專利名稱::霍亂弧菌疫苗候選物及其構建方法
技術領域:
:本發明領域屬于生物技術,更具體的講,涉及生產霍亂弧菌(Vibriocholerae)疫苗及利用基因工程手段構建它們的方法。
背景技術:
:下面列出了在本發明文章中所用到的名詞術語的簡要解釋。ctxφ病毒是指某些霍亂弧菌菌株產生的由蛋白質包被的DNA顆粒,它能將包括霍亂毒素基因在內的DNA轉導到其它霍亂弧菌菌株。霍亂毒素是指由細菌產生時造成霍亂病臨床癥狀的蛋白質。ctxφ編碼的毒素基因是指,除了霍亂毒素基因之外分別編碼“密閉小帶毒素”及“副霍亂腸毒素”的zot基因和ace基因。霍亂弧菌非產毒菌株通常認為是指,去除了編碼上述各種毒素的基因的任何菌株,其與疫苗一樣良好且有用,但是仍然能夠產生一種并不期望的反應原性癥狀。術語安全疫苗或安全菌株是指,缺少了霍亂弧菌非產毒菌株中殘余的反應原性的這類菌株。血凝素/蛋白酶是指顯示兩重功能的蛋白質,其中一種是使某些物種的紅細胞凝集的能力;另一種性質是使例如粘蛋白的蛋白質降解。術語celA是指編碼內切葡聚糖酶A蛋白質的核苷酸序列。這種蛋白質天然地存在于熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)中,它具有β(1-4)葡聚糖-葡聚糖水解活性,能夠降解纖維素及其衍生物。胸苷酸合酶是指能夠利用N5,N10-亞甲基-四氫葉酸催化脫氧尿嘧啶一磷酸(dUMP)的還原性甲基化作用,產生2,5脫氧胸苷一磷酸(dTMP)和二氫葉酸的蛋白質。基本上純的DNA是指不包含在本發明DNA所來源的微生物之天然存在的基因組中的thyA編碼序列的5’或3’末端緊密相鄰的編碼序列的DNA。該術語還包括,例如整合到載體菌株、細胞系或質粒上的重組DNA,或直接作為一個獨立分子而存在(例如,cDNA、限制性片段或PCR片段)的重組DNA。它也包括作為編碼附加序列的雜合基因的一部分的重組DNA分子。同源序列是指,在兩條或多條給定鏈的相同位點處分別具有相似或相同的核苷酸或氨基酸殘基的DNA或蛋白質序列。在特定位點具有的相同或相似的殘基數目越多,則兩條鏈之間的相同或相似百分比越大。霍亂臨床癥狀是由口感染細菌霍亂弧菌所致的一種急性腹瀉疾病。在對霍亂研究了一百多年以后,仍需要一種有效、安全的疫苗。人類已經經歷了七次大規模的霍亂流行;前六次是由古典生物型的菌株引起的,當前第七次流行的特征在于由屬于埃爾托生物型(ElTor)的弧菌占主導地位。最近,從1991年1月起,這種流行病傳播到南美洲,在秘魯、厄瓜多爾、哥倫比亞和智利引發了25000多例疾病,導致2000多人死亡。到1992年11月,一種新的血清組O139在印度和孟加拉國出現,它具有很強的傳染能力,從而引起了發展中世界的普遍關注。最近的這些經歷加強了針對由O1血清組(埃爾托生物型)霍亂弧菌和O139霍亂弧菌所引起的疾病的有效的霍亂疫苗的需要。由于霍亂病康復后有一個持續至少三年的免疫狀態,霍亂弧菌免疫學上進行的大量努力已經研制了活減毒霍亂疫苗,當口服給藥后其在免疫接種性質上與霍亂病非常相似,但是不會在服用它們的個體中導致反應原性。這類疫苗包括ctxφ弧菌噬菌體編碼的所有毒素基因的缺失突變。見Kaper.J等人的專利,WO91,18979和Mekalanos.J,WO95,18633的專利。待分析的第一個針對霍亂的疫苗要追溯到1885-1892年。它是一種傳統疫苗,包括通過“減毒”弧菌的非腸胃途徑給藥。結果療效有限且產生難以接受的反應原性。(FinkelsteinR.A美洲大陸霍亂病國際研討會,圣保羅,巴西(SaoPaulo,SP)1992)。在1892年首次用減毒的霍亂弧菌菌株嘗試了口服接種。由于誤解了這種嘗試的結果,這種策略立即就被放棄了。通過化學誘變處理弧菌作為免疫劑,口服接種免疫后來于1970-1980年在美國馬里蘭的疫苗培育中心獲得。這些突變體的毒力回復阻礙了這一策略的進一步發展(Levine等人,感染與免疫(Infectionandimmunity),No2,1984;Finkelstein等人,美國專利4,328,209),且促進了研究者對產生不能回復的、遺傳確定的非產毒突變體的研究。盡管這些突變體已經表現出賦予針對疾病的比較可靠的免疫保護作用(KaperJ.B和LevineM的美國專利06,472,276和581,406),但使用它們的重要缺陷是它們在接種者體內產生高水平的不利反應(Levine等人,感染與免疫,56卷,No.1,1988)。根據這些材料,克服了這些主要問題之后所制備的一種有效的霍亂疫苗是安全的。此外,世界范圍的研究目前普遍地關注細菌之間遺傳信息的水平轉移,因此當設計活細菌疫苗時必須注意到這一方面,目的在于改善接種期間對環境的影響。這也是獲得好的穩定性水平和免疫原性水平所必須的。