人血管緊張素Ⅱ/血管升壓素受體樣基因的制作方法

專利名稱：人血管緊張素Ⅱ/血管升壓素受體樣基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸、由其編碼的多肽和這些多核苷酸和多肽的用途及其生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明的多核苷酸和多肽與血管緊張素和/血管升壓素受體家族(以下稱為CBDAKD01)有關(guān)。本發(fā)明還涉及抑制或激活這些多核苷酸和多肽的作用。
“CBDAKD01”一般是指具有序列2所示氨基酸序列的多肽或其等位變體。
“CBDAKD01活性或CBDAKD多肽活性”或“CBDAKD01或CBDAKD01多肽生物活性”是指CBDAKD01的代謝或生理功能，包括類似活性或提高的活性或具有較低不希望有的副作用的活性。所述活性還包括CBDAKD01的抗原和免疫原活性。
“CBDAKD01基因”是指具有序列1所示核苷酸序列的多核苷酸或其等位變體和/或其互補物。
“抗體”在本文中包括單克隆和多克隆抗體、嵌合、單鏈和人源化抗體以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物。
“分離的”表示“通過人工”改變其天然狀態(tài)。如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語時，在活動物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。
“多核苷酸”一般指聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈和雙鏈RNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA，含有DNA和RNA的雜合分子，可以是單鏈或更常見為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。此外，“多核苷酸”還指含有RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語“多核苷酸”也包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA，以及為穩(wěn)定性或其他原因已對骨架進(jìn)行修飾的DNA或RNA?！靶揎棥眽A基包括例如三苯甲基化堿基和肌苷等稀有堿基?？梢詫NA和RNA進(jìn)行多種修飾，因此，“多核苷酸”包括自然界中常見的多核苷酸的化學(xué)、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA化學(xué)形式?！岸嗪塑账帷币舶ㄏ鄬Χ痰?、通常被稱為寡核苷酸的多核苷酸。
“多肽”指含有通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排物(peptideisosteres)互相連接的兩個或多個氨基酸的任何肽或蛋白?！岸嚯摹奔劝ǘ替?通常稱為肽)的寡肽或寡聚體，也包括長鏈(通常稱為蛋白)。多肽可能含有20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^翻譯后加工等天然方法或本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這些修飾在基本教科書和專論以及大量研究論文中敘述詳盡。修飾可以發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。在給定多肽的不同位點同類修飾可以以相同或不同的程度存在。并且給定多肽可以含有多種類型的修飾。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，也可以為分支或不分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可能由于翻譯后的天然加工或合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價輟合、血紅素的共價輟合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價輟合、脂或脂衍生物的共價輟合、磷脂酰肌醇的共價輟合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI錨定物形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；⒀趸?、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二?；?、外消旋化、硒?；?selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的氨基酸加入蛋白質(zhì)，如精氨?；捅樵诘鞍谆?可以參見例如《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性》第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993 and Wold，F(xiàn).，“翻譯后蛋白修飾前景與展望”，1-12頁，《蛋白的翻譯后共價修飾》B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，1983；Seifter et al.，“蛋白修飾和非蛋白輔因子的分析”，MethEnzymol (1990)82626-646和Rattan et al.，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化”，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62)。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個或多個置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過誘變技術(shù)或直接合成制備。
“同一性”在本領(lǐng)域中已知是通過比較序列確定的兩個或多個多肽序列或多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示通過這些序列鏈之間的匹配確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度。“同一性”和“相似性”可以通過已知方法方便地計算，包括但不限于以下文獻(xiàn)中所述方法《計算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.，ed.OxfordUniversity Press，New York，1988；《計算生物學(xué)簡介和基因組工程》，Smith D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計算機分析》第1部分，Griffin A.M.，and Griffin H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》，von Heiinje，G.，Academic Press，1987；《序列分析引物》，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，NeW York，1991；Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。優(yōu)選確定同一性的方法被設(shè)計成使測試的序列之間匹配最大。而且，確定同一性和相似性的方法已被編成可公開獲得的計算機程序。確定兩個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)387)，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul，S.F.et al.，J Molec Biol(1990)215403)。BLAST X程序可從NCBI或其他來源獲得(BLAST手冊，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，etal.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一性。
