專利名稱：：基于馬傳染性貧血病毒(eiav)的逆轉錄病毒載體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及逆轉錄病毒載體，尤其(但不僅僅)涉及衍生自非靈長類動物慢病毒，并能將遺傳物質轉移至非分裂或緩慢分裂細胞的逆轉錄病毒載體。有段時間，人們對研制基于慢病毒(逆轉錄病毒的小亞組)的逆轉錄病毒載體系統相當有興趣。這一興趣的誘因首先是使用基于HIV的載體將抗HIV治療劑靶向HIV易感細胞的想法，其次是下列推測，即由于慢病毒能感染非分裂細胞(Lewis&Emerman1993，病毒學雜志，68，510)，基于這些病毒的載體系統將能轉導非分裂細胞(如Vile&Russel1995Brit.Med.Bull，51，12)。基于HIV的載體系統已經產生(Buchschacher&Panganiban1992，病毒學雜志，66，2731)，使用該系統轉導了CD4+細胞，并按預期的那樣轉導了非分裂的細胞(Naldini等，1996科學272，263)。另外，慢病毒載體能很穩定地長期表達所需基因。對經轉導的大鼠神經元細胞而言至少為3個月。基于MLV的載體僅能在6周內穩定表達所需基因。迄今為止產生的基于HIV的載體在轉導細胞中導致整合的原病毒，其末端具有的HIVLTR限制了這些載體的使用，因為除非使用內部啟動子，否則LTR不得不用作任何插入基因的表達信號。內部啟動子的使用具有顯著的缺陷，將其它啟動子置于逆轉錄病毒LTR轉錄單位內會導致不可預測的后果，其詳細記載于Bowtell等，1988，病毒學雜志，62，2464；Correll等，1994，血液84，1812；Emerman和Temin1984細胞39，459；Ghattas等，1991，分子細胞生物學，11，5848；Hantzopoulos等，1989PNAS86，3519；Hatzoglou等，1991，生物化學雜志，266，8416；Hatzoglou等，1988，生物化學雜志，263，17798；Li等，1992，人類遺傳學理論，3，381；McLachlin等，1993，病毒學，195，1；Overell等，1988，分子細胞生物學，8，1803；Scharfman等，1991PNAS88，4626；Vile等，1994，基因理論，1，307；Xu等，1989，病毒學，171，331；Yee等，1987PNAS84，5197。涉及的因素包括兩個啟動子的相對位置和方向，啟動子的特性，表達的基因和所采用的任何選擇方法。內部啟動子的存在會影響包裝細胞系所能達到的轉導效價和整合載體的穩定性。HIV和其它慢病毒LTR對基因表達具有病毒特異性的需求。例如，HIVLTR在缺乏病毒Tat蛋白時不具活性(Cullen1995AIDS9，S19)。因此，需要以某種方式修飾LTR以改變基因表達的需求。一些基因治療應用特別地需要組織特異性的基因表達。HIV載體有很多顯著的缺陷，限制了它們對某些疾病的治療應用。HIV-1的缺陷在于它是攜有潛在的致癌蛋白質和序列的人類病原體。導入在包裝細胞中產生的能表達HIVgag-pol的載體顆粒會將這些蛋白質導入患者體內，從而導致血清轉變的風險。為此，需要研制不會將HIV蛋白質導入患者體內的基于慢病毒的載體。現在，我們已發現可以提供改良的慢病毒載體，該載體克服了基于HIV載體的局限性。在研制任何逆轉錄病毒載體系統時，重要的是從逆轉錄病毒基因組中除去可抑制載體轉移異源基因能力的序列或可將不利的蛋白質編碼序列轉移至靶細胞的序列。逆轉錄病毒可被有效包裝的RNA序列長度有限，因此，逆轉錄病毒基因組長區域的存在嚴重限制了載體對異源編碼RNA的編碼能力。我們還發現可以基于非靈長類動物慢病毒提供慢病毒載體，該載體對異源編碼序列具有高編碼能力，并且將逆轉錄病毒的組分轉移至靶細胞的能力降低。我們驚奇地發現需要從非靈長類動物慢病毒中得到的載體基因組序列的量基本上低于基于HIV的載體所需要的量。對包裝HIV載體基因組的序列需求是復雜的。HIV-1包裝信號包含剪接供體位點，并含有gag基因的5’非翻譯區域部分，其推定的二級結構含有4個短莖-環。基因組別處的其它序列對HIV的有效衣殼化也是至關重要的。例如，有效包裝可歸功于gag蛋白編碼序列的前350個bp，并且涉及env未完全確定的區域。為了構建能表達異源基因的HIV載體，使用了延伸至350bp長的gag蛋白編碼序列的包裝信號。我們驚奇地發現非靈長類動物慢病毒的包裝信號結構與HIV的完全不同。不同于4個莖-環的短序列后接著不完全確定的gag和env序列區域，我們發現gag基因的較短區域足以進行有效包裝。實際上，EIAV載體中gag基因較大區域的缺失是有利的，其可導致較高滴度的病毒載體產生。可使用這一信息提供由非靈長類動物慢病毒序列構建的改良載體，相對于HIV載體而言，其具有高滴度和有利特征。本發明的第一方面提供了含有非靈長類動物慢病毒的缺失gag基因的逆轉錄病毒載體基因組，其中gag中的缺失除去了gag編碼序列核苷酸350下游的一個或多個核苷酸。優選缺失從核苷酸350至少延伸至gagpol編碼區的C末端。更優選缺失另外還除去了gag編碼區的核苷酸300，最優選缺失僅保留gag編碼區的前150個核苷酸。然而，也可使用甚至更多的gag缺失，例如，gag編碼區含有gag編碼區的前109個核苷酸。gag編碼區也可僅含有gag編碼區的前2個核苷酸。慢病毒基因組的其它特征包含在病毒基因組中，是轉導靶細胞，復制，逆轉錄和整合所必需的。它們至少是含有R區域和U5區域的序列，含多嘌呤序列片斷(PPT)的3’LTR序列和非靈長類動物慢病毒的3’LTR序列或含有非靈長類動物慢病毒序列和其它元件的雜合LTR的LTR部分。任選地，逆轉錄病毒基因組含有得自逆轉錄病毒的輔助基因，例如但不限于rev基因，tat基因，vif基因，nef基因，vpr基因或S2基因。也可添加其它組分，例如內含子，剪接供體位點，rev效應元件(RRE)，克隆位點和選擇標記基因。另外，我們已驚奇地闡明可構建出非靈長類動物慢病毒基本的載體系統，該系統在載體生產或轉導分裂和非分裂細胞時既不需要S2，Tat，env也不需要dUTP酶。因此，根據本發明的另一方面，衍生得到載體的非靈長類動物慢病毒基因組缺乏一個或多個輔助基因。輔助基因的缺失非常有利。首先，它使產生的載體不含一般與慢病毒(如HIV)感染之疾病相關的基因。尤其是tat和env與疾病相關。其次，輔助基因的缺失使載體能包裝更多的異源DNA。第三，可刪除功能未知的基因，例如dUTP酶和S2，從而降低導致不利影響的風險。另外，我們發現非靈長類動物慢病毒基因組的前導序列是gag和gagpol高效蛋白質表達所必需的。因此，根據本發明的另一方面，衍生得到載體的非靈長類動物慢病毒基因組缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導序列。這些資料進一步確定了一套最佳慢病毒載體的極限必需功能組分。所提供的載體具有最大的遺傳能力和高滴度，但不具有功能未知(S2，UTP酶)因此可能存在風險，或者是與AIDS相關的HIV蛋白質類似物(tat，env)的輔助基因。本發明提供了衍生自非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉錄病毒載體，其(1)含有缺失的gag基因，其中gag中的缺失除去了gag編碼序列核苷酸350下游的一個或多個核苷酸；(2)其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了一個或多個輔助基因；(3)其中非靈長類動物慢病毒基因組缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導序列；以及(1)，(2)和(3)的組合。在優選的實施方案中，逆轉錄病毒載體含有(1)和(2)和(3)的全部特征。本文所用的“非靈長類動物”載體指的是衍生自最初不是感染靈長類動物，尤其是人的病毒的載體。因此，非靈長類動物病毒載體包括感染非靈長類哺乳動物，如狗，綿羊和馬，爬行動物，鳥類和昆蟲的載體。本文所用的慢病毒載體是含有至少一個慢病毒組成成分的載體。優選該組成成分參與載體感染細胞，表達基因或進行復制的生物學機制。非靈長類動物慢病毒可以是一般不感染靈長類動物的慢病毒科家族的任何成員，其包括貓免疫缺損病毒(FIV)，牛免疫缺損病毒(BIV)，山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)，梅迪維斯納病毒(MVV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)。優選慢病毒是EIAV。馬傳染性貧血病毒感染所有的馬，導致血漿病毒血癥和血小板減少(Clabough等，1991，病毒學雜志，656242-51)。據認為，單核細胞變為巨噬細胞的成熟化過程可控制病毒的復制。EIAV具有最簡單的慢病毒基因組結構。除了gag，pol和env基因外，EIAV還編碼3個其它基因tat，rev和S2。Tat可作為病毒LTR的轉錄激活劑起作用(Derse和Newbold1993，病毒學，194530-6；Maury等，1994，病毒學，200632-42)，而Rev通過rev效應元件(RRE)調節和協同病毒基因的表達(Martarano等，1994，病毒學雜志，683102-11)。據認為，這兩種蛋白質的作用機制與靈長類動物病毒的相應機制非常類似(Martano等，文獻同上)。S2的功能未知。另外，已鑒定出EIAV蛋白質Ttm，它是由在跨膜蛋白質開始處與env編碼序列剪接到一起的tat第一外顯子編碼的。除蛋白酶外，非靈長類動物慢病毒的逆轉錄酶和整合酶含有第4個編碼dUTP酶的pol基因產物。它對這些慢病毒感染某些非分裂細胞類型的能力起到一定的作用。本發明第一方面的病毒RNA由啟動子轉錄，所述啟動子可以是病毒或非病毒來源，但能介導真核細胞如哺乳動物細胞中的表達。任選在啟動子上游或下游加入增強子。RNA轉錄物終止于可以由慢病毒的3’LTR提供的聚腺苷酸化位點或不同的聚腺苷酸化信號。因此，本發明提供了DNA轉錄單位，其含有能介導逆轉錄病毒載體基因組表達的啟動子并任選含有增強子。本文所述轉錄單位含有的核酸區域含有能被轉錄的序列。因此，此定義中包括編碼mRNA，tRNA和rRNA的序列。對啟動子而言，序列可以是有義或反義方向。根據眾所周知的技術，使用反義構建體可抑制基因在細胞中表達。核酸可以是例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其類似物。編碼mRNA的序列任選包括一些或所有5’和/或3’轉錄但一般不翻譯或要不然與翻譯的編碼序列相連的側翼序列。還可任選包括一般與轉錄序列相連的相關轉錄控制序列，例如轉錄終止信號，聚腺苷酸化位點和下游增強子元件。核酸可包括cDNA或基因組DNA(可含有內含子)。術語“啟動子”使用的是本領域的一般含義，例如基因表達的Jacob-Monod理論中的RNA聚合酶結合位點。術語“增強子”包括與轉錄起始復合物的其它蛋白質組分結合因而利于由其相關啟動子介導的轉錄啟動的DNA序列。優選編碼第一病毒載體組分的轉錄單位的啟動子和增強子具有強活性，或在生產本發明的逆轉錄病毒載體的條件下能在生產細胞中被強誘導，和/或在生產第二病毒載體的條件下能在原代靶細胞中被強誘導。優選編碼第二病毒載體組分的轉錄單位的啟動子和增強子具有強活性，或能在靶細胞中被強誘導。啟動子和/或增強子的活性可以是組成型有效的，或受組織或時間的限制。適當的受組織限制的啟動子/增強子例子包括在腫瘤細胞中具有高活性的啟動子/增強子，例如MUC1基因，CEA基因或5T4抗原基因的啟動子/增強子。受時間限制的啟動子/增強子例子包括對局部缺血和/或低氧反應的啟動子/增強子，例如低氧效應元件或grp78或grp94基因的啟動子/增強子。一個優選的啟動子-增強子組合是人巨細胞病毒(hCMV)主要即時早期(MIE)啟動子/增強子組合。可以改變下列區域中的LTRU3(為了得到強組成型表達，誘導型表達或組織特異性表達)；R(為了除去TAR莖環)；或U5(為了使用例如得自牛生長激素基因的增強的不基于U5的聚腺苷酸化信號)。在一個構型中，內部啟動子盒是反向的，聚腺苷酸化信號被置于盒的下游。在另一實施方案中，所用的聚腺苷酸化信號含有至少一個內含子。本發明的載體可以使用自我滅活的策略。通過缺失轉錄增強子或3’LTR之U3區域中的增強子和啟動子已構建出自我滅活的逆轉錄病毒載體。一輪載體復制之后，這些改變被拷貝至5’和3’LTR中，產生無活性的原病毒。然而，這種載體中LTR內部的任何啟動子仍具有活性。使用此策略消除了病毒LTR中的增強子和啟動子對內部置入基因轉錄的影響，這種影響包括增加轉錄或抑制轉錄。還可使用該策略消除3’LTR下游轉錄至基因組DNA中。人基因療法對此很在意，因為在該療法中防止激活內源性癌基因非常重要。還構建出另一種類型的自我滅活載體，該載體具有側翼于包裝信號的直接重復序列以使包裝信號在逆轉錄的過程中經常被缺失，產生包裝缺損病毒。由于足夠長的直接重復序列的存在，所得原病毒中的大多數失去其包裝序列。通過設計載體，使包裝信號缺失重建在G418中選擇被載體感染之細胞的neo標記nad，缺失率可增加至100％。此策略對基因療法應用特別有用，因為在基因療法中，基因轉移之后載體的任何擴散都是不必要的。在本發明第一方面的其它優選實施方案中，所需的一個或多個目的核苷酸(NOI)被導入載體的克隆位點。這種治療基因可由置于逆轉錄病毒LTR中的啟動子表達，或由導入克隆位點的內部啟動子表達。適當的NOI克隆序列包括治療和/或診斷用的序列，其包括但不限于編碼細胞因子，趨化因子，激素，抗體，經改造的免疫球蛋白-樣分子，單鏈抗體，融合蛋白，酶，免疫共-刺激分子，免疫調制分子，反義RNA，靶蛋白的transdominant陰性突變體，毒素，條件毒素，抗原，腫瘤抑制蛋白和生長因子，膜蛋白，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(如連接有報道基團)的序列。當被包括時，這種編碼序列一般與適當的啟動子可操作相連，所述啟動子可以是驅動核酶表達的啟動子或不同的啟動子。NOI編碼序列可編碼融合蛋白或編碼序列區段。可使用本發明的逆轉錄病毒載體將NOI，例如激活前體藥物的酶傳遞至腫瘤位點以治療癌癥。此時，將適當的前體藥物與適當的激活前體藥物的酶聯合使用以治療個體(如患者)。適當的前體藥物與載體一起被施用。前體藥物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(與堿性磷酸酶聯合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶聯合，Mullen等，1994，癌癥研究，541503-1506)；阿霉素-N-對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V-酰胺酶聯合，Kerr等，1990，癌癥免疫及免疫療法31202-206)；對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(與羧肽酶G2聯合)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與β-內酰胺酶聯合)；SR4233(與P450還原酶聯合)；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶聯合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前體藥物(與硝基還原酶聯合，Friedlos等，1997，藥物化學雜志，401270-1275)和環磷酰胺(與P450聯合，Chen等，1996，癌癥研究561331-1340)。