專利名稱：：藥用級人參的制作方法本申請是1997年10月23日申請的共同待審的美國申請號為08／956616的部分繼續申請，其完整公開文本以參考的方式引入本文，后者是1997年4月15日申請的共同待審的美國申請號為08／838198的部分繼續申請，08／838198又是1996年4月15日申請的共同待審的美國申請號為08／632273的部分繼續申請，08／632273又是1995年4月14日申請的美國申請號為08／421993的部分繼續申請，08／421993號申請為了利于1997年2月4日申請的美國申請號為08／774550號申請而放棄。1．發明領域本發明總的來水涉及植物藥材以及將所述藥材轉化成醫學有用且藥學可接受形式的方法。更具體地說，本發明涉及組成指紋和活性指紋在將人參加工成適于臨床治療和／或改善疾病、紊亂和／或病情的具備藥用級組合物水平的植物藥過程中的應用。2．發明背景藥物生產是在對各生產批次的組成和生物活性的控制下進行的。這種標準化和控制在對患者的可預期性治療和一致性治療中提供了可重現的材料。由植物藥材制備的植物藥給生產者提出了特殊的問題，即期望實現藥物需要的有控制、可重現、和標準化。由于植物藥含有多種成分，并且由于原料的生長、收獲和加工條件所致的組成和含量的巨大差異，導致上述問題成為首要問題。植物曾是并還將是大量藥物化合物的來源。幾個世紀以來，各種形式的植物來源材料被用于治療無數種不同疾病。植物藥材的形式通常是來源于一種或多種植物或植物部分的粉末，或者來源于整體植物或選擇的植物部分的提取物。這些粉末或提取物大多數是生物活性和非生物活性成分的復雜混合物。雖然植物粉末和提取物已經廣泛地在醫學中應用，但仍然存在很多與這類藥物應用有關的問題。例如，植物藥材的復雜化學性質使其難于以任何形式的控制和預期方式應用。由收獲方式不同的植物得到的不同批次的藥材其化學組成的潛在差異導致該藥材不適于臨床應用。在積極的方面，植物藥材中典型存在的生物活性成分的復雜組合提供了協同或增加生物活性范圍的可能。然而，由于這些復合藥材的未知特征，其藥效的潛在改進還不能預測。上述與植物藥固有的化學復雜性有關的問題導致，在從大量具有藥用價值的植物材料中分離提取生物活性成分方面需付出巨大的努力。該研究領域隨著化學分離和分析技術的改進得以迅速發展。分離純化后，各種活性成分可以應用于臨床，確定具體成分的藥效。從植物藥材中分離和純化個體成分是這類藥物發展過程的基礎。純化后，通常將可能的活性成分與藥物可接受載體混合，然后進行進一步的試驗動物研究以及最終的對人的臨床實驗。證明臨床有效性后，這類藥物被認為是藥用級的，因為它們含有單一的或至多少數幾個含量已知、特征明確的成分。藥用級藥物的優點在于可以在治療方案中精確地跟蹤各個成分的作用。而且，可以準確控制藥物劑量，提供相對可預測的藥物作用。所述相對純的藥用級藥物的缺點在于由于將藥物從天然環境中分離出來，降低了天然形成植物材料提供的復合潛能和協同生物活性。分離產物的研究也可以稱為通過分解敏感的生物／植物復合體制備的人工制品。一些行業專家認為由這種協同活性提供的潛在優勢，其價值超過了與特征不明確或臨床應用不能控制的復合植物材料應用有關的臨床風險。雖然從植物材料中分離和純化單一成分成為藥物研究和發展的普遍方式，研究復合植物提取物，鑒定其藥物質量仍然得到關注。一些復合植物藥材和提取物存在有效但相對不可預測的藥學特性。由于用未曾建立批次穩定性和組成上差異較大的特征不明的藥材治療患者可能引起的固有風險，使這些藥材中的大多數不能應用于臨床。因此，需要提供標準化上述復合植物材料的方法，以使它們可以更有效地用于臨床研究和治療患者。2．1人參的背景知識人參是人參家族兩個成員——亞洲人參或美洲人參的干燥根。人參也被稱為高麗參。野生人參十分罕見，但中國和朝鮮已經大面積栽培。人參被稱為“世界最好的抗壓力滋補品”(Mowrey，1990，下一代植物藥，KeatsPublishing，NewCanaan，CT)，在中國幾百年來一直被用作壯陽藥。雖然應用人參的適應癥眾多，但一般認為人參增加元氣，包括生理和心理機能。已知人參沒有禁忌癥、副作用、或與其它藥物的相互作用。推薦劑量為每日1-2g根；可以用1．75g藥物浸劑，每日飲一到兩次。或者，可以服用含250mg根的膠囊(Tyler，1994，草藥的選擇，HaworthPress，NY)。人參應用的主要適應癥是其對神經系統和心血管系統的作用。看起來人參能夠有效地增強精神活動和智力行為。特別是增強生殖能力和精確性(Fulder，1984，關于人參，ThorsensPublishers，NewYork)。據認為它也可以增強學習能力。據報道，人參有助于轉移壓力產生的生理影響，例如保護胃免受壓力誘生的潰瘍。令人感興趣的是，動物研究表明，除去腎上腺后人參引起的生理反應消失(Mowrey，1990，下一代植物藥，KeatsPublishing，NewCanaan，CT)。也曾報道人參降低心率和血壓(Chen，1982，ChungHuaHsinHsuehKuanPingTsaChih，10(2)182-187)以及增加血管彈性。曾報道人參對大量其它適應癥有效，包括增加耐力，減少疲勞和衰弱的次數，加速蛋白質和脂類的合成，刺激免疫系統，增強生殖力，作為抗毒素，促進對輻射的抗性，對氮氣和芥子氣毒害的保護，促進抗體產生，作為抗炎藥，作為退熱藥，作為止痛藥，延長壽命和抵抗自然衰老過程，以及加速康復。還報道人參表現抗癌活性，以及治療其它病情例如糖尿病、哮喘、頭痛、貧血、消化不良、陽痿、抑郁、和月經不調有效(Mowrey，1990，下一代植物藥，KeatsPublishing，NewCanaan，CT)。3．發明概述本發明提供了制備藥用級人參的方法。該方法是PharmaPrintingTM的過程。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟提供植物藥材，例如人參，其含有大量具有特定生物活性的成分；從植物藥材中取出有代表性的部分；將該部分分成若干標記組分，其中每種標記組分含有至少一種活性成分；確定給定標記組分的特定生物活性的程度，以提供該部分的生物活性指紋；將該部分的生物活性指紋與已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，提供生物活性指紋比值，根據生物活性指紋比值確定該植物藥材是否是藥用級人參。本發明還提供了一種方法，包括以下步驟提供植物藥材，例如人參，其具有特定的生物活性，所述植物藥材含有多種成分；將植物藥材的代表性部分分成若干標記組分，其中至少一種標記組分含有至少一種活性成分；確定各標記組分的特定生物活性的程度，以提供該代表性部分的生物活性指紋；將該代表性部分的生物活性指紋與已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，確定該植物藥材是否是藥用級人參。在一個實施方案中，一種或多種標記組分含有一種活性成分。本方法還包括其它步驟確定各標記組分中活性成分的含量，提供該部分的定量組成指紋，將該定量組成指紋和生物活性指紋與定量組成指紋和生物活性指紋標準相比較，確定是否該植物藥材是藥用級人參。該方法還包括其它步驟確定植物材料所述部分的總生物活性，將該部分的總生物活性與已建立的藥用級人參的總生物活性標準相比較。本發明還提供了制備藥用級人參的方法，所述方法包括以下步驟提供含有多種具有特定生物活性成分的人參藥材，其中各活性成分具有標準化的生物活性譜；從該植物藥材中取出有代表性的部分；將該部分分成若干標記組分，其中每種標記組分含有至少一種活性成分；測定每種標記組分中存在的各活性成分的量；基于各活性成分的存在量以及標準化的成分的生物活性譜計算各標記組分的生物活性，提供該部分的計算生物活性指紋；將該部分的計算生物活性指紋與已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，提供生物活性指紋比值，根據生物活性指紋比值得以確定是否該植物藥材是藥用級人參。本發明的方法可用于從具有特定或所需生物活性的合適植物藥材中制備藥用級人參。植物藥材優選由植物材料提取到的提取物，例如水提物或有機提取物(例如醇提物或超臨界二氧化碳提取物)或可以進行進一步處理的有機溶劑提取物。或者，植物藥材是植物材料粉末、種子油、香精油、或水蒸汽蒸餾產物。在一個實施方案中，植物藥材是單一物理狀態的均勻材料，例如油或溶液。植物藥材可以是單獨地來源于目的植物的純化材料。在本發明中，活性成分可以包括但不限于一種或多種下列化學種類人參皂甙、多聚乙酰、生物堿、碳水化合物、類胡羅卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、類黃酮、糖甙、異戊二烯類、脂類、大環抗生素、核酸、青霉素、多肽、酚類、聚乙炔、多聚乙酰、多酚、多糖、蛋白質、前列腺素、甾類和萜類。在一個實施方案中，本發明提供了制備藥用級人參的方法，其中一種或多種標記組分含有兩種活性成分。在另一個實施方案中，本發明提供了制備藥用級人參的方法，其中至少一種標記組分含有至少一種選自人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1、γ-氨基丁酸、谷氨酸、和谷氨酰胺的標記成分。在另一個實施方案中，本發明提供了制備藥用級人參的方法，其中活性成分選自人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1、和γ-氨基丁酸。人參的生物活性／臨床適應癥與人或其它動物的疾病、功能失調或病癥有關。因此該方法可用于制備用于治療和／或改善和／或預防人和／或獸類疾病、功能紊亂或病癥的藥用級人參。適應癥的例子包括但不限于，腎上腺功能紊亂、過敏癥、心血管疾病、癌癥或中樞神經系統紊亂、內分泌失調、胃腸道疾病、炎癥、代謝性疾病、惡心或微生物或病毒誘生的疾病、以及壓力疾病。在這些實施方案中，所述部分可以分成生物活性成分和非生物活性成分。而且，標記組分可以含有一組相關成分。本發明還提供了制備藥用級人參的PharmaPrint的方法。并且本發明提供了通過上述方法制備的藥用級人參。在一個替換實施方案中，人參(亞洲或西伯利亞變種)可以與一種或多種選自下述的植物藥材組合蘆薈、紫云英、越桔、牛蒡、甘菊、栗子、coriolusversicolor、茅草、crampbark、蒲公英根、dongquai、土木香、月見草、小米草、falseunicormroot、小白菊、大蒜、姜、銀杏、goldenseal、gotakola、葡萄子提取物、綠茶、guggulipid、山楂、蛇麻子、常春藤、kava、甘草、水飛雉、槲寄生(美洲、亞洲和歐洲變種)、益母草、燕麥、osha、粉色西番蓮、南瓜、pygeum、紅三葉草、迷迭香、撒爾沙植物、sawpalmetto、黃芩、St．John’swort、小蕁麻、V．agnus-castus、wildindigo、wilsyam、和yerbamansa。本發明的制備藥物的方法包括PharmaPrintingTM人參加一種或多種上面所列植物的方法，以及含人參和一種或多種上面所列植物的藥用級藥物。在該實施方案的一個方式中，人參可以與紫云英、甘草、和／或撒爾沙植物組合。以舉例說明的方式而不是限制的方式，藥用級人參可以與藥用級植物藥材混合，例如echinacea、纈草和／或blackcohosh。參見1997年10月23日申請的，發明名稱為“藥用級echinacea”，美國申請號為08／956603(代理人檔案號為9117-015)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)；還參見1997年10月23日申請的，發明名稱為“藥用級纈草”，美國申請號為08／956615(代理人檔案號9117-016)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)；還參見1997年10月23日申請的，發明名稱為“藥用級blackcohosh”，美國申請號為08／956611(代理人檔案號為9117-018)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)。3．1定義術語“藥用級”，在本說明書中應用的含義是，植物藥中的某些特定生物活性成分和／或非生物活性成分必需在明確規定的絕對和／或相對濃度范圍內，和／或這些成分經疾病、失調或病癥特異性生物活性檢測測定必須表現一定活性水平。所述疾病、失調或病癥可以是人或動物患有的。就象本領域技術人員理解的，術語“藥用級”不意味著暗示該植物藥只適用于受控制的產品，例如處方列出的藥，即“處方藥”，或柜臺提供的藥，即“非處方藥”。