多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)∶BLOSSUM62，來自Hentikoff andHentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89∶10915-10919(1992)缺口補償12缺口長度補償4可以應(yīng)用這些參數(shù)的一個程序是Genetics Computers Group，Madison WI提供的gap程序。上述參數(shù)是肽比較的缺省參數(shù)(末端缺口不補償)。
多核苷酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)匹配=+10，錯配=0缺口補償50缺口長度補償3可以使用這些參數(shù)的一個程序是Genetics Computers Group，Madison WI提供的gap程序。上述參數(shù)是核酸比較的缺省參數(shù)。
優(yōu)選多核苷酸實施方案還包括含有與序列1的多核苷酸參照序列的同一性至少為50、60、70、80、85、90、95、97或100％的分離多核苷酸，其中所述序列可以與序列1的參照序列相同，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的核苷酸改變，其中所述改變選自至少一個核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個或多個毗連群散在分布在參照序列中。核苷酸改變的數(shù)量如下確定序列1中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤Xn-(Xn·y)其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為序列1的總核苷酸數(shù)，y值在50％時為0.50，在60％時為0.60，在70％時為0.70，在80％時為0.80，在85％時為0.85，在90％時為0.90，在95％時為0.95，在97％時為0.97，在100％時為1.00，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。編碼序列2多肽的多核苷酸序列的改變會在其編碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或移碼突變，因而改變后的多核苷酸編碼的多肽發(fā)生變化。
優(yōu)選多肽實施方案還包括含有與序列2的多肽參照序列的同一性至少為50、60、70、80、85、90、95、97或100％的分離多肽，其中所述序列可以與序列2的參照序列相同，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，其中所述改變可以選自至少一個氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個或多個毗連群散在分布在參照序列中。氨基酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在50％時為0.50，在60％時為0.60，在70％時為0.70，在80％時為0.80，在85％時為0.85，在90％時為0.90，在95％時為0.95，在97％時為0.97，在100％時為1.00，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。本發(fā)明的多肽一方面，本發(fā)明涉及CBDAKD01多肽(或CBDAKD01蛋白)。CBDAKD01多肽包括序列2的多肽，以及含有序列2的氨基酸序列的多肽，和含有與序列2全長的同一性至少為80％的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選與序列2的同一性至少為90％，更優(yōu)選同一性至少為95％。同一性至少為97-99％的序列是高度優(yōu)選的。CBDAKD01多肽還包括其氨基酸序列與具有序列2氨基酸序列的多肽全長的同一性至少為80％的多肽，優(yōu)選與序列2的同一性至少為90％，更優(yōu)選同一性至少為95％。同一性至少為97-99％的序列是高度優(yōu)選的。優(yōu)選的CBDAKD01多肽具有至少一種CBDAKD01生物活性。
CBDAKD01多肽可以是“成熟”蛋白的形式，也可以是較大蛋白如融合蛋白的一部分。通常包括附加氨基酸序列較為有利，附加氨基酸序列包括分泌或前導(dǎo)序列，原序列，幫助純化的序列如聚組氨酸殘基，或重組生產(chǎn)過程中有助于穩(wěn)定的附加序列。
本發(fā)明也包括CBDAKD01多肽片段。片段是其氨基酸序列與CBDAKD01多肽的氨基酸序列的一部分完全相同，而不具有CBDAKD01的全部氨基酸序列。同CBDAKD01多肽一樣，片段可以是獨立的，或作為一部分或一個區(qū)域包括在較大的多肽中，優(yōu)選作為一個單獨的連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明的多肽片段的代表性實例包括例如大約自氨基酸1-20、21-40、41-60、61-80、81-100和101到CBDAKD01多肽末端的片段?！按蠹s”包括在任一端或兩端較具體所述的范圍大或小幾個、5個、4個、3個、2個或1個氨基酸。
優(yōu)選的片段包括例如具有CBDAKD01多肽的氨基酸序列的截短的多肽，但缺失了包括氨基末端的一段連續(xù)殘基或包括羧基末端的一段連續(xù)殘基，或缺失了兩段連續(xù)殘基，一段包括氨基末端，一段包括羧基末端。還優(yōu)選其特征在于結(jié)構(gòu)或功能特性的片段，例如包括如下結(jié)構(gòu)的片段α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、β-片層和β-片層形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)、卷曲和卷曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩親區(qū)、β兩親區(qū)、柔性區(qū)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)和高抗原指數(shù)區(qū)。其他優(yōu)選的片段是生物活性片段。生物活性片段是介導(dǎo)CBDAKD01活性的片段，包括具有類似活性或較高活性的片段，或具有較低不希望的活性的片段。還包括在動物尤其是人中具有抗原性或免疫原性的片段。
優(yōu)選所有這些多肽片段保持了CBDAKD01的生物活性，包括抗原活性。給定序列和片段的變體也是本發(fā)明的一部分。優(yōu)選的變體是參照物中保守氨基酸發(fā)生置換的變體，即參照物中的殘基被具有類似特性的其他氨基酸置換。典型的這種置換包括Ala，Val，Leu和Ile之間的置換；Ser和Thr之間的置換；酸性殘基Asp和Glu之間的置換；Ash和Gln之間的置換；堿性殘基Lys和Arg之間的置換；或芳香族殘基Phe和Tyr之間的置換。特別優(yōu)選的是其中置換、缺失或增加幾個、5-10個、1-5個或1-2個氨基酸或這些方式的組合的變體。
