專利名稱：流行性出血熱原代地鼠腎細胞多價純化疫苗的制作方法
技術領域：
本發明屬生物制藥領域，涉及流行性出血熱疫苗，特別是涉及應用GHKC為細胞基質和以適應于GHKC的EHF病毒株為毒種，生產流行性出血熱多價疫苗及純化的方法。
流行性出血熱(EHF)國際上稱腎綜合征出血熱(HFRS)，是以鼠類作為傳播媒介的自然疫源性疾病，是一種嚴重危害人民健康的病毒性急性傳染病。近年來，全世界每年有約15萬病例，死亡率達3％～10％。流行疫區在不斷擴大，重癥型疫區主要發生在亞洲和歇洲東部，輕癥型遍及全世界。在中國，已有28個省，市、自治區有本病的發生和不同程度的流行，1986年曾發生11萬病例，對人民的健康、生命安全和國民經濟的發展均造成嚴重影響。為此，對疫區高危人群和將進入疫區工作或旅游的人們進行特異性免疫接種，是降低發病率，有效控制本病暴發流行的根本途徑。
自1978年韓國李鎬汪等首次成功地分離到腎綜合征出血熱病毒以后(Lee HW,et al,Infect Dis,1978.137,298)，國內外許多研究者都著手進行流行性出血熱疫苗的研究。韓國李鎬汪首先研制出乳鼠腦純化疫苗(LeeHW.et al,Archvirol,1990 [supplⅠ],35)，朝鮮金洛濟等研制出白鼠和地鼠乳鼠腦純化疫苗(金洛濟等，中華實驗和臨床病毒學雜志，1991,5,487)，我國在流行性出血熱疫苗研究方面進展也較快。蘭州生研所用分離自黑線姬鼠的LR1株(Ⅰ型)病毒研制出鼠腦純化疫苗(孫柱臣等，中國媒介生物學及控制雜志，1992.3<特刊7期>,203).上海生研所和浙江省防疫站用分離自病人血清的Z10株(Ⅰ型)病霉研制出長瓜沙鼠腎細胞疫苗(朱智勇等，中國媒介生物學及控制雜志，1992.3<特刊7期>,279)，流研所用分離自黑線姬鼠的A16株(Ⅰ型)病毒研制了雞胚細胞疫苗(嚴玉臣等，中國媒介生物學及控制雜志，1992,3,166)，長春生研所和中國預防醫學科學院病毒學研究所用分離自羅賽鼠的L99株(Ⅱ型)病毒研制出地鼠腎細胞疫苗(宋干、黃永成等，病毒學報，1991,7(2),102～106)，但上述的疫苗均是單價疫苗(Ⅰ型或Ⅱ型)，而我國多數是以Ⅰ型或Ⅱ型為主的混合型疫區。
1995年5月，世界衛生組織(WHO)在芬蘭赫爾辛基召開了漢坦病毒疫苗研制會議，會議提出“漢坦病毒疫苗的最終目標應是一種能防御各種致病漢坦病毒的多價疫苗”(《國外醫學》預防、診斷、治療用生物制品分冊，1997,20(1),27)，韓國從l993年開始用Ⅰ型疫苗和Ⅲ型疫苗(普馬拉病毒、PUUV)聯合研究雙價疫苗，但未見人體臨床觀察的報道。1993年，我國宋干、黃永成等研制出包括出血熱Ⅰ型和Ⅱ型的地鼠腎細胞雙價疫苗(宋干等，病毒學報，l993,9(2),144～l51),1997年浙江省防疫站和杭州天元生物藥業公司聯合研制出原代沙鼠腎細胞(Ⅰ型、Ⅱ型)雙價疫苗(董關木，中國公共衛生，1997,13(8),451)，這兩種疫苗均含較多的細胞雜蛋白。
本發明的主要目的是提供一種以金黃地鼠腎細胞作為感染病毒的細胞基質，以適應于GHKC的流行性出血熱病霉JR-C-1,PS6和L99為毒種，制備流行性出血熱雙價(或多價)滅活疫苗的方法。該方法包括地鼠腎單層細胞的制備，用已知病毒JR-C-1,PS6和L39感染地鼠腎細胞，收獲病毒液和疫苗配制等。
本發明另一個主要目的是提供一種對流行性出血熱雙價(或多價)滅活疫苗半成品進行純化的方法，該方法是將半成品疫苗液經高速離心，鹽析沉淀，超濾濃縮和柱層析等步驟進行純化。