該術語同樣適用于處方列出的藥物、非處方藥、或者作為飲食添加的成分，即“食品添加劑”。本文提到的“成分”指分開的化合物(即化學物質)，其天然存在于植物藥中，或者加入植物藥，從而制備具有規定生物活性范圍和／或組成范圍的成分的藥用級植物藥。本文提到的“活性成分”指一種或多種成分，其在疾病特異性生物檢測中得到的各個成分活性總和，它占該植物藥材觀察到的生物活性的實質性部分。優選活性成分的活性總和占觀察到的生物活性的大部分或超過50％。本文提到的“組分”一般指具有規定參數例如溶解度、分子量范圍、極性范圍、吸附系數、結合特性、化學反應性、或選擇性溶解度的一組成分或一類結構類似的成分。組分更經常為選擇性溶劑溶解技術和分離技術(即液-液萃取)的產物，包括pH依賴性分離、色譜分離技術即閃光色譜、制備型高效液相色譜(HPLC)、制備型氣相色譜、分配色譜、制備型薄層色譜、親合色譜、尺寸排阻色譜、液-液色譜例如逆流色譜或向心色譜或離心色譜。通過參考下面部分以及附圖中對本發明的詳細描述和具體實施方案的例子可以更充分地理解本發明。4．附圖簡述圖1是按照本發明用于建立標準化學和／或生物活性指紋的程序的示意圖，所述標準指紋用于在制備藥用級藥物過程中，將隨后處理的植物藥材與之相比較。圖2是按照本發明用于將植物藥材加工成為藥用級藥物的程序的示意圖。圖3是分離不同類生物活性組分的程序的示意圖。圖4是人參商業產品的比較，其中列出了為六種商業產品(即品種A-F)確定的所示的特定物質(化合物)的百分數(％w／w)。簡稱Rg1，人參皂甙Rg1；Re，人參皂甙Re；Rb1，人參皂甙Rb1；Rc，人參皂甙Rc；Rb2，人參皂甙Rb2；Rd，人參皂甙Rd；Rf，人參皂甙Rf(未顯示)。5．發明詳述5．1PharmaPrintingTM法本發明提供了制備可以被分類為藥用級植物藥的方法。該方法被命名為PharmaPrintingTM。用本發明方法生產的藥用級植物藥尤其適合應用于臨床研究，更重要是用于治療患者。該方法確保特定方案中應用的藥物質量穩定，始終適于用作人和獸類預防或治療劑。本發明提供了密切控制植物提取物和其它植物藥材(例如植物提取物和來源于生物制品的哺乳動物組織)的質量、劑量和臨床效果的可能。本發明的一方面涉及為各種植物藥材建立化學和／或生物活性指紋標準。一旦該標準建立后，其被用于藥物生產程序，以確保植物材料符合藥用級要求。本發明進一步提供了為多種植物藥材建立的具體定量指紋和生物指紋。這些指紋用于確定是否具體植物藥材符合特定治療方案中藥物活性要求和藥物組成要求的水平。該確定對于保證用植物藥材進行的臨床研究和患者治療是基于一致的和可證明的提取組合物參數是重要的。本發明可用于提供充分表征，批次間組成一致的植物藥材，以便可以精確地確定它們的給藥劑量，并有效地應用于臨床。本文所述的方法提供了臨床實驗結果可重現的保證。首先，得到目的植物藥材的樣品。一些植物藥材可以原料的形式或以加工過的提取物的形式通過商業途徑獲得。通常它們是植物提取物或其它的意欲被用作藥物的組合物。加工后的藥材可以包括表現特定生物活性的多種活性成分和不直接表現相關生物活性的多種非活性成分。在一個實施方案中，從植物藥材中取出一部分，將其用于質量保證程序或標準化程序。優選該部分為均勻植物藥材的代表性部分。該程序涉及將植物藥材部分分成若干標記組分，其中每種標記組分包括至少一種活性成分或者有時含有一種非活性成分。確定各標記組分中的活性成分或非活性成分的量，以便提供該部分的定量指紋。同時確定各標記組分的生物活性的程度，以提供該部分的生物活性指紋。然后將該部分的化學和／或生物活性指紋與為藥用級藥物建立的相應指紋相比較。如果該植物的指紋與標準指紋相當，那么該植物被鑒定為藥用級植物藥。如果不能，那么可以改良該植物藥材以便使其與標準指紋相當，或者不使用該植物藥材。5．1．1形成PharmaPrint的方法當一些藥材的推定活性成分已知，則其PharmaPrint方法的形成始于文獻綜述。這涉及綜述化學文獻、生物學文獻、已出版的藥材的生物檢測方法和臨床數據。尤其有用的信息資源是由NormanFarnswroth博士為伊利諾斯州大學(Chicago)藥學合作研究負責程序管理的NAPRALERT計算機數據庫；Leung和Foster，食品、藥品和化妝品中應用的常見天然成分大全(EncyclopediaofCommonNaturalIngredientsUsedinFood，DrugandCosmetics)，第二次編輯，JohnWiley&SonsNewYork，NY，1996；草藥和植物藥(HerbalDrugsandPhytopharmaceuticals)，N．G．Bisset編，CRC出版社BocaRaton，FL，1994；Duke，生物活性植物藥及其活性手冊(HandbookofBiologicallyActivePhytochemicalsandTheirActivities)，CRC出版社BocaRaton，FL，1992；Tyler和Foster”草藥和植物藥產品(HerbsandPhytomedicinalProducts)”，非處方藥手冊(HandbookofNonprescriptionDrugs)，Berardi等編，UnitedBookPress，Inc．Washington，DC，1996。對于一種特定適應癥，必須研究文獻確定推定的活性成分確實與那種疾病狀況有關。另外，如果公開了推定活性成分和適應癥的任何生物檢測法，生物檢測必須與適應癥和推定活性成分一致。適當的生物檢測應與臨床相關端點結合。生物檢測應在一段較寬的濃度范圍內定量。通常，制作IC50曲線(半數抑制濃度)、EC50(半數有效濃度)、或者適當的Ki或Kd(酶離解常數和其抑制物的離解常數)曲線。然后對植物藥材的推定活性成分和色譜組分進行徹底的化學和生物學分析。分析結果，確定樣品中各化學成分的生物活性定量分析。然后，將樣品的生物活性作為一個整體與單獨成分的生物活性比較。在這一點上，個體化學成分可以與臨床相關端點相關。同樣的方法可以應用于測定刺激或抑制效果的生物檢測。基于個體成分的活性和已知的總活性，如果混合這些成分，它們應當占生物活性的基本部分。通常，混合活性至少占總活性的25％。優選個體活性成分的活性總和占觀察生物活性的大多數或超過50％。更優選，分離的個體成分代表超過70％的活性。更優選分離的個體成分代表超過80％的生物活性。另一個考慮是盡可能選擇較少的活性成分作為PharmaPrint的部分。較少的活性成分對于在原料的接受和加工方面的實際考慮是重要的。本發明建立了有關化學成分和生物活性之間的相關性。一旦滿意的相關性建立后，就可以不必對每個樣品的生物指紋進行操作。目的植物藥材各樣品的適當成分和／或標記組分的化學分析足以代表大多數生物活性，然后確定某種給定植物藥材樣品為藥用級。在一個實施方案中，本發明可以涉及下列程序之一。一個程序(如圖1所示)涉及為一種特定的藥用級植物藥建立組成和生物活性指紋標準。指紋標準建立后，可以如圖2所示將植物藥材實際加工成藥用級藥物。為特定植物藥材建立化學和／或生物活性指紋的開始步驟涉及將提取物或粉末分成一組或多組(如圖1步驟1所示)。基于這些組作為指紋標記(可以含或不含活性成分)的潛力分離并鑒定這些組，所述指紋是為加工的植物藥材而建立。經選擇和鑒定作為潛在標記的推定成分或推定成分組根據被加工的植物藥材和藥物用途變化較大。每種植物藥材至少應當選擇兩種推定標記。潛在標記的數目可以超過五個，對于復雜的植物藥材提取物或粉末可以多達15-20或者更多。潛在標記的鑒定和選擇大部分基于它們的潛在生物活性或對特定藥物應用的生物活性的貢獻。對于不同的適應癥，可以用不同的提取方法對同樣的植物藥材制備提取物，以便優化特定的生物活性組成。自身無明顯生物活性的標記可以被分離，可以被包括作為指紋中應用的標記。當這些標記的存在能夠指示提供觀察到的植物藥整體生物活性的基本部分的其它活性成分的存在時，這些“代理”標記可以作為理想的內標。它們還有助于確定藥物的正確植物學名稱(即chemotoxonomy)。將植物藥材分成各種推定標記組的最初分離步驟可以通過簡單的萃取分離到復雜的親和色譜技術等常規分離技術實現，包括凝膠過濾色譜、發光硅膠色譜和反相色譜。一旦鑒定到特定植物藥材的推定標記后，則如圖1步驟2所述測定各標記的生物活性。用于測定植物藥材生物活性的特定生物檢測法基于植物藥材的預期用途進行選擇。優選生物檢測將能夠反映推定標記的關于用植物藥材治療的疾病或適應癥的生物活性。步驟2中得到的生物檢測結果被用于鑒定具有所需生物活性的成分(步驟3)和較少活性或基本上無活性的成分(步驟4)。然后定量分析步驟3和4中鑒定的各組，確定各組中存在的各鑒定組分的量。然后如圖1步驟5所述用生物檢測和定量組成分析的結果制作植物藥材的生物檢測指紋和／或化學指紋。確定生物活性和／或化學組成的可接受范圍，作為建立植物藥材指紋的一部分。此步操作主要基于建立各標記的生物活性和定量的可接受范圍，這能夠提供加工材料所需的整體藥理活性。另外，可以評價活性和非活性標記的各種組合，以確定由活性和非活性成分組合導致的所需生物活性的潛在增加。步驟5建立的生物檢測和定量指紋可以準確鑒定植物藥材，這可以用于建立臨床應用所需的劑量療法和治療方案。利用任何新藥研究中通常應用的常規臨床方法建立劑量療程和治療方案。用于確定劑量和治療方案的加工材料必須與步驟5建立的指紋的要求匹配或相符。該方法能夠確保劑量和治療方案有效并可重復，因為用于研究劑量和方案的加工材料都具有同樣的本發明的指紋。通過如圖1所示的一般程序確定的生物檢測和定量指紋作為制備藥用級植物藥的部分生產程序。該指紋被作為定性確認或標準化程序的一部分，以確保特定植物藥材含有適當的化合物，可以被正確加工，以提供與已經被標準化并按照如圖1所示的程序測試的材料發揮相同臨床作用的植物藥。制備本發明的藥用級植物藥的實例程序如圖2所示。首先通過萃取、粉末化或其它生產方法加工目的植物藥材21，以制備加工的植物材料22。然后分析加工材料22的樣品，確定其是否與圖1標準化程序中建立的指紋要求相匹配。該定性確認或標準化程序如圖2步驟23所示。如果加工材料符合前面建立的特定材料的指紋要求，則其如步驟24所示可以被認為是藥用級的。如果該材料接近但不十分符合標準指紋，則按照需要對其改進，以符合指紋標準(步驟25)。使加工材料符合指紋標準的改進可以通過很多方法進行。進一步加工植物藥材的方法可以包括對植物藥材的進一步萃取、選擇性萃取、選擇性加工、批次重組(例如，將高劑量和低劑量的批次混合，以制備藥用級藥材)或者按照需要添加各種化合物。如果植物藥材基本上落在生物活性標記和定量標記的指紋范圍之外，則拋棄該批次(步驟26)。在一個實施方案中，用于確定特定植物藥材是否屬于藥用級的定性確認標準化步驟23包括取得均勻樣品，優選均一樣品，或者待測植物藥材的一部分。樣品應當包括活性成分，其為藥材提供觀察生物活性并產生前面確定的標準品的生物活性和／或化學指紋。樣品還將包括一種或多種非活性成分。非活性成分是那些不具有直接可測量的生物活性的成分。非活性成分包括下列種類活性非常低以至于不能占活性的基本部分的成分；其存在表明其它活性成分的存在，可以作為其它成分的代理標記的成分；在相關檢測中不表現化學或生物學活性的非活性成分。優選樣品僅是待測植物藥材的一小部分。因此，取得代表藥材全部批次的均勻樣品優選均一樣品是重要的。圖3顯示了一個更詳細的方案，表明存在于植物藥材水提取物中的不同成分的最初分離步驟。隨后采用萃取和沉淀分離水或有機相中的活性成分。圖3的方案尤其很好地適用于從植物藥材例如槲寄生中分離水溶性活性成分類型。圖3顯示了一個分離植物主要化學成分類型的實例性通用方法。主要應當使用新鮮植物(包括葉、根、花、漿果和莖)，雖然也可以使用干藥材。如果需要可以使用植物的特殊部分，例如葉、花、莖或根。在該方法中，可以在液氮溫度下冷凍植物的特殊部分或整體植物。這有助于粉碎，并保證活性成分的完整性和效力。用蒸餾水反復提取磨碎的粉末。如果需要，用熱水、乙醇、其它有機溶劑、水醇溶液、稀釋乙酸或它們的任意組合進行提取。選擇的實際溫度優選接近或為水的沸騰溫度。優選首先確定提取物的總生物活性。混合的提取物用于進行特定生物檢測，例如，如果藥物被用作抗菌藥，則在有蓋培養皿中進行抑制細菌生長的試驗。或者，如果藥物預期用作抗癌藥，則優選進行抑制癌細胞細胞培養的試驗。從這些數據計算每毫升提取物中含有的生物活性單位(生物活性單位被定義為在試驗系統中該提取物抑制50％的細菌或癌細胞生長的稀釋倍數)。可以用于計算刺激效果例如免疫激活等的類似生物活性單位。為了建立本發明的藥物指紋(PharmaPrint)，按照圖3所示的程序提取植物，將其分為主要成分(例如皂甙、萜類、脂類、生物堿、核酸、蛋白質和碳水化合物)。