本發(fā)明的CBDAKD01多肽可以通過任何合適的方式制備。這些多肽包括分離的天然存在的多肽，重組生產(chǎn)的多肽，合成生產(chǎn)的多肽，或這些方法組合生產(chǎn)的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域廣為人知。本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明另一方面涉及CBDAKD01多核苷酸。CBDAKD01多核苷酸包括編碼CBDAKD01多肽和片段的分離的多核苷酸以及與其密切相關(guān)的多核苷酸。更具體而言，本發(fā)明CBDAKD01多核苷酸包括含有序列1的核苷酸序列、編碼序列2的CBDAKD01多肽的多核苷酸，和具有序列1的特定序列的多核苷酸。CBDAKD01多核苷酸還包括含有與編碼序列2的CBDAKD01多肽的核苷酸序列全長的同一性至少為82％的核苷酸序列的多核苷酸，和含有與序列1全長的同一性至少為82％的核苷酸序列的多核苷酸。優(yōu)選同一性至少為90％的多核苷酸，尤其優(yōu)選同一性至少為95％的多核苷酸。同一性至少為97％的多核苷酸是高度優(yōu)選的，更優(yōu)選同一性至少為98-99％的多核苷酸，最優(yōu)選同一性至少為99％的多核苷酸。CBDAKD01多核苷酸還包括其同一性足夠使其在用于擴增或用作探針或標(biāo)記的條件下可以與序列1中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了與CBDAKD01多核苷酸互補的多核苷酸。
本發(fā)明的CBDAKD01結(jié)構(gòu)上與血管緊張素和/或血管升壓素受體家族的其他蛋白相關(guān)，表1中編碼人CBDAKD01的cDNA測序的結(jié)果(序列1)證實了這一點。序列1的cDNA序列含有編碼序列2的514氨基酸的多肽的一個開放讀框(核苷酸47-1588)。表2的氨基酸序列(序列2)485氨基酸殘基與大鼠血管緊張素/血管升壓素受體(AII/AVP)(N.Ruiz-Opazo，et al.，Nature，Med.1074-1081，1995)的同一性大約為30％(FASTA)。表1的核苷酸序列(序列1)489核苷酸殘基與大鼠血管緊張素/血管升壓素受體(AII/AVP)(N.Ruiz-Opazo，et al.，Nature，Med.1074-1081，1995)的同一性大約為57.9％(FASTA)。因此，預(yù)期本發(fā)明的CBDAKD01多肽和多核苷酸具有與其同源多肽和多核苷酸類似的生物功能/特性，其用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
表1a a人CBDAKD01核苷酸序列(序列1)。
表2b b人CBDAKD01氨基酸序列(序列2)。
本發(fā)明編碼CBDAKD01的多核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選從cDNA文庫中獲得，該文庫使用表達(dá)序列標(biāo)記(EST)分析由來自人臍血細(xì)胞的mRNA衍生(Adams，M.K.，et al.，Science(1991)2521651-1656；Adams，M.D.，et al.，Nature，(1992)355632-634；Adams，M.D.，et al.，Nature(1995)377 Supp3-174)。本發(fā)明的多核苷酸也可以來自天然來源如基因組DNA文庫，或可以使用眾所周知的市售技術(shù)合成。
編碼序列2的CBDAKD01多肽的核苷酸序列可以等同于表1的多肽編碼序列(序列1的核苷酸47-1588)，或者可以是由于遺傳密碼豐余(簡并)形成但仍編碼序列2的多肽的序列。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組生產(chǎn)CBDAKD01多肽時，該多核苷酸可以包括成熟多肽或其片段的編碼序列本身；成熟多肽或片段編碼序列與其他編碼序列框內(nèi)融合的序列，其他編碼序列例如前導(dǎo)或分泌序列、前或原或前原蛋白序列或其他融合多肽部分的編碼序列。例如可以編碼幫助融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明這一方面的一些優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記序列是6-組氨酸肽或HA標(biāo)記，前者以pQE載體提供(Qiagen，Inc.)，有關(guān)論述參見Gentz et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821-824。多核苷酸也可以含有非編碼的5′或3′序列，如轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列，剪切和聚腺苷酸化信號，核糖體結(jié)合位點和穩(wěn)定mRNA的序列。
進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案是編碼CBDAKD01變體的多核苷酸，所述變體包括表2的CBDAKD01多肽氨基酸序列(序列2)，其中置換、缺失或增加幾個、5-10、1-5、1-3、1-2或1個氨基酸殘基或是這些方式的組合。
本發(fā)明還涉及與上述序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明尤其涉及在嚴(yán)緊條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。在本文中，“嚴(yán)緊條件”表示只有序列之間的同一性至少為80％、優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選97-99％時才能發(fā)生雜交。
本發(fā)明的多核苷酸與序列1或其片段的核苷酸序列相同或足夠相同，因此可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼CBDAKD01的全長cDNA和基因組克隆，也可以分離與CBDAKD01基因具有高序列相似性的其他基因(包括編碼除人以外的物種的同源物和直向同源物的基因)的cDNA和基因組克隆。這些雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一般這些核苷酸序列與參照物序列的同一性為80％，優(yōu)選同一性為90％，更優(yōu)選同一性為95％。探針一般包括至少15個核苷酸。優(yōu)選這些探針包括至少30個核苷酸或至少50個核苷酸。特別優(yōu)選的探針為30到50個核苷酸。
在一個實施方案中，獲得編碼CBDAKD01多肽的多核苷酸包括除人以外的物種的同源物或直向同源物的方法包括以下步驟用具有序列1或其片段的標(biāo)記探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選合適的文庫；分離含有所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。因此，另一方面，本發(fā)明的CBDAKD01多核苷酸還包括以下核苷酸序列，其核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下與序列1的核苷酸序列或其片段雜交。CBDAKD01多肽還包括以下多肽，其氨基酸序列由上述雜交條件下獲得的核苷酸序列編碼。這些雜交技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。嚴(yán)緊雜交條件如上所述，或者換而言之為以下條件在如下溶液中42C溫育過夜，然后在約65℃用0.1×SSC洗滌濾膜，所述溶液包括50％甲酰胺，5×SSC(150 mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切的鮭精DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以作為研究試劑和材料，用來尋找動物和人類疾病的治療和診斷方法。載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的一個或多個多核苷酸的載體，經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。利用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可用來生產(chǎn)這些蛋白。