目前已有由補加霍亂毒素B亞單位的全細胞組成的滅活霍亂疫苗(Homgren等人,微生物學和免疫學的最新課題,146卷,1989)。這樣的疫苗是安全有效的,但是要產生一個與霍亂感染相當的免疫應答需要多次接種,劑量較大,因此是非常昂貴的。接種霍亂疫苗的另一個選擇是最近官方許可的CVD103-HgR,這是一種屬于古典生物型的活霍亂疫苗。它安全、有效并且便宜;然而它在針對當前流行的ELTor和O139弧菌的保護效力上并不象針對古典弧菌那樣好(見美國專利5399494)。另外的活疫苗候選物已經在專利WO95/18633中描述過。這些突變體代表了所有的當前廣泛流行的血清型,包括O139。它們是安全的,它們的制備便宜,且已初步證明有效;然而它們沒有像CVD103-HgR那樣進行過廣泛的試驗。所有的這些候選物都是能在環境的天然條件下存活的原養菌。此外,盡管在資料中描述了一種得到確定的突變體的方法,被提議的候選物組成不移動的自發突變體。發明者提出,免疫候選物不移動的本性限制了它們到達腸細胞表面的能力,且避免了引發它們的親本系特有的反應原性應答。Finkelstein等人,細菌生物學(Bacteriology),173卷,第11期,3311-17,克隆并測序了編碼血凝素/蛋白酶基因(hap),通過在細菌染色體用一個卡那霉素抗性基因盒插入失活這個基因,而進一步的分離得到了hap-1突變體。這一菌株是一條基礎研究的途徑,而不是作為疫苗為目的。Finkelstein等人,感染與免疫,60卷,第二章,427-78闡明了野生型和HAP突變體的毒性程度相同,得出了hap基因產物不直接參與致毒性的結論。在本文中作者提供的結果支持了HA/P是一種能夠破壞不同的霍亂孤菌粘附素宿主細胞受體的“離脫酶(detachase)”的結論。除了這一知識,沒有構建以接種免疫為目的的這個基因的突變體。Robert等人,疫苗(Vaccine),14卷,No.16,1517-22,1996,闡明了用異種標記物插入到血凝素/蛋白酶位點而不損害弧菌的集群能力的事實。霍亂弧菌在人小腸上集群,對于誘導腸粘膜中分泌IgA的強局部免疫應答是必需的,同時產生針對霍亂的持續很長的免疫(Taylor等人,感染性疾病雜志(TheJournalofInfectiousDiseases),1994,170:1518-23)。Mekalanos博士早已經確定表示,集合淋巴小結對細菌的吸收是不能導致反應原性的集群過程的結果,這被認為是產生局部免疫應答的一個關鍵步驟。相反,細菌和腸細胞的相互作用產生了免疫接種不能接受的不利反應(MekalanosJ等人,巴斯德研究所公報(Bull.Inst.Pasteur),93:255-262,1995)。根據這個標準,干擾弧菌到達腸細胞的能力的突變是霍亂疫苗期望的特征。發明詳述盡管在霍亂毒素基因內有缺失(不產毒的突變體),霍亂弧菌突變體仍能在人體內產生不能接受的水平的反應原性,這就妨礙了將多種活減毒突變體用于免疫接種。本發明中提出了一種通過失活血凝素/蛋白酶基因(hap)去除霍亂弧菌非產毒突變體中殘余的反應原性之方法,這對于得到更安全、遺傳確定且穩定的霍亂弧菌突變體是有用的,該突變體可作為有用的口服活疫苗在人體內誘導出針對霍亂的免疫保護。這個突變體來源于一種霍亂弧菌非產毒菌株,通過用標記基因celA破壞hap基因而產生。在本文優選的實施方案中,疫苗株屬于霍亂弧菌埃爾托生物型或O139血清型中的一種。優選的這類菌株是從霍亂弧菌非產毒突變體得來的,通過基因工程手段得到,且用位于hap位點內的標記基因celA標記。現在最優選的實施方案中菌株是638,1333或L911。本發明還包括了一種增強待用做活疫苗或作為大量生產死疫苗的菌源的任何霍亂弧菌菌株之環境生物安全性的方法。在這里所描述的方法包括克隆和對thyA基因實施一個內部缺失的遺傳操作,用“體外”產生的突變的等位基因交換其在染色體上的野生型拷貝。本發明優選的實施方案包括如下霍亂弧菌疫苗株,這些霍亂疫苗屬于現有的生物型和血清型,或是任何現有的疫苗不起作用的新出現的血清型,和那些通過在編碼HA/P和胸苷酸合酶的基因上進行基因操作得到的增加了環境生物安全性特征的雙重突變體。更優選的突變體是81,413或SG251a的衍生物,最優選方案的菌株是638T或是1333和L911的thyA衍生物。還包括了可用作將抗原遞呈給粘膜免疫系統的實體之疫苗株版本。我們已經發現這些突變體在實驗室和/或臨床實驗中具有低水平的反應原性,即使口服途經給藥后也能引發出強的免疫應答。結果這些血凝素/蛋白酶缺陷型突變體和它們的衍生物都具有期望在人體內針對霍亂的疫苗的性質。此外,本發明還提供了編碼霍亂弧菌胸苷酸合酶的thyA基因的基本上純的DNA。