各成分的分離組分按照需要測試生物活性。這可以指活性(例如槲寄生群的蛋白質和生物堿組分)。進一步用親和色譜、高效液相色譜、氣相色譜或其它色譜將活性成分組分成個體成分。以重量和特定生物活性單位為基礎量化提供主要生物活性的成分。這些成分能夠為最初的草藥提取物提供建立藥物要求的指紋。每毫升藥用級提取物的生物活性單位為臨床研究提供了建立準確劑量的方式。一旦樣品分離成個體標記組分，其中至少一種標記組分含有至少一種活性成分，對每個組分進行分析，以測定其活性成分的量，并提供樣品的定量指紋。每個成分的定量可以通過應用任何已知的定量分析方法獲得。示范性的定量方法包括重量分析、光譜分析或應用定量檢測器，如使用氣相色譜或高效液相色譜和其它分離系統。其它適合的定量方法包括通過酶、放射性、比色、元素分析分光光度法、熒光或磷光和抗體檢測(如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫測定(RIA))進行分析。在一個實施方案中，每個組分定量分析的結果用于制備樣品的定量指紋。指紋由成分在每個標記組分中的量和該成分的身份組成。然后將該定量指紋和已建立的已知標準指紋相比較(圖1)，以確定該材料是否為藥用級。如果樣品的定量指紋落在藥用級指紋要求的定量范圍內，該材料可以被鑒定為達到藥用級。作為進一步的質量保證分析，對個體標記組分可以進行生物學檢測。用于不同組分檢測的生物學檢測和用于標準指紋的相同，也依賴于該材料特定的臨床應用傾向。從該材料獲得的生物活性和已建立的標準生物活性進行比較，以確定該材料是否為藥用級。如果樣品的生物活性指紋落在藥用級指紋要求的生物活性范圍內，該材料可以被鑒定和證明為達到藥用級。5．1．2．可選的形成PharmaPrint的方法當推定的植物藥材活性成分未知時，其形成PharmaPrint的方法也始于文獻綜述。這涉及綜述該植物藥材，或相關植物藥材，或由相關活性的植物藥材可獲得的任何化學文獻、生物學文獻、已出版的生物檢測方法和臨床數據。根據疾病狀況，選擇一系列相關的生物檢測法。應用生物檢測法分析樣品或提取物的總體活性。然后將該顯示活性的生物檢測法用于推定的活性成分未知的植物藥材的組分分析。這種分離是根據通常的方法進行的，例如，通過介電常數、生物親合性、極性、大小、溶解度或吸附粉末分離。然后分析組分，以確定哪一個組分有活性。假定發現活性，再分餾每個活性組分，以分離單個的推定的活性成分，即，化學成分單一的化合物。根據已知的單體化學化合物和它們定量的生物活性，可以繪出定量效能曲線，并可以測定出每個單體化學化合物的半數抑制濃度(IC50)。如果推定活性成分是激動劑，可能需要其它的參數(結合、活化、應答)。在通常情況下，生物檢測由以下組成對成分、組分或整個提取物的刺激或抑制作用的進行適當檢測，然后對這些影響進行適當定量評價。對于最可能的(或典型的)檢測(其中標準(或放射標記的)激動劑或拮抗劑產生可以測定的作用)，可以對該材料的抑制和／或刺激進行評價，并典型地通過IC50、EC50等或其它適當的參數(Ki、Kd、Km等)進行表示。然后將單個推定活性成分的活性相加，和未分餾的植物藥材樣品進行比較。如果這些成分是主要活性成分，那么它就具有植物藥材(其中活性成分未知)“活性成分”的一個最初指紋。5．1．3．形成PharmaPrint方法的其它改變如果在檢測過程中出現復雜情況，從上述假定活性成分未知的植物藥材PharmaPrint概括的普通方法具有幾種改變。一種改變發生在個體成分的活性總和不占植物藥材生物活性的主要部分的情況。在這一點，有幾種減少個體成分活性的可能原因，第一，活性成分的分解或降解，或，第二，協同作用。另一種可能的情況，從任何組分都沒有發現明顯的或大量減少的活性，但是植物藥材或提取物在生物檢測中顯示出活性。和標準相比，非特異性基質作用也可能減少總體提取物的活性。如果活性成分在分析過程中分解，測定相對簡單。僅是組分再結合時，再結合組分的活性和原材料的活性進行比較。如果活性損失較大，那么問題可能在于分解。為了確定哪一個活性成分分解，將植物藥材原藥的色譜分析和再結合組分進行對比。峰消失或峰面積減小表明該成分可能分解。為了克服許多方法存在的分解，典型地，可以使用溫和的提取／分餾方法，如液-液色譜(反相流動色譜)或超臨界二氧化碳提取或色譜。對于個體組分的活性不占植物藥材生物活性總和的主要部分的另一個解釋，是一個或更多活性成分之間或和非活性成分之間的協同作用。為了確定協同作用的發生，需要對成對的(pair-wise)再結合組分進行分析。如果結合成分比個體組分顯示更高的活性，組分中兩個或更多的個體成分可以產生協同。例如，一個藥材可能含有3個組分，每一個單獨具有10％的活性(即，它們未結合的生物活性總和為30％)，但是結合后具有100％的活性。在這種情況下，組分間協同作用。通過重復對組分成對(pair-wise)再結合或觀察更大的組分，任何協同活性都會發現。一旦兩個組分表現出協同，像上面那樣進行再分餾，研究成對的個體組分或成對的分離成分，以發現產生協同的個體成分。也可以研究個體成分或組分三種方式的比較。為什么當植物藥材顯示出活性，而組分在生物檢測中無活性這里，解釋包括分解、協同、或許多活性成分而沒有個體組分顯示活性。第一步是分餾每一個最初的組分，看生物檢測中是否有活性成分。如果沒有，組分應該再結合，分析確定是否有活性的分解發生。如果發生分解，應該按照上面所述進行適當的測定。如果沒有分解，應該嘗試可選的分餾方法。最終，足夠大量或適當大小或選擇的組分顯示出活性。如果懷疑協同，按照上面描述的協同部分進行實驗。5．2．加工和提取植物藥材材料的方法植物藥材材料可以加工形成整個植物或植物的選擇部位的水或有機提取物。整個植物或部分的植物藥材材料還可以加工形成粉末。許多感興趣的植物藥材商業可以購買到粉末、水提取物、有機提取物或油。在一個實施方案中，優選植物材料提取物，因為它們易于溶解在液體藥物載體中。但是，粉末植物材料非常適合許多以固體劑型(例如片劑或膠囊)給藥的應用。這些都是本領域熟練技術人員已知的方法。并且，許多植物材料和／或提取物可以商業購買。作為植物藥材的加工和提取實例，下文提供了實施例。另外對提供的實施例進行了詳細的描述。對于有代表性的根部，可以切片、冷凍或研磨成粉末。如果是粉末狀的，用適當的溶劑振搖，過濾(Tanabe等，1991，ShoyakugakuZassi，45(4)316-320)。或者，可以采用以下方法使根均質化，丙酮提取過濾；可以對植物藥材進行蒸汽蒸餾，以獲得必要的油，餾出液溶解于丙酮-水或適當的溶液；或者切片的根莖冷凍和／或冷凍干燥，得到的粉末用丙酮-水提取(Tanabe等，1991，ShoyakugakuZassi，45(4)321-326)。另一個加工植物藥材的方法是用100℃水溶液提取(Yamahara等，1985，J．Ethnopharmacology13217-225)。從上述方法提取的最初溶液，可以用適當的溶劑應用液／液提取進一步提取。植物藥材可以分別使用極性或非極性溶劑進行兩步提取。然后蒸發溶劑，合并組分(Nagabhusan等，1987，CancerLet．36221-233)。植物藥材還可以加工成可以蒸煮的糊狀物或粉末(Zhang等，1994，食品科學雜志(J．OfFoodScience)59(6)1338-1343)。提取干燥的植物藥材可以使用許多溶劑，例如丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、己烷、異丙醇、甲醇、其它的醇、和超臨界二氧化碳(Sipro等，1990，國際食品科學和技術雜志(Int．J．OfFoodScienceandTechnology)，25566-575，和其中的參考文獻)。對于其它的植物藥材如sawpalmetto，醫藥產品為種子油或漿果。再一個有代表性的制備中，制備采用己烷或超臨界二氧化碳提取。許多sawpalmetto制劑可以商業購買，例如PermixonTM或TalsoTM。對于臨界二氧化碳提取植物藥材的一個實例，參見Indena，歐洲專利No．0250953B1。或者，可以將植物藥材碾碎，在索氏萃取器中用適當的溶劑(90％)提取(Elghamry等，1969，Experientia25(8)828-829)。還可以用乙醇提取植物藥材(Weisser等，1996，前列腺(TheProstate)，28300-306)。可以用多種方法制備干燥材料，包括冷凍干燥、微波干燥、液氮冷卻和研磨成粉末70℃真空干燥10小時；或陰涼處空氣干燥，或熱空氣干燥(List和Schmidt，HagersHandbuchderPharmazeutischenPraxis，Springer-Verlag紐約，1933，1973-1979；Araya等，1981，比較病理學雜志(JournalofcomparativePathology，135-141)。浸劑、稀釋的水溶液提取物、還已知浸劑，可以用60-100C水制備(Nosel和Schilcher，1990)。還可以使用煎劑。當粒子大小小于0．25mm時，提取更有效率(List和Schmidt，植物藥學技術，CRCPressBocaRaton，FL，1989)。對于制備植物藥材的油提取物，有許多指導原則。植物藥材可以在油中45℃下消化(浸漬)10天，同時還推薦70℃下12-24小時(Hobbs，1989，HerbalGram18／1924-33；Smith等，實驗室中藥藥學定量確認Williams，OR，1996)。在St．John’sWort中，例如，據報道提取中將制品暴露于太陽光下，導致黃酮類含量提高40％(以四羥黃酮計算)(Maisenbacher和Kovar，1992)。另外，據報道對于St．John’sWort，油制品中的金絲桃素(hypericin)增加20％，其中材料經乙醇進一步提取，和油混合(Georgiev等，1983，NauchniTr．-VisshInst．Plovid．30175-183)。或者，可以制備植物藥材的乙醇-水制品(Dyukova，1985，Farmitsiya3471-72；Georgiev等，1983，NauchniTr．-VisshInst．Plovid．32257-263；Wagner和Bladt，1994，Kowalewski等，1981，HerbaPol．27295-302)。按照HagersHandbuch植物藥材的酊劑，如St．John’sWort，可以通過應用藥物或冷凍乙醇浸泡植物藥材，過濾，在深色瓶中保存(List和Horhammer，1993)。一些植物藥材，如St．John’sWort，對溫度和光都敏感。對于該類植物藥材，應該干燥和制冷劑一起包裝，或冷藏運輸，并閉光和空氣保存。在St．John’sWort中，當在60℃-140℃保存6周以上，粉末提取物、片劑和糖漿制劑中的金絲桃素(hypericin)含量明顯減少。干燥提取物在20℃下保存，至少1年保持穩定(Adamski等，1971，Farm．Pol．27237-241；Benigni等，Hypericum．PlanteMedicinaliChimica．FarmacologiaeTerapia，MilanoInverni&dellabeffa；1971)。St．John’sWort的其它成分，發現油制劑中的hyperforin和adhyperforin非常不穩定，特別是暴露于光線下，和14日降解的一樣多(meisenbacher等，1992，PlantaMed．，351-354)。乙醇提取的制劑穩定性(在空氣中)提高至6個月。同樣地，檢測到四個呫噸酮和幾種黃酮類化合物(包括四羥黃酮和13’，Ⅱ8-biapigenlin)，認為它們可能是外用制劑的活性成分(Bystrov等，1975，四面體通訊(TetrahedronLetters)322791-2794)。5．2．1．植物材料和粉末植物材料的液體提取物有代表性地，人參以植物藥材材料(其為粉末狀根的水或醇提取物)或原料中藥材的形式提供。植物藥材通常的液體提取物劑型為“浸劑”。浸劑的制備可以通過浸漬或煎煮加工。浸劑通常是從干燥或新鮮的植物藥材中提起水溶性成分有效的方式。另一個通常的液體植物藥材提取物為酊劑。有代表性地，植物藥材酊劑為從新鮮或干燥的植物藥材的醇或水醇提取物。它通常通過滲透或浸漬加工制備。植物藥材濃的酊劑，和酊劑母液中，100ml酊劑可以代表10g植物藥材(干燥重量)。通常的植物藥材，100ml酊劑可以代表20g植物藥材。在這些制劑中，干燥植物藥材和溶劑的比例分別為1∶10和1∶5。這些濃度已經被美國國家藥典官方認可，通常制備1∶4和其它濃度的酊劑。