為進(jìn)行重組生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過多種標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊中所述的方法實現(xiàn)，所述實驗手冊如Davis et al.，《分子生物學(xué)基本方法》(1986)和Sambrook et al.，《分子克隆實驗室手冊》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，所述方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、微注射、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、摩擦轉(zhuǎn)化、粒子轟擊或感染。
合適宿主的代表性實例包括細(xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草桿菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞和曲霉細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和草地夜蛾Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和Bowes melanoma細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。
可使用多種表達(dá)系統(tǒng)。這些表達(dá)系統(tǒng)包括染色體、附加體和病毒衍生的系統(tǒng)等，例如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒的載體，和衍生自上述元件組合的載體，所述病毒包括桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，組合載體如衍生自質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒的載體。表達(dá)系統(tǒng)可以含有調(diào)節(jié)和啟動表達(dá)的控制區(qū)。一般來說，任何適于在宿主中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸的系統(tǒng)或載體均可使用。合適的核苷酸序列可以通過多種已知的常規(guī)技術(shù)插入到表達(dá)系統(tǒng)中，所述技術(shù)可參見例如Sambtook et al.，《分子克隆實驗室手冊》第2版(同上)。
為了翻譯的蛋白可以分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)、周質(zhì)空間或胞外環(huán)境，可以向所需的多肽上加入合適的分泌信號。這些信號可以是多肽內(nèi)源的，也可以是外源分泌信號。
如果CBDAKD01多肽要表達(dá)用于篩選試驗，一般優(yōu)選多肽在細(xì)胞表面生成。在這種情況下，細(xì)胞可以在用于篩選試驗之前收獲。如果CBDAKD01多肽分泌到培養(yǎng)基中，可以回收培養(yǎng)基以回收和純化多肽；如果在細(xì)胞內(nèi)生成，細(xì)胞首先要裂解，然后回收多肽。CBDAKD01多肽可以通過已知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水相互作用色譜，親和色譜，羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選高效液相色譜用于純化。如果多肽在分離或純化過程中變性，已知的重折疊蛋白的方法可用于恢復(fù)活性構(gòu)象。診斷試驗本發(fā)明還涉及CBDAKD01多肽作為診斷試劑的應(yīng)用。檢測與功能障礙相關(guān)的CBDAKD01基因突變形式可以提供一種診斷工具，這可以增加或限定一種由于CBDAKD01的表達(dá)不足、表達(dá)過量或表達(dá)異常產(chǎn)生的疾病或疾病易感性的診斷。CBDAKD01基因中攜帶突變的個體可以通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測出來。
診斷核酸可以獲自受試者細(xì)胞，如血、尿、唾液、組織活檢樣品或尸檢材料?；蚪MDNA可以直接用來檢測，或在分析之前使用PCR或其他擴增技術(shù)酶促擴增。RNA或cDNA可以類似方式使用。缺失和插入可以通過與正?；蛐拖啾葦U增產(chǎn)物的大小變化檢測。點突變可以通過將擴增DNA與標(biāo)記的CBDAKD01核苷酸序列雜交來鑒別。完全匹配的序列可以通過RNA酶消化或融解溫度上的差異與錯配雙鏈區(qū)分。DNA序列差異也可以通過DNA片段在加入或不加變性劑的凝膠上的電泳遷移率或直接DNA測序來檢測?？蓞⒁娎鏜yers et al.，Science(1985)2301242。在特定位置的序列變化也可以通過核酸酶保護(hù)試驗如RNA酶和S1保護(hù)法或化學(xué)切割法來顯示?？蓞⒁奀otton et al.，PNAS USA(1985)854397-4401。在另一個實施方案中，可以構(gòu)建含有CBDAKD01核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列(array)，以便進(jìn)行例如基因突變的有效篩選。陣列技術(shù)方法廣為人知，適用性廣泛，可用來解決分子遺傳學(xué)中的多種問題，包括基因表達(dá)，遺傳連鎖和遺傳變異性。(參見例如M.Chee et al.，Science，Vol.274，pp610-613(1996)。
診斷試驗通過利用上述方法檢測CBDAKD01基因的突變，提供了診斷或確定對高血壓、心臟病、癌癥和腎病的易感性的方法。
此外，高血壓、心臟病、癌癥和腎病可以通過以下方法診斷確定來自受試者樣品中的CBDAKD01多肽或CBDAKD01 mRNA的水平異常降低或增加。表達(dá)降低或增加可以使用核苷酸定量領(lǐng)域已知的任何方法在RNA水平上確定，所述方法例如PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)、RNA印跡和其他雜交方法?？捎糜诖_定來自宿主的樣品中的蛋白水平如CBDAKD01多肽水平的試驗技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些試驗方法包括放射免疫試驗、競爭結(jié)合試驗、蛋白印跡分析和ELISA試驗。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及確定疾病或疾病易感性的診斷藥盒，所述疾病特別是高血壓、心臟病、癌癥和腎病，所述藥盒包括(a)CBDAKD01多核苷酸，優(yōu)選序列1的核苷酸序列，或其片段；(b)與(a)中核苷酸互補的核苷酸序列；(c)CBDAKD01多肽，優(yōu)選序列2的多肽，或其片段；(d)CBDAKD01多肽的抗體，優(yōu)選序列2的多肽的抗體。應(yīng)當(dāng)理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分(substantial component)。染色體試驗本發(fā)明的核苷酸序列對染色體鑒定也有價值。該序列可以特異靶向一個個體染色體上的特定位置并可與其雜交。根據(jù)本發(fā)明染色體相關(guān)序列的作圖是將這些序列與疾病相關(guān)的基因聯(lián)系起來的重要的第一步。一旦序列已經(jīng)被定位在具體的染色體位置，該序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這些數(shù)據(jù)可參見例如V.McKusick，《人類的孟德爾遺傳》(由Johns Hopkins University Welch Medical Library在線獲得)。定位在同一染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系可以通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)確定。