通過病毒或非病毒載體可將本發明的載體傳遞至靶位點。眾所周知，載體是允許或便于一個實體從一個環境轉移至另一個環境的工具。例如，重組DNA技術中使用的一些載體能將如DNA區段(如異源DNA區段，如異源cDNA區段)的實體轉移至靶細胞。任選地，一旦進入靶細胞，載體可發揮作用以將異源DNA維持在細胞內或可用作DNA復制單位。重組DNA技術中所用載體的例子包括質粒，染色體，人造染色體或病毒。非病毒傳遞系統包括但不限于DNA轉染方法。本文中的轉染包括使用非病毒載體將基因傳遞至靶哺乳動物細胞的方法。典型的轉染方法包括電穿孔，DNAbiolistics，脂質介導的轉染，緊密DNA介導的轉染，脂質體，免疫脂質體，脂質轉染法，陽離子試劑-介導的，陽離子表面的親水脂分子(CFA)(天然生物技術199614556)及其組合。病毒傳遞系統包括但不限于腺病毒載體，腺相關病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，桿狀病毒載體。載體的其它例子包括來自體內的傳遞系統，其包括但不限于DNA轉染法，如電穿孔，DNAbiolistics，脂質介導的轉染，緊密DNA介導的轉染。術語“逆轉錄病毒載體顆粒”指的是經包裝的逆轉錄病毒載體，其優選能結合并進入靶細胞。正如論述載體時所討論的，相對于野生型逆轉錄病毒而言，顆粒的組分可被修飾。例如，可對顆粒的蛋白質外膜中的Env蛋白進行基因修飾以改變其靶向特異性或獲得一些其它所需的功能。優選病毒載體優先轉導某些細胞類型。更優選病毒載體是靶向載體，即具有相對于天然病毒而言有所改變的組織嗜性從而使載體靶向特定的細胞。對于逆轉錄病毒載體而言，通過修飾Env蛋白可達到這一目的。逆轉錄病毒第二載體的Env蛋白需要在原代靶細胞中成為無毒性的包膜或以無毒性的量產生的包膜，例如MMLV兼嗜性包膜或經修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，優選安全性特征是缺失逆轉錄病毒組分之間同源的區域或序列。優選包膜可轉導人細胞，適當的env基因的例子包括但不限于VSV-G，MLV兼嗜性env，如4070Aenv，RD114豬白血病病毒env或流感病毒的血細胞凝集素(HA)。Env蛋白能與有限量人細胞類型上的受體結合，并且可以是含有靶向組成成分的經改造的包膜。env和gag-pol編碼序列由在選定包裝細胞系中具有活性的啟動子和(任選地)增強子轉錄，轉錄單位由聚腺苷酸化信號終止。例如，如果包裝細胞是人細胞，適當的啟動子-增強子組合是人巨細胞病毒主要即時早期(hCMV-MIE)基因的啟動子-增強子，可使用SV40病毒的聚腺苷酸化信號，其它適當的啟動子和聚腺苷酸化信號是本領域已知的。包裝細胞可以是被治療的個體體內的包裝細胞，或也可以是體外培養的細胞，如組織培養細胞系。適當的細胞系包括哺乳動物細胞，如得自鼠成纖維細胞的細胞系或人細胞系。優選包裝細胞系是人細胞系，例如293細胞系，HEK292，293-T，TE671，HT1080。或者，包裝細胞可以是得自被治療的個體的細胞，例如單核細胞，巨噬細胞，干細胞，血細胞或成纖維細胞。從個體中分離細胞，體內施用包裝和載體組分，接著再施用自身包裝細胞。或者，給體內包裝細胞施用包裝和載體組分。將逆轉錄病毒包裝和載體組分導入個體細胞的方法是本領域已知的。例如，一個方法是通過瞬時三聯轉染將產生逆轉錄病毒載體顆粒所需的不同DNA序列，如env編碼序列，gag-pol編碼序列和缺損的逆轉錄病毒基因組同時導入細胞(Landau&Littman1992，病毒學雜志，66，5110；Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)。在一個實施方案中，本發明的載體構型將3個轉錄單位用作其生產系統，它們可表達基因組，gag-pol組分和包膜。包膜表達盒可包括多種包膜之一，如VSV-G或多種鼠逆轉錄病毒包膜，如4070A。通常，這3個表達盒由3個瞬時轉染進入適當細胞系，如293T的質粒表達或由穩定生產細胞系中的整合拷貝表達。另一種方法是使用另一種病毒作為3個表達盒的表達系統，所述病毒如桿狀病毒或腺病毒。這些都是核表達系統。迄今為止，使用痘病毒表達逆轉錄病毒或慢病毒載體系統的所有組分尚未見描述。尤其是，盡管慢病毒不尋常的密碼子使用及其RNA操作系統，如rev/RRE系統的需求是給定的，目前仍不清楚所有3個表達盒的摻入及其隨后在載體中的表達是否可行，所述載體在胞質而不是核中進行表達。迄今為止，仍存在這種可能性，即載體組分的表達及其在基因傳遞載體中的功能需要主要的核因子和核RNA操作途徑。本文描述了這種系統，證明慢病毒組分可在胞質中制備，它們裝配成功能性的基因傳遞系統。該系統的優點是使痘病毒易于處理，表達水平升高，并能將內含子維持在載體基因組中。因此，根據本發明的另一方面，提供了用于體內基因傳遞的雜合病毒載體系統，該系統含有可得自或基于痘病毒的第一病毒載體和可得自或基于vectroviral載體，優選慢病毒載體，甚至更優選非靈長類動物慢病毒載體的第二病毒載體。由第一載體DNA編碼的逆轉錄病毒載體生產必需的基因的表達可產生第二載體。所述基因包括逆轉錄病毒的gag-pol，包膜病毒和含有一個或多個治療或診斷用NOI的缺損逆轉錄病毒載體的env基因。缺損的逆轉錄病毒載體一般含有具有逆轉錄功能的序列，5’長末端重復(LTR)的至少一部分，3’LTR的至少一部分和包裝信號。如果需要使第二載體變為復制缺損的，第二載體可由位于單個或兩個或多個腺病毒或其它第一載體上的多個轉錄單位編碼。在一些治療或實驗的情況下，應避免在體外由MVA衍生制備EAIV的需要。MVA-EIAV雜合體被直接傳遞至患者/動物體內，例如將MVA-EIAV靜脈內注射至小鼠的尾靜脈中，此重組病毒感染鼠的多個組織，如肺，脾臟等。被感染的細胞表達具有轉導活性的EIAV，其含有基因治療用的治療基因。EIAV載體顆粒從這些細胞中芽出，并轉導相鄰的細胞。被轉導的細胞則含有整合拷貝的EIAV載體基因組并表達治療基因產物或其它所需的基因產物。如果治療基因產物的表達對宿主具有潛在的毒性，可通過特異性啟動子，如低氧效應元件(HRE)調節表達，該元件可將表達限制于低氧環境中的那些細胞。針對肺/氣管上皮細胞的基因治療，如治療囊性纖維化，MVA-EIAV可以是鼻內傳遞的氣溶膠形式。或者，可體外轉導巨噬細胞，然后再次進行轉導以產生基于EIAV的載體的巨噬細胞工廠。另外，由于MVA不具有復制能力，MVA-EIAV雜合體也可用于治療免疫抑制的宿主。痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬的原型成員，它是第一個用于表達重組外源蛋白質的病毒(Mackett等，1982，Paoletti&Panicalli1982)。痘苗病毒具有大于180kb的大DNA基因組，有報道表明它可容納大至25kb的外源DNA(Merchlinsky&Moss1992)。幾個其它的痘病毒株已被改造為重組表達載體(參見Carroll和Moss1997的綜述)，例如禽痘病毒(Taylor&Paoletti1988)，金絲雀痘病毒(Taylor等1991)，豬痘病毒(vanderLeek等1994)和昆蟲痘病毒(Li等1997)。另外，出于對安全性的考慮，已開發出幾個高度減毒的痘苗病毒株，它們對人和其它哺乳動物細胞無害，例如經修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)(Mayr1978，Sutter1992)，NYVAC(Paoletti等1994)，DNA復制酶缺損的痘苗病毒(Holzer等1997)。這些病毒都可以用于本發明。MVA得自具有復制能力的痘苗天花疫苗株Ankara。在雞胚成纖維細胞中傳代＞500次之后，病毒分離株在包括小鼠的多種免疫缺損動物模型中表現出高度減毒(Mayr等1978)。用減毒的分離株MVA接種120，000個人，大多數人無免疫應答(Mahnel1994)，也沒有不良反應。研究表明MVA可感染多種哺乳動物細胞，但僅在倉鼠腎細胞BHK-21中觀察到生產性的感染(Carroll1997)。在所有其它受試的哺乳動物細胞系中，觀察到早期表達，DNA復制和晚期表達導致非感染性的不成熟病毒顆粒的產生(Carroll1997，Meyer1991)。病毒復制研究表明極少數哺乳動物細胞可支持很低水平的感染性病毒產生，即每個細胞中產生1個感染性MVA顆粒的BS-C-1細胞(Carroll和Moss1997)。晚期基因表達通常產生比受早期啟動子控制的那些基因多10倍以上的蛋白質(Chakrabarti等1997，Wyatt等1996)。在所有其它減毒痘病毒株中，很少在哺乳動物細胞中觀察到晚期基因表達。逆轉錄病毒載體系統，如MLV-HIV和慢病毒載體系統的產生需要構建表達病毒基因組和必需結構蛋白的生產細胞系以制備具有轉導能力的病毒。一般說來，這是相對無效的方法，當病毒是具有毒性包膜蛋白，如VSV-G的假型病毒時，該方法會進一步復雜化。由重組痘病毒表達功能性基因組和所需的結構蛋白可避免很多目前無效的逆轉錄病毒和慢病毒載體生產技術。另外，這種重組痘病毒可直接注射至患者體內以在體內產生逆轉錄病毒或慢病毒。因其非-復制表型及其進行早期和強晚期表達以產生高滴度載體制品的能力，MVA是特別適于構建痘病毒-逆轉錄病毒或痘病毒-慢病毒雜合體的痘病毒。為了產生功能性的逆轉錄病毒或慢病毒載體基因組，RNA基因組的5’端應是精確無誤的(Cannon等，1996)。對基于痘苗病毒的生產系統而言，這是一個挑戰，因為很多痘苗病毒啟動子含有轉錄效力的下游決定因素(Davison1989b，Moss1996)。然而，我們找到了幾個解決問題的方法a．使用T7啟動子和T7終止序列。b．使用早期啟動子(其中RNA起始位點下游的序列不是高度保守的)(Davison1989a)。c．使用痘苗病毒中期和晚期啟動子，其需要起始位點下游的其它序列與產生真正的5’末端的策略相結合，或者將其它下游序列置于兩個R區域。對晚期啟動子轉錄起始位點下游4個核苷酸的特定序列是有要求的(Davison1989b,Moss1996)。在第一種情況下，核酶被置于啟動子下游，R區域上游。核酶被設計成順式裂解RNA以產生正確的5’末端。在第二種情況下，方法是修飾R區域以摻入額外的序列。對5’和3’LTRR區域都必須這么做。具有依賴于T7的系統的優點是它需要通過兩個重組痘苗病毒感染細胞以產生轉導EIAV病毒顆粒。例如，一個MVA可攜有載體基因組(在T7啟動子的控制之下)和gag/pol和env序列(在痘苗病毒啟動子的控制之下)。其它MVA可攜有受痘苗病毒啟動子控制的T7聚合酶基因(Wyatt等1995)。本發明的逆轉錄病毒載體顆粒也能夠轉導不能被非慢病毒，如MLV有效轉導的緩慢分裂的細胞。緩慢分裂的細胞約3至4天分裂1次，其包括某些腫瘤細胞。盡管腫瘤含有快速分裂的細胞，但一些腫瘤細胞，尤其是腫瘤中心的細胞分裂仍很緩慢。或者，靶細胞可以是能進行細胞分裂的生長停滯的細胞，例如腫瘤塊中央部分的細胞或干細胞，如造血干細胞或CD34-陽性細胞。或者，靶細胞可以是分化細胞的前體，例如單核細胞前體，CD33-陽性細胞或骨髓前體。或者，靶細胞可以是分化細胞，例如神經元，星形細胞，膠質細胞，微膠質細胞，巨噬細胞，單核細胞，上皮細胞，內皮細胞或肝細胞。從人個體分離之后，靶細胞可被體外轉導或直接進行體內轉導。本發明載體系統對一個或多個治療基因的傳遞可以單獨使用或與其它治療或治療組分聯合使用。例如，可使用本發明的逆轉錄病毒載體傳遞一個或多個可用于治療WO-A-98/05635中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出其中的一部分疾病癌癥，炎癥或炎性疾病，皮膚病，發燒，心血管病，出血，凝結和急性期反應，惡病質，厭食，急性感染，HIV感染，休克狀態，移植物-抗-宿主反應，自身免疫病，重復灌注損傷，腦膜炎，偏頭痛和依賴于阿斯匹林的抗-血栓形成；腫瘤生長，發病和擴散，血管生成，轉移，惡性腫瘤，腹水，惡性胸膜滲漏；大腦局部缺血，局部缺血性心臟病，骨關節炎，風濕性關節炎，骨質疏松，氣喘，多發性硬化，神經退化，早老性癡呆，動脈粥樣硬化，中風，脈管炎，局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎；牙周炎；齦炎；牛皮癬，特應性皮炎，慢性潰瘍，大皰性表皮松解；角膜潰瘍，視網膜病和外科傷口愈合；鼻炎，過敏性結膜炎，濕疹，過敏癥；再狹窄，充血性心臟病，子宮內膜異位，動脈粥樣硬化或endosclerosis。另外，或者，可使用本發明的逆轉錄病毒載體傳遞一個或多個可用于治療WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出在人或獸藥中可治療的其中一部分疾病細胞因子和細胞增殖/分化活性；免疫抑制劑或免疫刺激劑活性(如治療免疫缺損，包括如免疫缺損病毒感染；調節淋巴細胞生長；治療癌癥和很多自身免疫病，防止移植排斥或誘導腫瘤免疫力)；調節血細胞生成，如治療骨髓或淋巴疾病；促進骨，軟骨，腱，韌帶和神經組織的生長，如愈合創傷，治療燒傷，潰瘍，牙周病和神經退化；抑制或激活促濾泡激素(調制能育性)；趨化活性(例如將特異性細胞類型移動至受傷或感染位點)；止血和溶栓活性(如治療嗜血桿菌病和中風)；抗炎癥活性(如治療膿毒性休克或局限性回腸炎)；抗微生物劑；代謝或行為的調制劑，止痛劑；治療特異性缺損疾病；治療例如牛皮癬。另外，或者，可使用本發明的逆轉錄病毒載體傳遞一個或多個可用于治療WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出其中一部分疾病巨噬細胞抑制和/或T細胞抑制活性，因此，抗炎癥活性；抗-免疫活性，即針對細胞和/或體液免疫反應，包括與炎癥不相關之反應的抑制作用；抑制巨噬細胞和T細胞粘附細胞外基質組分和纖連蛋白的能力，以及上調T細胞中的fas受體表達；抑制不必要的免疫反應和炎癥，包括關節炎(包括風濕性關節炎)，與超敏反應相關的炎癥，變態反應，氣喘，全身性紅斑狼瘡，膠原病和其它自身免疫病，與動脈粥樣硬化相關的炎癥，動脈粥樣硬化，粥樣硬化性心臟病，重復灌注損傷，心動停止，心肌梗塞，血管炎，呼吸窘迫綜合征或其它心肺病，與消化道潰瘍相關的炎癥，潰瘍性結腸炎和其它胃腸道疾病，肝纖維變性，肝硬變或其它肝病，甲狀腺炎或其它腺病，腎小球腎炎或其它腎和泌尿道疾病，耳炎或其它耳-鼻-喉疾病，皮炎或其它皮膚病，牙周炎或其它牙病，睪丸炎或睪丸附睪炎，不育癥，睪丸外傷或其它與免疫相關的睪丸病，胎盤功能異常，胎盤機能不全，習慣性流產，驚厥，驚厥前期和其它與免疫和/或炎癥相關的婦科疾病，前眼色素層炎，中眼色素層炎，后眼色素層炎，結膜炎，脈絡膜視網膜炎，眼色素層視網膜炎，視神經炎，眼內炎癥，如視網膜炎或類囊腫斑水腫，交感性眼炎，鞏膜炎，視網膜著色，退化性fondus病的免疫和炎癥成分，眼外傷的炎癥成分，由感染引起的眼炎癥，增生的玻璃體-視網膜病，急性缺血性視覺神經病，過多瘢痕形成，例如青光眼濾過手術之后的瘢痕形成，抗眼移植物的免疫和/或炎癥反應和其它與免疫和炎癥相關的眼炎，與自身免疫病相關的炎癥(此時，在中樞神經系統(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎癥抑制將是有利的)，帕金森氏病，治療帕金森氏病引起的并發癥和/或副作用，AIDS-相關的癡呆綜合征，HIV相關的腦病，視神經脊髓炎，Sydenham舞蹈病，早老性癡呆和其它CNS退化性疾病或紊亂，Stokes氏病的炎癥成分，脊髓灰質炎后綜合征，精神病的炎癥成分，脊髓炎，腦炎，亞急性致硬化全腦炎，腦脊髓炎，急性神經病，亞急性神經病，慢性神經病，急性感染性多神經炎，Sydenham舞蹈病，重癥肌無力，假-腫瘤腦，Down氏綜合征，Huntington氏綜合征，肌萎縮性側索硬化，CNS受壓或CNS外傷或CNS感染的炎癥成分，肌肉萎縮和營養不良的炎癥成分，中樞和外周神經系統的免疫和炎癥相關疾病，外傷后炎癥，膿毒性休克，傳染病，手術的炎癥并發癥或副作用，骨髓移植或其它移植并發癥和/或副作用，基因治療的炎癥和/或免疫并發癥和副作用(例如因為被病毒載體感染)，或與AIDS相關的炎癥，阻遏或抑制體液和/或細胞免疫反應，通過減少單核細胞或淋巴細胞的量來治療或緩解單核細胞或白細胞增殖性疾病，例如白血病，移植天然或人造細胞，組織和器官(例如角膜，骨髓，器官，晶狀體，起搏器，天然或人造皮膚組織)時預防和/或治療移植排斥。