和植物藥材粗提取物相比，酊劑的微生物量減少，保存期更長。這主要是由于提取液中含有20％或更大濃度的醇。有時液體提取物由甘油和水作為溶劑進行制備。該甘油溶液通常需要含有至少50％的甘油，以抑制微生物的污染。甘油溶液還可以通過酊劑蒸干乙醇，“后加入”甘油進行制備。另一種類型的液體提取物為“流體提取液”。流體提取液為植物藥材的液體制劑，其藥物性質為1ml提取液代表1g干燥植物藥材。官方的解釋是按照官方的標準(其中使用的溶劑已確定)浸透加工進行制備。通常通過溶劑蒸發的濃縮液體提取物，可以形成油狀、半固體或固體的提取物。干燥的液體提取物在除去溶劑前，通過液體提取物、油或半固體在適當的載體上吸附進行制備。或者，干燥的粉末狀提取物可以按如下制備從液體提取物中除去溶劑，得到粉末狀的固體提取物。5．3組分的分離一旦制備出樣品提取物和／或可選地商業購買提取物，就需要進行組分分析。如果已經建立指紋，樣品或等分試樣分成許多相同的具有標準指紋的標記組分。每一個標記組分包括一個或更多的活性或非活性成分。分別根據每一個待測植物藥材，建立標記組分。對于一些藥材，只需要很少幾個標記組分。對于其它更復雜的藥材，可能有許多標記組分。例如，槲寄生ViscumalbumL．蛋白質提取物，優選的蛋白質標記組分為根據組分與糖結合的親和性分離的組分。但是，根據植物藥材中成分的類型，可以建立鑒定和將材料分成標定組分的不同參數。將樣品分離成標記組分可根據常規技術中的任何一種來進行，例如液相色譜和抽提方法。應該使用與用于建立標準指紋相同的程序。因為需要測定許多組分的生物活性，因此優選應用非破壞性的分離技術。液柱色譜是一種有用的分離技術，它使用了根據具體所使用的化合物的特定親和能力的親和色譜(例如，碳水化合物和靶向酶)。分餾后，除去溶劑，材料溶解于適當的介質中，用于生物檢測。適當的介質的例子包括DEMO、乙醇、不同的洗滌劑、水和適當的緩沖液。溶劑的選擇依賴于待測成分的化學性質和與測定系統的相容性。5．4適當的生物檢測方法的建立示范性的生物檢測可以包括任何細胞增殖檢測，如L1210細胞抑制的測定，和特定疾病相關的免疫活性或關鍵酶的抑制。可用于生物檢測的其它轉化細胞系的實例包括HDLM-3Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤，肝細胞瘤細胞系，攜帶特定細胞受體或酶的人／動物細胞系的初級或已建立的培養物。生物檢測的結果用于制備藥材的生物活性指紋。指紋可以像兩個選擇標定組分的檢測一樣簡單。相反，指紋可以包括對許多不同組分進行的大量不同的生物檢測。可以對不同的標定組分進行相同的檢測。也可以對相同的標定組分進行不同的檢測。生物檢測的結合依賴于特定的植物藥材和它可能的臨床應用的復雜性。生物檢測要和標準藥材建立生物活性指紋的方法相同。5．4．1．酶和基于受體的檢測本發明實際應用中優選酶和基于受體的檢測。檢測的選擇或是根據臨床疾病可接受的酶檢測，或是從特定臨床疾病相關的檢測中選擇。選擇適當、有效的生物檢測非常重要。理想地，生物檢測應該是穩定的，即經時具有重現性，并在一個較寬的濃度范圍內顯示出定量的劑量反應。對于活性成分未知的植物藥材，選擇相關的生物檢測。根據可能的活性機理，以人的治療應用作為指導，選擇本領域已知的檢測。活性機理應該和臨床相關應用相一致。根據酶活性、受體結合活性、細胞培養物活性、抗組織活性和整個動物體內活性，存在大量的臨床相關檢測。這部分涉及酶和受體結合檢測。有許多關于酶和受體結合檢測的書，例如，酶學方法，科學出版社，或Boyers，酶。天然生物活性制品，檢測、分離和結構確定，S．M．Colegate和R．J．Molyneux，CRCPress(1993)。也討論了特定的生物。細胞免疫學方法，R．RafaelFernadez-Botran和V．Vetvicka，CRCPress(1995)中描述了免疫細胞活化檢測和細胞因子受體檢測。“篩選微生物代謝物中新藥理論和實際的考慮”描述了發現藥學相關生物檢測的其它方法(Yarbrough等，(1993)，抗生素雜志(J．Antibiotics)，46(4)536-544)。還有許多商業合同研究供應商，包括Panlabs，Paracelsian和NovaScreen。例如，對于用于治療神經學疾病的植物藥材，生物檢測的集合可以包括腎上腺素受體、膽堿能受體、多巴胺受體、GABA受體、谷氨酸受體、單胺氧化酶、氧化氮合成酶、阿片受體或5-羥色胺受體。對于心血管疾病，檢測的集合可以包括腺苷A1激動；腎上腺素能α1、α2、β1，激動和拮抗；血管緊縮素Ⅰ抑制；血小板凝集；鈣通道阻滯；回腸收縮反應；心律失常；心肌收縮；血壓；心律；變時性；收縮性；缺氧；低密度；KCN缺氧；門靜脈鉀去極化；門靜脈自發激活；血栓烷血小板凝集。對于代謝疾病，可以使用下列生物檢測膽固醇，血清HDL，全血清；血清HDL／膽固醇比率，HDL／LDL比率；葡萄糖，血清葡萄糖含量；或腎功能，尿鉀排泄、尿鹽排泄和尿溶劑變化。對于過敏／炎癥疾病，可以使用下列生物檢測變態Arthurs反應，被動皮膚過敏反應；緩激肽B2；氣管收縮；組胺H1拮抗；炎癥，角叉菜膠對巨噬細胞移動的影響；白細胞三烯D4拮抗；神經激肽NK1拮抗；或血小板激活因子，血小板凝集或重要的炎癥介質的生物合成的誘導(例如，白細胞介素IL-1，IL-6，腫瘤壞死因子或花生四烯酸)。對于胃腸道疾病，可以使用下列生物檢測縮膽囊素CCKA拮抗；外周膽堿能抑制；胃酸，五肽促胃酸激素；胃潰瘍，乙醇；回腸電刺激調節；回腸電刺激痙攣或5-羥色胺5-HT3抑制。對于抗菌、抗真菌、或抗滴蟲疾病，可以使用下列白色念珠菌；大腸桿菌；肺炎克氏桿菌；蛙分支桿菌；普通變形桿菌；綠膿桿菌；耐性金黃色葡萄球菌；胎兒毛滴蟲；或須發癬菌。對于其它的疾病，本領域技術人員可以選擇相關的生物檢測。基于酶或受體的檢測具體實例包括下列乙酰膽堿酯酶；3-羥基丁醛還原酶；血管緊張素轉化酶(ACE)；腎上腺素α、β、大鼠雄激素受體；CNS受體；1或2環加氧酶(Cox1，Cox2)；DNA修復酶；多巴胺受體；雌激素受體內分泌生物檢測；纖維蛋白原酶；GABAA或GABAB；β-葡萄糖苷酸酶；脂肪氧化酶，例如5-脂肪氧化酶；單胺氧化酶(MAO-A，MAO-B)；磷脂酶A2，血小板激活因子(PAF)；鉀通道檢測；前列環素細胞周期蛋白；前列腺素合成酶；5-羥色胺檢測，例如，5-HT活性或其它5-羥色胺受體亞型；5-羥色胺再攝取活性；類固醇／甲狀腺總科受體；血栓烷合成活性。可以從大量的資源中獲得具體的酶檢測，包括PanlabsTMINC(Bothell，WA)和NovaScreenTM(Baltimmore，MD)。另外的檢測包括ATP酶抑制，苯并芘羥化酶抑制，HMG-CoA還原酶抑制，磷酸二酯酶抑制，蛋白酶抑制，蛋白質生物合成抑制，酪氨酸羥化酶和激酶抑制，睪酮-5α-還原酶和細胞因子受體檢測。5．4．2．細胞培養物和其它檢測除了酶和受體檢測，還有其它生物檢測。這些檢測優選在細胞培養物中進行，但也可以在整個生物體中進行。細胞培養檢測包括培養的肝細胞和肝細胞瘤活性(對膽固醇水平、LDL膽固醇受體水平、HDL／LDL膽固醇比率的影響)；對抗L1210、HeLa或MCF-7細胞抗癌活性；PC12人成神經細胞瘤細胞調控受體水平；初級細胞培養物促黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)或促乳激素的活性調控；肥大細胞Ca2+流入量；對吞噬作用、淋巴細胞活性或TNF釋放的細胞培養物檢測；血小板凝集活性或對抗HDLM-3Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤活性，抗有絲分裂活性，受感染細胞抗病毒活性，抗菌活性(細菌細胞培養物)和抗真菌活性。可以使用的組織或整個動物檢測還包括抗炎小鼠耳皮炎，大鼠腳爪膨脹；肌肉收縮檢測；被動皮膚過敏反應；血管舒張檢測；或全動物碳粒清除試驗。這些檢測可以從許多來源獲得，包括PanlabsTMInc．(Bothell，WA)。5．4．3．抗癌活性藥物的抗癌作用可以通過大量的細胞培養系統進行研究；它們包括小鼠白血球過多、L1210、P388、L1578Y等。也可以使用人的腫瘤細胞系，像KB和HeLa。在一個有代表性的檢測中，腫瘤細胞在適當的細胞培養介質(像含有10％胎牛血清的RPMI-1640)中生長。根據細胞系的細胞周期時間，用不同濃度的測試材料處理對數性生長的細胞14-72小時。在培育期結束時，通過細胞計數器評價處理組和未處理組的細胞生長。通過錐蟲蘭排除實驗和通過線粒體脫氫酶造成的四唑染料減少，測定細胞的生活力。藥物抑制培養物中細胞生長的能力可以表明其可能的抗癌作用。這些作用可以通過動物耐受腫瘤(其為人疾病模型)來證實(Khwaja，T．A．等，1986，腫瘤學(Oncology)，43(增補1)42-50)。藥物抗癌作用的最經濟的評價方法，是研究它對含有10％胎牛血清的最小必需介質(MEM)中腫瘤細胞生長的影響。接觸藥物的細胞(兩組)在潮濕的CO2培養箱中在37℃下培養2-4天(依賴于腫瘤細胞的數量加倍時間)。培養期結束時，統計算細胞數量，計算細胞生長抑制程度，和在同樣條件下未處理的對照組細胞生長進行比較。不同的實驗室根據個體的需要使用不同類型的細胞系。美國國家癌癥研究所(NCI)推薦使用KB細胞(人鼻咽癌)用于抗癌藥物的體內評價。細胞生長抑制由藥物處理和未處理對照組評價的蛋白質含量(Lowry’s方法)所決定。NCI還推薦使用小鼠白血病P388懸浮培養物用于評價植物提取物和相關天然產物的抗癌潛力。在微量滴定平板中培養的小鼠白血病L1210細胞，常規用于抗癌活性的體內檢測。白血病L1210的細胞數量加倍時間為10-11小時，和藥物接觸48小時(3-4代的對數生長)，用于評價其抗腫瘤活性。對于生長抑制研究，所有的儲備液和稀釋液用無菌的0．9％NaCl溶液制備。在微量滴定平板(0．18ml／孔)中，對于每個抑制劑濃度以2-5×104細胞／ml的濃度接種細胞培養物兩份。在每種情況下，加入0．02ml的抑制劑以獲得1∶10的稀釋液。加蓋的微量滴定平板在空氣中含有5％CO2的潮濕的CO2培養箱中培養48小時。在培養期結束時，將每孔等分量的培養物加入到測量體積的等滲鹽水中，用電子細胞計數器計數。通過錐蟲蘭排除測定細胞的生活力。通過繪制細胞生長抑制百分率(和鹽處理的對照組細胞濃度相比)對對數藥物濃度的曲線，計算結果，表示為引起50％細胞生長抑制的的濃度(IC50)(從圖中可測出)。也可以評價出藥物對腫瘤細胞系的細胞毒效應。然而，這些實驗需要較長的時間，而且花費更昂貴。在該研究中，洗滌藥物處理的細胞，使其不含藥物，然后在軟瓊質或適當的培養基鋪板，通過存活細胞增殖和形成微集落能力評價細胞的生活力。某種藥物濃度得到的細胞集落數量和未處理的對照組得到的相比較，以評價細胞殺傷和細胞毒活性。在槲寄生提取物研究中，我們使用EMT-6細胞松散的貼壁培養物(小鼠乳腺癌)。該細胞在含有10％的透析的胎牛血清和抗生素的Eagle’sMEM(F14)中生長。旋轉細胞懸浮液，懸浮于添加10％的透析胎牛血清的Spinner’s培養基中的小球(70個細胞／ml)，在塑料培養皿中鋪板，培養2小時，使細胞附著。這時細胞和不同濃度的提取物接觸2-24小時。然后，除去培養基，用不含藥物的培養基代替，在培養皿中培養5-7天。集落用亞甲蘭(0．33％，在0．01％KOH中)染色，用自動集落計數器計數。EMT-6細胞的鋪板效率為46％。(Khwaja等，1986，腫瘤學(Oncology)，43(增補1)42-50)。5．4．4．抗病毒活性不同藥物的抗病毒活性可以通過人細胞系(像HeLa或H9淋巴瘤細胞)的細胞培養物確定。將該細胞用病毒感染，病毒在細胞培養物中增殖。病毒產生細胞溶解作用或致細胞病變效應的能力取作終點。例如，H9細胞的HIV感染導致多核細胞的產生。該致細胞病變效應如果通過某一濃度的藥物降低或提高，表示了其作為抗HIV藥的潛力。結果可以通過細胞培養物中病毒酶的評價驗證，例如，通過研究病毒逆轉錄酶的表達量。病毒酶的表達降低支持了藥物治療的抗病毒作用(KhwajaT．A．美國專利第5，565，200號；J．Levy等，1984，科學，225840)。5．5．分析化學成分的分析方法有許多方法用于分離和分析單個的化學成分，包括氣相色譜(GC)，質譜(MS)，GC-MS，高效液相色譜(HPLC)，HPLC-MS，薄層色譜(TLC)，高效TLC(HPTLC)凝膠色譜和反相色譜(RPC)。這些色譜方法基可以應用分析級的，也可以應用制備級的。為了確定未知成分的化學結構，有代表性地應用核磁共振(NMR)和質譜組分分析。