受影響和正常個體中cDNA或基因組序列的差異也可以確定。如果在某些或全部受影響個體中觀察到某一突變，而在正常個體中未觀察到該突變，則該突變可能是疾病的病因。CBDAKD01基因已經(jīng)被定位在X染色體上的q21.3?？贵w本發(fā)明的多肽或其片段或類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞也可用作免疫原，生成對CBDAKD01多肽免疫特異性的抗體?！懊庖咛禺愋缘摹痹诒绢I(lǐng)域中表示對本發(fā)明多肽的親和力明顯大于對本領(lǐng)域其他相關(guān)多肽的親和力。
針對CBDAKD01多肽的抗體可以通過常規(guī)方法向動物優(yōu)選非人類的動物給藥多肽或含表位片段、類似物或細(xì)胞獲得。為了制備單克隆抗體，可以使用提供連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生成的抗體的任何技術(shù)。實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)，三瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，Immunology Today(1983)472)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole etal.，《單克隆抗體和癌癥治療》，pp77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4，946，778)也可以改進(jìn)后用來生產(chǎn)本發(fā)明多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠或其他有機體包括其他哺乳動物也可以用來表達(dá)人源化抗體。
上述抗體也可以用來分離或鑒定表達(dá)所述多肽的克隆或純化親和色譜技術(shù)制備的多肽。
抗CBDAKD01多肽的抗體也可以用來治療高血壓、心臟病、癌癥和腎病等。疫苗本發(fā)明的其他方面涉及在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括用CBDAKD01多肽或其合適的片段免疫接種哺乳動物，產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞應(yīng)答，從而保護(hù)該動物免于高血壓、心臟病、癌癥和腎病等疾病。本發(fā)明的其他方面也涉及在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給藥指導(dǎo)CBDAKD01多肽體內(nèi)表達(dá)的載體來給藥CBDAKD01多肽，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，生成抗體保護(hù)動物免于疾病。
本發(fā)明的其他方面涉及免疫原/疫苗制劑(組合物)，將其引入哺乳動物宿主時，可誘導(dǎo)針對CBDAKD01多肽的免疫應(yīng)答，其中該組合物含有CBDAKD01多肽或CBDAKD01基因。該疫苗制劑還可以含有合適的載體。因為CBDAKD01多肽在胃中可以被降解，優(yōu)選通過腸胃外途徑給藥(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)等注射)。適合胃腸外給藥的制劑包括含水和不含水的無菌注射液，其中可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì)；含水和不含水的無菌懸浮液，其中可以含有懸浮劑或增稠劑。該制劑可以是單劑或多劑容器形式，例如密封安瓿和小瓶，也可以保存在凍干條件下，只需在使用前加入無菌液體載體即可。疫苗制劑也可以含有增強制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)，如水包油系統(tǒng)或本領(lǐng)域已知的其他系統(tǒng)。劑量取決于疫苗的比活性，可以通過常規(guī)試驗方便地確定。篩選試驗本發(fā)明的CBDAKD01多肽可以用于篩選激活(激動劑)或抑制(拮抗劑或稱為抑制劑)本發(fā)明的CBDAKD01多肽激活的化合物的方法中。因此本發(fā)明的多肽也可以用來從細(xì)胞、無細(xì)胞制備物、化學(xué)文庫和天然產(chǎn)品混合物中評價鑒定激動劑或拮抗劑。這些激動劑或拮抗劑可以是本發(fā)明多肽的天然或修飾的底物、配體、受體、酶等；或者是本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)或功能模擬物?？蓞⒁奀oligan et al.，Current Protocol inImmunology 1(2)Chapter 5(1991)。
CBDAKD01多肽具有多種生理功能，包括多種病理效應(yīng)。因此，有必要尋找刺激CBDAKD01多肽或抑制CBDAKD01多肽功能的化合物和藥物。一般，激動劑可以用于高血壓、心臟病、癌癥和腎病等疾病的治療和預(yù)防目的。拮抗劑可用于高血壓、心臟病、癌癥和腎病等疾病的多種治療和預(yù)防目的。
一般，這些篩選方法包括使用表達(dá)CBDAKD01多肽或?qū)Ρ景l(fā)明的CBDAKD01多肽有反應(yīng)的合適細(xì)胞。這些細(xì)胞包括來自哺乳動物、酵母、果蠅或大腸桿菌的細(xì)胞。將表達(dá)CBDAKD01多肽的細(xì)胞(或含有表達(dá)多肽的細(xì)胞膜)或?qū)BDAKD01多肽有反應(yīng)的細(xì)胞與待測化合物接觸，觀察結(jié)合或功能反應(yīng)的刺激或抑制。比較接觸過候選化合物的細(xì)胞與未接觸過候選化合物的相同細(xì)胞的CBDAKD01活性的能力。
該試驗可以簡單地測試候選化合物的結(jié)合，其中與具有CBDAKD01多肽的細(xì)胞的粘附通過直接或間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記檢測，或通過包括與標(biāo)記競爭物競爭的試驗檢測。并且，這些試驗可以測試候選化合物是否會產(chǎn)生CBDAKD01多肽激活產(chǎn)生的信號，使用適合于具有CBDAKD01多肽的細(xì)胞的檢測系統(tǒng)。激活抑制劑通常在已知激動劑存在時試驗，觀察候選化合物存在對激動劑激活的影向。
另外，該試驗可以簡單地包括以下步驟混合候選化合物與含有CBDAKD01多肽的溶液，形成混合物，測定混合物中CBDAKD01活性，比較混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的CBDAKD01活性。
CBDAKD01 cDNA，蛋白和蛋白的抗體也可以用來設(shè)計檢測加入的化合物對細(xì)胞中CBDAKD01 mRNA和蛋白生成的影響的試驗。例如，可以設(shè)計ELISA，通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法使用單克隆和多克隆抗體來測定分泌或細(xì)胞結(jié)合的CBDAKD01蛋白水平，這可以用來從合適的工程改造的細(xì)胞或組織中尋找可以抑制或增加CBDAKD01生成的物質(zhì)(也可以分別稱為拮抗劑或激動劑)。
CBDAKD01蛋白可以用來鑒定存在的膜結(jié)合或可溶受體，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)受體結(jié)合技術(shù)。這些包括但不限于配體結(jié)合和交聯(lián)試驗，其中CBDAKD01用放射性同位素(125I)標(biāo)記，化學(xué)修飾(如生物素化)，或與適合檢測或純化的肽序列融合，與推測的受體源(細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞上清、組織提取物、體液)溫育。其他方法包括生物物理技術(shù)，如表面胞質(zhì)共振和分光術(shù)。除了用來純化和克隆受體之外，這些結(jié)合試驗也可以用來鑒定CBDAKD01激動劑和拮抗劑，它們與CBDAKD01對存在的受體的結(jié)合競爭。進(jìn)行篩選試驗的標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
可能的CBDAKD01多肽拮抗劑的實例包括CBDAKD01多肽的抗體，或者在某些情況下為與CBDAKD01多肽的配體、底物、受體、酶等密切相關(guān)的寡核苷酸或蛋白，例如配體、底物、受體、酶等的片段；或者為與本發(fā)明的多肽結(jié)合但不引發(fā)應(yīng)答的小分子，從而抑制多肽的活性。