本發明還提供了通過基因療法治療個體的藥物組合物，其中組合物含有治療有效量的本發明的逆轉錄病毒載體或由其產生的或得自該載體的病毒顆粒，所述載體含有一個或多個可傳遞的治療和/或診斷用NOI。藥物組合物可用于人或動物。一般說來，醫生可決定最適于個體受試者的實際劑量，該劑量取決于特定個體的年齡，體重和反應。組合物可任選含有藥物可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。藥物載體，賦形劑或稀釋劑的選擇取決于給藥途徑和標準的藥物學操作方法。除載體，賦形劑或稀釋劑外，藥物組合物可含有任何適當的結合劑，潤滑劑，懸浮劑，包被劑，增溶劑和其它能輔助或增加病毒進入靶位點的載體試劑(例如脂質傳遞系統)，也可含有這些試劑作為載體，賦形劑或稀釋劑。適當時，可通過下列方式中的任何一種或多種施用藥物組合物吸入劑，栓劑或陰道藥栓的形式，典型地為洗劑，溶液，乳劑，軟膏或撒粉的形式，使用皮膚貼片，以含有如淀粉或乳糖之賦形劑的片劑形式口服，或者以單獨或與賦形劑混合的膠囊或卵狀小體形式口服，以含有調味劑或著色劑的酏劑，溶液或懸浮液的形式口服，或者可以非腸道注射，例如intracavernosally，靜脈內，肌內或皮下注射。對于非腸道給藥而言，最好以無菌水溶液的形式使用組合物，所述溶液可含有其它物質，例如足夠的鹽或單糖以制備與血液等滲的溶液。對于口或舌下給藥而言，可以按常規方式配制的片劑或錠劑形式施用組合物。通過本發明的載體系統傳遞一個或多個治療基因的方法可以單獨使用，或與其它治療或治療成分聯合使用。可治療的疾病包括但不限于癌癥，神經病，遺傳病，心臟病，中風，關節炎，病毒感染和免疫系統疾病。適當的治療基因包括編碼腫瘤抑制蛋白，酶，前體藥物激活酶，免疫調制分子，抗體，經改造的免疫球蛋白樣分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，作用于血管的蛋白質或肽，細胞因子，趨化因子，抗病毒蛋白質，反義RNA或核酶。在本發明治療方法的優選實施方案中，使用本發明的載體系統將編碼前體藥物激活酶的基因傳遞至腫瘤，隨后用適當的前體藥物治療個體。前體藥物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(與堿性磷酸酶聯合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶聯合，Mullen等，1994，癌癥研究，541503-1506)；阿霉素-N-對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V-酰胺酶聯合，Kerr等，1990，癌癥免疫及免疫療法31202-206)；對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(與羧肽酶G2聯合)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與β-內酰胺酶聯合)；SR4233(與P450還原酶聯合)；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶聯合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前體藥物(與硝基還原酶聯合，Friedlos等，1997，藥物化學雜志，401270-1275)和環磷酰胺或異環磷酰胺(與細胞色素P450聯合，Chen等，1996，癌癥研究561331-1340)。根據本發明，可使用本領域技術人員熟知的標準分子生物學技術。文獻中完整描述了該技術。例見Sambrook等(1989)分子克隆；實驗室手冊；Hames和Glover(1985-1997)DNA克隆操作方法，第Ⅰ-Ⅳ卷(第2版)；免疫球蛋白基因工程方法，McCafferty等(1996)，“抗體工程操作方法”。參照下列附圖，在實施例中進一步描述了本發明圖1-顯示出質粒pESP，pONY3和pONY2.1nIsLacZ之轉錄單位的結構。圖2-顯示出整合EIAV載體的PCR分析，用EIAV載體轉導細胞(泳道1和5)或模擬轉導細胞(泳道2和6)的基因組DNA進行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作對照。A.PCR檢測EIAVLTR。B.PCR檢測pol。圖3-顯示出用于鑒定EIAV載體之包裝需求的缺失質粒的載體轉錄單位結構。圖4-顯示出得自pONY2.13LacZ中存在的gag轉錄單位的RNA二級結構預測。圖5描述了衍生自EIAV基因組的載體。圖6描述了衍生自EIAV的gagpol構建體。圖7描述了含有S2缺失的EIAV載體。圖8描述了具有缺失的S2和dUTP酶基因的EIAVgagpol構建體。圖9描述了EIAV基本載體。圖10描述了顯示出本發明EIAVgagpol構建體分析的凝膠。圖11顯示出pONY4載體的例子。圖12顯示出兩個SIN載體。圖13描述了具有割裂polyA信號的載體。圖14描述了具有割裂polyA信號的載體。圖15描述了具有割裂polyA信號的載體。圖16顯示出具有割裂polyA信號的pONY4-GFP的構建。圖17顯示出MLV/EIAV載體的構建。圖18顯示出構建MLV/EIAV載體所用的引物。圖19顯示出pONY-小鼠的完整序列。圖20和21顯示出PCR的引發過程。圖22顯示出pEMVA4(用引物EMAV1-8進行PCR之后)。圖23顯示出pEMVA4。圖24顯示出pEMVA5。圖25和26顯示出5’末端形成的錘頭策略的例子。圖27顯示出pEMVA6。圖28顯示出pEMVA7和pSynpONY4.1。圖29顯示出EMVA10/11。圖30顯示出pEMVA9。圖31顯示出pEMVA10。圖32顯示出pLWHORSE3.1。圖33顯示出pMCRev。圖34顯示出pYFVSVG。圖35顯示出pYFAmpho。圖36顯示出重組的MVA構建體。圖37顯示出pSC65的完整序列。圖38顯示出pLW22的完整序列。詳細解釋圖1．該研究中使用的質粒。顯示出EIAV的基因組結構，其包括剪接供體(d1，d2和d3)和剪接受體位點(a1，a2和a3)。也顯示出gag,pol,env,tat,rev,S2和病毒LTR的位置。質粒pESP是含有SV40啟動子和嘌呤霉素抗性基因的EIAV載體基因組。質粒pONY3是EIAVgagpol表達質粒。pONY2.1nIsLacZ是含有HCMVIE增強子/啟動子和β-半乳糖苷酶基因(nlslacZ)的EIAV載體基因組。圖2顯示出整合EIAV載體的PCR分析，用EIAV載體轉導細胞(泳道1和5)或模擬轉導細胞(泳道2和6)的基因組DNA進行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作對照。A．PCR檢測EIAVLTR。B．PCR檢測pol。表2。轉導分裂和非分裂細胞。根據Lewis等(Lewis,P.F和M.Emerman，1994，病毒學雜志，68510-6)的方法，用(空心柱)或不用(陰影柱)蚜腸霉素處理293T細胞，然后用EIAV載體pONY2.1nIsLacZ或MLV載體HIT111(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)進行轉導。48小時之后，用X-gal染色細胞，將兩次獨立實驗的滴度平均值計算為每ml的lacZ集落形成單位。實驗之間的誤差不超過10％。圖10顯示出gagpol表達構建體的分析。通過SDS/PAGE電泳分離30微克總細胞蛋白質，轉移至硝酸纖維素濾膜上，用抗-EIAV抗體進行探測。第二抗體是抗馬HRP(Sigma)。，將三次獨立實驗的滴度平均值計算為每ml的lacZ集落形成單位。實驗之間的誤差不超過10％。用EIAVgagpol共轉染pONY2.1nIsLacZ和包膜表達質粒。實施例1-構建含有缺失的gag基因的EIAV載體為了構建無復制能力的EIAV載體系統，我們將Payne等(1994，普通病毒學雜志，75425-9)所述的感染性原病毒克隆pSPEIAV19(登記號為U01866)用作起點。根據Payne等(文獻同上)的編號系統除去對應于5835/6571位的HindⅢ/HindⅢ片斷以簡單地缺失部分env，籍此構建原始的基于EIAV的載體。此片斷被pTIN500(Cannon等，1996，病毒學雜志，708234-8240)中受SV40早期啟動子控制的嘌呤霉素抗性基因所取代，產生pESP(圖1)。通過用pESP和pRV67(Kim等，1998，病毒學雜志，72(1)811-6)磷酸鈣轉染293T細胞(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)產生病毒原種，質粒pRV67中的水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)由HCMV-IE增強子/啟動子表達。也可使用其它VSV-G表達質粒，例見Yee等，1994，PNAS919564-9568。按下述使用所得上清液轉導人腎(293T)和犬骨肉瘤細胞(D17)。轉染48小時之后，收集組織培養液，流過0.45μm濾器進行過濾。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的培養基制備10倍稀釋物，然后將500μl等分試樣置于前一天接種有1.6×105個細胞/孔D17細胞的12孔培養板中。2小時后，加入1ml培養基。2天后，加入嘌呤霉素至終濃度為4μg/ml，再持續保溫7天。作為陽性對照，將基于鼠白血病病毒(MLV)的載體(pTIN500)與pHIT60(MLVgagpol)和pRV67(Cannon等，1996，病毒學雜志，708234-8240)聯合使用，其中pTIN500含有受SV40早期啟動子控制的嘌呤霉素抗性基因。用EIAV載體進行嘌呤霉素選擇達7天之后，在任一種細胞類型上都未觀察到抗性集落。MLV載體在293T細胞上產生了5.0×104c.f.u./ml，在D17細胞上產生了1.0×104c.f.u./ml。對此結果作類似的擴展，即在缺乏tat，因而不能產生足夠量的重要成分，如gagpol和tat時，EIAVLTR在人細胞中不具有功能。因此，構建了另一個載體系統，其含有3個轉錄單位以產生1)載體基因組RNA；2)env和3)gag-pol。為了確保產生足夠量的每種成分，env和gag-pol轉錄單位由在選定人包裝細胞系中具有活性的啟動子-增強子轉錄。通過這種方式，產生了足夠量的gag-pol(最可能是tat)以確保有效產生有轉導能力的載體顆粒。構建了載體基因組，該基因組的pol區域內具有下述報道基因。通過將由pSPEIAV19經PCR擴增的EIAVLTR插入pBluescriptⅡKS+(Stratagene)構建出質粒pONY1。使用pfu聚合酶，用下列引物PCR擴增EIAV克隆pSPEIAV19的5’LTR5’GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG3’GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC通過補平5’突出端使擴增子成為平端，使用T4DNA聚合酶將其插入用BssHⅡ切割，通過除去3’突出端而成為平端的pBluescriptⅡKS+中。此構建體被稱為pONY1，相對于pBluescriptⅡKS+的β-半乳糖苷酶而言，其方向為5’至3’。對pONY1的測序未顯示出有突變。用MluⅠ(216/8124)切割載體基因組pSPEIAV19DH，插入用MluⅠ(216)切割的pONY1中以制備pONY2。用BssHⅡ消化(619/792)pBluescriptⅡKS+得到多克隆位點。通過補平5’突出端使其成為平端，連接至用BglⅡ和NcoⅠ(1901/4949)切割的pONY2中，通過補平5’突出端使其成為平端。相對于EIAV序列而言，方向為3’至5’，稱之為pONY2.1。通過將pLNCX(登記號M28246)(PstⅠ/HindⅢ)插入pSP72(Promega)產生pSPCMV。將pTIN414(CannonPM等，病毒學雜志，70，8234-8240)的β-半乳糖苷酶基因插入pSP72(XhoⅠ/SphⅠ)中產生pSPlacZ。β-半乳糖苷酶基因的5’末端被pAD.RSVbgal(J.Clin.Invet.90626-630，1992)的SV40T抗原核定位信號取代。用XhoⅠ/ClaⅠ切割pAD.RSVbgal，并插入用XhoⅠ/ClaⅠ切割的pSPlacZ中產生pSPnlslacZ。用PstⅠ切下pSPlacZ和pSPnlslacZ中CMV核定位和非核定位的β-半乳糖苷酶，以EIAV的5’至3’方向將其插入pONY2.1的PstⅠ位點。所得構建體被稱為pONY2.1nlslacZ和pONY2.1lacZ。將pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片斷插入哺乳動物表達載體pCl-neo(Promega)中以制備EIAVgagpol表達質粒(pONY3)，從而使gag-pol基因由hCMV-MIE啟動子-增強子表達。具體地說，用MluⅠ(216/8124)切割gagpolpSPEIAV19DH并插入用MluⅠ(216)切割的pCl-neo(Promega)中以制備pONY3。質粒pONY3不應產生功能性的基因組，因為其缺乏適當的LTR序列。按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，通過用3種質粒pRV67，pONY3和pONY2.10nlsLacZ瞬時共轉染293T細胞以產生病毒，然后按下述用病毒轉導293T細胞和D17細胞。轉染48小時之后，收集組織培養液，流過0.45μm濾器進行過濾。