色譜類型的確定依賴于最有可能具有生物活性的化學成分。例如，其生物活性是由于脂肪酸，就將該脂肪酸酯化，用GC分析它的酯。對于具有醇基團的有機化合物，將其修飾，制備酯、甲硅烷基或其它極性更小的官能團。該衍生物適合于GC分析(Steinke等，1993，PlantaMed．59155-160；Breu等，1992，Arzneim．-Forsch／DrugRes．42(1)547-551)。如果活性最可能是由于類黃酮，可以選擇HPLC法。反相HPLC(RP-HPLC)已用于許多植物藥材(具體為山楂、粉色西番蓮、甘菊、銀杏)的類黃酮分析(Pietta等，1989，色譜學(Chromatographia)，27(9／10)509-512)。通過TLC(Vanhaelen和Vanhealen-Fastre，1983，色譜雜志，281263-271)以及MS分析對大蒜的植物成分進行定量檢測。CRC色譜手冊關于“液體分析”，K．D．Mukherjee，“甾體的分析和特征鑒定”，H．Lamparczyk，J．Sherma，和“肽和蛋白質的高效液相色譜”，C．T．Mant和R．S．Hodges，是可獲得的現有文獻，其描述了柱和溶劑系統。5．6．組分的分析在一個可選擇的實施方案中，藥物指紋(PharmaPrint)不是根據已知生物活性的個別化學成分，還可以應用限定的組分或化合物的種類建立PharmaPrint。一些植物藥材的化學成分形成許多密切相關成分的復雜混合物，以至于，從實際的觀點考慮，需要根據組分或化合物的種類，而不是根據單個的化合物，建立PharmaPrint。該類型的成分的實例為外源凝集素(糖結合蛋白質)或醣蛋白以及水飛薊中的水飛薊素。有許多組分分析的實例(凝膠過濾原理和方法，PharmaciaBiotech，RahmsiLund瑞典，Ulsumi等，1987，生物化學雜志(J．Biochem．)，1011199-1208)。5．7．應用PHARMAPRINTEDTM材料的方法在植物藥材建立指紋后，分析單個樣品，以確定其是否落在可接受的標準范圍內。一旦樣品得到證實，它適合用于有關人和動物的許多疾病。該材料可用于臨床實驗，以提供穩定質量的材料和用于實驗的ose制劑的準確劑量。PharmaPrintedTM材料還可用于動物的毒理分析，其中質量穩定的材料可用于定量毒理分析。在許多情況下，它可以作為材料分析或生物應用的參考。PharmaPrintedTM植物材料可用于植物藥相關的任何疾病。參見例如，Leung和Foster，1996，和中藥和植物藥學，1994。更具體的病狀或治療適應癥包括AIDS、適應原(adaptogen)、輕度至中度抑郁、抗關節炎、抗癌、止瀉、抗蠕蟲、抗炎、通過GI止惡心、抗風濕、解痙、抗潰瘍、絞痛、抗菌、抗誘變、抗氧化、抗病毒、動脈硬化、關節炎、哮喘、血壓、前列腺良性增生(BPH)、支氣管哮喘、支氣管炎、鎮靜、咳嗽、大腦循環紊亂、膽固醇降低、肝硬化、皮膚病抗炎、糖尿病、利尿、劇瀉、痛經、消化不良、肺氣腫、環境緊張、祛痰、自由基清除劑、GI損傷、痔瘡、肝炎、肝保護、高血壓、高血脂、血催乳素過多、免疫調節活性、纖維蛋白溶解增加、對抗細菌感染、炎癥、失眠、哺乳、肝保護、長壽、月經循環調節、偏頭痛、肌肉痛、骨關節炎、疼痛、外周血管疾病、血小板凝集、PMS、促進月經、前列腺疾病、甘油三酯減少、減輕月經痛、呼吸道感染(RTI)、視網膜病、鼻竇炎、風濕、鎮靜、催眠藥、咽喉痛、刺激頭發生長、表面傷口愈合、耳鳴、局部濕疹(皮炎)、泌尿道感染(UTI)、靜脈曲張、靜脈不足或傷口愈合。其它的適應癥包括止血、抗菌、抗寄生蟲、退熱、強心、祛風、利膽、鎮痛、發汗、催吐、通經、潤膚、退燒、催奶、肝的、催眠、通便、鎮定、祛痰、發紅、興奮、滋補、醫治創傷、潰瘍stores、溢膿、牙齦炎、胃炎、潰瘍、膽結石、間歇性跛行、感冒、流行性感冒、喉炎、頭痛、帶狀皰疹、膀胱炎、腎結石、特異反應性陰道炎、子宮纖維瘤、骨質疏松、痛風。PharmaPrintedTM人參藥物優選的適應癥包括，但不僅限于此抗壓力、催欲、增加活力、神經系統疾病、心血管疾病、提高智能、增加生殖能力、提高精確性、提高學習能力、減輕壓力、抗潰瘍、腎上腺疾病、降低心律、降低血壓、增加血管緊張、增加耐受力、免疫系統刺激、提高生育力、抗毒素、抗炎、退熱、鎮痛、減慢老化過程、加快康復、抗癌治療、糖尿病、哮喘、頭痛、貧血、消化不良、陽萎、抑郁、和月經疾病。5．8．人參PHARMAPRINT在這部分通過應用下表1-10提出的數據，提供了人參的生物和化學PHARMAPRINT的說明性發展。它們的檢測和應用參考的詳細描述見下面的第6部分。5．8．1．人參的生物PHARMAPRINT人參的生物PHARMAPRINT特征在于下面表1-8提出的生物活性譜。指出了提取物、組分和參照化合物的PHARMAPRINT的百分率(％)活性。對于提取物和組分的計算根據平均分子量為200的假定。在所有的表中，測定得到報導的抑制百分率的提取物或參照化合物的濃度如括號中所示。其中，在表的最上欄給出了濃度，下面給出了具體抑制值，適用的濃度以及百分率抑制值；表最上欄給出的濃度只適用于該欄的百分率抑制值，其中它不和具體的百分率抑制值一起出現在表中。表1對于GABAA和PAF-R檢測的人參PharmPtint表2對于血栓烷A2受體檢測(TXA2)、白細胞三烯B4受體檢測(LTB4)、磷脂酶A2受體檢測(PLA2)、白細胞介素-8受體檢測(IL8R)、和谷氨酸受體AMPA位點檢測(AMPA)的人參生物PharmPrint。表3在所示的生物檢測中人參的生物PharmPrint。<tablesid="table3"num="003"><table>提取物谷氨酸NMDA，甘氨酸(10-4M)5-LO白細胞三烯C4合成酶非選擇性腺苷Rec．，(1μm)Ca2+作用，Voltinsens．KChnl(10-4M)PG10150±2040±20(10μm)45±20PG10260±2020±10(1000μm)25±10參照化合物人參皂甙RcG-090220±1025±10(1000μm)55±20100±20人參皂甙ReG-102720±10(1000μm)85±20人參皂甙Rb1G-077720±10人參皂甙Rf人參皂甙RdG-010225±1065±20(1000μm)人參皂甙Rb2G-010430±1540±20(100μm)人參皂甙Rg130±15</table></tables>縮寫5-LO為5-脂肪氧合酶表4在單胺氧化酶A(MAOA)檢測和其它指示的生物檢測中人參的生物PharmPrint。<tablesid="table4"num="004"><table>提取物鈉位點2(10-4M)多巴胺攝取(10-4M)血管緊張素Ⅱ，2型中心(10-4M)促腎上腺皮質激素釋放因子(10-4M)MAOA(10-4M)PG10125±10PG10220±1030±15參照化合物人參皂甙RcG-090225±1030±1525±1020±1020±10人參皂甙ReG-102730±15人參皂甙Rb1G-077730±1525±10人參皂甙Rf35±15人參皂甙RdG-010225±1040±2050±2030±15人參皂甙Rb2G-010425±1025±1030±1530±15人參皂甙Rg125±1025±1020±10(10-5M)</table></tables>表5在單胺氧化酶B(MAOB)檢測和其它指示的生物檢測中人參的生物PharmPrint。<tablesid="table5"num="005"><table>提取物MAOB(10-4M)組胺H1(10-4M)組胺H2(10-4M)非選擇性腎上腺素能α-1(10-4M)蕈毒堿M1(10-4M)PG10140±20PG102參照化合物人參皂甙RcG-0902人參皂甙ReG-102720±10人參皂甙Rb1G-077730±15人參皂甙Rf25±10(10-6M)20±10人參皂甙RdG-010230±1520±10人參皂甙Rb2G-010425±1025±1035±15人參皂甙Rg120±10</table></tables>表6在所示的生物檢測中人參的生物PharmPrint。<tablesid="table6"num="006"><table>提取物非選擇性阿片受體(10-4M)非選擇性腎上腺素能β(10-4M)CCKB(10-4M)谷氨酸NMDA拮抗劑位點(10-4M)5-羥色胺攝取(10-4M)PG10170±2020±10PG102145±20(10-6M)90±20參照化合物人參皂甙RcG-0902人參皂甙ReG-1027人參皂甙Rb1G-0777人參皂甙Rf人參皂甙RdG-010255±2045±2020±10人參皂甙Rb2G-0104人參皂甙Rg1</table></tables>通過實驗，應用表1-8中的數據，人參的PharmPrint可以基于組分3、4、13和17的生物活性，和在GABAA受體檢測(表1)中的整個提取物的活性，和選自下組的一個或更多的檢測AMPA，PAF-R，非選擇性腎上腺素能β，谷氨酸NMDA甘氨酸，和MAOA檢測，檢測的優選按次序遞降。表7在指示的生物檢測中人參的生物PharmPrint。<tablesid="table7"num="007"><table>樣品PLA2檢測(IC50=mg／mlGABAA結合檢測(IC50=mg／ml)谷氨酸AMPA結合檢測(IC50=mg／ml)5-脂肪氧合酶(％抑制@1mg／ml)平均提取0．76±0．210．022±0．020．28±0．3245％組分PLA2檢測(IC50=mM)GABAA(％抑制@0．1mM)谷氨酸AMPA(％抑制@0．1mM)5-脂肪氧合酶(％抑制@0．1mM)H2Okupchan0．94371NA84DCMkupchan0．94356NA28EtOAckupchanNA10052NA1％MeOHNA86NANA2．5％MeOHNA80NANA5％MeOH31％@0．187NANA10％MeOH35％@0．184NANA20％MeOH25％@0．187．5±14．8NANA40％MeOHNA76．5±0．7NANA80％MeOHNA31±29．7NANA100％MeOH47％@0．143．5±13．4NA34±4．2100％丙酮54％@0．132．5±21．9NAEC50=315ng／ml參照PLA2檢測(IC50=mM)GABAA(IC50=mM)谷氨酸AMPA(IC50=mM)5-脂肪氧合酶(％抑制)GABANT0．000080NANT人參皂甙Rb10．024NANA23％@0．03mM人參皂甙Rb20．028NANA20％@0．03mM人參皂甙RbC0．028NANANA人參皂甙RbD0．046NANA25％@0．03mM人參皂甙RbENANANA35％@0．03mM人參皂甙RbFNANANANA人參皂甙RbG132％@0．1NA21％@0．1mMNA谷氨酸NTNA100％@0．1mMNT谷氨酰胺NTNA50％@0．1mMNT脯氨酸NT0．054±28％@0．1mMNT</table></tables>報導值假定分子量為200NT未測定NA=無活性在一個供可選擇的實施方案中，PharmPrint的形成基于生物活性等于或大于生物活性范圍的最小值，如表1-8中所示，作為該實施方案的說明性實例，基于GABAA檢測中(100±20)(表1)所有提取物的生物活性的PharmPrint值，在10-4M濃度至少80％抑制。表8生物藥物指紋活性人參的藥物指紋范圍<tablesid="table8"num="008"><table>生物檢測標記物范圍(IC50)μg／mL寬的范圍(平均值±3STD)中間范圍(平均值±2STD)優選范圍(平均值±1STD)GABAA0．50-2505．0-10012．0-50．0谷氨酸，AMP2．50-240025．0-1200100-600磷脂酶A250．0-2000250-1500530-950</table></tables>5．8．2．人參的化學PHARMAPRIN通過參照表9和10(其列出了指示特定人參標記成分的值的范圍)，可以更便利地形成人參的化學PHARMAPRINT。在許多情況下，該特定成分已進行過檢測，并在本文提出的特定生物檢測中顯示出生物活性。表9用于建立人參化學PHARMAPRINT的人參化學成分指示人參皂甙的值(％W／W)。<tablesid="table9"num="009"><table>人參皂甙范圍Rg10．1-4．0Re0．1-7．5Rb10．1-4．0Rc0．1-4．0Rb20．1-4．0Rd0．1-5．