因此，本發(fā)明另一方面涉及一種篩選藥盒，用來鑒定CBDAKD01多肽的激動劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等；或者是降低或增加CBDAKD01多肽生成的化合物，該藥盒包括(a)CBDAKD01多肽，優(yōu)選序列2的多肽；(b)表達(dá)CBDAKD01多肽優(yōu)選序列2的多肽的重組細(xì)胞；(c)表達(dá)CBDAKD01多肽優(yōu)選序列2的多肽的細(xì)胞膜；(d)CBDAKD01多肽的抗體，優(yōu)選序列2的多肽的抗體。應(yīng)當(dāng)理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分。預(yù)防和治療方法本發(fā)明提供了與CBDAKD01多肽活性過高或過低有關(guān)的疾病的治療方法，所述疾病如高血壓、心臟病、癌癥和腎病等。
如果CBDAKD01多肽活性過高，可以有幾種方法。一種方法包括向受試者給藥上述抑制劑化合物(拮抗劑)和可藥用載體，其用量可以抑制CBDAKD01多肽的功能，例如通過阻斷配體、底物、受體、酶等的結(jié)合，或通過抑制第二信號，從而緩解異常癥狀。另一種方法中給藥能夠與內(nèi)源CBDAKD01多肽競爭結(jié)合配體、底物、酶、受體等的可溶形式的CBDAKD01多肽。這種競爭物的典型實例包括CBDAKD01多肽的片段。
在另一種方法中，可以使用表達(dá)阻斷技術(shù)抑制編碼內(nèi)源CBDAKD01多肽的基因的表達(dá)。已知的這種技術(shù)包括使用反義序列，可以是內(nèi)部產(chǎn)生的或單獨給藥。可以參見例如O′Connor，J Neurochem(1991)56560，《基因表達(dá)反義抑制劑的寡脫氧核苷酸》CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)。或者可以使用與基因形成三螺旋的寡核苷酸。參見例如Lee，et al.，Nucleic Acid Res(1979)63073；Cooney et al.，Science(1988)241456；Dervan et al.，Scicence(1991)2511360。可以給藥這些寡聚體或在體內(nèi)表達(dá)有關(guān)寡聚體。
為了治療CBDAKD01和其活性表達(dá)不足的異常癥狀，有幾種方法可以使用。一種方法包括向受試者給藥治療有效量的激活CBDAKD01多肽的化合物，即上述激動劑，結(jié)合給藥可藥用的載體，從而緩解異常癥狀?；蛘?，可以使用基因治療來實現(xiàn)受試者相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源生產(chǎn)CBDAKD01。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以如上述經(jīng)工程改造用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)。然后分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體并導(dǎo)入用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞中，載體中含有編碼本發(fā)明多肽的RNA，因而包裝細(xì)胞可以生產(chǎn)含有目的基因的感染性病毒粒子。可以向受試者給藥這些生產(chǎn)細(xì)胞，以便體內(nèi)改造細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)多肽?；蛑委煹挠嘘P(guān)論述可參見第20章，“基因治療和其他基于分子遺傳學(xué)的治療方法(及其中的參考文獻(xiàn))，《人類分子遺傳學(xué)》，T Strachan and A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)。另一種方法是給藥治療有效量的CBDAKD01多肽，結(jié)合給藥合適的藥用載體。制劑和給藥CBDAKD01多肽的可溶形式等肽和肽或小分子的激動劑和拮抗劑可以與合適的藥用載體組合配方。這些制劑包括治療有效量的多肽或化合物和可藥用載體或賦形劑。這些載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合。制劑應(yīng)當(dāng)適合給藥方式，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明還涉及藥包和藥盒，其中包括一個或多個容器，裝有一種或多種本發(fā)明的上述組合物成分。
本發(fā)明的多肽和其他化合物可以單獨使用，或與其他化合物如治療化合物聯(lián)合使用。
藥用組合物的優(yōu)選全身給藥方式包括注射，一般是靜脈內(nèi)注射。也可使用其他注射途徑如皮下、肌肉、或腹膜內(nèi)途徑。全身給藥的其他方法包括使用膽酸鹽或梭鏈孢酸或其他表面活性劑等滲透劑經(jīng)粘膜、經(jīng)皮給藥。此外，如果配制成腸道或膠囊劑，也可以口服給藥。這些化合物也可以以軟膏、糊劑、凝膠等形式表面和/或局部給藥。
所需劑量范圍取決于肽的選擇、給藥途徑、制劑性質(zhì)、受試者癥狀的性質(zhì)和主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量范圍為0.1到100μg/kg。鑒于可以獲得的化合物有多種，不同的給藥途徑有不同的效果，所需劑量的變化范圍很大是可以預(yù)見的。例如，預(yù)期口服給藥較靜脈注射所需劑量大。這些劑量水平的變化可以使用用來優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)實驗方法調(diào)整，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。
治療用多肽也可以在受試者體內(nèi)內(nèi)源產(chǎn)生，這種治療形式通常稱為“基因治療”。因此，例如來自受試者的細(xì)胞可以用多核苷酸如編碼來自體內(nèi)的多肽的DNA或RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體工程改造。然后將這些細(xì)胞引入受試者體內(nèi)。
本說明書中所引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，全部引作參考，如同每一出版物單獨和個別地指明引作參考一樣。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人張慶華、沈宇、茅矛、顧柏?zé)?ⅱ)發(fā)明名稱人血管緊張素Ⅱ/血管升壓素受體(AII/AVP)樣基因(CBDAKD01)(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)通訊地址(A)聯(lián)系人Ratner & Prestia(B)街道P.O.Box 980(C)城市Valley Forge(D)州PA(E)國家USA(F)郵政編碼19482(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Prestia，Paul F(B)登記號23，031