ThyADNA是指SEQID1中所描述的DNA序列及其片段、缺失序列、破壞序列和同源序列。在這里所描述的疫苗株的構建方法包括在已經去除了所有包含ctxφ前噬菌體的基因的霍亂弧菌非產毒突變體中,用celA破壞的等位基因替換編碼野生型血凝素/蛋白酶的基因。這些突變體的遺傳非常確定,蛋白質水解活性缺陷也非常穩定,在109個細胞中沒有檢測到回復突變。所述的突變體由celA染色體標記所賦予的纖維素水解活性也同樣穩定,即使通過小鼠或人的腸以后。具有增強的環境生物安全性的更進一步之衍生物的構建方法,包括在突變體的thyA基因上引入一個基因缺失,得到一個胸腺嘧啶/胸苷營養缺陷型的衍生物。所得的三重突變體遺傳非常確定且穩定。結果這個突變使該菌株具有一個只有存在胸腺嘧啶/胸苷的條件下對抗甲氧芐啶抗生素的抗性標記。這樣的標記是不可能通過水平轉移而轉化它細菌,這歸功于它的隱性性質。本發明提供了非產毒的,遺傳確定的、穩定及安全的霍亂弧菌突變體,它們作為在人體內誘導產生針對霍亂的免疫保護作用的口服活疫苗是非常有用的。當設計我們的無反應原性的霍亂疫苗候選物時,我們已經堅持了反應原性是霍亂弧菌與腸細胞相互作用的結果這一觀點。我們推理負責粘蛋白降解的主要分泌蛋白酶失活,將會導致該霍亂弧菌菌株不能穿過腸細胞的厚粘液層,但是并不改變它到達M細胞的表面并引發一個強的免疫應答的能力。發現在C7258、C6706和SG25-1菌株中降解粘蛋白的主要分泌的蛋白酶是可溶性的血凝素/蛋白酶,它是一個在Finkelstein等人,細菌學雜志(JournalofBacteriology),173卷,No.11,PP:3311-3317,1991中描述過的推定的毒力因子。平行于血凝素/蛋白酶基因的失活,將熱纖維梭菌中編碼內切葡聚糖酶A的DNA片段插入到霍亂弧菌染色體上。這個突變與ctxφ基因組中先前缺失的霍亂毒素基因相結合,產生帶有標記的具有極好的性質的疫苗候選物,用作針對霍亂免疫接種人類的免疫劑。本申請中的最主要的發現是我們的非產毒菌株中hap的破壞能夠去除它們殘余的反應原性。作為一個實施例而不是限制的目的霍亂弧菌非產毒突變體對于構建用以免疫接種為目的之血凝素/蛋白酶表達缺陷型的安全突變體是非常有用的,如表1a中所述。非產毒突變體的具體特征在于它們的染色體上缺失了所有的ctxφ編碼序列,且存在一個單一的RS1元件,它的核苷酸序列已經通過DNA測序所證實。產生霍亂弧菌非產毒突變體的方法在別的文獻中已很好的描述過[醫學研究文獻(ArchiyesofMedicallResearch),27,No3,pp275-283]。表1a構建缺陷型HA/P突變體的起始菌株。所有菌株及制造方法已經在醫學研究文獻,27,No3,pp275-283,1996描述過;81和413分別衍生于C7258和6706,二者都是1991年秘魯的臨床分離株;SG25-1a是O139分離株SG25-1的衍生物,來自加爾各答,印度,1993年。相似的,表1b提供了血凝素/蛋白酶突變體作為構建具有更好的生物安全性特征的thyA缺陷型衍生物。表1b血凝素/蛋白酶突變體用于構建thyA突變體帶有意在增加其生物安全性的額外突變之非產毒菌株的表征血清學特征將任何新的突變引入到這里所描述的疫苗株后,衍生物被證明保留了所期望的血清型。從懸浮于鹽水中的平板上收獲細胞,立即用特異于稻葉血清型(Inaba)、小川血清型(Ogawa)或O139的Difco分型血清檢測。接種引發的主要免疫應答是針對細菌的LPS的。通過血清學檢驗證實,本發明中所述所有的菌株都保留了所期望的O-抗原的表達。此外,LPS在聚丙烯酰胺電泳和Western雜交中的分布型圖沒有改變。幼鼠集群分析用幼鼠集群分析(Herrington等人,實驗醫學雜志(J.Exp.Med.),168:1487:1492,1988)分析每個突變體的集群性質。把終體積為50μl含有105-106個弧菌的接種物胃內施用于至少五只小鼠的種群。30℃下18-24小時后,處死小鼠并解剖它們的腸子,勻漿并鋪于含有支持突變體生長的適當補充物之細菌學培養基平板上。檢測過夜培養后生長的菌落的附加標記。霍亂弧菌雙重突變和三重突變(Δctxφ,HA/P)/(thyA-)菌株在未斷乳小鼠腸中定居的能力可以從表2中觀察到。638、1333和638T株都是小鼠的小腸上的很好的定居者。在幼鼠胃腸道上的集群與人腸上的集群的相關性已為廣泛接受,這對起動粘膜免疫系統和誘導一個強的分泌IgA的應答是必需的。盡管L911的集群能力不如其它菌株,但它也能形成集群。必須說明638T是638的一個thyA-基因突變體。引入到此菌株的這個突變產生了一種胸腺嘧啶或胸苷依賴性,這就降低了這一菌株在通常缺乏嘧啶的天然條件下繁殖的能力。