0總共人參皂甙1-20</table></tables>表10化學藥物指紋活性人參的藥物指紋范圍<tablesid="table10"num="010"><table>化學標記物范圍(IC50)μg／mL寬的范圍(平均值±3STD)中間范圍(平均值+2STD)優選范圍(平均值+1STD)總共人參皂甙0．20-25．02．00-20．07．0-14．0人參皂甙Rb10．1-21．01．50-17．04．50-13．1人參皂甙Rg10．05-3．250．10-2．600．70-2．00GABA0．005-2．190．01-1．720．02-1．26谷氨酸0．005-0．550．03-0．440．13-0．34谷氨酰胺0．005-0．780．01-0．600．04-0．41脯氨酸0．05-1．380．1-1．090．22-0．80</table></tables>5．8．3．換算率應用植物藥材的干燥粉末提取物得到的PharmPrint值，可以換算成與植物藥材原材料干重有關的值，應用的比例在下表13中進行說明。因此，將基于干燥粉末提取物的PharmPrint值換算成與干燥植物材料有關的值，在表11中，通過適當的因素劃分。表11換算率。<tablesid="table11"num="011"><table>換算率植物藥材比率(粉末至提取物)SawPalmetto10∶1St．John’swort5∶1纈草根5∶1Echinacea5∶1銀杏50∶1人參5∶1V．agnus-castus10∶1BlackCohosh1∶1越桔100∶1水飛薊40∶10</table></tables>下面的實施例只是為了舉例說明，絕不是為了限制本發明。6．實施例人參(亞洲)PHARMAPRINTINGTM6．1．商業可購買的人參人參是在全世界范圍內都可以購買的最常見的植物藥材產品。一些產品和供應商為MurdockMadausSchwabe(Springville，Utah)提供的GinsunTM，EnzymaticTherapy(GreenBay，Wisconsin)提供的GS500TM，和NutritionalProducts，Ltd．(Burnaby，britishColumbia，Canada)提供的GinsengSoftgelsTM。粉末狀人參提取物可以從ZuellingBotanicals，Inc．(德國)的部門BotanicalsInternational購買。人參干燥提取物IDB可以從Indenas．a．(Milan，Italy)購買，標準為含有7％的人參皂甙。還可以從下列公司購買到人參Shaklee，Lichtwer，Sunsource，Nature’sResource，HerbalChoice-Botalia，Nature’sWay，NaturaLife，Herbalharvest，BotaliaGold和PhytoPharmica。6．2．組分分析將人參粉末用40ml去離子水溶解，裝填入LiChroprepRP-18(40-60μm)的柱中(2．5×92cm，柱體積450ml)。預先裝填柱子，用去離子水平衡。如下表12所示，按順序分批用水／乙醇混合液，最后用乙酸乙酯過柱。從表12所示的22個組分中分別取出等分試樣(0．5ml)，進行HPLC檢測。然后將剩下的組分蒸發，測定殘渣的重量。每個組分的收集體積和殘渣重量在表12中列出。回收的柱組分總重量為14．6074g，即，使用材料的97％。表12LiChroprepRP-18柱組分<tablesid="table12"num="012"><table>洗脫劑組分編號體積(ml)殘渣重量(g)100％H2O組分1112．50．002100％H2O組分2112．5樣品損失100％H2O組分3112．50．8400100％H2O組分4112．55．694210％MeOH組分52253．830610％MeOH組分62250．631710％MeOH組分72250．941410％MeOH組分82250．115220％MeOH組分92250．059320％MeOH組分102250．070220％MeOH組分112250．071820％MeOH組分122250．027040％MeOH組分132250．023740％MeOH組分142250．072940％MeOH組分152250．065540％MeOH組分162250．027880％MeOH組分172250．022080％MeOH組分182250．6110100％MeOH組分192250．5464100％MeOH組分202250．5456100％MeOH組分219000．1138100％EtOAC組分224500．0991</table></tables>22個柱組分中的每一個0．5ml等分試樣，再進一步進行HPLC分析。HPLC條件如下。使用水μBondpakC-18ODS柱(250cm×4．6cmID)和PDA檢測器(200-400nm)，溶劑坡度為在75分鐘內18％乙腈提高至40％乙腈，最后5分鐘保持100％乙腈。6．3．生物活性檢測推定的人參生物活性模式有兩方面作用。第一，它具有適應性作用，它非特異性地增強身體中對外源壓力因子和潛在的有害化學物質的抵抗力(Kim等，1992，Biochem．Biophys．Res．Commun．189670-676)。第二，它促進身心機能整體改善(Mohri等，1992，PlantaMedica58321-323)。人參表現出的免疫調節活性可以部分解釋為它的適應性作用。人參提取物對小鼠腹腔內給藥，刺激了細胞調節免疫，提高了對抗綿羊紅細胞和天然殺傷細胞的抗體水平(Singh等，1984，PlantaMedica50549)。還有人參皂甙Rg1和Rb1改善正常以及認知損害動物的記憶和學習的報道(由Foster綜述，1996，美國植物藥材委員會，植物藥材系列-303)。6．3．1．GABAA／B受體的拮抗劑GABA(γ-氨基丁酸)是哺乳動物中樞神經系統(CNS)主要的抑制性遞質。當GABA從突觸前部釋放，它可以和受體結合，或被細胞攝取和代謝。有兩類GABA受體，GABAA和GABAB。GABAA受體激活氯通道，同時受體通過和細胞內第二信使(如G蛋白或腺苷酸環化酶)相互作用，調節Ca2+和K+通道(Kimura等，1994，Gen．Pharmacol．25193-199)。人參皂甙Rb1、Rb2、RC、Re、Rt和Rgl都抑制[3H]-蠅蕈醇結合的高親和性GABAA位點。相反，總皂甙組分和只有人參皂甙RC抑制[3H]-蠅蕈醇結合的位點。對化合物進行GABAA的生物檢測中，使用從牛小腦細胞膜部分純化的受體。濃度設定在5nM[3H]-GABA，反應在50mM的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中、0-4℃下進行60分鐘。在反應中，用1μMGABA測定非特異性結合。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應。用閃爍計數測定纖維上捕集的放射性，和對照化合物比較，以測定[3H]-GABA和GABAA受體結合的競爭度(Enna等，1977，大腦研究(BrainResearch)，124185-190)。文獻化合物和檢測特性如下所列。人參提取物和其組分的參照化合物為Rb1、Rb2、Rc、Re、Rf和Rg(Sigma化學公司或Indofine化學公司)。參照化合物Ki(nM)蠅蕈醇4．4異去甲檳榔次堿9．5GABA23．1TRIP25．1檢測特性KD(結合親和性)370nMBmax(受體數量)0．7pmol／mg蛋白質和受體結合的抑制，使用從大鼠皮層細胞膜部分純化的受體。使用5nM濃度的[3H]-GABA配體，加上100μM的異去甲檳榔次堿，一起阻滯和GABAA的結合。反應在含有2．5mMCaCl2的50mM的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7．4)中進行，在25℃下保溫60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應。用閃爍計數測定纖維上捕集的放射量，值和對照相比較，測定在[3H]-GABA和受體結合中是否有任何競爭的發生(Scherer等，1988，大腦研究公報(BrainRes．Bulletin)，21439-443)。文獻化合物如下所列。提取物和組分標準與上面描述的GABAA檢測中使用的相同。參照化合物Ki(nM)GABA13．0(+／-)-氯苯氨丁酸250．0曲胺(kojicAmine)1177．0蠅蕈醇2543．05-氨基戊酸3540．0Thiomuscimol＞10，0002-羥基氯苯氨丁酸＞10，000SR95531＞10，000檢測特性KD(結合親和性)38nMBmax(受體數量)222fmol／mg蛋白質6．3．2．抗血小板活性近年來更加確定血小板在動脈粥樣硬化形成中起到的作用。內皮損傷導致內皮下膠原暴露于循環的血細胞下，這樣導致巨噬細胞和血小板在損傷部位發生堆積。在該過程中，血小板分泌許多化學物質，包括血管活性物質和血小板衍生的生長因子(PDGF)。該細胞增殖和平滑肌細胞遷移的結果導致了動脈粥樣硬化損傷的增長。已報道70％的甲醇人參提取物和人參皂甙Ro可以遲延凝血和提高纖維蛋白溶解(Kuo等，1990，PlantaMedica56164-167)。對人參提取物及其組分對血小板凝集的抑制進行了檢測，如下所描述。6．3．2．1．血小板凝集檢測簡要地，從新西蘭種的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，雄性或雌性)得到的靜脈血，和十分之一體積的檸檬酸三鈉(0．13M)混合，然后在室溫、220Xg下離心10分鐘。得到的上清液為富含血小板的血漿(PRP)。通過200μM花生四烯酸鈉在37℃下保溫，進行非可逆聚集。通過光學凝集器(opticalaggregometer)測定凝集。測試材料在30μM的濃度下和PRP保溫5分鐘，以測定血小板凝集的百分比抑制。文獻參考的標準如下所列。檢測基于Bertele等，1983，科學(Science)220517-519。化合物IC50(μM)阿司匹林(乙酰水楊酸)12BM13，505(Daltroban)3．2BW-755C1．2CGS12970120*吲哚美辛0．28NDGA35苯異妥英2．6保泰松28*表示使用標準參照藥物；BW-755C=3-氨基-1-[3-(三氟甲基)苯基]-2-二氫吡唑；CGS12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；NDGA=去甲二氫愈創木酸。除了使用200μM花生四烯酸鈉誘導血小板凝集，還使用5nM血小板激活因子acether(PAF-acether)(Nunez等，1986，歐洲藥理學雜志(Eur．J．Pharmacol)123197-205)。文獻參考的標準如下所列。化合物IC50(μM)NectandrinA(BN-52021)3．3CGS-1297026CV-398810Kadsurenone(L-651108)1．7L-6527310．83L-6599890．33RP-4874017SRI-634411．7WEB-20860．11CGS-12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；CV-3988=3-(4-羥基-7-甲氧基-10-氧-3，5，9-trixa-11-氮雜-4-磷雜二十九烷-1-基)-噻唑啉；L-652731=2R，5R-(3，4，5-三甲氧基苯)。還可以使用文獻中描述的其它檢測。Kieswetter等(1991，Int’lJ．Clin．Pharm．，Ther．，&Toxicol．29151-155)描述了評價血小板凝集的其它技術。血管擴張抑制作用的臨床指示是靜脈不足的另一種檢測。它是通過研究冠狀動脈片斷對乙酰膽堿的收縮反應得出的(Bettini等，1991，Fitoterapia62(1)15-28)。6．3．2．2．PAF受體(PAF-R)檢測在該檢測中，通過測定[3H]-血小板激活因子(PAF)和PAF受體的結合，分析人參提取物和組分。取樣品10μM。從雄性或雌性新西蘭種的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，)得到的血小板，在改性Tris-HClpH7．5緩沖液中應用標準技術制備。50μg的膜等分試樣和0．4nM的[3H]-PAF在25℃下保溫60分鐘。在1μMPAF存在下，評價非特異性結合。過濾膜，洗滌三次，計數過濾器，以測定[3H]-PAF特異性的結合。