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的培養基制備10倍稀釋物，然后將500μl等分試樣置于前一天接種有1.6×105個細胞/孔D17細胞的12孔培養板中。2小時后，加入1ml培養基，再持續保溫48小時，使用大腸桿菌β-半乳糖苷酶的X-gal染色方法評估LacZ基因的表達(macGregor等，1991，分子生物學方法，Vol7，EJMurray編，p217-235)。在這兩種情況下，病毒以約105LacZ-轉導細胞-形成單位(l.f.u.)/ml的頻率轉導細胞，該頻率比由pHIT111產生的基于MLV的載體約低10倍。這些數據表明我們已制備出基于EIAV的載體系統，也暗示著用外源DNA取代env的HindⅢ/HindⅢ片斷可破壞基因組的功能。接著，我們鑒定了EIAV載體顆粒成為假型病毒的能力，所述假型病毒具有得自其它病毒的包膜蛋白。用產生MLV兼嗜性(pHIT456)和MLV親嗜性(pHIT123)包膜(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)以及VSV-G(pRV67)的包膜表達質粒共轉染pONY2.10nlsLacZ和pONY3(表1)。用包膜質粒共轉染pHIT111(MLV載體基因組)和pHIT60(MLVgagpol表達質粒)作為陽性對照(表1)。用病毒上清液轉導多種細胞系，包括人腎(293T)，鼠胚(NIH3T3)和犬骨肉瘤(D17)細胞系。如所預期的，病毒的細胞嗜性在很大程度上由包膜決定。EIAV可以是具有兼嗜性包膜的假型病毒，但轉導效率有所不同。兼嗜性假型病毒在D17細胞上的滴度約為102，在NIH3T3細胞上的滴度約為103，在293T細胞上的滴度約為104。這些差異的原因未被深究。EIAV也可以是具有MLV親嗜性包膜的假型病毒，這些病毒以104l.f.u./ml的滴度轉導NIH3T3細胞，用具有VSV-G包膜的EIAV假型病毒轉導所有受試細胞系。不同包膜和細胞類型之間的滴度不同，對非鼠細胞而言，整體效率相對較高，但仍低于鼠載體系統的效率。總之，這些數據表明EIAV載體系統并不依賴于EIAV包膜，其可有效地成為具有3個賦予寬宿主范圍之包膜的假型病毒。這使得該系統與目前使用的基于MLV的系統一樣有用。按相同的方式，使用RD114包膜，例如使用pRDF(Cosset等，1995，病毒學雜志，697430-7436)也可使EIAV載體成為假型病毒。為了鑒定轉導事件，我們進一步對被具有VSV-G的EIAV假型病毒載體轉導的293T細胞進行了PCR分析。具體地說，我們想知道與具有gagpol表達質粒pONY3的重組體相反的載體基因組是否已成為β-半乳糖苷酶基因的轉導載體。當使用分離自轉導細胞的基因組DNA時，使用特異于EIAVLTR的引物進行PCR擴增，得到預期的310bp的PCR產物(圖2A，泳道1)。當將模擬轉導的293T細胞DNA用作模板時，未檢測到PCR產物(圖2A，泳道2)。pONY2.10nlsLacZ被用作陽性對照(圖2A，泳道3)。當pONY3被用作模板時未檢測到PCR產物(圖2A，泳道4)。使用pol特異性引物時PCR產物的缺乏(圖2B)進一步證實pONY3中的gagpol序列未整合至宿主染色體中。總之，這些數據說明真正的載體基因組轉導了細胞。為了測定EIAV載體是否保留了轉導非分裂細胞的能力，根據已知方法(Lewis和Emerman1994)，通過用蚜腸霉素處理將293T細胞滯留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒載體轉導細胞。與未經處理的細胞相比，在經蚜腸霉素處理的細胞中，MLV載體的轉導效率要低4個數量級。MLV細胞轉導的不完全阻斷可能是分裂細胞小群體所致。與之形成對照的是，在基于EIAV的載體中未觀察到顯著差異。這表明EIAV載體與HIV載體一樣都可有效地轉導非分裂細胞。載體基因組pONY2.10lacZ含有1377個核苷酸長的gag。使用RNA二級結構預測(“http://www.ibc.wustl.edu/～zuker/ma/”)鑒定gag前導序列和5’末端內可能的莖環結構。根據這些預測，在pONY2.10lacZ的gag區域進行4種缺失(圖1)。使用標準方法通過PCR誘變進行缺失。pONY2.1lacZ含有1377個核苷酸長的gag(從1901位核苷酸開始缺失)pONY2.11lacZ含有354個核苷酸長的gag(從878位核苷酸開始缺失)pONY2.12lacZ含有184個核苷酸長的gag(從708位核苷酸開始缺失)pONY2.13lacZ含有109個核苷酸長的gag(從633位核苷酸開始缺失)pONY2.14lacZ含有2個核苷酸長的gag(從526位核苷酸開始缺失)按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)在3質粒共轉染中使用這些載體，將產生的病毒滴定在293T細胞和D17細胞上。發現gag編碼序列的前109個核苷酸是除非翻譯區域外的最大包裝所需的；pONY2.13lacZ(表2)。在D17細胞上發現類似的滴度。圖4顯示出得自pONY2.13lacZRNA之gag序列的推測的二級結構。根據圖4中推測的二級結構，在pONY2.13lacZ的主要剪接供體密碼子的上游和下游區域內又進行了4種缺失。pONY2.21lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失pONY2.22lacZ含有第424至463位核苷酸的缺失pONY2.23lacZ含有第470至524位核苷酸的缺失pONY2.24lacZ含有第529至582位核苷酸的缺失pONY2.25lacZ含有第584至645位核苷酸的缺失pONY2.26lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失和第470至524位核苷酸的缺失按上述方法，在3質粒共轉染中使用這些載體，將產生的病毒滴定在D17細胞上。發現此區域的缺失嚴重影響病毒的滴度(表3)。構建體pONY2.23和2.26給出最低的滴度。它們都含有第470至524位核苷酸的缺失。最不嚴重的缺失是第409至421位核苷酸的缺失。根據這些數據，主要剪接供體周圍的區域對最佳包裝是有用的。可使用類似的二級結構預測和缺失分析來鑒定其它非靈長類動物慢病毒的包裝信號。表1．病毒載體的轉導效率<tablesid="table1"num="001"><table>載體包膜滴度(l.f.u./ml)aD17NIH3T3293TpONY2.1nlslacZ模擬＜1＜1＜1pONY2.1nlslacZpHIT456(MLVamp)1.0×1028.4×1022.0×104pONY2.1nlslacZpHIT123(MLVeco)＜11.5×104＜1pONY2.1nlslacZpRV67(VSVG)1.0×1053.6×1032.0×105pHIT111模擬＜1＜1＜1pHIT111pHIT456(MLVamp)1.3×1052.6×1062.0×107pHIT111pHIT123(MLVeco)＜12.8×106＜1pHIT111pRV67(VSVG)3.0×1062.0×1055.0×106</table></tables>a轉導了每種細胞類型，轉導靶細胞48小時之后，染色β-半乳糖苷酶活性。將3次獨立實驗的平均滴度計算為每ml的lacZ形成單位。實驗之間的誤差不超過10％。用EIAVgagpol表達質粒(pONY3)共轉染pONY2.1nlslacZ和包膜表達質粒。用MLVgagpol表達質粒(pHIT60)共轉染pHIT111和包膜表達質粒。表2<tablesid="table2"num="002"><table>載體基因組滴度(l.f.u./ml)pONY2.103.30E+04pONY2.111.60E+05pONY2.121.40E+05pONY2.131.70E+05pONY2.145.40E+02模擬1.0E+01</table></tables>表3<tablesid="table3"num="003"><table>載體基因組滴度(l.f.u./ml)2.211.20E+042.223.80E+032.231.20E+022.245.20E+022.255.60E+022.261.00E+022.134.00E+04</table></tables>實施例2-構建pEGASUS-1按下述制備基于EIAV的載體(pEGASUS-1)，其僅含有759個核苷酸長的EIAV序列(第268-675位核苷酸和第7942-8292位核苷酸)。通過PCR擴增，由pONY2.10LacZ得到包含EIAV多嘌呤序列片斷(PPT)和3’LTR的序列，所用引物為PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG和3’NEGSpeⅠ(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG。純化產物，用SpeⅠ(ACTAGT)消化，并連接至用SpeⅠ消化并用堿性磷酸酶處理而制備的pBSⅡKS+中。篩選轉化至大腸桿菌XL-1Blue之后得到的菌落中是否存在3’LTR，所述LTR的方向應使3’LTR的U5區域鄰近pBSⅡKS+接頭的NotⅠ位點。測定克隆插入物的序列，結果表明與EIAV克隆pSPEIAV19(ACU01866)相比，它僅含有一個變化，即R區域的堿基3和4之間的‘C’插入。在PCR反應所用的模板中也發現了相同變化。該克隆被稱為pBS.3’LTR。接著，將報道基因盒CMV啟動子/LacZ導入pBS.3’LTR的PstⅠ位點。CMV/LacZ盒為pONY2.10LacZ(見上文)的PstⅠ片斷。連接上述片斷，用連接物轉化大腸桿菌XL-1Blue。大量克隆中CMV/LacZ插入物的定向使得LacZ基因鄰近3’LTR，通過使用標準方法將其轉染至293T細胞系中來評估CMV/LacZ盒的活性。選擇轉染后48小時通過用X-gal顯色而呈現藍色細胞的克隆待用，并稱之為PBSCMVLacZ.3’LTR。在表達載體pCIEneo中構建EIAV載體的5’區域，pCIEneo是pCIneo(Promega)經修飾的衍生物，其另外包含上述完整CMV啟動子之5’末端的約400bp片斷。使用引物VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)，pHIT60為模板，通過PCR擴增得到該400bp的片斷。用BglⅡ和SpeⅠ消化產物，連接到已經過類似消化的pCIneo中。使用引物CMV5’EIAV2(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG)和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)，以？為模板DNA擴增從R區域至gag編碼區之第150位核苷酸(核苷酸268至675)的EIAV基因組片斷。引物CMV5’EIAV2的5’區域含有緊接CMV啟動子轉錄起始位點上游的序列，并可被SacⅠ切割。3’PSI.NEG與通過缺失分析(上文)限定的EIAV包裝序列的3’端結合，并含有XbaⅠ位點。用SacⅠ和XbaⅠ切下PCR產物，連接至為連接而制備的經相同酶消化的pCIEneo中。該操作將EIAVR區域的起點置于CMV啟動子的轉錄起始位點，如此產生的轉錄物從EIAV所用的真正的起始位置開始，并延伸至包裝信號的3’端。通過限制性分析評估正確的克隆，測定其序列，選擇被稱為pCIEneo.5’EIAV的克隆供進一步研究。接著，將pBS.CMVLacZ.3’LTR中的CMVLacZ和3’LTR盒導入pCIEneo.5’EIAV。用ApaⅠ消化pBS.CMVLacZ.3’LTR，用T4DNA聚合酶除去3’突出端，然后用NotⅠ消化。通過標準分子生物學技術純化含有CMVLacZ.3’LTR的片斷。用SalⅠ消化pCIEneo.5’EIAV，接著用T4DNA聚合酶補平5’突出端，籍此制備與上述片斷連接用的載體。然后用NotⅠ消化DNA，純化后用于連接反應。轉化大腸桿菌XL-1Blue之后，通過限制性分析篩選出存在插入物的菌落以鑒定出被稱為pEGASUS-1的所需克隆。使用實施例1所述的3質粒共轉染系統比較pEGASUS-1EIAV載體與pONY2.10LacZ的功能。得自兩個載體的滴度差不多，這表明pEGASUS-1含有以良好效率包裝所需的所有序列。實施例3-將RRE導入EIAV載體通過導入其它元件改善滴度對EIAV載體pEGASUS-1作進一步改進。方便導入所述元件的位點是SalⅠ位點，該位點位于包裝信號3’端XbaⅠ與pEGASUS-1之CMV/LacZ盒上游之間。例如，可將HIV或EIAV的RRE插入該位點。使用引物RRE(+)GTCGCTGAGGTCGACAAGGCAAAGAGAAGAG和RRE(-)GACCGGTACCGTCGACAAGGCACAGCAGTGG，通過PCR擴增由HIV-1分子克隆pWI3(Kimpton和Emerman1992，病毒學雜志，662232-2239)得到HIV-1RRE。用SalI消化DNA片斷和pEGASUS-1，連接后轉化大腸桿菌XL-1Blue。篩選存在HIVRRE的菌落，將含有正向或反向HIVRRE的兩個克隆用于進一步研究。通過進行4質粒共轉染在293T細胞中檢測載體pEGASUS-2.HIVRRE(+)或pEGASUS-2.HIVRRE(-)，其中表達HIV-1rev蛋白的質粒pCIneoHIVrev與載體pONY3和pRV67質粒共轉染。按下述通過PCR擴增得到文獻中限定(Martarano等，1994)的EIAVRRE。使用pONY2.10LacZ作為模板進行2次擴增，得到兩部分EIAVRRE。使用引物ERRE1(TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC)和ERRE2(GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG)得到5’元件，使用引物ERRE3(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)和引物ERRE4(AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG)得到3’元件。這些產物互相退火，因此可用于第二次PCR反應，得到‘編碼’EIAVRRE的DNA。前10輪循環不用引物ERRE1和ERRE4，然后在反應中加入這兩種引物再進行10輪擴增循環，籍此建立PCR擴增。用SalⅠ消化所得PCR產物和pEGASUS-1，連接后轉化大腸桿菌XL-1Blue。篩選含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于進一步研究。在4質粒共轉染中評估這些載體的活性，用SalⅠ消化pEGASUS-1，連接后轉化大腸桿菌XL-1Blue。篩選含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于進一步研究。在3質粒共轉染(EIAVrev由pONY3提供)或上述4質粒共轉染實驗(使用pCIneo.EIAVRev提供其它的EIAVrev)中評估這些載體的活性。為了構建pCIneo.EIAVREV，通過PCR擴增得到EIAVREV編碼序列。