本發明的最終目的是提供一種抗原性廣譜，抗原含量高，已去除大部分細胞雜蛋白，適合于全國各EHF疫區使用，并且十分安全有效的流行性出血熱多價純化疫苗。
一．流行性出血熱疫苗毒種的制備L99株，將分離自江西羅賽鼠的肺組織標本[L99毒株，引自《江西醫學院學報》l984,(3),1]，先于2～4日齡乳鼠腦腔接種傳代適應，當病毒感染乳鼠腦腔LD50達到8.0Log時，轉種于地鼠腎細胞，并以終末稀釋傳代方法連續傳10代以上，進行最后一次傳代時，待毒株感染地鼠腎細胞7-9天后，用免疫熒光法(IFA)檢查細胞內病霉抗原，當感染細胞IFA達到+++～++++時收獲病毒液，加10％～20％牛血清分裝后，置-60℃保存。毒種在地鼠腎細胞進行感染性消定，滴度≥8.5log TCID56/ml，支原體和無菌試驗均為陰性。同時應用單克隆抗體分型試劑確定毒種的抗原性和血清型的特異性，并且證明毒種內無外源因子。以此毒種作為生產流行性出血熱疫苗的毒種。
JR-C-1株，將分離自吉林省延邊地區的發病家兔的腎組織標本[即JR毒株，引自《中國公共衛生學報》1990,9(2),74]，如同L99株毒種制備方法一樣進行適應傳代后，再經空斑克隆法挑選出GHKC感染滴度≥8.5log TCID50/ml的克隆株JR-C-1，在GHKC上增殖和一系列檢定合格后作為生產用毒種。
PS6株，將分離自西安臨床急性期病人的血清標本，在乳鼠腦內連傳三代，得到特異性熒光陽性的毒株[即PS6株，引自姚樹元等，PS-6株漢坦病毒Ⅰ型的生物學性狀研究(碩士研究生畢業論文)，1996年]。將此毒株在GHKC上連續增殖傳7代，使其感染性滴度達8.5log TCID50時，將收獲的病毒液進行-系列檢定合格后，作為生產用毒種。
二．疫苗生產1、制備地鼠腎細胞選用10-14日齡健康的金黃地鼠，以無菌手續取出腎臟，剪碎后加入0.125％胰酶，置4-8℃18～20小時，棄去胰酶液，用含有0.2％乳白蛋白水解物Earle’s液并加有8％小牛血清的營養液分散細胞，制成細胞懸液，注人10立升培養瓶內，每瓶注入細胞懸液1000～1500ml。將細胞培養瓶置37℃恒溫室，旋轉培養2-3日，可形成均勻致密的細胞單層。
2、病毒接種與疫苗半成品收獲方法一，選擇細胞單層生長良好的培養瓶供感染病毒。如果生產Ⅰ型疫苗需感染JR-C-1或PS6毒種，如果生產Ⅱ型疫苗則需感染L99毒種。感染病毒量為3～4log TCID50/ml。感染用液為2％牛血清，0.2％乳白蛋白水解物Earle’s液。將已感染病毒的細胞培養瓶置干32～35℃恒溫室內旋轉培養1-3天，用Earle’s液沖洗細胞，然后再加入0.1％人白蛋白0.07‰半胱氨酸Earle’s液浸泡20小時左右后，再用同法沖洗一次，然后再換入0.2％人白蛋白199綜合培養液，置32～35℃恒溫室繼續培養，感染病毒后7-9天收獲，先收集培養液，再將細胞撞下，置-60℃凍融后再與培養液混合，通過絹布過濾，抽樣做無菌試驗和病毒滴定。將濾過后的培養液和細胞液混合液加入1/4000甲醛溶液(滅活劑)，先置33～37℃24小時后，轉置2-8℃滅活，此即為滅活疫苗的半成品。
方法二，按方法一將細胞感染病毒后，置于32～35℃培養1-3天，換人含2～4％小牛血清199綜合培養液，置32～35℃恒溫室繼續培養，感染病毒后7-9天收獲，再加入2～4％小牛血清199綜合培養液，置32～35℃繼續培養4～6天，第二次收獲病毒液。兩次收獲的病毒液均抽樣做無菌試驗和病毒滴定，并按方法一所述方法進行滅活。