表2hap∷celA疫苗株的集群容量<tablesid="table3"num="003"><table>菌株輸入輸出生物型/血清型相關基因型6381×1062.8×105埃爾托生物型/小川血清型Δctxφ,hap∷celA13332×1064.2×105埃爾托生物型/稻葉血清型Δctxφ,hap∷celAL9111.2×1068×103O139Δctxφ,hap∷celA638T1.7×1066×105埃爾托生物型/小川血清型Δctxφ,hap∷celA,thyA</table></tables>蛋白酶活性檢測奶-LB培養基平板是用于檢測TSB生長弧菌的上清液中的蛋白質水解活性。用于定量蛋白酶活性的偶氮酪蛋白法來自于GintherCL的AntimicrobAgentsChemother,15,522-526,1979。簡要的說是用1.1ml緩沖液(CaCl21mM;Tris0.2M;pH7.2;Azocasein1%)與200μl培養物上清液混勻,37℃溫育1小時。未反應的底物用83μl40%TCA沉淀10分鐘,然后12000轉/分離心10分鐘。溶液中的有色產物用NaOH中和,450nm下讀數。一個酶活力單位定義為反應一個小時使樣品光密度值凈增一個單位的酶量。引入這里所述的菌株血凝素/蛋白酶基因中的突變,導致在與它們的非產毒親本株相比,觀察到突變體的蛋白質水解活性下降了60-80%。表達內切葡聚糖酶A標記的弧菌之檢測為檢測CelA的活性,弧菌在LB平板上培養24小時,用含CMC指示劑的瓊脂覆蓋,60℃保溫4小時。內切葡聚糖酶A的陽性菌落通過剛果紅染色,漂洗,在平板上呈現出在紅色背景下由透明暈包圍的紅色菌落。CMC指示劑瓊脂由在pH6.3的磷酸-檸檬酸緩沖液中的0.7%的瓊脂糖、0.5%的CM-纖維素組成。染色液是1%的剛果紅水溶液。CelA標記用于明確區分穩定表達和在遺傳上繼承了霍亂弧菌性質的疫苗。受標記的弧菌的顯示如圖1所示。通過thyA基因的特異性誘變得到胸苷營養缺陷型疫苗株的得分補充作為碳源的葡萄糖和胸腺嘧啶/胸苷(200μg/ml)的M9-鹽,用于檢測thyA缺陷型突變體在M9-鹽葡萄糖培養基中生長時所受的損害。補充了200μg/ml胸苷的LB平板用于檢查thyA突變體產生的甲氧芐啶抗性。用影印培養法將菌群從M9-葡萄糖-胸苷平板轉到M9-葡萄糖平板上,以分析胸苷營養缺陷型的穩定性。菌株638、1333和L911都是能夠在以葡萄糖作為唯一碳源的礦物鹽中生長的原養細菌。638T菌株需要添加胸苷或胸腺嘧啶才能在基本培養基中生長。當這些補充物之一存在時,638T可抵抗高達200μg/ml甲氧芐啶。移動性分析用鉑針尖從主平板上的單一的、充分分離的菌落中挑出細胞,并通過插入(2-3毫米)接種至軟瓊脂平板上(LB,0.4%瓊脂)。30℃(培養24小時后測量每一個菌落通過軟瓊脂擴散的直徑。移動的標準如下菌株從接種點擴散等于或少于3毫米則認為是非移動性的。菌株從接種點擴散超過3毫米則認為是移動性的。本專利范圍內所有菌株,除了L911之外都是移動性的。L911是SG251的一個衍生物,在我們的實驗中,當用軟瓊脂進行分析時結果顯示它是非移動性的。鞭毛分析移動性的和非移動性的細菌通過電子顯微鏡分析其鞭毛的存在與否。簡要的說,霍亂弧菌在定居因子抗原瓊脂(CFA,酪蛋白水解物1%;酵母抽提物0.15%;硫酸鎂0.05%;氯化錳0.005%)中37℃培養4小時,收集并用鹽水(氯化鈉0.9%)清洗。菌體用1%的乙酸雙氧鈾負染色3分鐘,用透射電子顯微鏡分析。上述的所有疫苗株都證明有細菌鞭毛的存在,更要強調是對于非移動性的O139菌株L911(圖2)。這里所描述的菌株都顯示是有鞭毛的,包括非移動性的L911。TCP分析用免疫金電子顯微鏡技術檢查突變體菌株的菌體表面是否存在毒素相關的菌毛。細胞培養如鞭毛分析。新收集的弧菌懸液(10μl)沉積在碳包被的鎳網格上,把格子置于60瓦特的燈泡下固定1分鐘,用濾墊除去多余的液體。格子在一滴用生理鹽水1%小牛血清(BSA)、0.05%吐溫(Tween)-80稀釋的特定TCP血清中翻轉,保溫15分鐘,用生理鹽水-BSA-Tween洗滌。洗過的格子與用相同的緩沖液稀釋的金標記輟合物共同保溫15分鐘,用生理鹽水-BSA-Tween洗三次。洗過以后,樣品用1%的鉬酸銨溶液染色1分鐘。霍亂疫苗最重要的特征是具有安全性和抗原性。通過遺傳操作,霍亂弧菌菌株被認為是安全的,但是必須注意保持其抗原性不變。對本專利申請書中所公開的霍亂弧菌菌株,經評估在細菌中表達最顯著的抗原。免疫金電子顯微鏡顯示TCP在細胞表面。此外,這種重要定居因子的表達已經用Western分析檢測。所有已分析過的菌株(例如638、1333、L911和638T)都產生正常水平的TCP蛋白質,并把它們排列在細菌表面的大附器上(圖3)。