使用上述EIAVRRE所用的兩步“重疊”PCR擴增法得到EIAVREV序列。兩次反應的模板是pONY3，5’片斷的引物是EIAVREV5’O(CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGCAGAATCGAAG)和EIAVREVIN(CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)，3’產物的引物是EIAVREVIP(GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)和EIAV.REV3’O(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG)。10輪循環之后加入引物EIAVREV5’O和EIAV.REV3’O進行第二次PCR擴增。將所得產物與PCR片斷“TA”克隆載體pCR2.1(Invitrogen)連接，通過限制性酶分析評估EIAVREV插入物的方向，進一步證實了正確EIAVREV序列的存在。該構建體被稱為pTopoRevpos。通過用SpeⅠ和NotⅠ消化從pTopoRevpos中切下EIAVREV插入物，連接至已用NheⅠ和NotⅠ消化的pCIneo中。實施例4-轉導人巨噬細胞按下述從富含白細胞的血液(得自國立輸血機構，SouthmeadRdBristol,UK)中得到人原代單核細胞。根據廠商說明，通過在Ficoll不連續梯度(Pharmacia)上離心富集外周血單核細胞(PBMC)。將該細胞群體粘附至含有RPMI1640培養基(Dutch改良的；Sigma)的組織培養用塑料板上，從中得到巨噬細胞，所述培養基含有2％熱滅活人AB血清(Sigma)或10％FCS(Sigma)。用培養基充分洗滌培養板以除去未粘附的細胞。將3種質粒共轉染至293T細胞中可得到轉導實驗所用的病毒。實驗所用載體是pONY2.13衍生物，其中CMV/LacZ報道基因盒已被CMV/綠色熒光蛋白(GFP)取代。按下述制備載體pONY2.13GFP。用BglⅡ和XbaⅠ從pEGFP-N1(Clontech“http://www.clontech.com/”)中切下編碼紅移GFP的序列和真核翻譯信號，并連接至已用相同酶消化的通用克隆載體pSP72(Promega)中。然后使用XhoⅠ切下編碼GFP的序列，連接至已用XhoⅠ切割(籍此釋放LacZ編碼區)的pONY2.13中。轉化大腸桿菌XL-1Blue之后，通過限制性分析測定GFP插入物相對于CMV啟動子的方向能使表達按預期完成的克隆，通過將DNA轉染至293T細胞進一步證實GFP的表達。將3種質粒共轉染至293T細胞并在轉染后42-48小時收集回收載體將組織培養液流過0.45μm濾器進行過濾，4℃，用SW40Ti轉子，以50，000g(20Krpm)的轉速離心90分鐘以沉淀病毒。將病毒重新懸浮于50-100μl完全培養基中達2小時，再用于轉導實驗。按下述用pONY2.13GFP載體進行轉導用培養基將按5×105個細胞/孔的密度接種于48孔培養板的巨噬細胞洗滌1次，然后在細胞孔中再放300μl培養基。在培養基中加入病毒，緩慢吸放2至3次以確保混勻。轉導后3至5天評估轉導效率。使用熒光顯微鏡測定被轉導的巨噬細胞的數目。監測一段時間(例如幾周)內GFP的表達。或者，用攜有LacZ標記物的載體進行轉導。在該實驗中，通過使用免疫學方法檢測β-半乳糖苷酶的存在來評估轉導效率。實施例5-體內轉導EIAV載體至大鼠腦用含有1份Nembutal(0.1ml/35gm體重)，1份Novetal(0.1ml/35gm體重)和2份dH2O的溶液麻醉成年Wistar大鼠，并置于腦功能區定位儀中。沿著頭皮的腹側至尾側長度進行中線切開，將皮膚拉向一邊以露出顱骨。使用3.00mm后和3.00mm側的腦功能區定位坐標(由Bregma測定)，在顱骨中鉆一個直徑為1mm的孔。使用10μlHamilton注射器或1.0μl細玻璃毛細管單側皮質內注射EIAV載體至距腦表面不同深度處。將注射器在注射部位放5分鐘以防止回流。對照動物只接受用10μlHamilton注射器或1.0μl細玻璃毛細管皮質內注射的鹽水。然后縫合動物待其恢復。48小時之后，按上述將這些動物深度麻醉，用200ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)灌流心臟。然后解剖取出腦，在干冰制冷的異戊烷(-30℃)中冷凍，用低溫控制器在10μm處進行冠切割。將穿過注射位點和2mm腹側和尾側的每第5個切片集中到Super-Frost載玻片上，固定，用X-gal染色或進行免疫染色或用CresylViolet染色。實施例6-轉導在培養中分化的支氣管細胞上皮細胞可分化形成上皮樣單層，該單層顯示出(＞1000Ωcm3)電阻和骰狀形態。有多種方法可做到這一點，例如Fuller等，1984。這會產生極化細胞。該極性是功能性的，它模擬了體內上皮細胞。因此按實施例1至3所述，用載體和制品穿過基底外側表面或尖頂表面即可用EIAV載體轉導這些細胞。實施例7-基本EIAV系統為了消除輔助基因或具有有害作用的編碼序列對治療應用的風險，構建了缺乏tat，S2和dUTP酶的載體系統。構建S2突變體A)載體基因組pONY2.13lacZ含有gag的109個核苷酸(第633-4949位核苷酸缺失)(pONY2.13lacZ的描述見上文)。使用該載體制備EIAV載體基因組，通過缺失第5345-5397位的核苷酸從中消除了S2表達。除去了S2的ATG起始密碼子和env的起始密碼子。為了制備S2中的缺失，使用pONY2.13DNA為模板，用SY2/SY5和SY3/SY4進行PCR。收集這兩種PCR產物，用引物SY5和SY3進行PCR。將1.1kb的產物連接至pGEMT-easy(Promega)中以制備pGEMS2，測序以進一步證實缺失。通過用CelⅡ從pGEMS2中切下1.1kbS2區域并連接至pONY2.13lacZ中可制備pONY2.13lacZDS2。B)gagpol構建體將pONY3中S2的相同區域缺失以防止pONY3DS2和pONY2.13DS2之間的重組重建S2基因。使用pONY3DNA為模板，用SY1/SY2和SY3/SY4進行PCR擴增以制備pONY3DS2。收集這兩種PCR產物，用引物SY1和SY3進行PCR。將0.7kb的產物連接至pGEMT-easy(Promega)中以制備pGEMS22，測序以進一步證實缺失。通過用NotⅠ從pGEMS22中切下0.7kbS2編碼區域并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中可制備pBPCRS2。將pONY3(2.2kb)的EcoRV和NcoⅠ片斷插入已用EcoRV和NcoⅠ切割的pBPCRS2中可制備pBpONYS2。然后用EcoRV和CelⅡ進行切割(2.9kb片斷)并插入已用EcoRV和CelⅡ切割過的pONY3中以制備pONY3DS2。構建dUTP酶突變體通過將第4176位核苷酸由T定點誘變為A殘基可制備pONY3DdUTPase(Payne等，病毒學，210302-313)。該突變使天冬氨酸變為谷氨酸。使用PCR引物dUTPaseF和dUTPaseR，通過PCR擴增可實現該突變。模板DNA是pONY3。將PCR產物插入pGEMT-easy中，測序以進一步證實突變。所得載體為pGDdUTPase。用NotⅠ和EcoRV切割pONY3(4.6kb)并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中以制備pBEV。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，將0.4kb的帶插入用PacⅠ和PstⅠ切割過的pBEV中，所得載體被稱為pONY3pBDUTPase。經NotⅠ和EcoRV切割后(4.6kb)插入pONY3中以制備pONY3DdUTPase。構建S2和dUTP酶雙突變體為了制備pONY3的雙突變體，使用了構建體pBpONYS2。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，將片斷插入用PacⅠ和PstⅠ切割過的pBpONYS2中以制備構建體pS2DdUTPase。然后用EcoRV和CelⅡ切割并插入用EcoRV和CelⅡ切割過的pONY3中以制備pONY3DS2DdUTPase。分析S2和dUTP酶突變體按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，在3質粒共轉染的多種組合中使用pONY2.13lacZDS2，pONY3DdUTPase和pONY3DS2DdUTPase載體產生病毒，在處于分裂或非分裂狀態的293T和D17細胞上滴定產生的病毒。通過用蚜腸霉素處理(9)將細胞滯留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒載體轉導細胞(表4)。與未經處理的細胞相比，在經蚜腸霉素處理的細胞中，MLV載體的轉導效率要低4個數量級。MLV細胞轉導的不完全阻斷可能是分裂細胞小群體所致。與之形成對照的是，在基于EIAV的載體中未觀察到顯著差異。這表明基于EIAV的系統在生產或轉導時不需要S2或dUTP酶。Payne等(Payne等，病毒學，210302-313)和其他人已證明EIAVdUTP酶是感染馬巨噬細胞所必需的。這表示EIAV感染巨噬細胞的限制。通過轉導在基本培養基中培養7天的海馬胚胎第14天的神經元細胞以檢測S2和dUTP酶突變體的特性。多種EIAV載體之間沒有顯著差異。然而，MLV載體的轉導效率顯著降低。這表明S2和dUTP酶不是轉導生理學上非分裂細胞所必需的。簡單地說，我們得出結論對于載體生產或轉導而言，載體系統的任何部分都不需要tat，S2和dUTP酶。實施例8-添加Rev/RRE上文已描述了pEGASUS-1的構建。該載體含有759bp長的EIAV序列。當反式提供Rev時，將EIAVRRE(0.7kb)導入pEGASUS-1產生pEGASUS/RRE，導致滴度增加4倍(表2)。該載體目前含有1.47kbEIAV。實施例9-構建改良的gagpol表達質粒在pONY3中，gagpol編碼序列的起始位點之前有一段延伸的5’非翻譯區域。這一異常長的序列可能會使gagpol盒的表達受到損害。為了改良gagpol的表達，可修飾pONY3以除去其余的5’LTR。通過用NarⅠ和EcoRV切割pONY3可做到這一點。將2.4kb的片斷插入pBluescriptKS+(Stratagene)的ClaⅠ和EcoRV位點以制備構建體pBSpONY3.0。用XhoⅠ和EcoRV切割pBSpONY3.0，將2.4kb的片斷插入pONY3的XhoⅠ和EcoRV位點以制備pONY3.1。該操作除去了引物結合區域內5’LTR至NarⅠ位點這一段序列(386個核苷酸)。該構建體使滴度增加了2倍，蛋白質的表達也有所增加(圖10)。pONY3.1與pONY3類似，也編碼gag，gagpol，tat，S2和Rev。由于S2突變實驗證明S2不是生產系統或EIAV載體基因組所必需的，因此可以設計不含S2的gagpol表達構建體。產生了兩個這種構建體，即pHORSE和pHORSE3.1。使用pONY3為模板DNA，用EGAGP5’OUTER/EGAGPINNER3和EGAGP3’OUTER/EGAGPINNER5經PCR擴增制備pHORSE。純化這兩個PCR產物，集中并使用引物EGAGP5’OUTER/EGAGP3’OUTER再次進行擴增。將該產物插入pSP72的XhoⅠ和SalⅠ位點，制備出pSP72EIAVgagpol0’lap。用PvuⅡ和NcoⅠ切割pONY3，將4.3kb的片斷插入用PvuⅡ和NcoⅠ切割過的pSP72EIAVgagpolO’lap中，制備出pSPEGP。用XhoⅠ和SalⅠ切割該載體(4.7kb)并插入pCI-Neo的XhoⅠ和SalⅠ位點。該構建體被稱為pCIEGP。用SalⅠ切下pEGASUS中的RRE(0.7kb)，插入pCIEGP構建體的SalⅠ位點，制備出pHORSE。當在存在或缺乏pCI-Rev(表達EIAVRev開放閱讀框的構建體，見上文)時檢測pHORSE構建體的蛋白質表達時，發現它與預期的相同，對Rev有依賴性。然而，蛋白質表達水平低于pONY3.1。另外，當用于產生病毒時，滴度比pONY3.1的低100倍。出乎意料地是，當將pONY3.1的前導序列(含有從5’LTR之U5末端至gag383-524nt的ATG起始密碼子的序列)插入pHORSE，制備出pHORSE3.1時，蛋白質表達和病毒生產得以改善。通過用pONY3.1的1.6kbXhoⅠ/XbaⅠ片斷取代pHORSE中1.5kb的XhoⅠ/XbaⅠ片斷制備出pHORSE3.1。用pHORSE3.1得到的滴度類似于用pONY3.1得到的滴度。相對于pONY3.1而言，pHORSE3.1滴度略低的原因可能是用pHORSE3.1進行4質粒共轉染(因為該系統依賴于Rev)的需求所致。因此，我們得出結論基本的EIAV載體系統應具有該前導序列以使gagpol的表達水平最大化。當pHORSE3.1，pRV67，pCIRev和pEGASUS/RRE被用于4質粒共轉染時(表6)，產生了高滴度的病毒(2.0×104l.f.u./ml)。該系統缺乏Tat中負責Tat反式激活的第二個外顯子(Southgate等，病毒學雜志，1995，692605-2610)。這表明Tat不是基于EIAV的載體系統所必需的。通過對pHORSE3.1的骨架進行改造以表達Rev(用EIAVRev的開放閱讀框取代Neo開放閱讀框)可消除對4質粒共轉染的需求。通過用StuⅠ和BstⅪ切割pCI-Neo并用T4DNA聚合酶補平5’突出端即可做到這一點。籍此產生4.6kb的載體片斷，其中插入了得自pTopoRevpos的Rev開放閱讀框(用SacⅠ和XbaⅠ切割產生0.6kb的帶，其中使用T4DNA聚合酶補平5’突出端)。該載體被稱為pCREV。用XhoⅠ和NotⅠ從pHORSE3.1中切下包括RRE和前導序列的EIAVgagpol讀碼框(5.5kb)，插入pCREV的XhoⅠ和NotⅠ位點，得到pEGPR3.1。EIAVgagpol的密碼子最優化應消除gagpol蛋白質表達對RRE/Rev系統的依賴性。使用異源RNA輸出系統，如得自摩-傅猴病毒(MPMV)的組成型運輸元件(CTE)也可消除pEGASUS-1對Rev/RRE的需求(Bray等，PNAS，1994，911256-1260，Kim等，1998)。表4載體gagpolD17細胞上的比例滴度(l.f.u./ml)(非分裂細胞分裂細胞非分裂細胞/分裂細胞)S2+S2+,dUTPase+2.2×1051.1×1050.5S2-S2+,dUTPase+l.5×l051.3×1050.9S2-S2-,dUTPase+1.0×1051.2×1051.2S2-S2-,dUTPase-1.5×1051.6×1051.1S2+S2-,dUTPase+2.2×1052.3×1051.0S2+S2-,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0S2+S2+,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0MLV載體1.2×1076.7×1050.0006模擬實驗＜1＜11pONY2.10LacZ和pEGASUS+/-EIAVRRE的比較具有Rev的滴度高于pEGASUS-l的滴度，甚至在不舍RRE時也是如此，REV的作用可能由gagpol表達增強來體現。