3、疫苗配制按方法一制備的疫苗半成品，按新生物制品檢定規程要求進行原液病毒滴度測定、抗原量測定、殘余牛血清含量測定，滅活安全試驗等檢驗合格后，取Ⅰ型和Ⅱ型疫苗半成品等量混合可制成流行性出血熱雙價疫苗，效力試驗合格后，即可分裝進行成品檢定。包括，無菌試驗，PH值應為7.0-8.0，氫氧化鋁含量為＜0.7mg/ml，游離甲醛含量＜0.01％，硫柳汞含量＜0.01％，小鼠安全試驗4只鼠應健存。
按方法二制備的疫苗半成品，以兩個Ⅰ型毒種制備的半成品疫苗液占50％,L99毒種制備的半成品疫苗液占50％的比例配成多價疫苗半成品。
4、疫苗的純化此方法適合于流行性出血熱雙價疫苗和多價疫苗的純化。
選合格的半成品疫苗液，經高速離心(7000rpm40分鐘)去掉大部分細胞碎片，加1/50M醋酸鋅2～8℃鹽析30分鐘，2000～4000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用飽和EDTA溶解，用3MTris調PH至7.6～7.8,3000rpm離心30分鐘，上清液經超濾進行濃縮和透析(透析液為PH7.2 0.2MPB)，之后加到用PH7.2 0.2MPB平衡的Sepharose gel柱中進行層析，用A280nm監測，PH7.2 0.2MPB洗柱，收集第一峰部分、留樣后加防腐劑(1,20000硫柳汞)放4℃保存，純化樣品檢測包括，殘存牛血清蛋白含量測定(＜50ng/ml)、抗原量測定(ELISA≥1.128)，總蛋白測定(Lowry’s法)，效力檢定(PRXT≥1.20)，上述檢測合格后，純化疫苗進行除菌過濾，加Al(OH)3到0.5mg/ml。然后做無菌試驗，熱原試驗，合格后進行分裝，即為成品。成品檢定包括無菌試驗、毒性試驗、甲醛測定、硫柳汞測定，Al(OH)3測定，PH測定等。質量指標以滅活疫苗指標為準，純化疫苗的雜蛋白去除率達95％以上。
本發明制備的出血熱純化疫苗可以解決現有出血熱疫苗型別單一、抗原量較低、雜蛋白多、接種后易產生副反應和免疫效果不十分滿意的問題，該疫苗適用于我國各EHF疫區使用。
實施例一時間，1998年6月8日～9月19日取12-14日齡的金黃地鼠，處死后用0.3％新潔爾滅消毒，無菌取腎，剪碎，洗凈血球，加入PH8.0的0.125％的胰酶液，置8℃進行冷消化，18-20小時后取出。棄去胰酶液，用Earle’s液洗滌，加少量玻璃珠輕搖5-6次，收集各次懸液，經2層紗布過濾，使細胞懸于生長液中(生長液為8％牛血清乳白蛋白液)，搖勻后分裝到10立升瓶中，每瓶1000～1500ml，置37℃旋轉培養，三日后，細胞長成致密單層。
選取已長成致密單層的細胞培養瓶，棄去原瓶內的生長液，將毒種稀釋于2％牛血清的乳白蛋白液中，振搖均勻后分裝于培養瓶中，每瓶1000ml。置33℃～35℃旋轉培養2天，棄去病毒液，用Earle’s液噴洗，然后加入浸泡液，每瓶1000ml。浸泡液為0.07‰半胱氨酸Earle’s液，含0.1％人白蛋白，浸泡20小時后，棄去浸泡液，用同上方法再噴洗一次，然后換人細胞維持液1000ml/瓶。維持液為199綜合培養基含0.2％人白蛋白。將細胞瓶置33～35℃旋轉培養，8天后進行收獲，先收各瓶培養液800毫升，留存200ml，將細胞瓶置-60℃凍5～6小時后取出，振搖細胞使其破碎，然后將培養液與細胞液混合過濾。