活疫苗株這里所描述的638、1333、L911和638T菌株,能夠用于在人體內獲得適當的針對霍亂的免疫保護作用,前提是志愿者口服給藥后疫苗引發出高度血清轉變作用和產生低水平的不利反應。根據有關的當地流行病學的情況決定用單株或組合的疫苗株來免疫接種。疫苗株的培養能力疫苗株在標準實驗室培養基中培養。當其生長需要時將補充物胸苷(200μg/ml)加入,但是接種物中不包括補充物。劑量從無菌生理鹽水(NaCl0.9%)中的一個新鮮平板上收集的細菌后,給人服用單次口服劑量的碳酸氫鹽緩沖液(2%)中的活菌苗。每一個免疫接種劑量的接種物含有107-109個細胞。此外,可給予每個受試者多于一個劑量,每間隔7-28天一次。優選地弧菌以一種可保存它的活力的制劑形式凍干,接種前與碳酸氫鹽混合使用。638的臨床實驗638菌株已經在包含42位年齡在8-40歲的志愿者的人體實驗中進行測試。服用638菌株和安慰劑后的臨床觀察記錄總結示于表3。所有觀察的臨床表現形式為輕微的且具有短的持續期。現有數據在接種組和安慰劑組之間未顯示統計學顯著性。不論劑量如何,志愿者中最常見的報告是腹部汩汩叫和腹絞痛。四名志愿者出現中度腹瀉(三級)。他們中的三名接受了高劑量,一名為中等劑量。一名接受高劑量的志愿者有五次疏松糞便(接種72小時以后),排出物總計680克。兩名志愿者分別在接種28和72小時后有兩次疏松糞便,排出物總計分別為220克和500克。另外一名志愿者在接種73小時后一次腹瀉,排出量為300克。疫苗株的細菌學分離如表4所示,接種的42名志愿者中37名回收到638菌株(88%)。對于較高劑量,疫苗株的排泄在接種后72小時達到最高。四例腹瀉中有三例發生在這一時間。在排泄弧菌的37名志愿者中,12名排泄了至少4天,19名至少排泄了3天,28名排泄了兩天。排泄638菌株的志愿者的數目以及相對于糞便克數的霍亂弧菌數的平均值在較低劑量時下降。從志愿者的糞便中分離的弧菌產生內切葡聚糖酶,表明當在人腸內生長時celA報告基因是穩定存在的。我們認為638菌株在人小腸內能形成一個很好的集群。對疫苗株的免疫應答638菌株能引發明顯的和持續的免疫應答,其為抗弧菌的抗體血清、抗小川血清型LPS的IgG或IgA血清和小川血清型LPS特異的IgAASC(表5和6)。盡管GMT倒數在接種14天后達到最高峰,但是血清轉變在第7天發生,高效價持續到第28天。血清轉變速率、GMT倒數峰值和ELISA效價是劑量依賴性的。然而,即使是最低劑量,638菌株也誘導出一個相對于安慰劑明顯的抗弧菌抗體的應答。有相當比例的產生血清轉變的受試志愿者產生相對較高(≥1024)的抗弧菌效價(表6)。在ASC評價中存在高百分比的應答者(表5)反映這是一個638菌株的粘膜免疫(主要是sIgA)的有效刺激,其應答在接種14天后提高的抗-LPS的IgA效價。一個服用安慰劑的志愿者血清轉變為抗-LPS的IgG。這個志愿者有非常低的接種前的抗-LPS血清IgG,它在第七天增加到閾值,以后就一直保持恒定。另外一個服用安慰劑的志愿者達到ASC的閾值。相似地,這個志愿者也有接種前的極低數量的LPS特異性ASC。我們斷定638菌株可引發明顯的免疫應答。表3服用埃爾托生物型小川血清型候選物638疫苗株后不利反應的發生頻率。注1N=42,2N=14,3相對危險性,4(95%)表4從志愿者糞便中回收霍亂孤菌菌株638表6口服施用霍亂弧菌埃爾托型、小川血清型菌株638的志愿者的血清抗體應答注1效價/總量增長四倍的志愿者數;2效價/總量增長兩倍的志愿者數;3效價算術平均數倒數的對數。縮寫GMT,效價的幾何平均值;SD,平均數的標準偏差。IV實施例這里所描述的實施倒是為了舉例說明本發明的而非限制本發明。從非產毒親本中構建安全疫苗候選物從表1a中所述非產毒突變體菌株構建血凝素/蛋白酶缺陷型衍生物,每一個親本菌株的處理方法相同。首先,從大腸桿菌(E.coli)SM10λpir將含有因插入報告基因celA而失活的HA/P(hap)基因的自殺性載體pGPH6(圖4)轉移到非產毒突變體,產生一個氨芐青霉素抗性的共整合體。其次,Southern雜交證明共整合體中含有插入性失活的hap基因(hap∷celA),和通過DNA載體分離的野生型等位基因。第三,將上述氨芐青霉素抗性的共整合體在無抗生素的培養基上分開,篩選氨芐青霉素敏感的菌落。通過Southern雜交證明氨芐青霉素敏感的菌落命名為638、1333和L911,顯示出它們含有hap∷celA突變體等位基因。構建霍亂弧菌菌株638的胸苷酸合酶缺陷型衍生物638T為構建胸苷酸合酶表達缺陷型的霍亂弧菌突變體,首先克隆和測序了編碼它的基因thyA。霍亂弧菌的thyA基因最早通過互補一個自發的甲氧芐啶抗性、胸苷依賴型的突變體菌株81得到,用的是在pBR322中構建的菌株C7258的基因組文庫。