專利名稱：：糖氧化酶及其在焙烤中的用途的制作方法
背景技術：
：本發明涉及糖氧化酶在焙烤中的用途并且涉及一種新的糖氧化酶。相關現有技術的描述在制作面包的過程中，已知向面包面團中加入改善面包的和/或改善面團的添加劑，其中所述添加劑的作用特別導致面包的結構、體積、風味和新鮮度的改善以及面團機械加工性能和穩定性的改善。用于強化谷蛋白和改善面團流變學和加工性能的面團“調節劑”在工業中是眾所周知的并且已被長期使用。如碘酸鹽、過氧化物、抗壞血酸、溴酸鉀和偶氮二酰胺這樣的非特異性氧化劑具有谷蛋白強化作用。已經有人提出這些調節劑誘導了強化谷蛋白并從而強化面團的蛋白質之間鍵的形成。同樣已知使用葡萄糖氧化酶來強化谷蛋白并改善面團的流變學和加工性能。因此，US2，783，150公開了葡萄糖氧化酶在面粉中的用途，以改善面團的強度以及焙烤的面包的結構和外觀。EP321811和EP338452公開了與其它酶(硫氫基氧化酶、半纖維素酶、纖維素酶)結合的葡萄糖氧化酶在焙烤中的用途。但是，由于在制備焙烤制品中所用的谷物面粉中通常葡萄糖的含量低，因此葡萄糖氧化酶作為面團和/或面包改善添加劑的效力是有限的。因此，已經對鑒定出作用于除葡萄糖以外的底物的氧化還原酶產生了興趣。WO96/39851公開了己糖氧化酶的用途，該氧化酶能夠將D-葡萄糖以及包括麥芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖在內的幾種其它還原糖氧化成其各自的內酯，隨后水解成各自的醛糖二糖酸。WO97/22257公開了吡喃糖氧化酶在焙烤中的用途。該酶催化幾種單糖在C2位置上的氧化，其間伴隨著過氧化氫的釋放。盡管呈其吡喃糖形式的葡萄糖傾向于是優選的底物，但是該酶能夠氧化其它的底物，例如如木糖這樣的呋喃糖。盡管催化葡萄糖和其它糖直接氧化成相應醛糖酸的酶似乎廣泛分布在自然界中，但大多數已知的糖氧化酶對單糖具有特異性。Lin等人(1991，《Biochim.Biophys.Acta》111841-47)已經描述了從分離自土壤的Acremoniumstrictum菌株T1的麥麩培養物中分離和純化的寡糖氧化酶。該酶具有氧化在還原端上帶有葡萄糖殘基的寡糖的能力。該酶顯示出針對麥芽糖、乳糖、纖維二糖以及由多達7個葡萄糖單位組成的麥芽寡糖的反應性。JP-A5-84074公開了該酶作為分析試劑的用途。本發明人還發現了一種具有比氧化葡萄糖更有效地氧化麥芽糖糊精和纖維糊精能力的新的糖氧化酶。這種新的氧化酶可以從Microdochium、特別是從M.nivale中得到。本發明人已經分離并保藏了這樣的一個菌株M.nivaleCBS100236。這種新的糖氧化酶的氨基酸序列與已知的氨基酸序列之間具有非常低的同源性(＜20％的同一性)。因此，本發明提供了一種用于制備面團和/或由面團制得的焙烤制品的方法，該方法包括向所述面團中加入一種糖氧化酶，所述糖氧化酶對作為底物的聚合度為2或者更高的寡糖要比對相應的單糖具有更高的活性。本發明還提供了一種包括所述糖氧化酶的面包改善添加劑。該面包改善添加劑可以包括第二種酶(淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶或磷脂酶)，并且它可以呈聚結的粉末或顆粒的形式。本發明進一步提供了一種新的糖氧化酶。這種糖氧化酶可以是由MicrodochiumnivaleCBS100236產生的或具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽，或者該酶可以是其類似物。這種糖氧化酶也可以從Microdochium的菌株中衍生而來并且對麥芽四糖具有氧化活性，在底物濃度為0.83mM的情況下該氧化活性至少是對葡萄糖的氧化活性的兩倍。本發明還提供了一種通過培養Microdochium來生產所說的糖氧化酶的方法。本發明進一步提供了一種包括編碼本發明糖氧化酶的核酸序列的核酸構建體，以及在本發明糖氧化酶的重組生產中有利地使用的重組表達載體和重組宿主細胞。在另一方面，本發明提供了用于生產本發明糖氧化酶的重組方法，該方法包括在有助于生產所述糖氧化酶的條件下培養宿主細胞以及從細胞和/或培養基中回收所述的糖氧化酶。發明詳述糖氧化酶在焙烤中的用途本發明提供了向面團中加入糖氧化酶，該糖氧化酶對作為底物的聚合度為2或者更高的寡糖要比對相應的單糖具有更高的活性。可以以如下所述的面團和/或面包改善添加劑的形式加入所述的糖氧化酶。該糖氧化酶通常是以這樣的數量加入的，即對于在面團和/或焙烤制品的至少一個目標性能方面提供可測量的效果而言，該加入量是有效的。在面團中，通常在面團中以對應于0.01-5％的量、具體地講以0.1-3％的量包含有面包改善和/或面團改善添加劑。通常以每千克面粉對應著0.01-100毫克酶蛋白的量加入所述的酶，其中優選0.1-25毫克/千克、更優選0.1-10毫克/千克、并且最優選0.5-5毫克/千克。面團中寡糖的水平可以通過加入淀粉酶來提高，其中該淀粉酶水解淀粉以形成作為主要產物的寡糖，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖α-淀粉酶(可以以Novamyl(R)購得)、米曲霉α-淀粉酶(可以以Fungamyl(R)購得)或β-淀粉酶。寡糖氧化酶的使用可以導致焙烤制品體積的增加和面包屑結構與柔軟性的改善，以及面團強度與穩定性的增加和粘性的下降，從而導致機械加工性能的改善。這一作用可能是下面所討論的谷蛋白強化作用的結果或者是除此以外的結果。當使用劣質面粉時，這種對面團的作用可能特別有利。就將要在工業中加工的面團來說，這種改善的機械加工性能特別重要。面團的穩定性是焙烤面團的最重要的特性之一，并且對大規模和小規模應用來說都是重要的。穩定的或硬的面團能夠更大程度地耐受混合時間、醒發時間以及在面團運輸過程中的機械振動，而軟的或不太穩定的面團則不太能耐受這些處理。既然具有高的谷蛋白含量和良好的谷蛋白質量的面粉有助于形成硬的面團，含有低的蛋白含量或具有劣質的谷蛋白質量的面粉導致形成軟的面團。因此，具有優良的流變學和加工性能的硬面團是由含有堅固的谷蛋白網絡的面粉所產生的。可以將寡糖氧化酶加入到面團物質的任何混合物中或面團中或者加入到面團中所含的任何物質中；即在合適的并且避免所述酶暴露于強烈的化學品或條件之中(在這種情況下，該酶可能會變得失活)的情況下，寡糖氧化酶可以在制備面團的任何步驟中加入或者可以分一步、兩步或多個步驟加入。底物的特異性在底物濃度為10mM或更低的情況下，所述的糖氧化酶優選對聚合度為2-6的寡糖(尤其是麥芽糖、麥芽三糖或麥芽四糖)要比對葡萄糖具有更高的活性。這一比較可以在1mM或者更低的底物濃度下進行，并且對麥芽四糖的活性優選是對葡萄糖的活性的兩倍以上。糖氧化酶可能對麥芽糖糊精、纖維糊精或麥芽四糖具有氧化活性，其中在0.83mM的底物濃度下該活性至少是對葡萄糖氧化活性的兩倍。這樣的底物濃度代表著根據普通焙烤實踐制得的普通面團的濃度。因此，例如在由面團制得的提取物中，發現麥芽糖的濃度為4.1mM，這對應于如Poulsen，C.等人(1996.《谷物化學》7551-57)所述的在40℃下以1∶10的比例提取1小時所得的41毫摩爾/千克的面團。進一步提到的是如果面粉中存在著足夠的內源淀粉分解活性(例如β-淀粉酶)或者正如時常在實踐中通常采用的那樣，向面團或面粉中加入外源淀粉分解酶的話，那么可提取的麥芽糖的量可能會更高。WO96/39851類似地公開了麥芽糖在面團中是以1.4％(w/w)的水平存在著的。因此，可以利用的底物(例如麥芽糖)的量可能根據面粉的種類和質量、配方、混合和發酵方法以及其它添加劑的存在而有所不同。在pH6和50mM下，來自M.nivale的優選糖氧化酶具有下列優先順序(降序)纖維二糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞木糖＞乳糖。在Michaeli-Menten動力學的基礎上，針對優選底物的表觀Km值為59mM(纖維二糖)，11mM(麥芽糖)，42mM(葡萄糖)；對葡萄糖和麥芽糖而言，Vmax是相似的。因此，所述氧化酶顯示出優先選擇麥芽糖而不是葡萄糖，特別是在低的底物濃度下(低于10mM)更是如此。在底物濃度為0.83mM的情況下，來自M.nivale的優選糖氧化酶能夠以比氧化相應的單糖更高的速率來氧化聚合度(DP)為DP2-DP5的寡糖。因此，該酶能夠以比水解葡萄糖更高的速率水解麥芽糖糊精和纖維糊精兩者，其中單糖的單元分別是通過α-1，4或β-1，4糖苷鍵連接的。糖氧化酶能夠同樣好地并且以比水解單糖葡萄糖高出大約10倍的水平來水解所有的具有DP2-DP5的纖維糊精。當以麥芽糖糊精作為底物時，所述糖氧化酶的活性在比起針對單糖高出11/2倍(對麥芽六糖來說)到幾乎高出5倍(對麥芽四糖來說)的范圍內變化。糖氧化酶的性質所述的糖氧化酶在pH為5-7的范圍內優選是有活性的并且是穩定的，例如在該范圍內具有大于40％的活性，并且最優選在該范圍內具有最佳的活性。優選來自M.nivale的糖氧化酶在pH大約為6時具有最佳的活性，并且在pH范圍為5-7時顯示出至少80％的活性(相對于最大的活性)。在40℃下，在pH范圍為4-9時所述的酶是穩定的，但當pH為3時該酶是不穩定的。所述的糖氧化酶在20-45℃時優選是有活性的并且是穩定的，例如在該范圍內具有大于50％的活性，并且最優選在該范圍內具有最佳的活性。來自M.nivale的優選糖氧化酶在大約40℃時具有最佳的活性，并且在30-60℃的范圍內顯示出至少70％的活性(相對于最大的活性)。在pH為6時，該酶在60℃以下是穩定的，但在70℃時該酶失活。它的變性溫度為73℃。所述糖氧化酶能夠氧化在還原端帶有葡萄糖殘基的還原性寡糖。它氧化1-位上的葡萄糖殘基以形成相應的酸。因此，它氧化麥芽糖以形成麥芽糖酸并氧化乳糖以形成乳糖酸。可以分離出所述糖氧化酶的活性，例如基本上不含其它非糖氧化酶的多肽，比如正如由SDS-PAGE測定的以蛋白質為基礎的純度大于大約80％、并且更優選純度大于大約90％。來自M.nivale的優選糖氧化酶具有由SDS-PAGE測定的約為52kDa的分子量以及約為8.9的等電點。它表現為一種脫氫酶，它具有攜帶電子受體(諸如鐵氰化鉀、亞甲藍、苯醌和2，6-二氯苯酚-靛酚(DCPIP))的附帶的(side)活性。糖氧化酶的來源所述的寡糖氧化酶可以從微生物的來源獲得，諸如從真菌中獲得，例如絲狀真菌或酵母，具體地講為Ascomycota的真菌，例如真子囊菌綱，尤其是核菌類。所述糖氧化酶可以來源于例如產有絲分裂孢子的核菌類，諸如支頂孢屬，具體地講為A.strictum，比如ATCC34717或T1；A.fusidioides，比如IFO6813；或A.potronii，比如IFO31197。在一個優選的實施方案中，寡糖氧化酶是從由Lin等人(1991，《Biochim.Biophys.Acta》111841-47)以及在JP-A5-84074中公開的來源得到的。所述糖氧化酶還可以從Xylariales的微生物中得到；尤其是產有絲分裂孢子的Xylariales，諸如Microdochium屬，特別是M.nivale的種。公眾在培養物保藏所中可以容易地獲得這些菌株，諸如美國模式培養物保藏所(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)和真菌菌種保藏中心(CBS)。在MicrodochiumSyd(Samuels與Hallett，1983，《TBMS》81473)中描述了Microdochium屬。在與Gerlachia、G.nivalis、G.oryzae、雪腐病鐮孢或Rynchosporiumoryzae同義的情況下已經描述了Microdochium的一些菌株。通過專著(Hyponectr)fide(Muller，1977，《Rev.mycol.》41129)進一步描述了這些菌株。優選的菌株為M.nivale，NN008551。該菌株是從在印度選取的天然來源分離出來的，并且將該菌株于1997年12月4日按照國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約以登記入冊號CBS100236保藏在真菌菌種保藏中心。本發明人已經分離出編碼來自M.nivaleCBS100236的糖氧化酶的基因并且已將其插入大腸桿菌中。在1998年6月12日按照國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約，將包含所述基因的大腸桿菌菌株保藏在位于IL州Peoria市1815大學北街的農業研究服務保藏所(NRRL)并且命名為NRRLB-30034。附加的酶可以將所述的糖氧化酶作為唯一的酶加入面團中，或者該酶可以與一種或多種附加的酶結合起來使用。附加的酶可以是淀粉酶(如上所述)、環糊精葡聚糖轉移酶、肽酶(具體地講為外肽酶、轉谷氨酰胺酶)、脂肪酶、磷脂酶、纖維素酶、半纖維素酶(具體地講為戊聚糖酶，諸如木聚糖酶)、蛋白酶、蛋白質二硫化物異構酶(例如WO95/00636中公開的蛋白質二硫化物異構酶)、糖基轉移酶以及氧化還原酶(例如過氧化物酶、漆酶、葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧合酶、L-氨基酸氧化酶或附加的糖氧化酶)等等。附加的酶可以是包括哺乳動物和植物在內的任何來源的，優選是微生物(細菌、酵母或真菌)來源的并且可以通過本領域通常采用的技術得到。所述的淀粉酶可以來源于細菌或真菌，具體地講可以來源于曲霉屬的菌株(優選黑色曲霉或米曲霉的菌株)或來源于芽孢桿菌屬的菌株。一些實例為α-淀粉酶(例如來自解淀粉芽孢桿菌)和淀粉葡糖苷酶(例如來自黑色曲霉)。商業產品包括BAN和AMG(丹麥NovoNovoNordiskA/S公司的產品)、GrindamylA1000或A5000(可以從丹麥GrindstedProducts公司得到)以及淀粉酶H和淀粉酶P(荷蘭Gist-Brocades公司的產品)。所述的蛋白酶可以是Neutrase(可以從丹麥NovoNordiskA/S公司得到)。所述的脂肪酶可以來源于Thermomyces(腐質霉屬)、Rhizomucor、假絲酵母屬、曲霉屬、根霉屬或假單胞菌屬的菌株，具體地講可以來自T.lanuginosus(H.lanuginosa，EP305，216)、Rhizomucormiehei(EP238，023)、南極假絲酵母(例如WO88/02775中所述的脂肪酶A或脂肪酶B)、黑色曲霉、德列馬根霉、無根根霉或蔥頭假單胞菌(EP214，761與WO89/01032)。面團面團通常是包括小麥粉或小麥面粉和/或其它類型的粗粉、面粉或淀粉(諸如玉米粉、玉米淀粉、黑麥粗粉、黑麥粉、燕麥粉、燕麥粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、米淀粉、米粉、馬鈴薯粗粉、馬鈴薯粉或馬鈴薯淀粉)的面粉面團。所述面團可以是新鮮的、冷凍的或是預先焙烤的(par-baked)。所述面團通常是發酵的面團或者是將要進行發酵處理的面團。可以以多種方式使面團發酵，比如通過加入化學膨松劑(例如碳酸氫鈉)或者通過加入發酵劑(發酵的面團)，但是優選通過加入合適的酵母培養物來使面團發酵，所述的培養物諸如啤酒糖酵母(面包酵母)的培養物，而所述啤酒糖酵母例如為市售的啤酒糖酵母的菌株。所述面團也可以包括其它常規的面團成分，例如蛋白質，比如牛奶或奶粉、谷蛋白和大豆；雞蛋(或是完整的雞蛋、蛋黃或是蛋清)；起酥油，諸如顆粒狀的脂肪或油；氧化劑，諸如抗壞血酸、溴酸鉀、碘酸鉀、偶氮二酰胺(ADA)或過硫酸銨；還原劑，諸如L-半胱氨酸；糖；鹽，諸如氯化鈉、醋酸鈣、硫酸鈉或硫酸鈣。所述面團還可以包括乳化劑，諸如甘油單酯或甘油二酯、甘油單酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油單酯的乳酸酯、甘油單酯的醋酸酯、聚氧乙烯硬脂酸鹽、磷脂、卵磷脂與溶血卵磷脂。所述面團可以是面食制品的面團，其中該面團優選是由硬粒小麥粉或者具有相當質量的面粉制得的。當在制備面食制品和面條的過程中使用時，所述的糖氧化酶可以使得谷蛋白的結構得以增強，并從而使面團的粘性減小、面團的強度增加以及面團產品的結構得以改善。