(C)參考/案卷號GP-70382(ⅸ)電訊信息(A)電話610/407-0700(B)傳真610/407-0701(C)電傳846169(2)序列1信息(ⅰ)序列特征(A)長度2218堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列表述序列1CAGGGCAGCC TTCAGTCTGA TTCAGGAGAA CGAGGTCCTC TTCACCATGT GCTTCATCCC 60CCTGGTCTGC TGGATCGTGT GCACTGGACT GAAACAGCAG ATGGAGAGTG GCAAGAGCCT 120TGCCCAGACA TCCAAGACCT CCACCGCGGT GTACGTCTTC TTCCTTTCCA GTTTGCTGCA 180GCCCCGGGGA GGGAGCCAGG AGCACGGCCT CTGCGCCCAC CTCTGGGGGC TCTGCTCTTT 240GGCTGCAGAT GGAATCTGGA ACCAGAAAAT CCTGTTTGAA GAGTCCGACC TCAGGAATCA 300TGGACTGCAG AAGGCGGATG TGTCTGCTTT CCTGAGGATG AACCTGTTCC AAAAGGAAGT 360GGACTGCGAG AAGTTCTACA GCTTCATCCA CATGACTTTC CAGGAGTTCT TTGCCGCCAT 420GTACTACCTG CTGGAAGAGG AAAAGGAAGG AAGGACGAAC GTTCCAGGGA GTCGTTTGAA 480GCTTCCCAGC CGAGACGTGA CAGTCCTTCT GGAAAACTAT GGCAAATTCG AAAAGGGGTA 540TTTGATTTTT GTTGTACGTT TCCTCTTTGG CCTGGTAAAC CAGGAGAGGA CCTCCTACTT 600GGAGAAGAAA TTAAGTTGCA TGATCTCTCA GCAAATCAGG CTGGAGCTGC TGAAATGGAT 660TGAAGTGAAA GCCAA GCTA AAAAGCTGCA TGATCAGCCC AGCCAGCTGG AATTGTTCTA 720CTGTTTGTAC GAGATGCAGG AGGAGGACTT CGTGCAAAGG GCCATGGACT ATTTCCCCAA 780GATTGAGATC AATCTCTCCA CCAGAATGGA CCACATGGTT TCCTCCTTTT GCATTGAGAA 840CTGTCATCGG GTGGAGTCAC TGTCCCTGGG GTTTCTCCAT AACATGCCCA AGGAGGAAGA 900GGAGGAGGAA AAGGAAGGCC GACACCTTGA TATGGTGCAG TGTGTCCTCC CAAGCTCCTC 960TCATGCTGCC TGTTCTCATG GGTTGGGGCG CTGTGGCCTC TCCCATGAGT GCTGCTTCGA 1020CATCTCCTTG GTCCTCAGCA GCAACCAGAA GCTGGTGGAG CTGGACCTGA GTGACAACGC 1080CCTCGGTGAC TTCGGAATCA GACTTCTGTG TGTGGGACTG AAGCACCTGT TGTGCAATCT 1140GAAGAAGCTC TGGTTGGTGA ATTCTGCCTT ACGTCAGTCT GTTGTTCAGC TTTGTCCTCG 1200GTACTCAGCA CTAATCAGAA TCTCACGCAC CTTTACTGCG AGGCAACACT CTCGGAGACA 1260AGGGATCAAA CTACTCTGTG AGGGACTCTT GCACCCCGAC TGcAAGCTTC AGGTGTTGGA 1320ATTAGACAAC TGCAACCTCA CGTCACACTG CTGCTGGGAT CTTTCCACAC TTCTGACCTC 1380CAGCCAGAGC CTGCGAAAGC TGAGCCTGGG CAACAATGAC CTGGGCGACC TGGGGGTCAT 1440GATGTTCTGT GAAGTGCTGA AACAGCAGAG CTGCCTCCTG CAGAACCTGG GGTTGTCTGA 1500AATGTATTTC AATTATGAGA CAAAAAGTGC GTTAGAAACA CTTCAAGAAG AAAAGCCTGA 1560GCTGACCGTC GTCTTTGAGC CTTCTTGGTA GGAGTGGAAA CGGGGCTGCC AGACGCCAGT 1620GTTCTCCGGT CCCTCCAGCT GGGGGCCCTC AGGTGGAGAG AGCTGCGATC CATCCAGGCC 1680AAGACCACAG CTCTGTGATC CTTCCGGTGG AGTGTCGGAG AAGAGAGCTT GCCGACGATG 1740CCTTCCTGTG CAGAGCTTGG GCATCTCCTT TACGCCAGGG TGAGGAAGAC ACCAGGACAA 1800TGACAGCATC GGGTGTTGTT GTCATCACAG CGCCTCAGTT AGAGGATGTT CCTCTGGTGA 1860CCTCATGTAA TTAGCTCATT CAATAAAGCA CTTTCTTTAT TTTTCTCTTC TCTGTCTAAC 1920CTTCTTTTTC CTATCTTTTT TTCTTCTTTG TTCTGTTTAC TTTTGCTCAT ATCATCATTC 1980CCGCTATCTT TCTATTAACT GACCATAACA CAGAACTAGT TGACTATATA TTATGTTGAA 2040ATTTTATGGC AGCTATTTAT TTATTTAAAT TTTTTGTAAT AGTTTTGTTT TCTAATAAGA 2100AAAATCCATG CTTTTTGTAG CTGGTTGAAA ATTCAGGAAT ATGTAAAACT TTTTGGTATT 2160TAATTAAATT GATTCCTTTT CTTAATTTTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA2218(2)序列2信息(ⅰ)序列特征(A)長度514氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列表述序列2Met Cys Phe Ile Pro Leu Val Cys Trp Ile Val Cys Thr Gly Leu Lys1 5 10 15Gln Gln Met Glu Ser Gly Lys Ser Leu Ala Gln Thr Ser Lys Thr Ser20 25 30Thr Ala Val Tyr Val Phe Phe Leu Ser Ser Leu Leu Gln Pro Arg Gly35 40 45Gly Ser Gln Glu His Gly Leu Cys Ala His Leu Trp Gly Leu Cys Ser50 55 60Leu Ala Ala Asp Gly Ile Trp Asn Gln Lys Ile Leu Phe Glu Glu Ser65 70 75 80Asp Leu Arg Asn His Gly Leu Gln Lys Ala Asp Val Ser Ala Phe Leu85 90 95Arg Met Asn Leu Phe Gln Lys Glu Val Asp Cys Glu Lys Phe Tyr Ser100 105 110Phe Ile His Met Thr Phe Gln Glu Phe Phe Ala Ala Met Tyr Tyr Leu115 120 125Leu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg Thr Asn Val Pro Gly Ser Arg Leu130 135 140Lys Leu Pro Ser Arg Asp Val Thr Val Leu Leu Glu Asn Tyr Gly Lys145 150 155 160Phe Glu Lys Gly Tyr Leu Ile Phe Val Val Arg Phe Leu Phe Gly Leu165 170 175 Val Asn Gln Glu Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Lys Lys Leu Ser Cys Met180 185 190Ile Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Leu Leu Lys Trp Ile Glu Val Lys195 200 205Ala Lys Ala Lys Lys Leu His Asp Gln Pro Ser Gln Leu Glu Leu Phe210 215 220Tyr Cys Leu