篩選了一個克隆,提純并插入到pUc19質粒,用它作為模板方便了應用通用引物的測序。thyA基因的核苷酸序列和預測的胸苷酸合酶(TSasa)蛋白質的多肽序列都可見于SEQIDNO1中。為構建一個TSasa缺陷型的疫苗株,在“體外”刪除了thyA開放閱讀框里的一個內部限制性片段。刪除部分包括MluⅠ和BglⅡ限制制位點之間的核苷酸,并且去掉了編碼ThyA蛋白質第7位至第105位氨基酸的DNA序列。所得基因構建體與自發突變體霍亂弧菌815的thyA缺陷互補的能力受損。這個片段被克隆進pCVD442中單一的SacⅠ限制性位點得到pEST(圖5)。把這種質粒從大腸桿菌SM10λpir轉移到霍亂弧菌菌株638,并且篩選出一種氨芐青霉素抗性的共整合體,通過共整合體的Southern分析證明pEST被特異的整合進thyA基因。這種氨芐青霉素抗性的共整合體可用補充了胸苷的無抗生素培養基分離出來。在有胸苷時篩選蔗糖耐受的菌群。通過Southern雜交分析表征了一個命名為638T的胸苷依賴性、氨芐青霉素敏感性菌落,且被證明含有一個功能異常的thyA等位基因。pEST用于構建638T,并且對于構建1333T和L911T或任何其它確定的thyA缺陷的霍亂弧菌衍生物也將是非常有用的。下面是附圖的簡要描述。圖1利用CMC指示劑瓊脂的平板檢測中celA標記的霍亂弧菌的檢測。圖2O139血清組的霍亂弧菌突變體L911的鞭毛檢測。圖3638T細菌表面的TCP檢測。圖4圖示用于構建霍亂弧菌thyA∷celA突變體的自殺型載體pGPH6。圖5圖示用于構建thyA突變體的pEST自殺型載體。優點本發明提供給我們一種通過使非產毒突變體的血凝素/蛋白酶基因失活,產生更安全的霍亂弧菌突變體的途徑。這些衍生物可用作疫苗。菌株638、1333和L911的安全性和免疫原性與專利WO95/18633中已有的菌株相似。此外,它們也代表了所有的當前流行的霍亂弧菌菌株和新出現的O139血清組。所述的菌株也帶有一個可區分的標記,以幫助疫苗的環境抽樣調查。在構建在此所描述的疫苗株的過程中所有引入的突變是已知的非常確定的基因缺失或基因插入。本發明還提供了一種提高作為口服疫苗的活霍亂菌株的環境生物安全性的方法。這個提高是通過在thyA基因上產生一個確定的突變來實現的,對此這里也做了描述。638T疫苗株的特點是它的增強的環境生物安全性。它具有胸苷營養缺陷性,這限制了它在缺乏游離嘧啶的自然生態系統中生長。由于它的thyA基因突變使霍亂弧菌疫苗候選物638T具有甲氧芐啶抗性,該抗性因為它的隱性性質而不易傳遞給其它細菌。此外,對甲氧芐啶的抗性是需要培養基中有胸腺嘧啶或胸苷的存在為條件的。通過水平基因轉移而重新獲得霍亂毒素基因或其它DNA的顧慮在這些菌株中是多余的,因為它們在實驗室之外是不能增殖。Ⅴ保藏微生物菌株在保藏中,保藏信息待分配。序列表<110>CentroNacionaldeInvestigacionesCientificas<120>霍亂弧菌疫苗候選物及其構建方法<130>未定<140>PCT/CU98/00008<141>1998-12-30<150>CU142/97<151>1997-12-30<160>2<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>852<212>DNA<213>霍亂弧菌<220><221>CDS<222>(1)..(852)<223>thyA核苷酸序列<400>1gtgagacagtatttagatctttgtcagcgcatcgtcgatcaaggtgtt48ValArgGlnTyrLeuAspLeuCysGlnArgIleValAspGlnGlyVal151015tgggttgaaaatgaacgaacgggcaagcgttgtttgactgtgattaat96TrpValGluAsnGluArgThrGlyLysArgCysLeuThrValIleAsn202530gccgatttgacctacgatgtgggcaacaattagtttcctctagtcact144AlaAspLeuThrTyrAspValGlyAsnAsnGlnPheProLeuValThr354045acacgcaagagtttttggaaagccgccgtggccgagttgctcggctat192ThrArgLysSetPheTrpLysAlaAlaValAlaGluLeuLeuGlyTyr505560attcgtggttacgataatgcggcggattttcgccaattaggtaccaaa240IleArgGlyTyrAspASnAlaAlaAspPheArgGlnLeuGlyThrLys65707580acctgggatgctaatgccaatttaaaccaagcatggctcaacaatcct288ThrTrpAspAlaAsnAlaAsnLeuAsnGlnAlaTrpLeuAsnAsnPro859095taccgtaaaggtgaggatgacatgggacgcgtgtatggagttcagggt336TyrArgLysGlyGluAspAspMetGlyArgValTyrGlyValGlnGly100105110agagcttgggctaagcctgatggtggtcatattgaccagttgaaaaag384ArgAlaTrpAlaLysProAspGlyGlyHisIleAspGlnLeuLysLys115120125attgttgatgatttgagccgtggcgttgatgaccgaggtgaaattctt432IleValAspAspLeuSerArgGlyValAspAspArgGlyGluIleLeu130135140aacttctacaatccgggtgaatttcacatggggtgtttgcgcccttgc480AsnPheTyrAsnProGlyGluPheHisMetGlyCysLeuArgProCys145150155160atgtacagccatcatttttcattgctgggtgataccttgtatctcaac528MetTyrSerHisHisPheSerLeuLeuGlyAspThrLeuTyrLeuAsn165170175agtactcagcgttcatgtgatgtgcccttggggttgaatttcaacatg576SerThrGlnArgSerCysAspValProLeuGlyLeuASnPheAsnMet180185190gtgcaggtttatgtgttccttgcgctgatggcacagarcacagggaaa624ValGlnValTyrValPheLeuAlaLeuMetAlaGlnIleThrGlyLys195200205aagccgggcttggcgtatcacaagatcgtcaatgcgcacatttaccaa672LysProGlyLeuAlaTyrHisLysIleValAsnAlaHisIleTyrGln210215220gatcaactcgaattgatgcgcgatgtgcagctaaaacgtgagccattc720AspGlnLeuGluLeuMetArgAspValGlnLeuLysArgGluProPhe225230235240ccagcgcctcagttccatatcaatccaaagattaaaacactgcaggat768ProAlaProGlnPheHisIleAsnProLysIleLysThrLeuGlnAsp245250255ttggaaacttgggtcactttggatgattttgacgtcaccggatatcag816LeuGluThrTrpValThrLeuAspAspPheAspValThrGlyTyrGln260265270ttccacgatcctattcaatacccgttttcagtctaa852PheHisAspProIleGlnTyrProPheSerVal275280<210>2<211>284<212>PRT<213>霍亂弧菌<400>2ValArgGlnTyrLeuAspLeuCysGlnArgIleValAspGlnGlyVal151015TrpValGluAsnGluArgThrGlyLysArgCysLeuThrValIleAsn202530AlaAspLeuThrTyrAspValGlyAsnAsnGlnPheProLeuValThr354045ThrArgLysSerPheTrpLysAlaAlaValAlaGluLeuLeuGlyTyr505560IleArgGlyTyrAspAsnAlaAlaAspPheArgGlnLeuGlyThrLys65707580ThrTrpAspAlaAsnAlaAsnLeuAsnGlnAlaTrpLeuAsnAsnPro859095TyrArgLysGlyGluAspAspMetGlyArgValTyrGlyValGlnGly100105110ArgAlaTrpAlaLysProAspGlyGlyHisIleAspGlnLeuLysLys115120125IleValAspAspLeuSerArgGlyValAspAspArgGlyGluIleLeu130135140AsnPheTyrAsnProGlyGluPheHisMetGlyCysLeuArgProCys145150155160MetTyrSerHisHisPheSerLeuLeuGlyAspThrLeuTyrLeuAsn165170175SerThrGlnArgSerCysAspValProLeuGlyLeuAsnPheAsnMet180185190ValGlnValTyrValPheLeuAlaLeuMetAlaGlnIleThrGlyLys195200205LysProGlyLeuAlaTyrHisLysIleValAsnAlaHisIleTyrGln210215220AspGlnLeuGluLeuMetArgAspValGlnLeuLysArgGluProPhe225230235240ProAlaProGlnPheHisIleAsnProLysIleLysThrLeuGlnAsp245250255LeuGluThrTrpValThrLeuAspAspPheAspValThrGlyTyrGln260265270PheHisAspProIleGlnTyrProPheSerVal275280權利要求1.一種從意在用于針對霍亂的免疫接種之霍亂弧菌非產毒突變體中去除殘余的反應原性的方法,這種方法在于通過缺失、插入或任何其它確定的且不可逆的遺傳操作使血凝素/蛋白酶基因失活。2.一種從非產毒親本得到的霍亂弧菌疫苗株,其特征在于通過缺失、插入或任何其它確定的且不可逆的遺傳操作而具有功能異常的血凝素/蛋白酶基因。3.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的古典生物型。4.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的埃爾托生物型。5.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于埃爾托生物型霍亂弧菌的小川血清型或稻葉血清型。6.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的O139血清組。7.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于針對現有疫苗無效的任何出現的血清組。8.權利要求2的疫苗株,其中所述的疫苗株是霍亂弧菌菌株638、1333或L911。9.一種提高能夠在自然條件下存活并繁殖的霍亂弧菌疫苗候選物的環境安全性的方法,包括在其編碼胸苷酸合酶的thyA基因中導入確定且不可逆的突變。10.一種霍亂弧菌的疫苗株,其特征在于有一個功能異常的遺傳修飾的thyA等位基因代替它的天然基因,它是通過缺失、插入或任何其它確定的且不可逆的突變而得到的。11.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的古典生物型。12.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的埃爾托生物型。13.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于埃爾托生物型霍亂弧菌的小川血清型或稻葉血清型。14.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于霍亂弧菌的0139血清組。15.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株屬于針對現有疫苗無效的任何出現的血清組。16.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗株是霍亂弧菌菌株638T或1333的衍生物,或L911。17.權利要求10的疫苗株,其中所述的疫苗作為生產死霍亂弧菌疫苗的來源。18.thyA基因的純DNA,其包括示于SEQIDNO1的編碼霍亂弧菌天然胸苷酸合酶的核苷酸序列,用于獲得其環境安全性改善了的突變體。19.權利要求18的DNA,包括任何缺失、破壞或導致該基因功能異常的任何其它遺傳操作。20.權利要求18或19的DNA,其中所述的DNA包含在細胞中。21.權利要求18、19或20的DNA,其中所述的DNA包含在質粒中。全文摘要本發明涉及新的霍亂弧菌疫苗株,其中由血凝素蛋白酶基因編碼的粘蛋白酶活性被消除。所述基因被外源基因插入而中斷。還公開了具有更好的生物安全性的另外的霍亂弧菌突變體。文檔編號A61P31/04GK1301301SQ98813442公開日2001年6月27日申請日期1998年12月30日優先權日1997年12月30日發明者J·坎普斯戈梅茲,R·A·范多卡爾扎達,B·L·羅德里奎茲岡薩雷茲,T·Y·萊頓佩雷茲,E·瓦爾迪亞茲,A·J·西瓦卡布里拉,J·A·貝尼特茲羅布里斯申請人:國家科學研究中心