焙烤制品本發明的方法可以用于由面團制備的任意種類的焙烤制品，所述制品或具有柔軟的特性或具有松脆的特性，它或是白色的、淺色的或是深色的類型。實例為面包(具體地講為白色的全麥面包或黑麥面包)，一般說來該面包呈枕形面包或小白面包的形狀，還有法式baguette型面包、pita面包、未經發酵的玉米餅、蛋糕、薄烤餅、餅干、曲奇餅、脆皮松餅、大餡餅皮、瑞典黑麥面包干、饅頭、比薩餅等。預混物本發明進一步涉及面團和/或由面團制得的焙烤制品的預混物，例如呈面粉組合物形式的預混物，其中預混物包括所述糖氧化酶和如上具體描述的可選擇的其它酶。可以通過將有關的酶與諸如面粉、淀粉、糖或鹽之類的合適載體混合在一起來制備預混物。預混物可以含有其它的面團改善和/或面包改善添加劑，例如包括以上提及的酶在內的任何添加劑。面團和/或面包改善添加劑可以以顆粒或聚結的粉末的形式來提供作為面團和/或面包改善添加劑的所述糖氧化酶。面團和/或面包改善添加劑優選具有很窄的粒度分布，其中超過95％(重量)的顆粒在25至500μm的范圍內。顆粒和聚結的粉末可以通過常規的方法制備，例如通過在流化床制粒機中將淀粉酶噴灑到載體上來制備。所述載體可以由具有合適粒度的微粒核心組成。載體可以是可溶的或是不溶的，該載體例如有鹽(比如氯化鈉或硫酸鈉)、糖(比如蔗糖或乳糖)、糖醇(比如山梨醇)、淀粉、大米、玉米糝或大豆。氨基酸序列所述糖氧化酶可以是一種多肽，該多肽是由MictodochiumnivaleCBS100236產生的，它具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列，或者它是由存在于大腸桿菌NRRLB-30034中的基因編碼的；或者它可以是其類似物。類似物可以具有至少50％的同一性，可以具有免疫交叉反應性，可以是等位基因變體或具有氧化酶活性的片段。糖氧化酶還可以是由在嚴格性差的條件下與SEQIDNO1的核酸序列雜交的核酸序列編碼的多肽、其互補鏈或其至少有100個核苷酸的亞序列。SEQIDNO2中所示的氨基酸序列與已知的序列之間具有小于20％的同一性。它與來自加利福尼亞罌粟的網硬蛋白氧化酶前體的氨基酸序列(GenPept登記入冊號為2897944)有13.6％是相同的，與來自氧化節桿菌的6-羥基-D-煙堿氧化酶的氨基酸序列(GenPept登記入冊號為122805)有17.8％是相同的。采用用于獲得肽以及測定肽序列的標準方法，例如由IRL出版社于1989年出版的Findlay與Geisow編輯的《蛋白質測序-實用方法》所述的方法，可以測定多肽的氨基酸序列。與現有技術氨基酸序列的比較已經表明SEQIDNO2與任何現有技術的氨基酸序列之間僅僅具有極少的同源性(＜20％)。所述多肽可以是具有相差不超過3個氨基酸的氨基酸序列的變體，其中優選相差不超過2個氨基酸、且更優選相差不超過1個氨基酸。所述糖氧化酶可以包括至少一個部分序列，該部分序列為SEQIDNO2的第1-24位所示的N-末端氨基酸序列或者為SEQIDNO2的第229-266、249-271、303-322、336-347、383-404、405-414以及420-440位所示的內部序列。另一方面，糖氧化酶可以與所說部分序列的至少一個序列之間至少有50％是相同的，其中優選至少有60％、更優選至少有70％、甚至更優選至少有80％、甚至更優選至少有90％并且最優選至少有97％是相同的，這些序列都定性地保留著所述糖氧化酶的活性(在下文中稱作“同源糖氧化酶”)及其等位基因形式和片段的活性，其中的片段保留著糖氧化酶的活性。在一個優選的實施方案中，同源糖氧化酶包括一種氨基酸序列，該序列與所說部分氨基酸序列的至少一個序列之間相差5個氨基酸、優選相差4個氨基酸、更優選相差3個氨基酸、甚至更優選相差2個氨基酸、且最優選相差1個氨基酸。糖氧化酶可以包括其等位基因形式或片段，其中該片段保留著糖氧化酶的活性。同源糖氧化酶的氨基酸序列可以通過插入或缺失一個或多個氨基酸殘基和/或以不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基來區別于任意的部分氨基酸序列。氨基酸的改變優選在本質上是不重要的，即并不顯著地影響糖氧化酶的三級結構和/或活性的保守性氨基酸的取代。不重要的氨基酸的改變也可以包括小的缺失，一般說來為1至大約30個氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-末端的延伸，諸如氨基-末端甲硫氨酸殘基的延伸；在大約20-25個殘基以內的小接頭肽；或者通過改變凈電荷或另一種功能來促進純化的小的延伸反應，諸如聚組氨酸序列、抗原表位或結合域的延伸。保守性取代的例子有在堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)小組內的取代。一般不改變特異性活性的氨基酸的取代在本領域中是公知的并且例如由紐約州的學術出版社于1979年出版的H.Neurath和R.L.Hill編著的《蛋白質》一書中有所描述。最常發生的置換為Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly并且也可以反過來置換。核酸序列本發明提供了一種包括編碼所述糖氧化酶的核酸序列的核酸序列。編碼糖氧化酶的核酸序列可以包括a)克隆到存在于大腸桿菌NRRLB-30034中的質粒中的編碼糖氧化酶的DNA序列的一部分，或b)在SEQIDNO1的第67-1550位中所示的DNA序列，或c)a)或b)中所限定的DNA序列的類似物，該類似物ⅰ)與所說的DNA序列之間具有至少50％的同一性，或ⅱ)在嚴格性差的條件下與所說的DNA序列雜交的序列、其互補鏈或其亞序列。同一性的程度可以至少為60％、優選大約70％、優選大約80％、更優選大約90％、甚至更優選大約95％、且最優選大約為97％。等位基因變體指的是占據了同一染色體基因座的兩種或多種可替換形式基因的任意一種。等位基因變異是通過突變自然發生的，并且可以在群體中造成多態性。基因的突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有變化)或者可以編碼具有改變了的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體所編碼的多肽。雜交是指按照標準的Southern印跡方法，在嚴格性差、中等或嚴格性強的條件下類似的核酸序列與所述的寡核苷酸探針進行雜交(例如在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切(sheared)并變性的鮭精DNA以及針對嚴格性強、中等和嚴格性差而言分別為50％、35％或25％的甲酰胺中進行預雜交和雜交)。在一個優選的實施方案中，該核酸序列能夠在嚴格性強的條件下與糖氧化酶的編碼區雜交，所述編碼區位于編碼包含于CBS100236之中的本發明糖氧化酶的核酸序列、其互補鏈或其亞序列上。編碼糖氧化酶的DNA序列可以從產生所述糖氧化酶的任何細胞或微生物中分離出來，其中采用本領域眾所周知的各種方法以便將來自其天然位置的核酸序列重新確定到不同的位置上，而在該新的位置上將會復制所述的核酸序列。根據本領域眾所周知的方法，可以將包含于CBS100236之中的核酸序列或其亞序列的糖氧化酶編碼區用于設計寡核苷酸探針，以便從不同屬或種的其它菌株中分離出編碼糖氧化酶的同源基因。因此，為了鑒定和分離出其中相應的基因，可以按照標準的Southern印跡方法針對與所述探針雜交的DNA來篩選由所述其它微生物制得的基因組或cDNA文庫。該探針可以比整個序列短許多，但長度應當至少為15個核苷酸、優選至少為25個核苷酸、且更優選至少為40個核苷酸。也可以使用更長的探針，優選其長度不超過1200個核苷酸。既可以使用DNA探針，又可以使用RNA探針。通常將探針進行標記以用于檢測相應的基因(例如用32P、3H、生物素或抗生物素蛋白標記)。根據本發明，可以在SEQIDNO1的基礎上構建優選的探針。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它本領域公知的分離技術，可以分離出來自所述其它微生物的基因組或其它DNA。可以將來自文庫或分離的DNA的DNA轉移并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體物質上。為了鑒定出與編碼包含于CBS100236之中的本發明糖氧化酶的核酸序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用載體物質，其中最后優選在不高于40℃下每次都使用2XSSC、0.2％SDS洗滌載體物質，洗滌3次30分鐘，所述溫度更優選不高于45℃、更優選不高于50℃、更優選不高于55℃、甚至更優選不高于60℃、尤其是不高于65℃。采用X-光片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。能夠與寡核苷酸探針雜交的本發明分離的核酸序列可以從任何屬的微生物中、例如從細菌或真菌來源中得到，其中所述寡核苷酸探針與編碼包含于CBS100236之中的本發明的糖氧化酶的核酸序列、其互補鏈或其亞序列雜交。所述糖氧化酶可以從給定的微生物來源中獲得(或是內部生成的)。因此，糖氧化酶可以由來源生物體或由細胞生產，其中在該細胞中已經插入了來自所述來源的基因。此外，使用上面提到的探針，可以從包括由自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離出的微生物在內的其它來源鑒定并得到同源基因。用于從自然棲息地中分離微生物的技術是本領域眾所周知的。然后，通過類似地篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫，可以得到核酸序列。一旦用上述探針已經檢測出核酸序列，于是通過采用那些本領域普通技術人員眾所周知的技術(例如參見Sambrook等人，1989，出處同上)，可以分離或克隆所述的序列。用于分離或克隆核酸序列的公知技術包括從基因組DNA中分離、從cDNA中制備、或它們的結合。例如通過采用使用特異性引物的眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)，例如在US4，683，202或R.K.Saiki等人(1988，《科學》239487-491)中所述的方法，可以實現由所述基因組DNA克隆出本發明的核酸序列。另外可以參見例如Innis等人，1990，《PCR方案方法與應用指南》，學術出版社，紐約。從產生糖氧化酶的生物體或者另一種或有關的生物體中可以克隆出核酸序列，因此該核酸序列例如可以是核酸序列的糖氧化酶編碼區的等位基因變體或物種變體。另一方面，通過確定的標準方法，例如通過由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981，《四面體通訊》221859-1869)所述的phosphoamidite方法或者通過由Matthes等人(1984，《EMBO雜志》3801-805)所述的方法，可以合成制備出編碼所述酶的DNA序列。在前面提到的phosphoamidite方法中，例如在DNA自動合成儀中合成出寡核苷酸，將寡核苷酸純化、退火、連接并且克隆到合適的載體中。對于與所述糖氧化酶基本類似的糖氧化酶的合成而言，編碼所述糖氧化酶的核酸序列的修飾可能是必須的。術語與所述糖氧化酶“基本類似”是指所述糖氧化酶的非天然存在的形式。這種糖氧化酶與從其天然來源分離出的糖氧化酶的區別可能在于一些人工改造的方式。例如，可能使人感興趣的是合成出所述糖氧化酶的變體，其中所述變體在如使用位點誘變的特異活性、熱穩定性、氧化穩定性、最佳pH或類似方面有所不同。在編碼包含于CBS100236之中的本發明糖氧化酶的核酸序列或其亞序列的糖氧化酶編碼區的基礎上，和/或通過引入核苷酸的取代，其中該取代并不產生由所述核酸序列編碼的糖氧化酶的另一種氨基酸序列但卻對應著打算生產所述酶的宿主生物體的密碼子使用，或者通過引入可能產生不同氨基酸序列的核苷酸的取代，便可以構建類似的序列。對于核苷酸取代的一般性描述，例如參見Ford等人，1991，《蛋白質的表達與純化》295-107。這種取代可以在對所述分子的功能至關重要的區域之外進行并且仍然生成了具有活性的糖氧化酶。根據本領域公知的方法，比如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見Cunningham與Wells，1989，《科學》2441081-1085)，可以鑒定出對由分離出的核酸序列編碼的糖氧化酶的活性而言是必須的并因而優選不進行取代的氨基酸殘基。在后一技術中，在所述分子中每個帶正電的殘基上引入突變，并且檢測所得突變分子的蛋白酶活性以鑒定出對所述分子的活性至關重要的氨基酸殘基。通過分析晶體結構也可以測定底物-酶相互作用的位點，其中晶體結構是通過諸如核磁共振分析、結晶學或光親和標記(例如參見deVos等人，1992，《科學》255306-312；Smith等人，1992，《分子生物學雜志》224899-904；Wlodaver等人，1992，《FEBS通訊》30959-64)之類的技術測定的。所述的糖氧化酶可以是一種融合多肽，其中將另一種多肽融合到所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽是通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)融合到本發明核酸序列(或其部分)中來產生的。用于生產融合多肽的技術是本領域公知的，并且包括將編碼所述多肽的編碼序列連接起來，從而使得它們位于框架中，并且融合多肽的表達處于同一啟動子和終止子的控制之下。還有另一種用于鑒定糖氧化酶編碼克隆的方法涉及將基因組DNA的片段插入表達載體(比如質粒)中，用所得的基因組DNA文庫轉化糖氧化酶陰性細菌，然后將轉化的細菌涂布到含有糖氧化酶底物的瓊脂上，從而使得鑒定出表達糖氧化酶的克隆。最后，所述的DNA序列可以是基因組與合成來源混合的，可以是合成與cDNA來源混合的或是基因組與cDNA來源混合的，所述序列是根據標準的技術在適宜的情況下通過將合成的、基因組的或cDNA來源的片段連接在一起制得的，其中所述片段對應于整個DNA序列的各個區域。氨基酸或核酸序列的同一性本說明書與權利要求書中所指的多肽的同一性被確定為表明由第二個序列衍生出的第一個序列的該兩個序列之間相同的程度。根據在Needleman，S.B.與Wunsch，C.D.(1970)《分子生物學雜志》48443-45中所述的方法并按照用于多肽序列比較的如下設置缺口(gap)產生罰分(penalty)為3.0且缺口延伸罰分為0.1，便可以適當地測定出同一性。通過公知的計算機程序，比如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星軟件包程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學計算機小組，575科學道，麥迪遜市，威斯康星州，美國53711)可以進行測定。另一方面，通過Clustal方法(Higgins，1989，《CABIOS》5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，麥迪遜市，威斯康星州)可以測定同一性的程度，其中所述軟件帶有同一性的平臺(table)并按照如下的多個對比(alignment)參數缺口罰分為10、缺口長度罰分為0。成對的對比參數為Ktuple=1、缺口罰分=3、窗口=5、且對角線=5。類似多肽的成熟區與上述糖氧化酶序列之間的同一性程度表現為優選至少60％、更優選至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、尤其是至少為95％。對本發明來說，通過帶有同一性平臺、缺口罰分為10以及缺口長度罰分為10的Clustal方法(Higgins，1989，《CABIOS》5151-153)來測定兩個核酸序列之間同一性的程度。