表6用pCI-Rev和pRV67對293T細胞進行轉染。將病毒滴定至D17細胞上。引物SY5ACCCCGTACGTCTTCCCGAGCG(下劃線的是SunⅠ)dUTPaseFGTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGAAGAAGGATATAC(下劃線的是PacⅠ)(黑體的堿基是由T至A的單堿基變化，該變化使dUTP酶滅活)dUTPaseRTCTTCTGCAGGTCCTGATCCTTGCTTAGTGC(下劃線的是PstⅠ)S2StopRGACCATGTTACCCCTTTACCATTAACTCCCTAATATCAAAC(黑體的堿基是由TATGG至TTAGG的變化，該變化除去了S2的起始密碼子)S2StopFGTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATCGCATTCTACGGGGGAATCC(黑體的堿基是由TATGG至TACGG的變化，該變化除去了S2的起始密碼子)EGAGP5’OUTERCCATGCACGTCTCGAGCCAGCATGGGAGACCCTTTGAC(下劃線的是XhoⅠ)EGAGP3’OUTERCGAGCTAGAGGTCGACTCAATTTGGTTTATTAGTAAC(下劃線的是SalⅠ)EGAGPINNER3GCAATGGAATGACATCCCTCAGCTGCCAGTCC(下劃線的是PvuⅡ)EGAGPINNER5GGGATGTCATTCCATTGCCACCATGGGAAGTATTTATCACTA(下劃線的是NcoⅠ)實施例10-pONY4載體系列為了避免在轉錄EIAV基因組時使用Tat并增加全長轉錄物的量，對pEGASUS載體(實施例2)而言可用HCMV增強子/啟動子取代EIAVU3(5’LTR)。質粒構建pONY2.11lacZ的gag中含有缺失，僅保留了373bp的gagORF。通過用pEGASUS-1的CMVLTR取代5’LTR可制備pONY4。用BglⅡ/XhoⅠ切割pEGASUS-1釋放出3.2kb片斷(含有CMVLTR)，將該片斷插入用BglⅡ/XhoⅠ切割的pSP72中。該構建體被稱為pSPPEG213。用HpaⅠ/NarⅠ切割該構建體，將1.3kb的片斷(包含CMVLTR)插入用NaeⅠ/NarⅠ切割的pONY2.11lacZ中。pONY4.1在lacZ基因下游(SfuⅠ和SalⅠ位點之間)含有缺失(2.1kb)，使得tat,S2,env,rev和RRE或者缺失或者被大大截短(圖11c)。通過用SfuⅠ/SalⅠ切割，用Klenow聚合酶使之成為平端并進行再連接可制備出pONY4.1。通過用pEGFP-N1(Clontech)的GFP基因平端片斷(BamHⅠ/XbaⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成為平端)取代pONY4的lacZ基因(SacⅡ/KpnⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成為平端)可制備pONY4G。載體的產生和檢測用16微克載體質粒，16微克gagpol質粒和8微克包膜質粒，通過磷酸鈣法轉染鋪于10cm培養皿中的人腎293T細胞以產生載體原種。轉染36-48小時之后，過濾(0.45μm)上清液，等分成小份，儲存于-70℃。4℃，以20000rpm超速離心(SW40Ti轉子)90分鐘以制備濃縮的載體制品。將病毒重新懸浮于PBS中達3-4小時，等分成小份，儲存于-70℃。在8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的存在下進行轉導。始終可觀察到pONY2.11lacZ產生的滴度比較少缺失的pONY2.10lacZ產生的滴度約高2至4倍。對pONY4而言，當其5’LTR中的U3被CMV增強子/啟動子取代時，滴度又增加了5至10倍。實施例11-EIAV“自我-滅活”的載體(SIN-載體)LTR中的元件會影響得自EIAV載體的轉基因在特定細胞類型中的表達。為了除去該元件，可構建SIN(自我滅活的)載體，然而，有效產生載體所必需的某些序列必須維持，這一需求影響到該載體的精確構型(分子細胞生物學，1996，Sep；16(9)4952-5l)。RNA結構是通過裂解和聚腺苷酸化特異性因子進行poly(A)位點識別的決定因素，GraveleyBR,FlemingES,GilmartinGM，病毒學雜志，1996，Mar；70(3)1612-7，兩個不大相關的慢病毒中通過U3序列增強mRNA3’加工的共有機制，GraveleyBR,GilmartinGM。另外，SIN載體提供了避免在轉導細胞中產生全長轉錄物的途徑。制備了兩個SIN載體一個含有推定的重要序列(用于聚腺苷酸化)，該序列位于MluⅠ和MunⅠ位點之間，另一個中缺失了所述序列。缺失的5’邊界是距3’LTR之U3區域的5’末端112個堿基處。圖12中示出了兩個SIN載體的結構。pONY4G.SIN-MLU和pONY4G.SIN-MUN載體中存在的缺失以破折線表示，引物以斜體表示。使用pONY4G為模板，經聚合酶鏈反應擴增得到核苷酸7300至8079(根據登記號為U01866的EIAV克隆pSPEAIV19計數)之間的DNA序列。擴增的有義引物為ERRE3，反義引物為SIN-MLU(C7143GTCGAGCACGCGTTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑體為MluⅠ位點)或SIN-MUN(C7142GTCGAGCCAATTGTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑體為MunⅠ位點)，其中下劃線序列與(pSPEIAV19)的核苷酸8058-8079互補。分別用NspⅤ和MluⅠ或MunⅠ消化PCR產物，然后連接至分別用NspⅤ(SfuⅠ)和MluⅠ(部分消化)或MunⅠ消化過的pONY4G中。實施例12-具有反向構型內部啟動子-報道基因盒的EIAV載體在如pONY4Z或pONY4G的EIAV載體中，內部CMV-報道基因盒的定向使自5’LTR和內部啟動子的轉錄方向相同，在兩個啟動子的轉錄物中使用了3’LTR的聚腺苷酸化信號。通過調轉內部啟動子-報道基因盒的方向得到另一種構型，然而，聚腺苷酸化信號必需置于盒的下游。按下述制備一例“反向”載體。用PstⅠ消化pONY4Z，用T4DNA聚合酶補平突出的末端。將其用作“載體”片斷與pEGFP-C1的MluⅠ/AseⅠ片斷(含有包括CMV-GFP-SV40早期mRNApolyA信號盒的序列)進行連接。連接前，用T4DNA聚合酶使該片斷成為平端。載體編碼質粒被稱為pONY4Greverse。通過與分別表達EIAVgag/pol和VSV-G蛋白的pONY3.1和pRV67共轉染，從pONY4Greverse中回收載體顆粒。pONY4Greverse對D17犬細胞的滴度比平行回收的pONY4G載體低13倍。pONY4Greverse的滴度較低可能是驅動基因組轉錄的CMV啟動子和GFP相互之間的干擾所致，然而，插入的CMV-GFP-polyA盒中存在的得自SV40的聚腺苷酸化信號對基因組RNA的截短作用也是一個原因。通過用牛生長激素聚腺苷酸化(BGHpA)信號取代pONY4Greverse的聚腺苷酸化信號可制備改良載體。為了進行這種改良，用BstAPⅠ消化pONY4Greverse，用T4DNA聚合酶使其成為平端，用PstⅠ進行切割。將該“載體”片斷與代表BGHpA的DNA片斷連接，后一片斷的制備方法如下用SphⅠ消化pcDNA3.1+(Invitrogen)，然后用T4DNA聚合酶使其成為平端，再用PstⅠ進行切割。實施例13-構建并使用含有內含子的polyA信號在本文所述的pONY載體中，所用聚腺苷酸化信號得自EIAV，其位于3’LTR的R和U5邊界。該信號可能不是最優化的，因為它們不是共有序列(見Whitelaw和Proudfoot，1986EMBO5；2915-2922和Levitt等，1989，Gen.andDev.3；1019-1025，其中描述了聚腺苷酸化信號的共有序列)。改良病毒聚腺苷酸化的一個方法是用共有的/強聚腺苷酸化信號的polyA取代3’LTRpolyA信號。通過這種方法，使生產細胞中的信號最優化。然而，轉導后丟失了該信號，因為在復制過程中，5’LTR是polyA信號的來源(見逆轉錄病毒1998CSH出版社(J.Coffin編)，有關逆轉錄病毒生命周期的綜述)。解決這一問題(轉導后沒有強的聚腺苷酸化信號)的新方法是以下列詳細描述的方式導入polyA信號該方法使用“割裂的polyA信號”，其中通過內含子將aataaa基元與必需的g/u盒分開。Liu等人(1993N.A.R.21；5256-5263)以前使用過該信號，他們闡明aataaa和g/u盒之間的大缺口會使polyA信號失去功能，聚腺苷酸化過程先于剪接。通過將割裂的polyA信號置于逆轉錄病毒載體中，該信號在轉導靶細胞之前不再起作用。這是因為聚腺苷酸化先于剪接，因此生產細胞中的載體表達過程中不使用上游割裂的polyA信號。圖13圖示了含有割裂的polyA信號的逆轉錄病毒載體在生產和轉導細胞中是如何起作用的。首先，該圖闡明盡管存在上游共有的聚腺苷酸化信號，但必要時使用病毒或其它polyA信號仍可使原始載體轉錄物平常的3’LTR聚腺苷酸化。這是因為盡管上游polyA信號在最終的載體基因組中是有功能的，但聚腺苷酸化機器并沒有讀出該信號，因為該信號只在除去內含子時產生，而并不存在于主要的RNA轉錄物中。第二，該圖闡明通過轉導，所得載體轉錄物在第一信號處被聚腺苷酸化；該信號已成為正常的強的聚腺苷酸化信號，而沒有內含子將必需的aataaa和g/u盒分開。在逆轉錄病毒載體中包含這種割裂的polyA信號有下列很多優點(1)在轉導細胞內使用強的不基于病毒的聚腺苷酸化信號會增強所述細胞中的基因表達。(2)使用基于天然LTR(見圖13)之信號上游的polyA信號，轉導后會產生較短的在其3’端含有較少病毒序列的RNA轉錄物，因此不能進行隨后的逆轉錄病毒的逆轉錄。實際上，如果目的基因由內部啟動子(如CMV)而不是LTR表達，轉導細胞中表達所得的轉錄物可被設計成根本不含病毒序列(見圖13A)。(3)包含3’LTR上游信號意味著割裂polyA信號下游RNA的表達僅限于生產細胞，因為轉導細胞中不轉錄這種RNA。因此將某些序列的表達(如IRESneo；見圖14B)限于生產細胞。(4)生產細胞中內含子的存在將有助于載體RNA由核輸出。(5)由于轉導后存在內部功能性的polyA信號，因此必要時可除去/缺失5’LTR中的病毒polyA信號(逆轉錄過程中為3’位置的拷貝)。這么做的用途是防止生產細胞中自5’LTR啟動子-近側的聚腺苷酸化過程(見Scott和Imperiale1997(分子細胞生物學，172127-35))，因此促進病毒全長轉錄物的產生。實例為了闡明該信號在逆轉錄病毒中的用途；按圖15所述構建“割裂的polyA信號”盒；其中內含子序列得自pCI(Promega)。制備好以后，使用與pONY4-GFP(圖16)唯一的sse8387位點相容的PstⅠ將該盒克隆至pONY4GFP載體中。轉導后，所得載體的3’LTR之前被聚腺苷酸化，因此3’至lacZ的病毒RNA不能被轉錄(圖16)。實施例14-構建MLV/EIAV載體通過用MLV等同物取代EIAVLTR序列，pONY載體的重復區域(R)內不再具有功能性的tar元件，結果，U3啟動子不需要轉導細胞中的Tat即可行使功能。圖17描述的是用圖18所述引物經重疊PCR制備載體的過程。使用引物Me1和Me2由MLV載體pHIT111(Soneoka等，1995，NAR23628-633)擴增PCR產物，而使用引物Me3和Me4由pONY4lacZ擴增產物。然后在無引物的PCR反應中將所得的兩個產物混合以重疊它們(圖17的陰影部分顯示出兩個產物之間的同源性)。用BglⅡ和XbaⅠ切割最終的全長產物，并用于取代pONY4lacZ(含有CMV/R/U5)的Bgl1-XbaⅠ片斷，制備出pONY4-5’MLV。所得載體具有得自MLV的CMV/R/U5序列，該序列與EIAVU5序列(整合前由整合酶進行基因組識別所需的序列)相連。下一步包括用引物Me5和Me6由pONY4LacZ模板進行PCR擴增和用引物Me7和Me8由pLXSN模板(Miller和Rosman1989生物技術7980-990)進行PCR擴增。然后通過無引物的PCR重疊這兩個PCR產物(引物之間的同源性由開口的框表示)，用NspⅤ和MunⅠ切割所得片斷，插入pONY4-5’MLV的NspⅤ-MunⅠ位點；從而用與pONY4lacZ之3’UTR/ppt/U3整合酶結合位點融合的3’MLVLTR取代3’EIAVLTR。所得質粒被稱為pONY-MOUSE(見圖19完整的DNA序列)，當在HIT系統中與pONY3.1和pRV67聯合時，滴度為104-5/ml。實施例15-驅動慢病毒載體基因組的早期啟動子在此實施例中，EIAV基因組由痘苗病毒早期啟動子P7.5E(Davison1989a)表達。啟動子經改造后可產生具有正確5’RNA末端的EIAV基因組。另外，還將痘苗病毒早期終止序列插入EIAV基因組的下游。將所得產物插入轉移質粒pSC65，它可同源重組至MVA基因組的TK區域。通過其缺乏對BudR的敏感性這一特征來選擇重組病毒(Earl等，1998)。圖11圖示說明了實施例10所述的EIAV基因組載體pONY4.0和pONY4.1以及痘苗病毒轉移載體pSC65(Chakrabarti等，1997)。P7.5E序列是AAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATT。早期啟動子的早期終止序列是TTTTTNT(N=任何核苷酸)(Fields)。按下述進行DNA操作，圖20和21給出了PCR引物的序列。引物為EMVA1/2的PCR產生了U3區域被P7.5E啟動子取代的5’LTR。使用HindⅢ/PstⅠ位點將其插入質粒pSP72(Promega)以制備pEMVA1。EIAVU3含有與痘苗病毒早期終止規則相匹配的序列(TTTTTAT)。使用引物EMVA3/4和EMVA5/6和重疊PCR，將該區域突變為TTTCCAT以防止早期終止。使用BglⅡ/PstⅠ位點將該PCR產物插入pEMVA1，產生pEMVA2。使用引物EMVA7/8將終止序列(TTTTTTTTT)插入3’LTRR區域的下游。使用MunⅠ/BglⅡ位點將該PCR產物插入pEMVA2得到pEMVA3。經由NarⅠ/NspⅤ位點將EIAV載體基因組的其余部分(pONY4)插入該質粒得到pEMVA4(圖22)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割，插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，得到pEPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖23)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA4，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA5(圖24)。