Tyr Glu Met Gln Glu Glu Asp Phe Val Gln Arg Ala Met225 230 235 240Asp Tyr Phe Pro Lys Ile Glu Ile Asn Leu Ser Thr Arg Met Asp His245 250 255Met Val Ser Ser Phe Cys Ile Glu Asn Cys His Arg Val Glu Ser Leu260 265 270Ser Leu Gly Phe Leu His Asn Met Pro Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu275 280 285Lys Glu Gly Arg His Leu Asp Met Val Gln Cys Val Leu Pro Ser Ser290 295 300Ser His Ala Ala Cys Ser His Gly Leu Gly Arg Cys Gly Leu Ser His305 310 315 320Glu Cys Cys Phe Asp Ile Ser Leu Val Leu Ser Ser Asn Gln Lys Leu325 330 335Val Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Leu Gly Asp Phe Gly Ile Arg340 345 350Leu Leu Cys Val Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Lys Leu355 360 365Trp Leu Val Asn Ser Ala Leu Arg Gln Ser Val Val Gln Leu Cys Pro370 375 380Arg Tyr Ser Ala Leu Ile Arg Ile Ser Arg Thr Phe Thr A la Arg Gln385 390 395 400His Ser Arg Arg Gln Gly Ile Lys Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu His405 410 415Pro Asp Cys Lys Leu Gln Val Leu Glu Leu Asp Asn Cys Asn Leu Thr420 425 430Ser His Cys Cys Trp Asp Leu Ser Thr Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser435 440 445Leu Arg Lys Leu Ser Leu Gly Asn Asn Asp Leu Gly Asp Leu Gly Val450 455 460Met Met Phe Cys Glu Val Leu Lys Gln Gln Ser Cys Leu Leu Gln Asn465 470 475 480Leu Gly Leu Ser Glu Met Tyr Phe Asn Tyr Glu Thr Lys Ser Ala Leu485 490 495Glu Thr Leu Gln Glu Glu Lys Pro Glu Leu Thr Val Val Phe Glu Pro500 505 510Ser Trp
權(quán)利要求
1．分離的多核苷酸，含有與編碼序列2的CBDAKD01多肽的核苷酸序列全長的同一性至少為80％的核苷酸序列；或者所述分離多核苷酸的互補核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括編碼序列2的CBDAKD01多肽的序列1的核苷酸序列。
3．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括與序列1的核苷酸序列全長的同一性至少為80％的核苷酸序列。
4．權(quán)利要求3的多核苷酸，其為序列1的多核苷酸。
5．權(quán)利要求1的多核苷酸，其為DNA或RNA。
6．含有一種表達(dá)系統(tǒng)的DNA或RNA分子，其中所述表達(dá)系統(tǒng)在相容宿主細(xì)胞中能夠生產(chǎn)CBDAKD01多肽，其氨基酸序列與序列2的多肽的同一性至少為80％。
7．含有權(quán)利要求6的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。
8．生產(chǎn)CBDAKD01多肽的方法，包括在可以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主，由培養(yǎng)物中回收多肽。
9．制備產(chǎn)生CBDAKD01多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求6的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生CBDAKD01多肽。
10．CBDAKD01多肽，含有與序列2的氨基酸序列全長的同一性至少為80％的氨基酸序列。
11．權(quán)利要求10的多肽，其包括序列2的氨基酸序列。
12．權(quán)利要求10的CBDAKD01多肽的免疫特異性抗體。
13．治療需要增加權(quán)利要求10的CBDAKD01多肽的活性或表達(dá)的受試者的方法，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的激動劑；和/或(b)向受試者提供分離的多核苷酸，其核苷酸序列與序列2的CBDAKD01多肽的編碼核苷酸序列全長的同一性至少為80％；或者其核苷酸序列與上述核苷酸序列互補，多核苷酸的形式可以實現(xiàn)所述多肽活性的體內(nèi)表達(dá)。
14．治療需要抑制權(quán)利要求10的CBDAKD01多肽的活性或表達(dá)的受試者的方法，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的拮抗劑；和/或(b)向受試者給藥抑制所述多肽的編碼核苷酸序列表達(dá)的核酸分子；和/或(c)向受試者給藥治療有效量的與所述多肽競爭其配體、底物或受體的多肽。
15．診斷受試者中與權(quán)利要求10的CBDAKD01多肽的表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，包括(a)確定所述受試者基因組中所述CBDAKD01多肽的編碼核苷酸序列中是否存在突變；和/或(b)分析來自受試者的樣品中是否存在CBDAKD01多肽的表達(dá)或其表達(dá)量。
16．鑒定抑制(拮抗)或激活權(quán)利要求10的CBDAKD01多肽的化合物的方法，包括(a)將候選化合物與表達(dá)CBDAKD01多肽的細(xì)胞(或表達(dá)CBDAKD01多肽的細(xì)胞膜)或?qū)BDAKD01多肽有反應(yīng)的細(xì)胞接觸；和(b)觀察結(jié)合或功能反應(yīng)的刺激或抑制；或比較接觸過候選化合物的細(xì)胞(或細(xì)胞膜)與未接觸過候選化合物的相同細(xì)胞的CBDAKD01多肽活性的能力。
17．權(quán)利要求16的方法鑒定的激動劑。
18．權(quán)利要求16的方法鑒定的拮抗劑。
19．權(quán)利要求9的方法制備的重組宿主細(xì)胞或表達(dá)CBDAKD01多肽的其細(xì)胞膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了CBDAKD01多肽和多核苷酸以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法。本發(fā)明還公開了在設(shè)計治療高血壓、心臟病、癌癥和腎病等疾病的方法和診斷試驗中利用CBDAKD01多肽和多核苷酸的方法。
文檔編號A61K39/00GK1286698SQ98813892
公開日2001年3月7日 申請日期1998年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月12日
發(fā)明者張慶華, 沈宇, 茅矛, 顧柏?zé)?申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)