免疫化學特性所述糖氧化酶與天然的M.nivale菌株或其表達糖氧化酶活性的有性型(teleomorph)的糖氧化酶之間具有免疫化學同一性或部分的免疫化學同一性。在這一實施方案中，將所說的糖氧化酶用于生產具有免疫反應性或結合到所述多肽表位上的抗體。與天然M.nivale的多肽之間具有免疫化學同一性的多肽是指含有抗天然M.nivale多肽的抗體的抗血清是否以相同的方式與其它多肽發生反應，比如采用具體的免疫化學技術來觀察沉淀是否完全融合、沉淀的形態是否相同和/或電泳遷移率是否相同。對免疫化學同一性的進一步解釋由Axelsen、Bock與Kroll在Blackwell科學出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll與B.Weeks編輯的《定量免疫電泳手冊》第10章中進行了描述。部分的免疫化學同一性是指含有抗天然M.nivale多肽的抗體的抗血清以部分相同的方式與其它的多肽反應，比如采用具體的免疫化學技術來觀察沉淀是否部分融合、沉淀的形態是否部分相同和/或電泳遷移率是否部分相同。對部分免疫化學同一性的進一步解釋由Bock與Axelsen在Blackwell科學出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll與B.Weeks編輯的《定量免疫電泳手冊》第11章中進行了描述。免疫化學特性可以通過免疫交叉反應同一性試驗來測定，比如眾所周知的Ouchterlony免疫雙擴散方法。具體地講，根據下列文獻所述的方法通過免疫接種兔子(或嚙齒類動物)便產生了抗所述多肽的抗血清Harboe與Ingild在Blackwell科學出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll與B.Weeks編輯的《定量免疫電泳手冊》第23章中，或者Johnstone與Thorpe在Blackwell科學出版社于1982年出版的《實用免疫化學》中(更具體地講在第27-31頁中)。優選地，所述抗體為單克隆抗體。例如根據在紐約冷泉港的冷泉港出版社于1988年出版的E.Harlow與D.Lane編輯的《抗體-實驗指南》中所述的方法，可以制備出單克隆抗體。例如通過硫酸銨沉淀、接下來通過透析和離子交換層析(例如DEAE-Sephadex)，可以從抗血清中獲得純化的免疫球蛋白。糖氧化酶的生產采用本領域公知的方法，通過在含有合適的碳源和氮源以及無機鹽的營養培養基上發酵以上提到的微生物菌株，便可以生產出所述的糖氧化酶(例如Bennett，J.W與LaSure，L.編輯《真菌附加基因操作》學術出版社，CA，1991)。合適的培養基可以通過商業途徑從供應商處得到或者可以根據出版的組成來制備(例如在美國模式培養物保藏所的目錄中)。在20℃至30℃范圍內的溫度適合于糖氧化酶的生長和生產。發酵可以是培養細胞以便使所說的糖氧化酶表達或分離的任何方法。因此，可以將發酵理解為包括在合適的培養基中并且在使得糖氧化酶表達或分離的條件下進行的搖瓶培養、在實驗室或工業發酵罐中進行的小規模或大規模的發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)。由上述方法生產得到的糖氧化酶可以通過常規的方法從發酵培養基中進行回收，其中包括、但卻不限于離心、過濾、噴霧干燥、蒸發或沉淀。然后可以將回收的蛋白質通過各種層析工藝進一步純化，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。所述的糖氧化酶可以通過下列方法生產，該方法包括(a)培養表達糖氧化酶的野生型生物體，以便生產出包括糖氧化酶的上清液；以及(b)回收糖氧化酶。另一方面，所述糖氧化酶也可以通過需氧培養轉化的宿主生物體來生產，其中所述生物體含有來自以上提到的菌株的合適的遺傳信息。這種轉化體可以通過如下所述的本領域公知的方法進行制備和培養。核酸構建體本發明還涉及核酸構建體，它包括可操作地連接到一個或多個控制序列上的本發明的核酸序列，其中所述控制序列能夠在與所述控制序列相適應的條件下在合適的宿主細胞中指導編碼序列的表達。核酸構建體可以是單鏈的或是雙鏈的核酸分子，它是從天然存在的基因中分離出來的或是已經進行了修飾以便含有核酸的區段，所述核酸區段以在自然界中不以其它方式存在的一種方式進行結合與并置的。當核酸構建體含有為表達本發明編碼序列所需的所有的控制序列時，所述的核酸構建體可以是表達盒。編碼序列可以是這樣的一種序列，其中當處于合適的控制序列的控制之下時，該序列被轉錄成mRNA并且被翻譯成本發明的糖氧化酶。通常通過位于5’-端的翻譯起始密碼子ATG和位于3’-端的翻譯終止密碼子來確定編碼序列的邊界。編碼序列可以包括、但卻不限于DNA、cDNA和重組的核酸序列。可以以多種方式操作本發明分離的核酸序列，以便提供糖氧化酶的表達。取決于表達載體，在核酸序列插入載體之前該序列的操作可能是人們希望的或是必須的。利用克隆方法用于修飾核酸序列的技術是本領域眾所周知的。控制序列可以包括對表達核酸序列的編碼序列而言是必須的或是有利的所有的元件。每個控制序列對于編碼糖氧化酶的核酸序列來說可以是天然的或是外源的。所述的控制序列包括、但卻不限于前導序列、啟動序列、信號序列以及轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。為了引入有助于將控制序列與編碼糖氧化酶的核酸序列的編碼區連接在一起的特異性限制位點，可以使控制序列具備多個接頭。控制序列可以為合適的啟動序列，即一種由用于表達所述核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動序列含有介導糖氧化酶表達的轉錄控制序列。所述啟動子可以是在所選的宿主細胞中表現出轉錄活性的任何的核酸序列，并且可以從編碼胞外的或胞內的糖氧化酶的基因中得到，其中所述基因對宿主細胞而言或是同源的或是異源的。用于指導本發明核酸構建體轉錄的合適的啟動子的例子(尤其是在細菌宿主中)為由下列來源得到的啟動子大腸桿菌的乳糖操縱子、天藍色鏈霉菌的瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌的蔗糖6-果糖基轉移酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌的生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌的青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌的xylA與xylB基因和原核生物的β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，《美國國家科學院學報》753727-3731)以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，《美國國家科學院學報》8021-25)。其它的啟動子在下列文獻中進行了描述《美國科學》中的“來自重組細菌的有用蛋白質”1980，24274-94；以及Sambrook等人，1989，出處同上。對于在真菌宿主中的轉錄來說，有用的啟動子的例子包括那些可以由編碼下列酶的基因衍生出來的啟動子米曲霉的TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei的天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉的中性α-淀粉酶、黑色曲霉的酸穩定性α-淀粉酶、黑色曲霉的葡糖淀粉酶、Rhizomucormiehei的脂肪酶、米曲霉的堿性蛋白酶、米曲霉的丙糖磷酸異構酶以及構巢曲霉的乙酰胺酶。控制序列也可以為合適的轉錄終止序列，即一種由所選的宿主細胞識別的用于終止轉錄的序列。可以將終止序列可操作地連接到編碼糖氧化酶的核酸序列的3’端。在本發明中可以使用任何在所選的宿主細胞中起作用的終止子。控制序列也可以為合適的前導序列，即對宿主細胞的翻譯來說很重要的mRNA的非翻譯區。可以將前導序列可操作地連接到編碼糖氧化酶的核酸序列的5’端。在本發明中可以使用任何在所選的宿主細胞中起作用的前導序列。控制序列還可以為信號肽的編碼區，該編碼區編碼與糖氧化酶的氨基末端相連的氨基酸序列，它可以指導所表達的糖氧化酶進入細胞的分泌途徑。信號肽的編碼區對糖氧化酶而言可以是天然的或者可以從外源來源中獲得。核酸序列的編碼序列的5’端本來就可以含有信號肽的編碼區，其中在翻譯讀框中該編碼區天然地與編碼分泌性糖氧化酶的編碼區的區段相連。另一方面，編碼序列的5’端可以含有這樣的信號肽編碼區，該編碼區對于編碼分泌性糖氧化酶的編碼序列的部分而言是外源的。在編碼序列通常不含信號肽的編碼區的情況下，可能需要外源的信號肽編碼區。另一方面，相對于通常和編碼序列相連的天然信號肽的編碼區來說，為了獲得糖氧化酶分泌的增強，外源信號肽的編碼區可以簡單地替換天然信號肽的編碼區。在本發明中可以使用能夠指導所表達的糖氧化酶進入所選宿主細胞分泌途徑中的任何信號肽的編碼區。針對細菌宿主細胞、具體地講為芽孢桿菌屬的有效的信號肽編碼區為由下列來源得到的信號肽的編碼區來自芽孢桿菌NCIB11837的生麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌的β-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)以及枯草芽孢桿菌的prsA基因。由Simonen與Palva(1993，《微生物學回顧》57109-137)描述了其它的信號肽。表達載體本發明還涉及重組表達載體，它包括本發明的核酸序列、啟動子、以及轉錄和翻譯的終止信號。可以將上述各種核酸序列與控制序列連接在一起以生產出重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以便可以使得在所述位點插入或取代編碼糖氧化酶的核酸序列。另一方面，通過將核酸序列或包括本發明核酸序列的核酸構建體插入到合適的表達載體中，便可以表達本發明的核酸序列。在創建表達載體的過程中，使編碼序列位于載體中，以便將編碼序列可操作地與合適的用于表達的并且有可能用于分泌的控制序列相連。在真核生物中，所述表達載體還可以包括可操作地與編碼糖氧化酶的DNA序列相連的聚腺苷酸化序列。終止序列和聚腺苷酸化序列可以適當地來源于與啟動子相同的來源。重組表達載體可以是能夠方便地經歷重組DNA的步驟并且能夠進行所述核酸序列表達的任何載體。載體的選擇通常取決于載體與該載體將被引入的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性的或閉環的質粒。載體可以為自主復制的載體，即該載體以染色體外的實體的形式存在并且其復制不依賴于染色體的復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的元件。另一方面，所述載體可以是這樣的一種載體，即當將其引入宿主細胞中時，該載體被整合到基因組中并且與已被整合到基因組中的所述染色體一起復制。載體系統可以是單一的載體或質粒或者是兩個或多個載體或質粒，它們共同含有將被引入到宿主細胞的基因組中的總DNA或轉座子。本發明的載體優選含有一個或多個允許容易地選擇轉化細胞的選擇標記。選擇標記是一種基因，其產物提供了抗微生物劑的抗性、對重金屬的抗性以及對營養缺陷體的原養型等。細菌選擇標記的例子有來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者為賦予了抗生素抗性(比如氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環素的抗性)的標記。此外，通過例如在WO91/09129中所述的共轉化也可以實現選擇，其中選擇標記位于單獨的載體上。本發明的載體含有這樣的元件，所述元件允許將載體穩定地整合到宿主細胞的基因組中或者允許在細胞中不依賴于細胞基因組的載體的自主復制。當將本發明的載體引入宿主細胞時，可以將該載體整合到宿主細胞的基因組中。對整合來說，載體可以依靠編碼糖氧化酶的核酸序列或該載體的任何其它的元件，以便通過同源重組將載體穩定地整合到基因組中。另一方面，載體可以含有用于指導通過同源重組整合到宿主細胞基因組中的附加的核酸序列。附加的核酸序列可以使載體在染色體的精確位置上整合到宿主細胞的基因組中。為了提高在精確位置上整合的可能性，整合元件優選應當含有足夠數量的核酸，比如100至1，500個堿基對、優選400至1，500個堿基對并且最優選800至1，500個堿基對，其中它們與相應的靶序列之間是高度同源的以便提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。對自主復制而言，載體可以進一步包括一個可以使該載體在目的宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的例子有允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，以及允許在芽孢桿菌中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。復制起點可以是一種具有突變以在芽孢桿菌細胞中發揮其對溫度敏感功能的復制起點(例如參見Ehrlich，1978，《美國國家科學院學報》751433)。可以將超過一個拷貝的編碼本發明糖氧化酶的核酸序列插入宿主細胞中，以擴增該核酸序列的表達。通過采用本領域眾所周知的方法將至少一個添加拷貝的核酸序列整合到宿主細胞基因組中并選擇轉化體，便可以實現所述核酸序列的穩定擴增。在WO94/14968中描述了用于實現基因組DNA序列擴增的方便方法。適合于構建編碼糖氧化酶并分別含有啟動子、終止子和其它元件的載體的方法是本領域普通技術人員眾所周知的(例如參見Sambrook等人，出處同上)。此外，理想的是加入相對于宿主細胞的生長而言可以調節糖氧化酶表達的調節序列。調節系統的例子為那些隨化學或物理刺激而導致基因的表達開始或停止的系統，其中包括存在著調節化合物。原核生物系統中的調節系統包括lac，tac和trp操縱系統。調節序列的其它例子為那些可以使得基因擴增的序列。在這些情況下，編碼糖氧化酶的核酸序列將會被可操作地與調節序列相連。雖然在一些情況下胞內的表達可能是有利的，例如當使用某些細菌作宿主細胞時，但通常優選的是，所表達的糖氧化酶是胞外分泌的。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，所述宿主細胞或者包括如上所述的DNA構建體或者包括表達載體，它們可以有利地用于重組生產糖氧化酶的過程中。宿主細胞可以是親代細胞的任何后代，由于復制過程中發生的突變，后代細胞與親代細胞是不同的。優選用包括核酸序列的載體轉化細胞，接下來將該載體整合到宿主染色體中。“轉化”是指將包括本發明核酸序列的載體引入宿主細胞中，以便將該載體保持為染色體的整合體或作為自復制的染色體外的載體。通常認為整合是有利的，這是因為在細胞中更有可能穩定地保持所述的核酸序列。通過如上所述的同源或非同源重組發生載體向宿主染色體中的整合。宿主細胞的選擇在很大程度上取決于編碼糖氧化酶的基因及其來源。宿主細胞可以是高等生物體、比如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選微生物的細胞、例如細菌或真菌(包括酵母)的細胞。合適的細菌細胞的例子有革蘭氏陽性細菌，其中包括、但卻不限于芽孢桿菌屬的細胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、強固芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬的細胞，例如變青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或者為革蘭氏陰性細菌，比如大腸桿菌以及假單胞菌種。