這樣就除去了lacZ基因末端和末端包膜區域之間的很多序列，因此該載體不含Tat，Rev，S2和Env。相關描述見實施例10。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，制備出pEPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖24)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。使用BHKTK-ve細胞系(ECACC85011423)和構建重組痘病毒的標準方法(Earl等，1998a&1998b)，pEPONY4.0和pEPONY4.1都適于將基因組表達盒插入MVA基因組的TK區域(CarrollMW和MossB病毒學1997Nov24；238(2)198-211)。實施例16-驅動慢病毒載體基因組的合成的早期/晚期啟動子痘苗病毒合成的早期/晚期啟動子對RNA起始位點的下游序列是有要求的(Davison1989b)。為此，用于產生逆轉錄病毒基因組的啟動子要么R區域被修飾，要么使用核酶產生正確的5’末端。修飾R區域是困難的，因為起始位點還未全部被鑒定，其序列也有差異(Davison1989b)。下文描述了由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)表達EIAV基因組的轉移質粒的產生。啟動子的下游插入了核酶以確保產生正確的RNA5’末端。該構建體還含有早期終止序列。DNA操作如下引物為EMVA9/1的PCR產生了U3區域被Psyn啟動子和錘頭核酶取代的5’LTR(圖25和26)。使用PacⅠ/NarⅠ位點將其插入質粒pEMVA4(實施例15)，制備出pEMVA6(圖27)。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，制備出pSynPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖27)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA6，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA7(圖28)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉移載體)中，制備出pSynPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖28)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。用構建重組痘病毒的標準方法(Earl等，1998a&1998b)，pSynPONY4.0和pSynPONY4.1都適于將基因組表達盒插入MVA基因組的TK區域(CarrollMW和MossB病毒學1997Nov24；238(2)198-211)。實施例17-驅動慢病毒載體基因組的T7啟動子可使用T7啟動子產生逆轉錄病毒基因組，其可制備出正確的5’末端。下文描述了由T7啟動子(T7)表達EIAV基因組的轉移質粒的產生。還將T7終止序列插入該啟動子的下游。將所得產物插入轉移質粒pSC65，它可同源重組至MVA基因組的TK區域。T7啟動子需要T7聚合酶，可以使用由痘苗病毒啟動子表達T7聚合酶的MVA病毒(Wyatt等，1995)。T7啟動子具有序列(-)TAATACGACTCACTATAGG(+2)，轉錄自A之后開始，優選自連續幾個G開始。T7終止序列是CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。T7啟動子和終止序列描述于質粒pCITE-4a(+)(Novagen)中。DNA操作如下引物為EMVA10/11的PCR(圖29)產生了U3區域被T7啟動子取代的5’LTR。使用PacⅠ/NarⅠ位點將其插入質粒pEMVA4，制備出pEMVA8(圖30)。引物為EMVA11/7的PCR產生了具有T7終止序列的3’LTR部分，使用MunⅠ/BglⅡ位點將其插入pEMVA8以制備pEMVA9。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉移載體)中，制備出pT7PONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖30)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA9，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA10(圖31)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉移載體)中，制備出pT7PONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖31)。這樣就除去了兩個痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。用構建重組痘病毒的標準方法(Earl等，1998a&1998b)，pT7PONY4.0和pT7PONY4.1都適于將基因組表達盒插入MVA基因組的TK區域(CarrollMW和MossB病毒學1997Nov24；238(2)198-211)。實施例18-構建EIAVgag/pol盒以在痘苗病毒中表達EIAVgag/pol的表達一般需要Rev/RRE，因為Rev能使未剪接的轉錄物輸出至核外。由于痘病毒位于胞質中，因此EIAV病毒RNA的輸出應該不成問題。但是，如果Rev具有其它功能，例如可維持RNA穩定性或作為翻譯增強子起作用，可以類似的方式將其表達為EIAVgag/pol(Martarano1994)。或者，可使EIAVgag/pol序列的密碼子最優化以克服輸出的Rev/RRE需求并增強RNA的穩定性。下文描述了由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)表達EIAVgag/pol的載體的產生。將其插入轉移質粒pLW-22(Wyatt和Moss附錄1，Earl等1998a&b)，它可同源重組至MVA基因組的DelⅡ區域。通過其表達的lacZ來選擇重組病毒。用XhoⅠ/NotⅠ切割pHORSE3.1(實施例9)給出5.5kb的帶，從而得到包括前導序列和gag/pol開放閱讀框和RRE的EIAVgag/pol(圖32)。然后將其插入用SalⅠ/NotⅠ(SalⅠ和XhoⅠ相容)切割的痘苗病毒轉移載體pLW-22中，制備出pLWHORSE3.1(圖32)。實施例19-構建EIAVrev盒以在痘苗病毒中表達如果由痘病毒產生EIAV病毒載體需要Rev，可由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)進行表達。將該構建體插入轉移質粒pMCO3，它可同源重組至MVA基因組的DelⅢ區域。通過其表達的GUS來選擇重組病毒(Carroll等，1995)。DNA操作如下質粒pCIRev描述于實施例9。該質粒是EIAVRev表達質粒。用AflⅡ/NotⅠ切割(0.6kb)，通過T4DNA聚合酶使其成為平端，插入用PmeⅠ切割的pMCO3(Carroll等，1995)中，得到pMCRev(圖33)。實施例20-構建異源包膜盒以在痘苗病毒中表達EIAV可以是具有多種包膜，如VSV-G和兼嗜性MLV包膜的假型病毒。下文描述了由P7.5早期/晚期啟動子表達兼嗜性包膜或VSV-G包膜的MVA轉移載體的產生。轉移載體是pYF6，它可同源重組至MVA的HA區域。通過直接對env的表達進行活免疫染色可選擇重組病毒。為了產生含有VSV-G盒的轉移載體，用SmaⅠ/EcoRⅤ切割VSV-G表達質粒pRV67(Kim等，1998)(1.7kb)，將所得片斷插入用SmaⅠ切割的pYF6中，制備出pYFVSVG(圖34)。類似地，為了產生類似的兼嗜性包膜構建體，用XbaⅠ切割pHIT456(Soneoka1995)，用T4DNA聚合酶使2.2kb的帶成為平端，插入用SmaⅠ切割的pYF6中，得到pYFAmpho(圖35)。用構建重組痘病毒的標準方法(Earl等，1998a&1998b)，pYFAmpho和pYFVSVG都適于將基因組表達盒插入MVA基因組的HA區域(CarrollMW和MossB病毒學1997Nov24；238(2)198-211)。實施例21-構建和擴增MVA-Lenti重組體通過依次與相關轉移質粒重組，構建出重組痘苗病毒，所述病毒含有多個編碼EIAV載體成分的插入物(圖25)。下文例舉了v.MEeG-Or的構建(圖36)1．用攜有gag-pol的質粒(pLWHORSE3.1)轉染BHK-21或CEF細胞，所述細胞以前曾被MVA感染過(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)。2．感染2天后，在BHK-21/CEF上檢測重組MVA病毒，在細胞上覆蓋一層瓊脂培養基，其中含有由pLW22表達的顏色標記β-半乳糖苷酶的底物(Chakrabarti等，1985)。3．挑選藍色噬斑，進行噬斑純化直至得到均一的重組病毒群體。4．然后用重組病毒與含有其它重組基因的轉移質粒重組pMCRev，其中基于GUS表達進行選擇(Carroll和Moss1995)，基因組(pEPONY4.0)，其中使用BudR基于TK陰性表型進行選擇(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)和VSVG(pYFVSVG)，其中通過直接免疫染色VSVG來鑒定重組體(Earl等1998a&b)。按下述在BHK-21或CEF細胞中擴增重組病毒增殖痘苗病毒高度減毒的毒株MVA衍生自有復制能力的毒株Ankara，并且在原代的雞胚成纖維細胞中經過570次傳代。起初認為MVA復制局限于CEF細胞，因為哺乳動物細胞中的復制極少見報道。然而，進一步的分析表明倉鼠幼腎細胞(BHK-21)能支持高滴度的MVA產生。因此，MVA可在BHK-21或原代CEF細胞上生長(Carroll和Moss1997，病毒學238198-211)。為了制備CEF細胞，取出10天齡雞胚的內臟，除去四肢和頭，鉸碎，在0.25％胰蛋白酶溶液中進行消化并于37℃保溫。將細胞懸浮液流過一層過濾篩以進行過濾，洗滌細胞，在SorvallRC-3B中以2000rpm的轉速離心5分鐘使細胞濃縮。將細胞懸浮于含有10％FCS的MEM中，等分至175cm培養瓶中，37℃在CO2溫箱中保溫。當細胞單層95％鋪滿時，用胰蛋白酶進行消化，用于接種另一培養瓶或6孔培養板。或者，將原代培養物轉移至31℃的溫箱中待用(Sutter和Moss(1992)ProcNatlAcadSciUSA8910847-1085l)。制備粗的，半純化的和純化的病毒原種粗的病毒原種可用于初步的重組病毒分析或作為病毒原種用于隨后的高滴度病毒的制備。通過離心出細胞膜和核或通過防止預表達的重組蛋白產物和細胞器污染的其它步驟(包括蔗糖離心)可對痘苗病毒制品進行半純化。所用方法為Earl等1998a&b；Earl和Moss，文獻同上，pp.16.17.1-16.17.16；Earl和Moss，文獻同上，pp.16.18.1-16.18.10；和Bronte等(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(7)3183-3188所述方法的改良方法。粗病毒在CEF或BHK-21(得自ATCC)中培養MVA，在175cm2組織培養瓶中，在HeLa或BS-C-1(ATCC)中培養WR。簡單地說，用感染復數約為1pfu的MVA或WR感染鋪滿的細胞單層。將病毒懸浮于10ml含有2％FCS的MEM中，并加入含有鋪滿的細胞單層的175cm2組織培養瓶中。37℃接種1小時之后，再加入20ml含有2％FCS的MEM。48至72小時之后，將感染的細胞刮到培養基中，1500g沉淀5分鐘。為了制備粗病毒，將細胞重新懸浮于每個175cm2組織培養瓶中的2mlMEM(2％)中。將細胞凍融3次，超聲處理，等分至1ml冷凍管中。凍融代表性的等分試樣，滴定以測定病毒濃度。將病毒原種儲存于-20℃以下。半純化的制品按上述收集感染細胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)。離心后將細胞重新懸浮于PBS(2ml/175cm2培養瓶)中，在冰上，在適當密封的玻璃dounce勻漿器中經30至40次摩擦以勻漿細胞。通過顯微鏡檢查細胞破裂情況。300g離心5分鐘(4℃)以除去核，細胞器和膜，保留上清液。將細胞沉淀物重新懸浮于1ml/175cm2培養瓶中，再次離心。收集上清液，等分后冷藏。純化的制品按上述收集感染細胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)，重新懸浮于10mMTris.Cl,pH9.0(2ml/175cm2培養瓶)中，從此將樣品置于冰上。按上述使用10mMTris進行勻漿。使用XL2015超聲杯(Misonics,USA)，以最大輸出量(500W)超聲處理裂解物1分鐘(在冰上)。將樣品置于冰上1分鐘，重復超聲處理3次。每次最多超聲處理5ml樣品，超聲處理過程中要加冰。將裂解物小心地鋪在SW-27離心管中的17ml36％蔗糖(溶于10mMTris.Cl,pH9.0)墊層上。4℃，用SW-27轉子，以13500rpm(32，900×g)的轉速將裂解物離心80分鐘。棄去上清液，將病毒沉淀物重新懸浮于無菌的PBS中，在超聲杯中超聲處理1分鐘(在冰上)。等分濃縮的病毒并儲存于-20℃以下。實施例22-由MVA-EIAV雜合體產生EIAV載體顆粒如上所述大規模制備重組MVA-EIAV制品。使用這些制品感染不允許MVA進入的哺乳動物細胞以使所得上清液僅含有EIAV和非感染性的MVA(Meyer等，1991，Carroll和Moss1997)。適當的細胞系是MRC5(ATCC)。以3為感染復數感染細胞。感染可進行48小時左右，然后收集上清液，EIAV載體顆粒可直接使用或通過超速離心或交叉-流動法進行濃縮/純化。為了大規模生產制品，可在懸浮液中或在微載體上或在滾動瓶中進行培養。按此方法制備的攜有目的基因的EIAV載體可用于在體內或體外轉導靶細胞。參考文獻Blomer.U..Naldini,L..Kafri.T_Trono,D_Verma,I.M_andGage,F.H.(1997).用慢病毒載體在成年神經元中進行高效和持續基因轉移，病毒學雜志，71，6641-6649。Blomer,U_Naldini.L_Verma,I.M_Trono,D_andGage,F.H.(1996).將基因療法應用于GNS，人類分子遺傳學，5SpecNo,1397-404。