參見Hwang等(1983，生物化學(Biochemistry)224756-4763)對檢測的描述。同樣地，生物檢測可以使用1nM量的[3H]-十六烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿，在含有0．25％BSA的50mMHEPES緩沖液(pH7．0)中反應2小時。通過玻璃過濾器過濾，從結合的中分離未結合的配體。通過液體閃爍計數測定捕集的放射量(修改自Hwang等，1985，生物化學雜志(J．BiologicalChemistry)26015639-15645)。6．3．3淋巴細胞和PC-12細胞活性發現人參的脂溶性組分刺激PC-12細胞分化(Mohri等，1992，PlantaMedica58321-323)，醇提取物刺激免疫系統細胞(Singh等，1984，PlantaMedica50549)。為了檢測擬神經元細胞系PC-12，細胞在35mm膠原涂層的無菌組織培養平板(在37℃下，用5％血清和5％牛胎兒血清補充的Dulbecco’s改良基本培養基(DMEM))上生長。為了評價神經突的生長，利用計算機圖像處理儀(XL-500，奧林巴斯，日本)，測定貼附于相差顯微鏡每天每個細胞的總面積，定量試驗PC-12細胞的過程。在5個以上區域中篩選出的細胞作為適當的樣品進行檢測。(Mohri等，1992，PlantaMedica58321-323)。T和B淋巴細胞檢驗如下。應用標準程序從小鼠胸腺分離的T-細胞，在初始細胞濃度5×106細胞／ml、37℃下的DEMO中生長。在10-0．001μM的范圍內10倍稀釋液中評價測試化合物。在37℃下培養15小時后，向培養物中加入2μCi[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷。再培養48小時后收獲細胞，通過閃爍計數測定加入的胸腺嘧啶脫氧核苷量(Dayton等，1992，分子藥理學(Mol．Pharmacol．)41671-676)。文獻參照化合物如下所列。文獻參照提取物和組分化合物與GABAA／B受體拮抗部分的相同。化合物EC50氰丙亞胺＞10μM抑氨肽酶B＞10μM刀豆素A1．8μg／ml白細胞介素2(人)＞100ng／ml白細胞介素2(大鼠)＞30U／ml白細胞介素5＞10ng／ml左旋咪唑＞10μM腫瘤壞死因子＞10ng／ml為了檢測人參衍生物對B-細胞生長的調控，應用標準程序從小鼠脾臟分離細胞。細胞在濃度為106細胞／ml的DEMO中生長。化合物用DEMO稀釋，測定范圍在10-0．001μM的10倍稀釋液。在37℃下培養15小時后，加入2μCi[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷。48小時后收獲細胞，通過閃爍計數測定加入的胸腺嘧啶脫氧核苷(Dayton等，1992，分子藥理學(Mol．Pharmacol．)41671-676)。文獻參照化合物如下所列。對提取物和組分化合物進行檢測(與GABA／B受體拮抗部分列出的相同)。化合物EC50氰丙亞胺＞10μM抑氨肽酶B＞10μM白細胞介素2(人)＞100ng／ml白細胞介素2(大鼠)＞30U／ml白細胞介素5＞10ng／ml左旋咪唑＞10μM脂多糖0．38μg／ml腫瘤壞死因子＞10ng／ml6．3．4．抗抑郁(丁苯喹嗪)檢測注射丁苯喹嗪甲烷磺酸鹽(100mg／kgi．p．)30分鐘后，給一組體重22±2g的ICR種小鼠口服給藥人參、人參提取物、人參提取物組分、或載體空白。60分鐘后紀錄體溫。丁苯喹嗪誘導的低溫反應減少50％或更多被認為是作用明顯，可以表明具有抗抑郁活性(Gylys等，1963，AnnalsN．YAcad．Sci．107899-913)。<tablesid="table13"num="013"><table>化合物ED50mg／kgp．o．阿米替林3苯丙胺1丁氨苯丙酮30可樂定＞30去甲丙米嗪1氟西汀＞30*丙米嗪3米安舍林30巴吉林10沙丁胺醇＞30反苯環丙胺3</table></tables>*表示使用標準參照藥物。6．3．5．抗壓力檢測通過測定PC12細胞激活的檢測中，對人參壓力釋放的臨床適應癥進行了生物分析。下面過程如Mohri等所描述(1992，PlantaMedica58321-323)。他們報道了人參親脂性成分可以激活他們的模型中的神經元細胞。或者，可以在大鼠或小鼠體內模型中評價人參的抗壓力活性。在該動物模型中研究人參成分的實驗可以按照Nabata等進行(1973，日本藥理學雜志(JapanJ．Pharmacol．)2329-41)。他們報道了應用小鼠和大鼠的大量行為檢測結果，包括條件避免實驗，運動原協調實驗和爬桿實驗。另外，還可以進行用于評價人參派生的抗壓力物質的受體結合檢測。靶受體包括，但不僅限于此，如上面提到的GABAA和GABAB受體。進行受體結合檢測可以使用本領域技術人員公知的任何方法，例如，Kimura等的方法，1994，基因藥理學(Gen．Pharmacol．)25(1)193-199。6．3．6．對于GABAA和PAF受體的生物檢測概述表對兩種提取物、18種組分和7中參照標準物進行了生物檢測，以測定GABA配體和GABAA受體結合的拮抗，或PAF和其受體的拮抗(表13)。第一種提取物，PG101，是由尖頭和纖維(PE5％N，EastEarthHerb，Eugene，OR)制成的中國人參根提取物。提取物的組分由Hauser(Boulder，CO)提供，純的人參皂甙從Sigma(St．Louis，MO)或IndofineChemicalCompany(Sommerville，NJ)商業購買。表13生物檢測概述表，報道了指定的提取物、組分和參照化合物在GABAA受體和PAF受體檢測中的百分比抑制。<tablesid="table14"num="014"><table>提取物GABAA受體(10-4M)PAF受體(10-4M)PG101992PG10210210組分GABAA受體(10-4M)PAF受體人參組分397．5-人參組分499．2-人參組分585．726(10-4M)人參組分671．4-人參組分767-人參組分89127(10-8M)人參組分994-人參組分1079．728(10-8M)人參組分1179-人參組分1285．225(10-8M)人參組分1387．2-人參組分1483．4-人參組分1572．233(10-8M)人參組分1668．522(10-4M)人參組分1794．9-人參組分1833．3-參照人參皂甙GABAA受體(10-4M)PAF受體RCG-0902-ReG-1027-Rb1G-0777-RfG-0107-RdG-0102-Rb2G-0104-Rg1G-0101-</table></tables>6．3．7．其它生物檢測如下段所描述，對人參提取物和參照化合物進行了26項另外的生物檢測。結果總結于下面的表14-18中。上面表13和下面表14-18中結果表明在測試濃度下未觀察到活性(0％抑制或激活)。應用從牛紋狀體膜制備的部分純化受體，測定了這些物質產生的[3H]-硝化甘油對蠅蕈堿M1受體(M1)的抑制。最終熱配體濃度為1nM，在100nM阿托品存在的條件下，對非特異性結合進行了測定。反應在25mMHEPES(pH7．4)、25℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應。用液體閃爍計數測定結合放射活性(Watson等，1983，生命科學(LifeSciences)323001-3011)。為了檢測谷氨酸受體，進行了兩種檢測。在第一種檢測中，研究了谷氨酸受體位點的拮抗劑(NMDA)。這里，受體為從大鼠前腦制備的部分純化材料。放射性配體為最終配體濃度2nM的[3H]-CGP39653。應用1mMNMDA測定了非特異性結合。檢測反應在50mMTris-醋酸(pH7．4)、0-4℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應(Lehmann等，1988，J．Pharmac．Exp．Ther．24665-75)。在谷氨酸受體的第二種檢測中，應用最終濃度5nM的[3H]-AMPA進行反應。應用100μMAMPA測定了非特異性結合。檢測反應在10mMK2HPO4／100mMKSCN(pH7．5)、0-4℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(Nurphy等，1987，神經化學研究(Neurochem．Res．)12775-781)。為了測定中樞神經系統縮膽囊素受體(CCKB)的抑制，制備了從小鼠前腦膜制備的部分純化受體。使用最終濃度為0．02nM的[125I]-縮膽囊素，在1μM硫酸處理的縮膽囊素8存在的條件下，對非特異性結合進行了測定。反應在含有360mMNaCl、15mMKCl、5mMMgCl2、1mMEGTA和0．25mg／ml桿菌肽的20mMHEPES(pH6．5)中、25℃下進行120分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(Wennogle等，1983，生命科學(LifeSciences)361485-1492)。應用小鼠肝線粒體膜作為部分純化的酶源，測定了MAOA酶活性(MAOA)的抑制。酶作用物為[14C]-5-羥色胺，應用1μM的Ro41-1049，對非特異性活性進行了測定。反應包括酶作用物向[14C]-5-羥基吲哚乙醛+NH4+的轉化。簡要地，酶和所需的酶作用物、亞型特異性阻滯劑司來吉蘭在37℃、100mMKPO4(pH7．2)下預保溫60分鐘。加入酶作用物，再保溫10分鐘。通過加入0．5ml的2M檸檬酸中止反應。放射性產物用甲苯／乙酸乙酯氟提取，應用閃爍分光光度測定法和對照樣品進行比較(Otsuka，S．和Kobayashi，Y，1964，生物化學藥理學(Biochem．Pharmacol．)13995-1006)。還使用大鼠肝線粒體膜作為部分純化的酶源，測定了MAOB酶活性(MAOB)的抑制。酶作用物為[14C]-苯乙胺。在1μM的Ro166491存在的條件下，對非特異性酶活性進行了測定。簡要地，酶和亞型選擇性阻滯劑氯吉靈(300nM)在37℃、100mMKPO4(pH7．2)下預保溫60分鐘。然后加入酶作用物，再保溫7分鐘。通過加入0．5ml的2M檸檬酸中止反應。然后像檢測MAOA酶一樣檢測放射活性(Otsuka，S．和Kobayashi，Y．，1964，生物化學藥理學(Biochem．Pharmacol．)13995-1006)。為了測定該物質對多巴胺受體(dp)所需的抑制活性，進行了下列檢測。應用[3H]-螺環哌啶苯作為配體(最終濃度為0．3nM)，從牛紋狀體膜制備部分純化的受體。為了測定非特異性結合，用1μM的螺環哌啶苯進行測定。反應在含有120mMNaCl、5mMKCl、2mMCaCl2和1mMMgCl2的50mMTris-鹽酸(pH7．7)、37℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應(Leysen等，1978，生物化學藥理學(Biochem．Pharmacol．)27307-316)。應用從牛紋狀體膜制備部分純化的受體，測定了該物質對配體和腺苷受體(ADNS)結合的抑制性質。放射性配體使用最終配體濃度為4nM的[3H]-5’-N-乙基羧基氨基腺苷。在10μMNECA存在的條件下，對非特異性酶活性進行了測定。反應在50mMTris-鹽酸(pH7．7)、25℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應(Bruns，R．等，1986，藥理學(Pharmacology)29331-346)。為了測定該物質對阿片受體(阿片)的抑制活性，從大鼠前腦制備部分純化的受體。使用的配體為1nM的[3H]-納洛酮。反應在50mMTris-鹽酸(pH7．4)、25℃下進行90分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應(Pert，C．和Snyde，S．H．，1974，分子藥理學(Mol．Pharmacology)19868-879)。為了測定促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)受體的抑制，使用從大鼠皮層膜制備的部分純化的受體。使用的放射性配體為最終配體濃度0．1nM的[125I]-Tyr-CRF。在1μMTyr-CRF存在的條件下，對非特異性結合進行了測定。