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞為遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的細胞。細菌宿主細胞的轉化例如可以通過下列方法來實現原生質體轉化(例如參見Chang與Cohen，1979，《普通分子遺傳學》168111-115)、使用感受態細胞(例如參見Young與Spizizin，1961，《細菌學雜志》81823-829；或者Dubnau與Davidoff-Abelson，1971，《分子生物學雜志》56209-221)；電穿孔(例如參見Shigekawa與Dower，1988，《生物技術》6742-751)；或接合(例如參見Koehler與Thorne，1987，《細菌學雜志》1695771-5278)。宿主細胞也可以是真核生物，比如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。有用的哺乳動物的細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉(HeLa)細胞、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞、或可以得到的任何編號的其它無限增殖化細胞系(例如可以從美國模式培養物保藏所得到)。在一個優選的實施方案中，宿主細胞為真菌細胞。正如本文中所用的那樣，“真菌”包括門(phyla)Ascomycota、Basidomycota、Chytridiomycota和Zygomycota[如Hawksworth等人在《Ainsworth與Bisby氏真菌字典》第8版(1995，CAB國際，大學出版社，劍橋，英國)中所定義的]以及Oomycota(如在Hawksworth等人，1995，出處同上，第171頁中引用的)和所有的產有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等人，1995，出處同上)。代表性的Ascomycota的小組例如包括鏈孢霉屬、Eupenicillium(=青霉屬)、Emericella(=曲霉屬)、Eurotium(=曲霉屬)以及以上所列舉的真酵母。Basidiomycota的例子包括蘑菇、銹菌和黑粉菌。代表性的Chytridiomycota的小組例如包括Allomyces、小芽枝霉屬、雕蝕菌屬以及水生真菌。代表性的Oomycota的小組例如包括Seprolegniomycetous的水生真菌(水霉)、比如綿霉屬。產有絲分裂孢子的真菌的例子包括曲霉屬、青霉屬、假絲酵母屬以及鏈格孢屬。代表性的Zygomycota的小組例如包括根霉屬和毛霉屬。在一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞為酵母細胞。本文中所用的“酵母”包括產子囊酵母(Endomycetales)、產擔孢子酵母以及屬于半知菌類(酵母菌)的酵母。產子囊酵母被劃分為蝕精霉科和糖酵母科。后者由四個亞科組成，即裂殖糖酵母亞科(例如裂殖糖酵母屬)、拿遜氏酵母亞科、油脂酵母亞科以及糖酵母亞科(例如畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬和糖酵母屬)。產擔孢子酵母包括Leucosporidim屬、紅冬孢屬、鎖擲酵母屬、Filobasidium屬與線黑粉菌屬。屬于半知菌類的酵母被劃分為擲孢酵母科(例如Sorobolomyces屬和布氏彈孢酵母屬)與隱球酵母科(例如假絲酵母屬)這兩科。酵母可以為比如在《酵母生物學與活性》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.與Davenport，R.R.編輯的應用細菌學協會的專題論文集系列9，1980)中描述的那樣。酵母生物學和酵母遺傳學操作是本領域眾所周知的(例如參見《酵母生物化學與遺傳學》Bacil，M.，Horecker，B.J.與Stopani，A.O.M.編輯，第2版，1987；《酵母》Rose，A.H.與Harrison，J.S.編輯，第2版，1987；以及《糖酵母的分子生物學》Strathem等人編輯，1981)。在更為優選的實施方案中，酵母宿主細胞為假絲酵母屬、克魯維氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、畢赤氏酵母屬或Yarrowia屬的種的細胞。在最優選的實施方案中，酵母宿主細胞為卡爾斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、道格拉斯氏糖酵母、克魯維氏糖酵母、Saccharomycesnorbensis或卵形糖酵母的細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞為乳克魯維氏酵母的細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞為Yarrowialipolytica的細胞。在一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞為絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括Eumycota和Oomycota亞門(如Hawksworth等人，1995，出處同上所定義的)的所有的絲狀體。絲狀真菌的特征在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復合多糖組成的營養菌絲壁。營養生長是通過菌絲的延伸，并且碳的分解代謝是專性需氧的。相比之下，比如啤酒糖酵母之類的酵母的營養生長是通過單細胞菌體的芽殖，并且碳的分解代謝可能是發酵型的。在一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、草根霉屬、Tolypocladium和木霉屬的種的細胞、但并不限于這些屬的種的細胞。在最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑色曲霉或米曲霉的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為Fusariumcerealis、Fusariumcrookwelense、禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、接骨木鐮孢、硫色鐮孢或Fusariumvenenatum的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為Humicolainsolens或Humicolalanuginosa的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為米赫毛霉的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為嗜熱毀絲霉的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為粗糙鏈孢霉的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為產紫青霉的細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞為Thielaviaterrestris的細胞。在另一個最優選的實施方案中，木霉屬的細胞為Trichodermaharzianum、康寧氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉的細胞。以本身公知的方式通過涉及原生質體形成、原生質體轉化以及細胞壁再生的方法可以轉化真菌細胞。在EP238023以及Yelton等人的論文(1984，《美國國家科學院學報》811470-1474)中描述了用于轉化曲霉屬宿主細胞的合適的方法。由Malardier等人(1989，《基因》78147-156)或者在共同未決的系列號為08/269，449的美國專利申請中描述了轉化鐮孢屬的種的合適方法。可以使用由下列文獻所述的方法來轉化酵母Becker與Guarente在Abelson，J.N.與Simon，M.I.編輯的《酶學方法》(紐約學術出版社公司)第194卷第182-187頁中的“酵母遺傳學與分子生物學指南”；Ito等人，1983，《細菌學雜志》153163；與Hinnen等人，1978，《美國國家科學院學報》751920。通過采用Graham與VanderEb(1978，《病毒學》52546)的磷酸鈣沉淀方法進行直接的攝取可以轉化哺乳動物的細胞。生產的重組方法所述糖氧化酶可以通過重組的方法來生產，該方法包括在有助于生產所說糖氧化酶的條件下培養如上所述的宿主細胞以及從細胞和/或培養基中回收該糖氧化酶。在這些方法中，采用本領域公知的方法在適合于糖氧化酶生產的營養培養基中培養細胞。例如，在合適的培養基中并且在使得糖氧化酶表達和／或分離的條件下對細胞進行搖瓶培養、在實驗室或工業發酵罐中進行小規模或大規模的發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)。采用本領域公知的方法，在包括碳源和氮源以及無機鹽的合適的營養培養基中進行培養(例如參見M.V.Arbige等人在AbrahamL.Sonenshein，JamesA.Hoch與RichardLosick編輯的《枯草芽孢桿菌與其它革蘭氏陽性細菌》美國微生物協會，華盛頓特區，1993，第871-895頁中)。合適的培養基可以通過商業途徑從供應商處得到或者可以根據出版的組成來制備(例如在美國模式培養物保藏所的目錄中)。如果糖氧化酶是分泌到營養培養基中的話，那么可以直接從培養基中回收糖氧化酶。如果糖氧化酶是不分泌的，那么從細胞裂解物中回收糖氧化酶。采用本領域公知的方法可以檢測對所述多肽具有特異性的糖氧化酶。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、酶產物的生成或酶底物的消失。例如，可以將酶測定用于測定所述多肽的活性。得到的糖氧化酶可以通過本領域公知的方法回收。例如，糖氧化酶可以通過常規的方法從營養培養基中回收，其中包括、但卻不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本發明的糖氧化酶可以通過本領域公知的各種方法來純化，其中包括、但卻不限于層析(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)、電泳方法(例如制備等電聚焦(IEF))、溶解度之差(例如硫酸銨沉淀)或提取(例如參見《蛋白質的純化》J.C.Janson與LarsRyden編輯，VCH出版社，紐約，1989)。工業應用除了以上所討論的在焙烤中的用途以外，例如還可以將所述的糖氧化酶以起到抗菌劑作用的有效量用于個人護理產品中，諸如牙膏(具體地講在希望使牙齒變白的情況下的牙膏)、漱口劑、假牙清潔劑、液體皂、皮膚護理霜和護膚液、頭發護理與身體護理制劑以及用于清潔隱形眼鏡的溶液。所述糖氧化酶也可以為衣物洗滌劑組合物或餐具洗滌劑組合物的組分，并且可以用于產生過氧化氫。衣物洗滌劑組合物可以包括表面活性劑、所說的糖氧化酶以及該糖氧化酶的底物。餐具洗滌劑組合物可以包括所說的糖氧化酶和漂白劑前體或過氧酸以及糖氧化酶的底物。所述的糖氧化酶可以用作分析試劑，例如用于測定給定樣品中存在的還原糖的數量，或者可以將該酶固定化并插入到電極中以便提供對淀粉或纖維素水解的連續測量。此外，可以將本發明的糖氧化酶用于把在還原端帶有葡萄糖殘基的寡糖氧化成相應的酸，例如用于由乳糖生產乳糖酸。用于測定糖氧化酶活性的方法DMAB/MBTH測定預混物7.2mM3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)0.33mM3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)4mg/ml重組的Coprinuscinereus過氧化物酶(rCiP)0.4M/0.4M磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液(pH6)培養混合物180μl500mM葡萄糖25mM檸檬酸鹽25mM磷酸鹽pH6.020μl樣品使培養混合物在30℃下培養20分鐘。然后，將100ml的培養混合物與100ml的預混物混合在一起。30秒鐘后，讀取540(或490)nm下的吸光度。其中包括0.2mMH2O2的標準樣品。4AA-TOPS測定測定是在96孔微量滴定板中進行的。將100μl0.1M的磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液(pH6)與50μl0.24M的葡萄糖和50μl預混物(3mM4-氨基安替比林(4AA)、7mMN-乙基-N-磺丙基-m-甲苯胺(TOPS)、40PODU/mlrCiP)混合，并且通過加入40μl經過了適當稀釋的氧化酶溶液來啟動反應。采用易于從分子設備公司得到的Vmax微量滴定板，在490nm下測量作為時間函數的吸收值，并且以吸收值線性增加的斜率作為活性。實施例實施例1來自野生型M.nivale的糖氧化酶的生產M.nivale的培養采用下列完全培養基來發酵M.nivaleCBS100236的菌株搖瓶培養基BARofec(Roquette)10克NH4NO3(Merck)10克KH2PO4(Merck)10克Solcafloc(Dicacel)40克MgSO4-7(H2O)0.75克Pluronic100％(BASF)0.1ml加入自來水至最終體積為1000ml。將pH調節到pH6.5，然后加入1片500mg的碳酸鈣。將100ml的完全培養基加入每個體積為500ml的帶有2個檔板的搖瓶中。然后將搖瓶在121℃下高壓滅菌40分鐘。由孢子懸浮液制備接種物，其中孢子懸浮液是由在26℃下培養了7天、然后在20ml無菌水和Tween80(ICI)中進行了洗滌的5PDA斜面培養物制得的。以2ml的孢子懸浮液接種每個搖瓶，然后在26℃下并且在125rpm的恒定振蕩下培養10天。在培養結束時，使細胞成為片狀，并從上清液中純化所述的酶。純化從5升的發酵中，使用截止分子量為10kDa的過濾器(Filtron)通過超濾將4300ml經過離心的發酵肉湯過濾并濃縮至660ml。用介于200與400mg/ml之間的(NH4)2SO4沉淀該酶。在將沉淀溶解在25mMTris(pH7.5)之后，通過超濾洗滌樣品，直至導電率與25mMTris(pH7.5)相同為止。使樣品通過體積為300ml的用同一緩沖液平衡過的Q-SepharoseXL柱(Pharmacia)并收集流出物。在加入(NH4)2SO4至100mg/ml時，使樣品通過用25mMTris(pH7.5)與100mg(NH4)2SO4/ml平衡過的HIC柱(Toyopearl-丁基650)(TosoHaas)。用25mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)洗滌流出物，并將其加入用同一緩沖液平衡過的SP-Sepharose柱(Pharmacia)中。使用線性鹽梯度來洗脫被結合的酶，使得超過10個柱的體積時達到溶于25mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)的1MNaCl。匯集活性組分。通過在苯基-superose柱上的HIC層析來最終完善該制備過程，使用在超過20個柱的體積時線性梯度由2M(NH4)2SO4進行至0M的25mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)的緩沖液。匯集活性級分并在25mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中透析24小時。鑒定由SDS-PAGE純化的蛋白質的分析表明分子量約為52kDa，并且通過等電聚焦測定pl約為8.9。純化的M.nivale的氧化酶還呈現出明顯的黃色，這表明存在著作為輔因子的FAD。對酶的吸光度的仔細研究揭示出385和440nm處的兩個吸收的最大值，這是該酶中存在FAD的特征。在存在葡萄糖的情況下，440nm處的峰消失了，這表明FAD被還原了。實施例2來自M.nivale的糖氧化酶的氨基酸序列還原并使M.nivale的高度純化的制品進行烷基化。然后用賴氨酰基內肽酶(Wako)或TPCK-胰蛋白酶(Promega)降解該酶的樣品。通過在Vydac218TP柱(Vydac)上的RP-HPLC以TFA(三氟乙酸)/異丙醇分離出肽，并且在Vydac218TP柱上以TFA/乙腈對肽重新純化。通過Edman降解分析所選擇的肽。通過測定在PVDF膜上電印跡的純化酶的序列來測定N-末端序列。所得到的部分序列為在SEQIDNO2的第1-24位所示的N-末端序列，以及如在SEQINNO2的第229-266、249-271、303-322、336-347、383-404、405-414、420-440位所示的內部序列。當在Swissprot與EMBL數據庫中進行檢索時，來自所述糖氧化酶的序列中沒有一個序列顯示出與任何相關的序列是同源的。實施例3Microdochiumnivale的基因組DNA的提取用10ml無菌的0.008％Tween20漂洗Microdochiumnivale(NN008551，CBS100236)菌絲體的瓊脂斜面培養物。將體積為2ml的菌絲體溶液接種到含有50mlMY50pH6.0培養基的250ml搖瓶中。MY50pH6.0培養基每升由下列物質組成50克麥芽糖糊精、2克MgSO4·7H2O、10克KH2PO4、2克K2SO4、2克檸檬酸、10克酵母提取物、2克脲和0.5ml的AMG痕量元素原液。AMG痕量金屬溶液每升由下列物質組成14.3克ZnSO4·7H2O、2.5克CuSO4·5H2O、0.5克NiCl2·6H2O、13.8克FeSO4·7H2O、8.5克MnSO4·H2O和3克檸檬酸。在26℃、125rpm下培養搖瓶6天。通過Miracloth(Calbiochem，LaJolla，CA)收集培養了6天的菌絲體，用大約50ml的10mMTis-1mMEDTApH8.0(TE)漂洗兩次并擠壓干。然后將菌絲體在液氮中冷凍并且在用干冰預冷的咖啡電研磨機中磨成細粉。將2克的粉末樣品轉移到無菌的一次性50ml錐形試管中，并緩慢地加入體積為20ml的裂解緩沖液(100mMEDTA，10mMTris，1％TritonX-100，500mM鹽酸胍，200mMNaCl，pH8.0)，之后再加入20μg/ml不含DNA酶的RNA酶A。在37℃下培養該混合物30分鐘。然后以0.8mg/ml的濃度加入蛋白酶K，并且在50℃下再培養該混合物2小時。在12-15，000×g下離心裂解的混合物20分鐘，以便使不溶的碎片沉淀下來。將裂解物上清液轉移到用10mlQBT緩沖液(Qiagen，SantaClarita，CA)預先平衡過的Qiagen-tip500Maxi柱(Qiagen，SantaClarita，CA)中，并用30ml的QC緩沖液(Qiagen，SantaClarita，CA)洗滌該柱。用15ml的QF緩沖液(Qiagen，SantaClarita，CA)洗脫DNA，并將7倍體積的經過濾器滅菌的異丙醇加入洗脫的DNA溶液中。輕輕地混合該溶液，然后在15，000×g下離心20分鐘以便使DNA沉淀。用5ml冰冷的70％乙醇洗滌成沉淀的DNA，將DNA進行空氣干燥并重新懸浮在500μl的TE中。實施例4Microdochiumnivale糖氧化酶基因的PCR擴增將來自實施例2中所述的純化Microdochiumnivale糖氧化酶N-末端和內部片段的一級氨基酸序列的數據用于創建下列簡并的PCR引物，以便由實施例3中制備的Microdochiumnivale基因組DNA擴增所述糖氧化酶的基因正向引物(N-末端肽序列)GCIGCIGGIGTICCIATHGAYAT(SEQIDNO3)反向引物(內部肽序列)IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT(SEQIDNO4)。根據制造商的說明，使用HotWaxOptistartTM試劑盒(Invitrogen，SanDiego，CA)完成擴增。安排了6個反應，其彼此不同之處在于如下表所示的pH和Mg2+的濃度<tablesid="table1"num="001"><table>1.5mMMgCl22.5mMMgCl23.5mMMgCl2pH8.5反應1反應2反應3pH9反應4pH9.5反應5pH10反應6</table></tables>擴增反應液(50μl)含有1.62μg作為模板的Microdochiumnivale基因組DNA、50皮摩爾的各種引物、1×PCR緩沖液、5μ110mMdNTP混合物以及含有適當數量Mg2+的HotWaxTMMg2+珠。將反應液在如下設置的PerkinElmer480循環變溫加熱器中循環循環1為在94℃下2.5分鐘并在72℃下2分鐘；循環2-37各為在94℃下45秒鐘、在50℃下45秒鐘并在72℃下2分鐘；并且循環38為在94℃下45秒鐘、在50℃下45秒鐘并在72℃下10分鐘。循環39為4℃下的保溫(soak)循環。將體積為9μl的各種反應液在1％瓊脂糖凝膠上使用50mMTris-50mM硼酸-1mMEDTA(TBE)緩沖液進行電泳。反應液4、5和6顯示出位于1335bp處的主要帶。匯集反應液4、5和6，并將它們在如上所述的1％瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠中切下1335bp的帶，并使用QiaexⅡ凝膠提取試劑盒(Qiagen，SantaClarita，CA)純化。然后根據制造商的說明，將純化的1335bp的PCR產物克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen，SanDiego，CA)中，并且轉化到大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用WizardMaxi制備試劑盒(Promega，麥迪遜市，威斯康星州)，從轉化體中分離出質粒DNA。根據制造商說明，使用應用生物系統公司的Prism377DNA測序儀以及377XL采集與分析軟件(PerkinElmer，應用生物系統公司，Foster市，CA)測定分離的質粒DNA的序列。序列的數據證實了1335bp的片段編碼Microdochiumnivale糖氧化酶基因的一部分。實施例5Microdochiumnivale基因組DNA的Southern印跡通過Southem雜交分析實施例3中制得的基因組DNA的樣品(Maniatis等人，1982，《分子克隆實驗手冊》，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)。用EcoRⅠ、KpnⅠ、NotⅠ、SacⅠ、SphⅠ或XbaⅠ(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)消化大約3μg的基因組DNA，并在0.6％瓊脂糖凝膠上使用TBE緩沖液通過大小來進行分級分離。在波長短的紫外光下給凝膠拍照，并將其在0.5MNaOH-1.5MNaCl中浸泡30分鐘，接下來在1MTris-HClpH8-1.5MNaCl中浸泡15分鐘。采用Turbo印跡方法(Schleicher與Schuell，Keene，NewHampshire)通過在20XSSPE(3M氯化鈉-0.2M磷酸二氫鈉-0.02MEDTA二鈉)中的毛細管印跡，將凝膠中的DNA轉移到HybondN雜交膜(AmershamLifeScience，ArlingtonHeight，IL)上。使膜與UV(UVStratalinker2400，Stratagene，LaJolla，CA)交聯，然后在45℃下將其在溫和的攪拌下在下列雜交緩沖液中浸泡2小時5XSSPE、50％甲酰胺(v/v)、0.3％SDS與200μg/ml變性并剪切的鮭睪丸DNA。通過隨機引發(PrimeitⅡ，Stratagene，LaJolla，CA)用α[32p]dCTP(Amersham，ArlingtonHeights，IL)對實施例4中所述的含有Microdochiumnivale糖氧化酶的部分編碼序列的1335bp片段進行放射性標記。將α[32p]dCTP-標記的片段以每毫升緩沖液約為1×106cpm的活性加入到雜交緩沖液中。在振蕩的水浴中，在45℃下將混合物與膜培養過夜。在培養后，在45℃下洗滌該膜3次共15分鐘，其中每次都是在含有0.2％SDS的2XSSC(0.3MNaCl，30mM檸檬酸鈉，pH7.0)中進行的。將膜在紙巾上干燥15分鐘，然后包裹在塑料包裝物中，并且在-70℃下借助增感屏(柯達公司，Rochester，NY)將該膜在X-光片下曝光3小時。Southern印跡表明在含有SacⅠ消化物的泳道中存在著3kb的帶。由于SacⅠ消化物產生了大小小到足以擴增并且大到足以含有全長基因的帶，因此將其用于通過反向PCR來分離完全序列。實施例6Microdochiumnivale糖氧化酶基因的編碼序列的反向PCR采用反向PCR來得到1335bp片段的5’與3’側翼DNA，以便分離出Microdochiumnivale糖氧化酶基因的整個編碼序列。將6μg的Microdochiumnivale基因組DNA(實施例3)的樣品用SacⅠ消化完全，然后根據制造商的說明使用QIAquick核苷酸去除試劑盒(Qiagen，SantaClarita，CA)進行純化。在14-16℃下，借助溶于最終體積為500μl的10個單位的T4連接酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)與1X連接酶的緩沖液，使1μg純化的消化DNA樣品進行自身連接過夜。然后通過在65℃下培養反應液15分鐘來加熱滅活所述的連接酶。使用Microcon30(Millipore，Bedford，MA)濃縮反應液。使用QIAquick核苷酸去除試劑盒來純化反應產物。然后將自身連接的產物用作反向PCR的模板。將下列引物以與常規的聚合酶鏈式反應相反的方向創建到糖氧化酶基因的5’和3’端，以便由1335bp的PCR產物的已知區域進行擴增靠上的1199bpTCCAGTTCTACGACCGCTACG(SEQIDNO5)靠下的158bpCAGACTTGGCAGAGACCTTGA(SEQIDNO6)。擴增反應液(100μl)含有100皮摩爾的各種引物、1μgSacⅠ消化的并自身連接的基因組DNA、10μl的10mMdNTP混合物、1xTaq聚合酶緩沖液(PerkinElrmer，Foster市，CA)和5個單位的Taq聚合酶(PerkinElmer，Foster市，CA)。將無菌的礦物油平鋪在反應液的頂部，并放入如下設置的PerkinElmer480型循環變溫加熱器中循環1為在94℃下2.5分鐘并在72℃下2分鐘；循環2-11各為在94℃下30秒鐘、在55℃下45秒鐘并在72℃下2分鐘；循環12-28各為在94℃下30秒鐘、在55℃下45秒鐘并在72℃下2分鐘，其中每個循環都延長20秒鐘；并且循環29為在72℃下10分鐘。循環30為4℃下的保溫循環。將反應液在1％瓊脂糖凝膠上使用TBE緩沖液進行電泳，其間顯現出3kb的帶。將3kb的帶從凝膠中切下，并使用QiaexⅡ凝膠提取試劑盒進行純化。然后將純化的3kb的PCR產物克隆到pCR2.1-TOPO中并轉化到大腸桿菌TOP10細胞中，以生成大腸桿菌pEJG40/TOP10。按照國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約，將大腸桿菌pEJG40/TOP10的轉化體于1998年6月12日保藏在位于IL州Peoria市1815大學北街的農業研究服務保藏所(NRRL)并且命名為NRRLB-30034。使用WizardMaxi制備試劑盒從該轉化體中分離出質粒DNA。根據借助染料-終止子化學(Giesecke等人，1992，《病毒學方法雜志》3847-60)的引物步行技術，使用應用生物系統公司的Prism377DNA測序儀以及377XL采集與分析軟件，對分離的質粒DNA進行測序。除了lac-正向和lac-反向引物以外，可以使用下列寡核苷酸測序引物進行測序1335bp片段的測序引物IACRTCRAARTARTARTCIACRAARTT(SEQIDNO7)RTTIACCCAICCRTC(SEQIDNO8)IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT(SEQIDNO9)DATRAARTCIACRTGRTCRAARTT(SEQIDNO10)CCAYTGYTCIGGIGTICCRTARTA(SEQIDNO11)CTCGCCACTTTCCCTGCTCCC(SEQIDNO12)CTCGGTCACCAAGGCTCTCCC(SEQIDNO13)GACCGCTACGACAACAACCAG(SEQIDNO14)反向PCR產物的測序引物TCGGAGAAATGAGAGCAACCA(SEQIDNO15)AGCCGACGTCCAGCATAGCAG(SEQIDNO16)ACCCTACCATACGAGTTCACG(SEQIDNO17)GGTCGAATCGTCACAAAGTAT(SEQIDNO18)CACTGGACTGCCGACTGGATG(SEQIDNO19)CAACAACCAGACCTACCC(SEQIDNO20)CTCAGCAGCACTTCTTTTCAT(SEQIDNO21)測序表明核酸序列具有一個1448bp(SEQIDNO1)的開放讀框(ORF)，其中含有一個65bp的內含子。該ORF的G+C的含量為58.33％。翻譯起點的-3位為腺嘌呤，這符合其中的-3位總為腺嘌呤的Kozak氏規則。推定的TATA基元也存在于-122，TATAAA處。推定的氨基酸序列(SEQIDNO2)表明具有495個氨基酸的蛋白質的計算分子量為54，678道爾頓。在vanHeijne規則(vanHeijne，1984，《分子生物學雜志》173243-251)的基礎上，頭18個氨基酸可能包括分泌型信號肽，它指導新生肽進入內質網中。采用vanHeijne程序計算得到30.395的得分，以便預測出信號肽。除了由于N-末端氨基酸序列沒有緊跟在信號肽之后而可能有4個氨基酸前肽不同之外，來源于純化Microdochiumnivale糖氧化酶片段(實施例2)的部分肽的氨基酸序列與那些在推定的氨基酸序列中發現的是一致的。實施例7Microdochiumnivale糖氧化酶表達載體的構建合成出如下所示的兩個合成的寡核苷酸引物，以便通過PCR擴增用于在鐮孢屬和曲霉屬宿主細胞中亞克隆與表達的來自Microdochiumnivale基因組DNA的糖氧化酶基因。為了促進基因片段亞克隆到表達載體pDM181和pBANE15中，分別在羧肽酶基因的5’和3’端引入SwaⅠ和PacⅠ限制酶位點。正向引物5’-GATTTAAATATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3’(SEQIDNO22)反向引物5’-GTTAATTAATTATTTGACAGGGCGGACAGC-3’(SEQIDNO23)。黑體字(每個都在第10-30位)表示編碼序列。除了循環參數變化如下以外，PCR、純化和亞克隆都在如實施例4所述的條件下進行循環1為在94℃下2分鐘、在60℃下4秒鐘以及在72℃下45秒鐘；循環2-37各為在94℃下45秒鐘、在60℃下45秒鐘以及在72℃下2分鐘；以及循環38為在94℃下45秒鐘、在60℃下45秒鐘以及在72℃下6分鐘。循環39為4℃下的保溫循環。載體pDM181含有尖孢鐮孢的類似胰蛋白酶的蛋白酶啟動子和終止子作為調節序列并含有吸水鏈霉菌的bar基因作為用于真菌轉化的選擇標記(WO98/20136；deBlock等人，1987，《EMBO雜志》62513-2518)。載體pBANE15(圖1)含有TAKA啟動子和AMG終止子并含有構巢曲霉的amdS基因作為用于真菌轉化的選擇標記。