型)與Menkes氏病患者的一些特征一致。Wilson氏病也在銅代謝方面有障礙，先天性銅在肝和腦中先天性過度積蓄。這三種病變都通過銅代謝影響MT的基因調控，反之它們的治療機制可能是通過MT進行的。近年來對Wilson氏病進行補Zn治療，取得了較好的療效。患者口服Zn鹽后誘導腸粘膜細胞內MT水平增高，由于MT與Cu結合能力強于與Zn結合的能力，因此Cu-MT可隨粘膜脫落到腸腔而由糞便排出，血漿Cu濃度減低，從而達到給Zn鹽促排Cu的效果(Gurkan．，V．Y．et al．1992．J．Lab．Clin．Med．120380-386)。
MT能消除自由基。1985年，Vasak離體實驗表明，MT可以消除由于輻射形成的OH自由基，而且在與GSH作用后，MT得到再生(Thonally，P．et al．1985．Bioch．Biophys．Acta．82736-44)。13μmol／L的MT與10μmol／L的GSH在保護牛胸腺DNA免受áOH損傷方面具有同等效力。對Cd耐受的中國倉鼠V79細胞含有較多的MT，與對照組相比，對H2O2、O2-引起的耐受力大大提高(Temopleton，D．M．et al 1991．Riordan JF and Vallee BL ed．Methods of Enzymology．Vol．205，11-24)。在臨床醫學中關于MT抗自由基的作用也有研究，Mulder等發現氧自由基與炎性腸病的組織損傷有關，通過測定病人中的MT濃度發現，MT的濃度為對照組細胞胞漿＞炎性腸病非炎性細胞胞漿＞炎性腸病炎性細胞胞漿，這一發現可能有助于闡明炎性腸病的部分病因，即腸上皮損傷可能是由于某種原因使消除自由基的物質減少，而導致氧自由基產消失衡(Mulder，T．P．J．et al．1991．Gut．321146-1150)。
MT與cDDP作用，可減輕cDDP細胞毒性。順二胺二氯鉑(cDDP)是一種常用的化療藥，但由于其對腎組織的損傷，應用受到很大限制。1985年，Imura等預給小鼠皮下注射硝酸鉍(BSN)致使cDDP的腎毒性減輕。Saijo等進一步研究發現，BSN可以特異誘導正常腎臟組織合成MT，而對腎癌和正常組織并不誘導MT產生；還發現cDDP對預給Bi鹽的動物腎臟損傷小，而cDDP殺傷腫瘤的效果未減。其機制可能與Bi鹽在腎組織中誘導MT合成，而在腫瘤組織中并不誘導MT合成有關(Saijo，N．et al Mrtallothionein 111，BaselBirkhauser Verlag，1993．279-292)。
另一方面，有研究表明MT與腫瘤抗藥性有關。對幾種抗cDDP細胞系進行MT含量分析，發現四種抗cDDP的腫瘤細胞系胞內MT含量比相應母系高2-4倍；用人MT-ⅡA DNA片段為探針進行核酸雜交，發現抗cDDP的細胞株中的MT mRNA含量比母系高幾倍甚至十幾倍；將人MT-ⅡA DNA片段轉入原來對cDDP敏感的鼠細胞中，發現該細胞系對cDDP的抗性提高了44倍，胞內MT含量也提高了10倍(Kellley，S．L．et al．1988．Science 2411813-1815)。
肝臟中富含MT，MT與肝臟疾病有一定關系。通過放免分析測定肝病患者肝MT含量，發現慢性肝炎病人的肝MT含量比正常人高，而肝硬化病人肝MT含量比正常人低，在動物肝硬化模型中用Zn誘導肝MT的合成，可明顯抑制肝組織纖維化，這表明肝MT含量下降可能與肝硬化病人組織纖維化有關(see ref．周杰昊等，1995．生理科學進展2629-34)。Mulder等人觀察原發性膽汁性肝硬變與MT的關系，發現原發性膽汁性肝硬變病人血漿MT濃度隨病情加重而上升，因而MT水平可作為原發性膽汁性肝硬變病情發展的一個監控指標(Mulder，T．P．J．et al．1991．Hepatology 141008-1012)。
本發明的人MTL除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人MTL還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人MTL的N端與小鼠MT-Ⅱ的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人MTL的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人MTL核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人MTL的表達水平或者抑制人MTL的過度表達。本發明的人MTL蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人MTL缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人MTL在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產物A／B為模板，將編碼人MTL的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．5和6)進行擴增，獲得人MTL cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5-CAAGGTCGACATGGACCCCAACTGCTCCT-3′(SEQ ID NO．5)，該引物含有SalⅠ限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人MTL編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO．6)，該引物含有HindⅢ限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人MTL的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子／操縱子(P／O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒測序驗證人MTL的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液體培養基中過夜培養(O／N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O／N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0．4-0．6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導啟動P／O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人MTL。用6M鹽酸胍(pH5．0)從柱中洗脫人MTL。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5．0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w／v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約6kDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO．4的序列一致。
實施例4人MTL在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產物A／B為模板，將編碼人MTL的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．7和8)進行擴增，獲得人MTL cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-CAAGAAGCTTATGGACCCCAACTGCTCCT-3′(SEQ ID NO．7)該引物含有HindⅢ限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人MTL編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-TAGGGGATCCTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO．8)該引物含有BamHⅠ限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人MTL的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(fl ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg／ml)的LB液體培養基中過夜培養(O／N)含所需構建物的克隆。抽提質粒測序驗證人MTL的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為6kDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO．4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg／0．2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg／0．2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人MTL基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生沉淀。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人復旦大學(ⅱ)發明名稱一種新的人金屬硫蛋白及其編碼序列(ⅲ)序列數目8(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TAC23(2)SEQ ID NO．2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2ACATCTGGGA GAAGAGCTGT TGC23(2)SEQ ID NO．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度247bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO．3TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TACCGCGGCT CGAAATGGAC CCCAACTGCT CCTGCACCAC 60TGGTGTCTCC TGCGCCTGCA CCGGCTCCTG CAAGTGCAAA GAGTGCAAAT GCACCTCCTG 120CAAGAAGAGC TGCTGCTCCT GCTGCCCCGT GGGCTGTGCC AAGTGTGCCC ACGGCTGTGT 180CTGCAAAGGG ACGTTGGAGA ACTGCAGCTG CTGTGCCTGA TGTGGGAACA GCTCTTCTCC 240CAGATGT 247(2)SEQ ID NO．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度61個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．4Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys 15Thr Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys 30Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala 45His Gly Cys Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn Cys Ser Cys Cys 60Ala 61(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．5CAAGGTCGAC ATGGACCCCA ACTGCTCCT29(2)SEQ ID NO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．6TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG 29(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．7CAAGAAGCTTATGGACCCCAACTGCTCCT 29(2)SEQ ID NO．8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．8TAGGGGATCCTCAGGCACAGCAGCTGCAG 29
權利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列雜交。
2．如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。
3．如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列。
4．一種分離的人MTL蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7．一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8．一種產生具有人MTL蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人MTL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人MTL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人MTL蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人MTL蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求4所述的人MTL蛋白多肽特異性結合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種新的人金屬硫蛋白L(Metallothionein－L,簡稱為“MTL”)的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白MTL是金屬硫蛋白MT的異構體之一。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號A61K39/395GK1290747SQ99108849
公開日2001年4月11日 申請日期1999年6月24日 優先權日1999年6月24日
發明者余龍, 張宏來, 傅強, 趙勇, 趙壽元 申請人:復旦大學