按液量加入福爾馬林至1,4000，硫柳汞1,20000，充分振搖后置37℃24小時，再轉置4℃14天，每天振搖2次。安全試驗合格后將Ⅰ型疫苗液和Ⅱ型疫苗液配制成雙價疫苗(1∶1比例)，加氫氧化鋁佐劑至0.5mg/ml。上述疫苗為半成品，經無菌試驗、病毒滴定、抗原量測定、殘余牛血清蛋白含量測定，病毒滅活安全試驗，效力試驗等檢定合格后，進行分裝，每支1.2毫升，分裝后進行成品檢定，成品檢定包括無菌試驗，外觀檢查，PH值，氫氧化鋁含量、游離甲醛含量、硫柳汞含量、毒性試驗等，成品檢定合格后即為流行性出血熱雙價疫苗。
實施例二時間1998年6月29日-10月30日制備地鼠腎細胞和感染病毒同實施例一．感染病毒的細胞置33～35℃旋轉培養2天，棄去感染液，換入維持液1000ml，維持液為199綜合培養液含2～4％小牛血清，將細胞瓶置33～35℃旋轉培養，8天后收獲培養液，再加入相同的維持液，33～35℃繼續培養4天，第二次收獲，兩次收獲的疫苗原液抽樣后，按液量加入福爾馬林至1,4000，如實施例一方法進行滅活后，按JR-C-1疫苗原液和PS6疫苗原液占50％，L99疫苗原液占50％的比例合并配成多價疫苗原液。之后，經7000rpm40分鐘離心去掉細胞碎片，按1/5M濃度加入醋酸鋅，2-8℃鹽析30分鐘后，3000rpm離心30分鐘，將沉淀用飽和EDTA溶解，再用3MTris液調PH7.6-7.8,3000rpm離心30分鐘，上清液經超濾濃縮透析后(透析液PH7.2 0.2MPB)上Sepharose gel柱進行層析純化，以A280nm監測，PH7.2 0.2MPB為洗脫液，收集第一峰。經0.2μm孔徑濾器除菌過濾后，留樣，加硫柳汞防腐(1,20000)放4℃保存，純化的樣品進行無菌試驗，抗原量測定，殘存牛血清蛋白含量測定，總蛋白量測定，熱原質試驗等檢定合格后，將純化的疫苗進行適當稀釋，加入AL(OH)3至0.5mg/ml，進行效力檢定，合格后，分裝，進行成品檢定，經過無菌試驗，外觀檢查，PH值，氫氧化鋁含量、游離甲醛含量，硫柳汞含量，動物安全試驗等檢定合格后，即為流行性出血熱多價純化疫苗，
權利要求
1．一種安全有效的適合各EHF疫區使用的流行性出血熱原代地鼠腎細胞多價純化疫苗，該疫苗制備方法包括應用對EHF病毒敏感的金黃地鼠腎細胞(GHKC)作為感染病毒的細胞基質，分別感染JR-C-1、PS6和L99毒株，制備疫苗半成品，之后，按一定比例配制成多價疫苗，并對疫苗進行純化，其特征在于該疫苗用上述的三個病毒株制備。
2．根據權利要求1的方法，其中所說的GHKC是指取10-14日齡金黃地鼠腎臟，用胰酶消化后，制成細胞懸液，在細胞培養瓶內旋轉培養，制備的單層細胞。
3．根據權利要求1的方法，其中所說的制備疫苗半成品，是指在一次制備的細胞培養瓶中，用一定配方的維持液達到兩次收獲病毒原液的方法。
4．根據權利要求1的方法，其中所說的對疫苗進行純化，是指將疫苗半成品經高速離心后，用鹽析方法沉淀病毒抗原，經超濾濃縮透析后，再經Sepharose gel柱層析純化。
全文摘要
本發明流行性出血熱原代地鼠腎細胞多價純化疫苗屬于生物制藥領域。該疫苗以三個適應于GHKC的EHF病毒株L99、PS
文檔編號A61K39/12GK1236646SQ9910798
公開日1999年12月1日 申請日期1999年6月9日 優先權日1999年6月9日
發明者韓亮, 王琪, 惠連, 趙麗紅, 王曉宏, 冉姝, 郝富勇, 王偉, 回良杰, 趙健, 姜惠賢, 馬軍 申請人:衛生部長春生物制品研究所