這兩個載體也含有用于在大腸桿菌中進行選擇的amp基因。用SwaⅠ和PacⅠ消化以上獲得的糖氧化酶的克隆，并使用TBE緩沖液通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳和QiaexⅡ凝膠提取試劑盒進行純化。將消化的片段克隆到事先用SwaⅠ和PacⅠ消化的pDM181和pBANE15中，于是分別生成了表達質粒pEJG35和pEJG33(圖2和圖3)。將所述表達質粒轉化到大腸桿菌XL10Gold細胞(Stratagene，LaJolla，CA)中。分離出含有正確質粒的轉化體，并使用WizardMaxi制備試劑盒制備質粒DNA。實施例8在米曲霉中表達Microdochiumnivale糖氧化酶的基因采用原生質體轉化(Yelton等人，1984，《美國國家科學院學報》811470-1474)，將pEJG33轉化到蛋白酶缺陷型米曲霉的宿主菌株JaL142(Christensen等人，1988，《生物/技術》61419-1422)和JaL228(WO98/12300)中。將100μl的原生質體(2×106)放入裝有大約5μgpEJG33的14mlFalcon試管中并溫和地混合。加入體積為250μl的溶于10mMTris-HClpH7.5-10mMCaCl2的60％PEG4000，并通過輕柔的翻滾以進行混合。然后將試管在37℃下培養30分鐘。加入3ml的STC(1.2M山梨醇，10mMTrispH7.5，10mMCaCl2)并通過倒置進行混合。然后將溶液直接涂布到Cove平板上，所述Cove平板每升由342.3克蔗糖、10ml的1.5MCsCl、10ml的1M乙酰胺、20ml的1XCove鹽溶液和1％的瓊脂組成。50XCove鹽溶液由每升26克KCl、26克MgSO4·7H2O、76克KH2PO4和50ml的Cove痕量金屬原液組成。每升Cove痕量金屬溶液由0.04克NaB4O7·10H2O、0.4克CuSO4·5H2O、1.2克FeSO4·7H2O、0.7克MnSO4·H2O、0.8克Na2MoO2·2H2O和10克ZnSO4·7H2O組成。在37℃下將平板培養5天。將轉化體轉移到培養基相同的平板中并在37℃下培養5天。在相同的條件下使用相同的平板通過將孢子劃線并挑取分離的菌落來純化轉化體。總共回收了12個米曲霉JaL142轉化體和22個米曲霉JaL228轉化體。在如上所述的單獨的COVE平板上培養轉化體，然后使用WiHeveen等人(1990，《應用微生物生物技術》33683)所述的指示平板測試其糖氧化酶的活性。將未轉化的宿主用作對照。總共鑒定出11個陽性轉化體。用無菌的去離子水制備每個陽性轉化體的孢子原種。將體積為500μl的包括未轉化宿主的每種孢子原種接種到含有25mlMY50培養基的125ml的搖瓶中。在37℃、200rpm下培養搖瓶7天。由于Microdochiumnivale的糖氧化酶含有作為輔因子的FAD，因此一組燒瓶還含有52μM的核黃素-5’-磷酸(Sigma化學藥品公司，St.Louis，MO)。在第3、5和第7天時從每個燒瓶中取出500μl的樣品并測定其糖氧化酶的活性。糖氧化酶的活性是在96孔板中測量的，其中含有10μl上清液，接下來加入1μl的鄰-茴香胺、69μl的Britton與Robinson緩沖液(pH6.0)、10μl的1MD-葡萄糖以及10μl如WO92/16634所述得到的Coprinuscinereus過氧化物酸(3.76PODU/ml)在405nm下，以mOD/分鐘為單位測量活性10分鐘。所有的轉化體都產生了可以檢測到的糖氧化酶的活性。向搖瓶中加入核黃素5’-磷酸對活性的增加具有次要的作用。將來自糖氧化酶最高產者的20μl的樣品在驗證糖氧化酶生產的8-16％Tris-甘氨酸凝膠(Novex，SanDiego，CA)上操作。通過將分離的菌落連續兩次貼補(patching)到新的COVE平板上，將具有最高活性的轉化體進行孢子的純化，然后將其在搖瓶中重新生長并如上所述重新測試糖氧化酶的活性以驗證糖氧化酶的生產。在34℃、pH7與1000-1200rpm下，在2升的實驗室發酵罐中使含有pEJG33的米曲霉JaL228發酵8天，其中發酵罐中含有由Nutriose、酵母提取物、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸、K2SO4、CaCl2·H2O和痕量金屬溶液組成的培養基。痕量金屬溶液(1000X)每升由22克的ZnSO4·7H2O、11克的H3BO3、5克的MnCl2·4H2O、5克的FeSO4·7H2O、1.6克的CoCl2·5H2O、1.6克的(NH4)6Mo7O24與50克的Na4EDTA組成。一次發酵中補充2×10-4MFMN/升(GOX003.8)，而另一發酵卻不進行補充(GOX002.8)。如上所述測定8天的樣品。結果表明在兩種發酵中都存在著糖氧化酶的活性，但在兩種發酵肉湯之間檢測不到糖氧化酶活性的差別。實施例9在Fusariumvenenatum中表達Microdochiumnivale糖氧化酶的基因采用Royer等人(1995，《生物/技術》131479-1483)的方法借助BASTATM(膦絲菌素抗性選搟，將pEJG35引入Fusariumvenenatum菌株CC1-3(WO97/26330)中。除草劑BASTATM中的活性成分為膦絲菌素。BASTATM是從AgrEvo(HoechstSchering，Rodovre，丹麥)得到的，并且在使用前用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取2次、再用氯仿∶異戊醇(24∶1)提取1次。在存在BASTATM下進行生長的基礎上，回收14個轉化體，然后將其在室溫下在單獨的瓊脂平板上培養，所述瓊脂平板由補充有5mg/mlBASTATM的20ml的50XVogels培養基(Royer等人，1995，出處同上)、25克蔗糖、25克純凈瓊脂以及25mMNaNO3組成。然后使用WiHeveen等人(1990，出處同上)所述的指示平板來測試轉化體中糖氧化酶的生產。測試的5個轉化體呈陽性。將來自每個陽性轉化體的填料(plug)接種到單獨的125ml搖瓶中，其中包括以未轉化的FusariumvenenatumCC1-3作為對照，搖瓶中含有補充了0.5g/lCaCl2的30mlM400Da培養基，然后在30℃下在150rpm的攪拌下培養7天。M400Da培養基每升由50克的麥芽糖糊精、2克MgSO4、2克KH2PO4、4克檸檬酸、2克脲、0.5gCaCl2和1ml的Cove痕量金屬溶液組成。一組燒瓶還含有52μM的核黃素5’-磷酸。在第3、5和第7天時，從每個燒瓶中取出500微升培養肉湯并進行離心。如實施例8所述，測定上清液的糖氧化酶的活性。所有的轉化體都產生了可以檢測到的糖氧化酶的活性。向搖瓶中加入核黃素5’-磷酸已經對活性的增加基本上沒有影響。將來自糖氧化酶最高產者的20μl的樣品在8-16％Tris-甘氨酸凝膠(Novex，SanDiego，CA)上操作，這證實了糖氧化酶的生產。將最高產者在Vogels/BASTATM平板上進行孢子純化。在30℃下，在2升發酵罐中將含有pEJG35的Fusariumvenenatum菌株CC1-3發酵8天，其中發酵罐中含有每升由下列物質組成的培養基20克蔗糖、2.0克MgSO4·7H2O、2.0克KH2PO4、2.0克檸檬酸·H2O、2.0克CaCl2·H2O、0.5ml的AMG痕量金屬溶液(在滅菌前將pH調節到4.5)以及每升由2.5克脲和30ml大豆維生素混合物組成的經過濾器滅菌的混合物，其中在培養基滅菌并冷卻后再加入所述的滅菌混合物。進料物流為由蔗糖和脲組成的經分批高壓滅菌的混合物。如實施例8所述測定8天的樣品。結果表明存在著糖氧化酶的活性。實施例10重組Microdochiumnivale糖氧化酶的純化將如實施例8所述制得的兩種米曲霉JAL228發酵的JaL228肉湯GOX002.8(1.2升)和GOX003.8(1.4升)結合起來。使用Whatman#2濾紙過濾結合的肉湯，然后進行洗滌并使用配備有S1Y10膜的Amicon螺旋形濃縮器通過超濾將其濃縮至512ml。如實施例8所述對糖氧化酶活性的測量表明基本上百分之百地回收了所述的酶。然后將濃縮液裝入用10mMTris-HCl(pH8)預先平衡的Q-Sepharose柱(189ml；Pharmacia生物技術公司，Piscataway，NJ)中。用溶于10mMTris-HCl(pH8)的2MNaCl洗脫糖氧化酶。如上所述對糖氧化酶活性的測量表明大部分的酶沒有結合到柱子上。將來自Q-Sepharose柱的流通的級分(flow-throughfractions)(760ml)調節到pH5.5，并將其裝入用10mMMES(pH5.5)預先平衡的SP-Sepharose柱(176ml；Pharmacia生物技術公司，Piscataway，NJ)中。用溶于10mMMES(pH5.5)的1MNaCl洗脫糖氧化酶，于是產生了根據SDS-PAGE具有表現電泳純度的糖氧化酶制劑。下表總結了重組糖氧化酶的純化。基于下列氧電極的測定，總共實現了14倍的純化、回收率為31％。采用Hansatech氧電極、通過由0.26ml的10mMMES(pH5.5)、30μl的1.0MD-葡萄糖以及3μl的糖氧化酶組成的測試溶液來測量糖氧化酶。重組糖氧化酶的純化體積A280A280xVA450A450xVA280/活性回收率A450肉湯258051.31001.9100278.2100超濾51244.2172.35251945107Q-76820.712116212487SepharoseSP-14452.65.73.711194531Sepharose單位體積，ml；AxV與回收率(活性x體積)，％；活性(過氧化物酶/鄰-茴香胺測定)，IU/ml。實施例11重組糖氧化酶的分子特性采用Novex8-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠的SDS-PAGE表明如實施例8和9所述得到的重組糖氧化酶具有約為55kDa的分子量，這與野生型糖氧化酶的類似。在應用生物系統公司的476A蛋白質測序儀(PerkinElmer/應用生物系統公司分公司，Foster市，CA)中，通過聯機的HPLC和液相三氟乙酸(TFA)傳遞(delivery)進行重組糖氧化酶的N-末端序列的測定。將重組糖氧化酶制劑在還原條件下使用NovexNupageMOPS緩沖液進行SDS-PAGE，其中使用了Novex10％Bis-Tris-SDS-PAGE凝膠。在25伏下、在10mMCAPS緩沖液(pH11.0)中，將凝膠電轉移印跡到PVDF膜(Novex，SanDiego，CA)上2小時。在溶于40％甲醇/1％醋酸的0.1％考馬斯藍R250中對PVDF膜進行染色，并切下觀察到的帶。采用測序試劑(PerkinElmer/應用生物系統公司分公司，Foster市，CA)從印跡軟片中測定切下帶的序列。乙內酰苯硫脲-氨基酸的檢測是通過聯機的HPLC使用緩沖液A和緩沖液B來完成的，其中緩沖液A含有3.5％的四氫呋喃水溶液以及18ml含有醋酸、醋酸鈉和己磺酸鈉的預混濃縮物(PerkinElmer/應用生物系統公司分公司，Foster市，CA)、而緩沖液B含有乙腈。采集數據，并使用應用生物系統公司的610數據分析軟件在MacintoshIIsi中進行分析。兩種切下的帶的N-末端測序都得到了SEQIDNO2的第1-21位所示的序列，其中第6位是不能確定的，但基于推定的氨基酸序列為半胱氨酸。N-末端的結果與推定的氨基酸序列相吻合，這表明由米曲霉和Fusariumvenenatum宿主進行了正確的處理。正如在用1厘米石英杯在ShimadzuUV160U分光光度計中記錄的那樣，在10mMMES-NaCl(pH5.5)中，重組的糖氧化酶具有黃素蛋白特有的紫外可見的光譜。在280和450nm下的相對吸光度為19，這略微大于野生型酶得到的數值12。通過氨基酸分析測量280nm下的消光系數為1.9g/(lxcm)，而預測值為2.1(包括FAD分子的貢獻)。因此，看起來每種重組的糖氧化酶都含有一個黃素分子(可能為FAD)。假定每個D-葡萄糖分子的氧化都與一分子O2還原為H2O2有關，那么使用如實施例10所述的Hansatech氧電極測量重組糖氧化酶的活性。在pH5.5和20℃下，重組的糖氧化酶以4.0IU/A280的比活或以116轉換/分鐘氧化D-葡萄糖(0.1M)。正如由實施例8所述的Coprinuscinereus過氧化物酶/茴香胺方法測定的那樣，重組的糖氧化酶具有與野生型酶相同的比活。實施例12底物特異性在60mM底物濃度下底物的特異性在室溫下在微滴板中通過以下列順序混合來測定來自M.nivale的糖氧化酶的底物特異性50μl0.4/0.4M磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液(pH6)50μl底物(360mM)50μl21.6mM3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)50μl1mM3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)50μl75μg/ml，rec.Coprinuscinereus過氧化物酶(rCiP)50μl糖氧化酶跟蹤記錄595nm下的吸光度至少3分鐘。計算出每分鐘吸光度的增加并將該值用作相對活性的測量值。本發明糖氧化酶對各種單糖和二糖底物的氧化活性的結果總結在下表中，并且該結果表明所述糖氧化酶能夠氧化大部分的還原糖而且對麥芽糖和纖維二糖要比對相應的單糖葡萄糖表現出更高的活性。該酶對諸如果糖、蔗糖、海藻糖和甲基-b-D-吡喃葡糖苷之類的非還原糖沒有活性。將結果表示為相對于D-纖維二糖的最佳活性的M.nivale酶的底物特異性。0.83mM下的底物特異性對底物特異性進一步的分析表明來自M.nivale的糖氧化酶能夠氧化所測試的所有聚合度(DP)、即DP2-DP5的寡糖，其中除了將底物濃度改變為0.83mM之外使用的測定條件與上述相同。而且，該酶能夠水解其中的單糖單元分別由α-1，4或β-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖糊精和纖維糊精兩者。糖氧化酶同樣好地并且以比水解單糖高出大約10倍的水平來水解所有測試的纖維糊精。當以麥芽糖糊精為底物時，所述糖氧化酶的活性在比起針對單糖高出11/2倍(對麥芽六糖來說)到幾乎高出5倍(對麥芽四糖來說)的范圍內變化。結果總結在下表中，該結果表明相對于DP1(D-葡萄糖)而言的聚合度與1，4鍵的類型對糖氧化酶活性的影響。活性％DPα-1，4β-1，41“100”2211949334811474477111151611014在1％底物濃度下的底物特異性當采用1％的底物濃度在上述測定條件下進行測定時，即使在通過透析除去小分子的寡糖和單糖之后，對來自M.nivale的糖氧化酶對多糖氧化活性的分析表明該酶能夠顯對羧甲基纖維素(CMC)有顯著的活性。結果總結在下表中，該結果顯示出相對于D-纖維二糖的糖氧化酶對羧甲基纖維素的活性。底物活性％D-纖維二糖“100”CMC17.7CMC，透析過的8.8在10mM底物濃度下的底物特異性在pH7.8(50mMTris-HCl緩沖液)、10mM底物下，測量來自M.nivale的糖氧化酶對各種底物的氧化活性。其中包括來自支頂孢屬的糖氧化酶的類似數據以便用于比較(如BBA(1991)111841-47中所述)。<tablesid="table3"num="003"><table>麥芽糖麥芽三糖麥芽四糖麥芽五糖麥芽六糖麥芽七糖乳糖葡萄糖纖維二糖Microdochium76.184.9100.058.641.232.567.039.665.7支頂孢屬1009474466656596447</table></tables>實施例13麥芽糖的氧化為了證明來自M.nivale的糖氧化酶氧化1-位上的還原基團，通過層析的方法在下列條件下跟蹤記錄麥芽糖的氧化在加入50μl純化的M．