Clever,J_Sassetti,C_andParslow.T.G.(1995)。人免疫缺損病毒1型5’包裝信號的RNA二級結構和針對gag基因產物的結合位點，病毒學雜志，69，2101-9。Clever.J.L..andParslow,T.G.(1997)。RNA二聚體化或衣殼化有缺陷的突變的人免疫缺損病毒1型基因組，病毒學雜志，71，3407-14。Fields,B.N_Knipe,D.M_andHowley,P.M.(1996).FieldsVirology,R.M.Chanock,J.L.Melnick,T.P.Monath,B.RoizmanandS.E.Straus.編.(philadelphia.NewYork:Lippincott-RavenPublishers).FullerS.vonBonsdorffCH,SimonsK.水泡性口炎病毒僅通過極化上皮細胞系MDCK的基底層表面感染和成熟，細胞，1984Aug;38(1)65-77Harrison,G.S_Long,c.J_Maxwell,F_Glode,L.M..andMaxwell,I.H.(1992).在含有整合的，受HIV-調節的白喉毒素A鏈基因的細胞中抑制HIV的產生，愛滋病研究和人逆轉錄病毒，8，39-45。HayashiT,ShiodaT,IwakuraY.ShibutaH.人免疫缺損病毒1型的RNA包裝信號，病毒學，1992Jun;188(2)590-599KimV.N_MitrophanousK_KingsmanS.M_KingsmanA.J.1998.基于人免疫缺損病毒1型的慢病毒載體的基本需求，病毒學雜志，199872811-6.Kim,S.Y_R.Bym,J.Groopman,andD.Baltimore.1989.人免疫缺損病毒感染過程中DNA和RNA合成的時序特征差異基因表達的證據，病毒學雜志，633708-3713。Lewis,P.F..andM.EmerD18n.1994.通過有絲分裂傳代是致癌逆轉錄病毒而不是人免疫缺損病毒所必需的，病毒學雜志，68510-6。MannR,MulliganRC,BaltimoreD.逆轉錄病毒包裝突變體的構建及其產生無輔助病毒的缺損逆轉錄病毒的用途，細胞，1983May；33(1)lS3-lS9Martarano,L_Stephens,R_Rice,N..andDerse,D.(1994).馬傳染性貧血病毒反式調節蛋白Rev控制病毒mRNA的穩定性，累積和其它的剪接方式，病毒學雜志，68，3102-11。Naldini,L_Blomer,U..Gage,F.H_Trono,D_andVerma,IM.(1996).注射了慢病毒載體的成年大鼠腦中轉基因的有效轉移，整合和持續的長期表達，ProcNatlAcidSciUSA93.11382-11388.Naldini,L..Blomer,U_Gallay.P..Ory.D_Mulligan.R_Gage,F.H_Verma,IM_andTrono.D.(1996).通過慢病毒載體進行體內基因傳遞并穩定轉導非分裂細胞(見評論)，科學272.263-7.Payne,S.L..Rausch.J_Rushlow.K.Montelaro,R.C..Issel,C..Flaherty.M_Perry,S_Sellon,D_andFuller,F.(1994).鑒定馬傳染性貧血病毒的傳染性分子克隆，普通病毒學雜志，75，425-9。Yee,1.-K_M.Atsushi,P.LaPorte.K.Bouic.J.C.Burns.andT.Friedmann(1994)產生高滴度泛嗜性逆轉錄病毒載體的一般方法高效感染原代肝細胞，Proc.Nlt1.Acad.Sci.USA919564-9568。Zufferey,R_Nagy.D_Mandel.R.1..Naldini,L_andTrono.D.(1997).多重減毒的慢病毒載體獲得有效的體內基因傳遞，NatBiotechnol15，871-875。Cannon1996病毒學雜志，1996708234-40.基于鼠白血病病毒的Tat可誘導的長末端重復取代載體抗人免疫缺損病毒基因療法所用的新系統，CannonPM,KimN,KingsmanSM,KingsmanAJ.CarrollMW,MossB大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GUS)用作重組痘苗病毒的標記，生物技術199519352-4CarrollMW.MossB痘苗病毒高度減毒的MVA毒株的宿主范圍和細胞病理學重組病毒在非人哺乳動物細胞系中的增殖和產生，病毒學，1991238198-211ChakrabartiS,BrechlingK,MossB痘苗病毒表達載體β-半乳糖苷酶的共表達能可見地篩選重組病毒噬斑，分子細胞生物學，1985123403-9ChakrabartiS,SislerJR,MossB生物技術199761094-7用于蛋白質表達的嚴密的，合成的痘苗病毒早期/晚期啟動子Davison1989a，分子生物學雜志，198920；210(4)749-69。痘苗病毒早期啟動子的結構，DavisonAJ,MossBDavison1989b分子生物學雜志，1989210(4)771-84.痘苗病毒晚期啟動子的結構，DavisonAJ,MossBPL.Earl(a).N.Cooper，LSWyatt,B.Moss&M.W.Carroll1998制備細胞培養物和痘苗病毒原種，分子生物學最新方法增刊，43Unit16.16.IohnWileyandSonsInc.PL.Earl(b),B.MossL.S.Wyatt,&M.W.Carroll1998產生重組痘苗病毒，分子生物學最新方法增刊43Unit16.17.分子生物學最新方法，JohnWileyandSonsInc.FlexnerC.HuginA.MossB自然1987330(614S)259-62通過載體介導的IL-2表達防止痘苗病毒感染免疫缺損小鼠HolzerGW,FalknerFG通過互補細胞系構建必需的DNA修復酶尿嘧啶DNA糖基化酶缺損的痘苗病毒，病毒學雜志，1997714997-5002KimVN,MitrophanousK,KingsmanSM,KingsmanAJ基于人免疫缺損病毒1型的慢病毒載體的基本需求，病毒學雜志，199872811-6MackettM,SmithOL,MossB痘苗病毒可選擇的真核克隆和表達載體，ProcNatlAcadSciUSA198279237415-9MahnelH,MayrABerlMunchTierarJ.tlWochenschr1994Aug；107(8)253-6[使用疫苗株MVA進行抗人和動物正痘病毒之免疫的經驗].[德文]ZenlralblBakteriol[B]1978Dec；167{5-6)375-90MartaranoL.StephensR,RiceN.DerseD馬傳染性貧血病毒反式調節蛋白Rev控制病毒mRNA的穩定性，累積和其它的剪接方式，病毒學雜志，1994May；68(5)3102-11MayrA.SticklH,MullerHK,DannerK,SingerH[天花免疫接種株MVA標記、遺傳結構、親代接種的經驗以及具有主動防御機制的生物體的行為].ZentralbJBakteriol[B].1978Dec；167(5-6)375-90。德文。MeyerH,SutterO,MayrA高度減毒的痘苗病毒MVA基因組中缺失的圖譜及其對毒力的影響，普通病毒學雜志，1991721031-8MossB痘病毒科病毒及其復制Chapter83.p2637-2672.InFields,B.N_Knipe,D.M.&HowJey,P.M.FieldsVirology.第3版，ednVol.2edsChanock,R..M..Melnick,J.L,Monath,T.P..R.oiZman.B.&Straus,S.E.Lippincott-RavenPublishers.Philadelphia.NewYork,1996MossB,CarrollMW,WyattLS,BenninkJR,HirschVM,OoldsteinS,ElkinsWR,FuerstTR,Lifsonm.PiatakM,RestifoNP,OverwijkW.ChamberlainR,RosenbergSA,SutterG,宿主范圍受限的，非復制痘苗病毒載體用作候選疫苗，AdvExpMedBioi1996；3977-13PanicaliD.PaolettiE構建痘病毒作為克隆載體將單純皰疹病毒的胸苷激酶基因插入傳染性痘苗病毒的DNA中ProcNatlAcadSciUSA1982794927-31SoneokaY,CannonPMRamsdaleEE,GriffithsJC.RomanoG,KingsmanSM,KingsmanAJ1995核酸研究，199523628-33。用于產生高滴度逆轉錄病毒載體的瞬時3質粒表達系統SutterG,MossB非復制的痘苗病毒能有效表達重組基因ProcNatlAcadSciUSA1992Nov15；89(22)10847-51TaylorJ.WeinbergR.TartagliaJ.RichardsonC.AlkbatibG,BriedisD,AppelM,NortonE,PaolettiE非復制病毒載體用作有效疫苗表達麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)糖蛋白的重組canarypox病毒，病毒學，1992Mar；187(1)321-8PaolettiE,TartagliaJ.TaylorJ安全有效的痘病毒載體-NYVAC和ALVAC.DevBioiStand1994；8265-9WyattLS,MossB,RozenblattS用于在哺乳動物細胞中進行瞬時基因表達的編碼噬菌體T7RNA聚合酶的復制缺損的痘苗病毒，病毒學，1995Jun20；210(1)202-5WyattLS,CarrollMW,CzemyCP,MerchlinskyM,SislerJRMossB修飾痘苗病毒Ankara的宿主范圍限制的標記恢復，病毒學，1998251334-42WyattLS.ShorsST.MUIphyBR,MossB開發能有效抗動物模型中的副流感病毒3感染的復制缺損的重組痘苗病毒疫苗，疫苗，1996Oct；14(1S)1451-8權利要求1．衍生自含有缺失gag基因的非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉錄病毒載體，其中gag中的缺失除去了gag編碼序列中核苷酸350下游的一個或多個核苷酸。2．權利要求1的逆轉錄病毒載體，其中缺失從核苷酸350至少延伸至gagpol編碼區的C末端。3．權利要求1或2的逆轉錄病毒載體，其中缺失另外還除去了gag編碼區的核苷酸300。4．權利要求1的逆轉錄病毒載體，其中缺失保留了gag編碼區的前150個核苷酸。5．權利要求1的逆轉錄病毒載體，其中缺失保留了gag編碼區的前109個核苷酸。6．權利要求1的逆轉錄病毒載體，其中缺失僅保留了gag編碼區的前2個核苷酸。7．衍生自非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉錄病毒載體，其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了一個或多個輔助基因。8．權利要求7的逆轉錄病毒載體，其中輔助基因選自dUTP酶，S2，env和tat。9．衍生自慢病毒基因組的逆轉錄病毒載體，其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了tat基因，但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導序列。10．上述任一權利要求的逆轉錄病毒載體，其至少含有馬慢病毒的一個成分。11．權利要求10的逆轉錄病毒載體，其中馬慢病毒是EIAV。12．權利要求11的逆轉錄病毒載體，其中逆轉錄病毒載體基本上衍生自EIAV。13．用于生產上述任一權利要求中逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒載體生產系統，其包括含有非靈長類動物慢病毒的gag-pol基因和包膜基因的包裝細胞。14．由權利要求13的生產系統生產的逆轉錄病毒載體。15．雜合病毒載體系統，其含有衍生自痘病毒的第一病毒載體和衍生自逆轉錄病毒的第二病毒載體。16．可由權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體得到的逆轉錄病毒顆粒。17．被權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒轉染或轉導的細胞。18．權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒或權利要求17的細胞用于制備藥物的用途。19．權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒或權利要求17的細胞用于制備將NOI傳遞至有此需求的靶位點的藥物組合物的用途。20．包括用權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒或利用權利要求17的細胞轉染或轉導細胞的方法。21．傳遞系統，其形式為權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒或權利要求17的細胞。22．權利要求1至12任一項或權利要求14或15的逆轉錄病毒載體或權利要求16的逆轉錄病毒顆粒或權利要求17的細胞的傳遞系統，其中傳遞系統含有非逆轉錄病毒表達載體，腺病毒和/或質粒。23．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體。24．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體生產系統。25．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒顆粒。26．用參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體轉染或轉導的細胞。27．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體的用途。28．用參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體轉染或轉導細胞的方法。29．傳遞系統，其形式為參照附圖，基本上如上文所述的逆轉錄病毒載體。全文摘要衍生自含有缺失gag基因的非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉錄病毒載體,其中gag中的缺失除去了gag編碼序列中核苷酸350下游的一個或多個核苷酸。文檔編號A61K48/00GK1285000SQ9881376公開日2001年2月21日申請日期1998年12月22日優先權日1997年12月22日發明者A·J·金斯曼,M·W·卡洛爾,J·羅爾,K·米特洛法諾斯,N·金申請人:牛津生物醫學(英國)有限公司