nivale糖氧化酶之前，將125μl的0.2M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH6)加入到250μl的10mM麥芽糖和75μl的水中。在40℃下在恒定的振蕩下培養樣品不超過30分鐘。通過將100μl的樣品加入到900μl95℃的水中來終止反應。然后采用下列條件在DionexDX-500系統中通過陰離子交換層析(CarboPacPA1柱，Dionex)、接下來通過脈沖電流檢測(Dionex)來分析50μl的反應混合物從Sigma化學藥品公司購買標準的麥芽糖糊精(DP1-7)。根據Fitting&Putman(1952)《生物化學雜志》199573所述制備麥芽糖酸。使用以上的方法，檢測出麥芽糖為保留時間約為8.0分鐘的峰，同時檢測出麥芽糖酸為保留時間約為13.3分鐘的峰。在上述條件下，在存在M.nivale糖氧化酶的情況下，由麥芽糖生成了麥芽糖酸，這是因為在大約13.3分鐘時展開了一個峰。因此，糖氧化酶氧化麥芽糖中游離的還原端基。下面以反應混合物中麥芽糖酸的μM濃度給出了所產生的麥芽糖酸的量培養時間(分鐘)麥芽糖酸(μM)0051501037030880實施例14結合常數Km通過改變糖底物的濃度并由4AA-TOPS測定方法測定糖氧化酶的活性來進行穩態動力學的研究。盡管該反應不是簡單的一底物-一產物的機理(E+SES→E+P)，但仍將其假設為簡單的Michaelis-Menten動力學反應。使用一些優選的底物來研究針對M.nivale的糖氧化酶的穩態動力學。由Lineweaver-Burke作圖法得到動力學常數，其中假設為簡單的Michaelis-Menten動力學反應(盡管這是一種相當不好的假設)以便得到各種底物的表觀值“Km”和“Vm”。“Km”的結果為葡萄糖42mM麥芽糖11mM纖維二糖59mM。所述的糖氧化酶對纖維二糖表現出最高的活性。但是，纖維二糖的“Km”要比麥芽糖的幾乎高出6倍。同樣地，葡萄糖的“Km”明顯高于麥芽糖的，而這兩種底物的“Vm”卻大體相同。因此，以前所顯示的在低的底物濃度下對麥芽糖的優選可以由麥芽糖較低的“Km”值加以解釋。實施例15pH與溫度的活性分布在室溫下采用以上實施例12中所述的方法、但是要用調節到待測pH值的緩沖液并在反應混合物中測量實際的pH，在微滴板中測定在某一pH范圍內來自M.nivale糖氧化酶的活性。下面的結果(相對于pH6.32時的最佳值的活性)表明所述糖氧化酶在pH5-7時具有最佳的活性，并且該酶具有相當寬pH的活性分布。pH活性％3.385.584.2827.695.3188.976.32100.007.1596.208.0557.25通過在玻璃試管中混合緩沖液與底物并且在不同的溫度下(30-80℃)預培養至少5分鐘來測定糖氧化酶的溫度活性分布150ml0.4/0.4M磷酸鹽/檸檬酸鹽(pH6)150ml180mM麥芽糖150ml氧化酶稀釋液通過加入氧化酶來啟動反應，并且在恒溫浴槽中在設置的合適的溫度下培養樣品。5分鐘后將樣品放在冰上，通過加入450μl的DMABMBTHrCiP(1∶1∶1)在如實施例12所述的各種濃度下測定過氧化氫的產生，并且在HP8452A二極管陣列分光光度計(惠普公司)上處理10秒鐘后測量590nm下吸光度的增加。其中包括沒有進行培養的盲試。下面所示的結果(相對于50℃下的最佳值)表明該酶在至少60℃以下是有活性的，其中在50℃下具有最佳的活性。℃活性％3086.284090.9850100.006079.95702.27實施例16由DSC測定的熱穩定性使用來自Pharmacia公司的NAP-5柱，將來自M.nivale的糖氧化酶樣品脫鹽入0.1MMES(pH6)中。將樣品(含有6.5mg/ml的氧化酶)裝入VP-DSC裝置(MicroCal)中，并以90°/小時的掃描速度進行由20℃至90℃的線性掃描。發現變性溫度為73℃。實施例17溫度和pH的穩定性溫度穩定性在通過4AA-TOPS檢測測量殘留活性之前，在pH6下在不同的溫度下預培養來自M.nivale的糖氧化酶10分鐘溫度℃殘留活性％40815078601007019802結果表明該酶在60℃以下是穩定的，但在70℃及70℃以上是不穩定的。這與由DSC實驗得到的結果是一致的。pH-穩定性在通過4AA-TOPS檢測測量殘留活性之前，在40℃下在不同的pH下培養來自M.nivale的糖氧化酶2小時pH殘留活性％324100595693799897993結果表明該酶在pH4-9的范圍內是穩定的，但當pH為3時是不穩定的。實施例18糖氧化酶對谷蛋白流變學特性的影響面包面團的配方小麥面粉100％(=10克)水58％(包括酶溶液)鹽1.5％糖1.5％小麥面粉為Meneba型面粉。該面粉不含抗壞血酸。將面團在10gMicroMixer(NSI-33R型，來自國家生產公司)中混合2∶30分鐘。在混合前加入來自M.nivale的糖氧化酶。在混合后，使面團在32℃和85％的相對濕度下靜置90分鐘。用2％的NaCl溶液從面團中洗出谷蛋白(在Perten儀器公司的Glutomatic2200中處理7分鐘)，然后在谷蛋白指標離心機2015(Perten儀器公司)中離心1分鐘。為了評價在振動下面團的強度，在BohlinVOR流變儀系統(Bohlin儀器公司)中分析谷蛋白的流變學特性，其中以恒定的頻率(1Hz)進行著發生應力形變的擺動(sweep)。在該方法中，將面團的粘彈特性劃分為兩個部分、即動力剪切儲能模量G’和動力剪切損耗模量G”。損耗模量與儲能模量之比在數值上等于粘彈性相角d的正切值。儲能模量G’的增加以及相角d的減小表明面團更硬并更有彈性。糖氧化酶G’G”d無(參考)349.5166.425.4650U/kg面粉397.9176.323.89*100U/kg面粉456.3*193.7*23.02*200U/kg面粉523.0*207.4*21.77*500U/kg面粉554.7*207.3*20.49*1000U/kg面粉708.5*249.4*19.40*結果表明G’儲能模量以與加入到面團中的糖氧化酶的用量成正比地增加。就相角d而言，所有經糖氧化酶處理的面團都與參考物的不同，并且相角隨加入酶的量成比例地減小。因此，糖氧化酶提高了彈性模量，從而以依賴于用量的方式提高了面團的彈性。圖表為三次獨立測量的平均值。通過在5％的顯著水平上進行ANOVA分析，用星號表示的數據在統計上是顯著的。實施例19糖氧化酶對面團堅度的影響焙烤步驟基本配方面粉(Meneba)12g(°100％)水60％(包括酶溶液)酵母4％糖1.5％NaCl1.5％面粉不含抗壞血酸。步驟將面團在10gMicroMixer(NSI-33R型，來自國家生產公司)中混合21/2分鐘。在混合前加入來自M.nivale的糖氧化酶。混合后面團的最終溫度約為27℃。在混合后立即對面團進行評價。對面團的評價根據經驗按照下列標度測量面團的粘性和堅硬度<tablesid="table5"num="005"><table>評分系統123456堅硬度非常軟太軟軟/良好正常硬太硬粘性幾乎為液體太粘粘良好干太干</table></tables>在2天的時間里進行評價，其中每天針對每個用量采用3次重復實驗。下表中總結的數據代表6種評價的平均值。結果表明面團的堅硬度和粘性都表現出相同的所述糖氧化酶產生具有極佳面團堅度的面團的能力隨用量而增加的趨勢。在200和300單位/千克下，熟練的面包師評價該面團具有極佳的堅硬度和柔軟性并具有非常通風的堅度。糖氧化酶堅硬度粘性無(參考)3.02.310U/kg面粉3.03.050U/kg面粉3.53.4100U/kg面粉4.04.0200U/kg面粉4.03.8300U/kg面粉4.14.1500U/kg面粉4.84.8溴酸鹽4.03.5實施例20為了測試MicrodochiumniVale的糖氧化酶(MCO)對不同加工參數中變化的耐受性，已經在“歐洲直接面團法”這種標準尺度焙烤試驗(2千克面粉)中測試了MCO。與標準的焙烤步驟(ABF-SP.1217.01/01)相比，通過增加水含量、通過增加混合時間和/或通過增加發酵時間來使面團變形。試驗的目的在于澄清MCO是否能使面團對這些變化具有更強的抗性。為了模擬實際的焙烤工藝，結合芬加密爾SuperMA(木聚糖酶與淀粉酶)來測試MCO。方案是以不完全的統計設計為基礎的。與不合MCO的對照相比，MCO的加入導致面團/面包的強度更好。比如當評價狀態(=“底部(foot)”的面積)時，例如可以斷定在MCO的用量(0-200U)與水加入量增加了1.5％和混合時間增加了+2分鐘之間沒有觀察到明顯的相互作用。序列表<110>NovoNordiskA/S<120>糖氧化酶及共用途<130>5421-WO，SLK<140><141><160>23<170>Patentln2.0版<210>1<211>1553<212>DNA<213>Microdochiumnivale<220><221>內含子<222>(1012)..(1076)<220><221>CDS<222>(1)..(1011)<220><221>CDS<222>(1077)..(1553)<220><221>mat-肽<222>(67)..(1550)<400&#621atgcgttctgcatttatcttggccctcggccttatcaccgccagcgct48MetArgSerAlaPheIleLeuAlaLeuGlyLeuIleThrAlaSerAla-20-15-10gacgctttagtcactcgcggtgccatcgaggcctgcctgtctgctgct96AspAlaLeuValThrArgGlyAlaIleGluAlaCysLeuSerAlaAla-5-11510ggcgtcccgatcgatattcctggcactgccgactatgagcgcgatgtc144GlyValProIleAspIleProGlyThrAlaAspTyrGluArgAspVal152025gagcccttcaacatccgcctgccatacattcccaccgccattgctcag192GluProPheAsnIleArgLeuProTyrIleProThrAlaIleAlaGln303540acgcagactactgctcacatccagtcggcagtccagtgcgccaagaag240ThrGlnThrThrAlaHisIleGlnSerAlaValGlnCysAlaLysLys455055ctcaacctcaaggtctctgccaagtctggtggtcacagctacgcctcg288LeuAsnLeuLysValSerAlaLysSerGlyGlyHisSerTyrAlaSer606570ttcggctttggtggcgagaacggtcacctcatggtccagctcgaccgc336PheGlyPheGlyGlyGluAsnGlyHisLeuMetValGlnLeuAspArg75808590atgattgatgtcatctcgtacaatgacaagactggcattgcccatgtt384MetIleAspValIleSerTyrAsnAspLysThrGlyIleAlaHisVal95100105gagcccggtgcccgcctcggacatctcgccaccgtcctcaacgacaag432GluProGlyAlaArgLeuGlyHisLeuAlaThrValLeuAsnAspLys110115120tacggccgtgccatctcccacggtacatgccctggtgtcggcatctcc480TyrGlyArgAlaIleSerHisGlyThrCysProGlyValGlyIleSer125130135ggccactttgcccacggcggcttcggcttcagctcgcacatgcacggt528GlyHisPheAlaHisGlyGlyPheGlyPheSerSerHisMetHisGly140145150ctggctgtcgactcggtcgtcggtgtcactgttgttcttgctgatgga576LeuAlaValAspSerValValGlyValThrValValLeuAlaAspGly155160165170cgcatcgttgaggcttctgccactgagaatgctgacctcttctggggt624ArgIleValGluAlaSerAlaThrGluAsnAlaAspLeuPheTrpGly175180185atcaagggcgctggctccaacttcggcatcgttgctgtctggaagctc672IleLysGlyAlaGlySerAsnPheGlyIleValAlaValTrpLysLeu190195200gccactttccctgctcccaaggttctcacccgctttggcgtcaccctc720AlaThrPheProAlaProLysValLeuThrArgPheGlyValThrLeu205210215aactggaagaacaagacctctgccctcaagggcatcgaggctgttgag768AsnTrpLysAsnLysThrSerAlaLeuLysGlyIleGluAlaValGlu220225230gactacgcccgctgggtcgccccccgcgaggtcaacttccgcattgga816AspTyrAlaArgTrpValAlaProArgGluValAsnPheArgIleGly235240245250gactacggcgctggtaacccgggtatcgagggtctctactacggcact864AspTyrGlyAlaGlyAsnProGlyIleGluGlyLeuTyrTyrGlyThr255260265cccgagcaatggcgtgcggctttccaacctctgctcgacactctgcct912ProGluGlnTrpArgAlaAlaPheGlnProLeuLeuAspThrLeuPro270275280gctggatacgttgtcaacccgaccacctccttgaactggatcgagtcg960AlaGlyTyrValValAsnProThrThrSerLeuAsnTrpIleGluSer285290295gtgctcagctactccaactttgaccatgtcgacttcattactcctcag1008ValLeuSerTyrSerAsnPheAspHisValAspPheIleThrProGln300305310cctgtaagtgttcaccgactttgcgctgggagaatgttttatgtcggctttac1061Pro315tgactccctctacaggtcgagaacttctatgccaagagcttgacgctcaag1112ValGluAsnPheTyrAlaLysSerLeuThrLeuLys320325agtatcaagggcgacgccgtcaagaactttgtcgactactactttgac1160SarIleLysGlyAspAlaValLysAsnPheValAspTyrTyrPheAsp330335340gtgtccaacaaggttaaggaccgcttctggttctaccagctcgacgtg1208ValSerAsnLyeValLysAspArgPheTrpPheTyrGlnLeuAspVal345350355cacggcggcaagaactcgcaagtcaccaaggtcaccaacgccgagaca1256HisGlyGlyLysAsnSerGlnValThrLysValThrAsnAlaGluThr360365370375gcctaccctcaccgcgacaagctctggctgatccagttctacgaccgc1304AlaTyrProHisArgAspLysLeuTrpLeuIleGlnPheTyrAspArg380385390tacgacaacaaccagacctacccggagacctcattcaagttcctcgac1352TyrAspAsnAsnGlnThrTyrProGluThrSerPheLysPheLeuAsp395400405ggctgggtcaactcggtcaccaaggctctccccaagtccgactggggc1400GlyTrpValAsnSerValThrLysAlaLeuProLysSerAspTrpGly410415420atgtacatcaactacgccgacccccgcatggaccgcgactacgccacc1448MetTyrIleAsnTyrAlaAspProArgMetAspArgAspTyrAlaThr425430435aaggtctactacggtgagaacctcgccaggctccagaagctcaaggcc1496LysValTyrTyrGlyGluAsnLeuAlaArgLeuGlnLysLeuLysAla440445450455aagtttgatcccaccgaccgtttctactaccctcaggctgtccgccct1544LysPheAspProThrAspArgPheTyrTyrProGlnAlaValArgPro460465470gtcaaataa1553ValLys<210>2<211>495<212>PRT<213>Microdochiumnivale<400>2MetArgSerAlaPheIleLeuAlaLeuGlyLeuIleThrAlaSerAla151015AspAlaLeuValThrArgGlyAlaIleGluAlaCysLeuSerAlaAla202530GlyValProIleAspIleProGlyThrAlaAspTyrGluArgAspVal354045GluProPheAsnIleAr9LeuProTyrIleProThrAlaIleAlaGln505560ThrGlnThrThrAlaHisIleGlnSerAlaValGlnCysAlaLysLys65707580LeuAsnLeuLysValSerAlaLysSerGlyGlyHisSerTyrAlaSer859095PheGlyPheGlyGlyGluAsnGlyHisLeuMetValGlnLeuAspArg100105110MetIleAspValIleSerTyrAsnAspLysThrGlyIleAlaHisVal115120125GluProGlyAlaArgLeuGlyHisLeuAlaThrValLeuAsnAspLys130135140TyrGlyArGAlaIleSerHisGlyThrCysProGlyValGlyIleSer145150155160GlyHisPheAlaHisGlyGlyPheGlyPheSerSerHisMetHisGly165170175LeuAlaValAspSerValValGlyValThrValValLeuAlaAspGly180185190ArgIleValGluAlaSerAlaThrGluAsnAlaAspLeuPheTrpGly195200205IleLysGlyAlaGlySerAsnPheGlyIleValAlaValTrpLysLeu210215220AlaThrPheProAlaProLysValLeuThrArgPheGlyValThrLeu225230235240AsnTrpLysAsnLysThrSerAlaLeuLysGlyIleGluAlaValGlu245250255AspTyrAlaArgTrpValAlaProArgGluValAsnPheArgIleGly260265270AspTyrGlyAlaGlyAsnProGlyIleGluGlyLeuTyrTyrGlyThr275280285ProGluGlnTrpArgAlaAlaPheGlnProLeuLeuAspThrLeuPro290295300AlaGlyTyrValValAsnProThrThrSerLeuAsnTrpIleGluSer305310315320ValLeuSerTyrSerAsnPheAspHisValAspPheIleThrProGln325330335ProValGluAsnPheTyrAlaLysSerLeuThrLeuLysSerIleLys340345350GlyAspAlaValLysAsnPheValAspTyrTyrPheAspValSerAsn355360365LysValLysAspArgPheTrpPheTyrGlnLeuAspValHisGlyGly370375380LysAsnSerGlnValThrLysValThrAsnAlaGluThrAlaTyrPro385390395400HisArgAspLysLeuTrpLeuIleGlnPheTyrAspArgTyrAspAsn405410415AsnGlnThrTyrProGluThrSerPheLysPheLeuAspGlyTrpVal420425430AsnSerValThrLysAlaLeuProLysSerAspTrpGlyMetTyrIle435440445AsnTyrAlaAspProArgMetAspArgAspTyrAlaThrLysValTyr450455460TyrGlyGluAsnLeuAlaArgLeuGlnLysLeuLysAlaLysPheAsp465470475480ProThrAspArgPheTyrTyrProGlnAlaValSrgProValLys485490495<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><223>引物<220><221>修飾的堿基<222>(3)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(6)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(9)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(12)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(15)<223>i<400>3gcngcnggngtnccnathgayat23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(7)<223>i<400>4nggrtcngcrtarttdatrtacat24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5tccagttctacgaccgctacg21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6cagacttggcagagaccttga21<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(19)<223>i<400>7nacrtcraartartartcnacraartt27<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221>修飾的堿基<222>(4)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(10)<223>i<400>8rttnacccanccrtc15<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9nggrtcngcrtarttdatrtacat24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10datraartcnacrtgrtcraartt24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccaytgytcnggngtnccrtarta24<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12ctcgccactttccctgctccc21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctcggtcaccaaggctctccc21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14gaccgctacgacaacaaccag21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15tcggagaaatgagagcaacca21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16agccgacgtccagcatagcag21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17accctaccatacgagttcacg21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18ggtcgaatcgtcacaaagtat21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19cactggactgccgactggatg21<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20caacaaccagacctaccc18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21ctcagcagcacttcttttcat21<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22gatttaaatatgcgttctgcatttatcttg30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23gttaattaattatttgacagggcggacagc30權利要求1．一種用于制備面團和/或由面團制得的焙烤制品的方法，該方法包括向所述面團中加入糖氧化酶，所述的糖氧化酶對作為底物的聚合度為2或更高的寡糖比對相應的單糖具有更高的活性。2．權利要求1的方法，其中在10mM或者更低的底物濃度下，所述糖氧化酶對具有聚合度為2-6的寡糖，特別是麥芽糖、麥芽三糖或麥芽四糖比對葡萄糖具有更高的活性。3．權利要求1或2的方法，其中所述的糖氧化酶可以由Microdochium或支頂孢屬的菌株、優選M.nivale的菌株、更優選CBS100236得到。4．一種包括糖氧化酶的面粉、面團或焙烤制品，所述的糖氧化酶對作為底物的聚合度為2或更高的寡糖比對相應的單糖具有更高的活性。5．一種面團和/或面包改善添加劑，所述添加劑包括a)一種糖氧化酶，所述的糖氧化酶對作為底物的聚合度為2或更高的寡糖比對相應的單糖具有更高的活性；和b)第二種酶，所述的第二種酶選自由淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶和磷脂酶組成的組中。6．權利要求5的組合物，其中所述的第二種酶為水解淀粉以生成作為主要產物的寡糖的淀粉酶。7．權利要求6的組合物，其中所述的淀粉酶為嗜熱脂肪芽孢桿菌的生麥芽糖α-淀粉酶、米曲霉的α-淀粉酶或β-淀粉酶。8．一種呈顆粒或聚結粉末形式的面團和/或面包改善添加劑，所述添加劑包括一種糖氧化酶的活性，所述糖氧化酶對作為底物的具有聚合度為2或更高的寡糖比對相應的單糖具有更高的活性。9．權利要求8的添加劑，其中超過95％重量的添加劑具有介于25與500μm之間的粒度。10．一種糖氧化酶，所述的糖氧化酶為a)由MicrodochiumnivaleCBS100236生產的多肽，或b)由DNA序列的糖氧化酶編碼部分所編碼的多肽，其中所述的DNA序列是被克隆到存在于大腸桿菌NRRLB-30034中的質粒中的，或c)具有如SEQIDNO2中所示氨基酸序列的多肽，或d)(a)、(b)或(c)中限定的多肽的類似物，所述類似物ⅰ)與所說的多肽之間具有至少50％的同一性，ⅱ)與抵御純化形式的所說多肽而產生的抗體之間具有免疫反應性，ⅲ)為所說多肽的等位基因變體，或ⅳ)為具有糖氧化酶活性的所說多肽的片段，或e)由在嚴格性差的條件下與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽ⅰ)SEQIDNO1的第67-1550位中所示的核酸序列，或ⅱ)其互補鏈；或其至少有100個核苷酸的亞序列。11．權利要求10的糖氧化酶，所述糖氧化酶可以從Microdochium的菌株、優選M.nivale得到。12．一種糖氧化酶，所述的糖氧化酶可以從Microdochium的菌株中得到并且對麥芽四糖具有氧化活性，其中在0.83mM的底物濃度下，所述糖氧化酶對麥芽四糖的氧化活性至少是對葡萄糖氧化活性的2倍。13．權利要求12的糖氧化酶，所述糖氧化酶可以從M.nivale的菌株、優選菌株M.nivaleCBS100236得到。14．一種用于生產糖氧化酶的方法，該方法包括在合適的營養培養基中培養產糖氧化酶的Microdochium菌株，接下來回收所述的糖氧化酶。15．權利要求14的方法，其中所說的菌株為M.nivale的菌株，優選CBS100236。16．一種核酸序列，所述的核酸序列包括編碼權利要求10-13之任一的糖氧化酶的核酸序列。17．一種編碼糖氧化酶的核酸序列，所述的核酸序列包括a)DNA序列的糖氧化酶編碼部分，所述DNA序列是克隆到存在于大腸桿菌NRRLB-30034的質粒中的，或b)SEQIDNO1的第67-1550位中所示的DNA序列，或c)a)或b)中限定的DNA序列的類似物，所述類似物ⅰ)與所說的DNA序列之間具有至少50％的同一性，或ⅱ)在嚴格性差的條件下與所說的DNA序列、其互補鏈或其亞序列進行雜交。18．一種核酸構建體，所述核酸構建體包括可操作地連接到一個或多個控制序列的權利要求16或17的核酸序列，所述的控制序列能夠指導所述糖氧化酶在合適的表達宿主中進行表達。19．一種重組表達載體，所述的表達載體包括權利要求18的核酸構建體、啟動子以及轉錄和翻譯的終止信號。20．一種重組宿主細胞，所述的宿主細胞包括權利要求18的核酸構建體。21．一種用于生產糖氧化酶的方法，該方法包括在有助于表達所述糖氧化酶的條件下培養權利要求20的宿主細胞以及回收所述的糖氧化酶。22．一種用于生產糖氧化酶的方法，該方法包括a)從產糖氧化酶的Microdochium菌株中分離出編碼所述糖氧化酶的DNA序列，b)在合適的載體中將所述DNA片段與合適的表達信號結合，c)用所述載體轉化合適的異源宿主生物體，d)在導致所述脂解酶表達的條件下培養所述轉化的宿主生物體，以及e)從所述培養基中回收所述的糖氧化酶。23．一種Microdochium屬的菌株，所述的菌株能夠表達權利要求10-13之任一的糖氧化酶。24．前述權利要求的菌株，所述的菌株為M.nivale，優選菌株CBS100236。25．權利要求10-13之任一的糖氧化酶用于個人護理產品的用途。26．權利要求10-13之任一的糖氧化酶作為測定還原糖數量的分析試劑的用途。27．根據權利要求10-13之任一的固定化糖氧化酶作為提供連續測量淀粉或纖維素水解的電極中的分析試劑的用途。28．根據權利要求10-13之任一的糖氧化酶用于由乳糖生產乳糖酸的用途。全文摘要通過加入糖氧化酶可以改善面團或面包的性能,其中比起相應的單糖而言所述糖氧化酶可以更加有效地氧化寡糖的還原端,例如優先于葡萄糖而氧化麥芽糖糊精或纖維糊精。從Microdochium的菌株、特別是從M.nivale中可以得到一種具有比氧化葡萄糖更有效地氧化麥芽糖糊精和纖維糊精能力的新的糖氧化酶。這種新的糖氧化酶的氨基酸序列與已知的氨基酸序列之間具有非常低的同源性(<20%的同一性)。文檔編號A61K8/96GK1283082SQ98812540公開日2001年2月7日申請日期1998年12月22日優先權日1997年12月22日發明者帕利·施耐德,索倫·克里斯坦森,朗·戴布達爾,克勞斯·C·富格爾桑,徐豐,伊麗莎白·戈萊特利申請人:諾沃挪第克公司