反應在含有10mMMgCl2、2mMEGTA、0．12TIU／ml抑肽酶和0．3％BSA的50mMHEPES中、25℃下進行120分鐘。通過在4℃下離心15分鐘，中止反應。重復洗滌后，溶解得到的小球，應用γ計數器測定放射性活性(DeSouza，E．B．，1987，神經科學(Neuroscience)788-100)。為了測定腎上腺素α2受體(腎上腺素α2)的傳遞作用，從大鼠整個大腦制備了部分純化的受體。使用的放射性配體為最終配體濃度1nM的[6，7-3H]-醋酸曲安縮松。在10μM醋酸曲安縮松存在的條件下，對非特異性結合進行了測定。檢測反應在含有10mM鉬酸鈉和10mMα-單硫甘油的50mMK2HPO4(pH7．4)中、0℃下進行16小時。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應。通過液體閃爍計數測定結合放射性活性(DaHan等，1994，Neurochem．Int．24339-348)。應用從人血小板制備的部分純化的受體，測定了該物質對血栓烷A2(血栓烷A2)受體的抑制活性。使用最終濃度為2nM的放射性配體[3H]-SQ29，548。加入10μM蒎烷-血栓烷，測定非特異性結合。檢測反應在含有138mMNaCl、5mMKCl、5mMMgCl2、5．5mM右旋糖和2mMEDTA的25mMTris-鹽酸(pH7．4)、25℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應。通過液體閃爍計數測定結合放射性活性(Hedberg，A．等，1988，J．Pharmacol．Exp．Ther．245786-792)。應用從豚鼠脾膜制備的部分純化的受體，測定了該物質對白細胞三烯B4受體的抑制特性。放射性配體使用最終濃度為0．5nM的[3H]-白細胞三烯B4。加入500nM白細胞三烯B4，測定非特異性結合。檢測反應在含有NaCl、MgCl2、EDTA和桿菌素的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)中、0℃下進行2小時。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應。通過液體閃爍計數測定結合放射性活性(Cardiner，P．J．等，1990，歐洲藥理學雜志(Eur．J．Pharmac．)182291-299)。通過從豬胰腺部分純化的酶磷脂酶A2的抑制分析，進一步研究了該物質的抗炎活性。簡要地，酶和該物質在含有[14C]-3-卵磷脂的100mM氨基乙酸-NaOH緩沖液(pH9)中預保溫10分鐘。通過加入2．5mMCa++開始反應，保溫5分鐘。通過加入200mMEDTA中止反應。用酸性己烷提取產物，通過閃爍計數測定存在的放射性活性量(Katsumata，M．等，Anal．Biochem．154676-681，1986)。為了測定該物質如何影響白細胞介素(IL-8)與其受體的結合，從人中性白細胞制備了受體的部分純化制品。反應在改性的Tris-鹽酸(pH7．5)緩沖液中進行。簡要地，30μg粗品受體制品和15pM[125I]IL-8在0℃下保溫120分鐘。通過含有250nMIL-8的反應，測定非特異性活性。通過玻璃過濾器過濾膜，洗滌三次，測定捕獲的放射性活性量(Grob，P．M．等，生物化學雜志(J．Biol．Chem．)2658311-8316，1990)。另一種研究該物質潛在抗炎特性的檢測涉及酶5-脂肪氧合酶(5-脂肪氧合酶)的研究。從大鼠嗜堿性白血病細胞(RB-1)制備粗品酶。該物質和粗品酶制品在25℃下保溫5分鐘。然后通過加入[14C]-花生四烯酸開始反應。8分鐘后，通過加入檸檬酸中止反應。通過放射免疫檢測法(RIA)測定放射標記的5-HETE量(Shimuzu，T．等，Proc．Natl．Acad．Sci．美國，81689-693，1984)。通過應用粗品酶制品的相同組織源，對相關酶，白細胞三烯C4(LTC4)合成酶進行了檢測。LTC4的甲酯和粗品酶制品在白蛋白和絲氨酸硼酸鹽存在的條件下，在15℃下保溫15分鐘。通過加入冰甲醇中止反應。LTC4的形成作為應用RIA示值方法酶活性的指標(Bach等，生物化學藥理學(Biochem．Pharmacol．)342695-2704，1985)。發現該物質在兩種通道中的抑制活性。第一，檢測了Ca2+激活，電壓不敏感鉀通道受體(K通道)。粗品受體制品從大鼠前腦制備，使用的[125I]-蜂毒明肽最終濃度為0．05nM。在100nM蜂毒明肽存在的條件下測定非特異性結合。檢測反應在含有0．1％BSA和5mMKCl的50mMTris-鹽酸(pH7．4)、0-4℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應。通過γ計數測定結合放射性活性(Seager，M．等，神經科學(Neuroscience)7565-570，1987)。發現的第二通道活性為鈉通道，位點2(鈉通道)。粗品受體制品從大鼠前腦制備，使用的放射性配體[3H]-蟾毒素最終濃度為2nM。在100nM烏頭堿存在的條件下測定非特異性結合。反應在含有130mM膽堿氯化物的50mMHEPES(pH7．4)中、37℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應，通過閃爍計數測定特異性活性(Creveling，C．R．分子藥理學(Mol．Pharmacology)23350-358，1983)。表明該物質活性的其它生物檢測有血管緊張素Ⅱ，2型，中心(AT2)。從牛小腦膜制備部分純化的受體。作為放射性配體的[125I]-tyr4-血管緊張素Ⅱ的最終濃度為0．1nM。在50nM人血管緊張素Ⅱ存在的條件下，對非特異性結合進行了測定。檢測反應在含有NaCl、EDTA和BSA的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)中進行，在37℃下反應60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應混合物，中止反應，通過γ計數測定特異性活性(Bennett，J．P．和Synder，S．H．生物化學雜志(J．Bio．Chem．)2517423-7430，1976)。另一組對該物質表現出活性的受體為組胺H1(H1)和組胺H2(H2)。H1受體的粗品受體制品從牛小腦膜制備。使用的放射性配體[3H]-新安替根最終濃度為2nM。在10μM吡咯烷甲苯基丙烯存在的條件下測定非特異性結合。反應在50mMNa-KPO4(pH7．5)中、25℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應，通過液體閃爍計數測定特異性活性(Chang等，神經化學雜志(J．Neurochemistry)321653-1663，1979)。H2受體的粗品受體制品從豚鼠紋狀體膜制備。使用的放射性配體[3H]-tiotdine最終濃度為4nM。在10nM西米替丁存在的條件下測定非特異性結合。檢測反應在與H1受體相同的緩沖液中進行。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應，通過液體閃爍計數測定特異性活性(Gajtkowski等，自然30465-67，1983)。為了測定該物質對抗β-腎上腺素非選擇性受體檢測(腎上腺素β，NS)的活性，從大鼠皮層膜制備粗品受體制品。使用的放射性配體為最終濃度為2nM的[3H]-DHA。反應在10μM烯丙心安存在的條件下進行測定非特異性結合。檢測反應在50mMTris-鹽酸(pH7．4)中、37℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應，通過液體閃爍計數測定特異性活性(Riva，M．和Creese，I．分子藥理學(Mol．Pharmacol．)36211-218，1989)。最后一個表明一些物質抑制的受體檢測為5-羥色胺受體。粗品受體制品從大鼠皮層膜制備。使用的放射性配體[3H]-麥角酰二乙胺最終濃度為5nM。檢測反應在含有4mMCaCl2、0．1mM巴吉林和0．1％抗壞血酸的50mMTris-鹽酸(pH7．4)中、37℃下進行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應，通過液體閃爍計數測定特異性活性(Peroutka，S．J．和Snyder，S．H．分子藥理學(Mol．Pharmacology)16687-699，1979)。表14生物檢測概述表報道了指示的提取物和參照化合物在血栓烷A2受體檢測(TXA2)、白細胞三烯B4受體檢測(LTB4)、磷脂酶A2受體檢測(PLA2)、白細胞介素-8受體檢測(IL8R)、和谷氨酸受體AMPA位點檢測(AMPA)中的百分比抑制。括號中為獲得報道百分比抑制的測試濃度。表15生物檢測概述表報道了指示的提取物和參照化合物在指示的生物檢測中的百分比抑制。括號中為獲得報道百分比抑制的測試濃度。<tablesid="table16"num="016"><table>提取物谷氨酸NMDA，甘氨酸(10-4M)5-脂肪氧合酶白細胞三烯C4合成酶非選擇性腺苷受體(1μm)Ca2+作用，Voltinsens．KChnl(10-4M)PG1014739(10μm)-44PG10258-20(1mM)26參照化合物人參皂甙RcG-09022024(1mM)5398人參皂甙ReG-1027-20(1mM)-86人參皂甙Rb1G-077723--人參皂甙Rf---人參皂甙RdG-01022563(1mM)-人參皂甙Rb2G-010428-39(100μm)-人參皂甙Rg130---</table></tables>表16生物檢測概述表報道了指示的提取物和參照化合物在單胺氧化酶A(MAOA)和其它指示的生物檢測中的百分比抑制。括號中為獲得報道百分比抑制的測試濃度。<tablesid="table17"num="017"><table>提取物鈉位點2(10-4M)多巴胺攝取(10-4M)血管緊張素Ⅱ，2型，中心(10-4M)促腎上腺皮質激素釋放因子(10-4M)MAOA(10-4M)PG101-23--PG102--2027參照化合物人參皂甙RcG-09022427252121人參皂甙ReG-1027----28人參皂甙Rb1G-0777-29-23-人參皂甙Rf---34-人參皂甙RdG-0102224148-32人參皂甙Rb2G-010423232832-人參皂甙Rg125--2520(10-5M)</table></tables>表17生物檢測概述表報道了指示的提取物和參照化合物在單胺氧化酶B(MAOB)和其它指示的生物檢測中的百分比抑制。括號中為獲得報道百分比抑制的測試濃度表18生物檢測概述表報道了指示的提取物和參照化合物在指示的生物檢測中的百分比抑制。括號中為獲得報道百分比抑制的測試濃度。<tablesid="table19"num="019"><table>提取物非選擇性阿片受體(10-4M)非選擇性腎上腺素能β(10-4M)CCKB(10-4M)谷氨酸NMDA拮抗劑位點(10-4M)5-羥色胺攝取(10-4M)PG101---7323PG102-146(10-6M)-88參照化合物人參皂甙RcG-0902-----人參皂甙ReG-1027-----人參皂甙Rb1G-0777-----人參皂甙Rf-----人參皂甙RdG-0102544622--人參皂甙Rb2G-0104-----人參皂甙Rg1-----</table></tables>6．4．化學檢測通過HPLC或TLC對人參進行化學檢測。色譜峰可以通過質譜進一步分析。人參含有大量的成分，包括但不僅限于甾醇(β-谷甾醇和β-葡糖苷)、7-9％的人參多糖、人參辛苷A-U、果膠、游離糖、biomins、polyacetylines和多肽。Sappinins被日本研究人員稱為人參皂甙，被俄羅斯研究人員稱為panaxosides。在亞洲人參中至少發現18種sappines。它們都是三萜系化合物。已報道有6種panaxosides。還報道人參油中含有倍半萜烯，有至少56種被稱為gynsaponins的皂角苷(Leung和Foster，1996)。一個人參皂甙化學分析的實施例提供如下。6種人參提取物膠囊樣品標記如下標記A，提取物軟膠囊批號611251；標記B，提取物軟膠囊批號GG10527；根粉末膠囊批號HC10999；標記D，提取物(4％)軟膠囊批號50959AA；標記E，提取物(4∶1)軟膠囊批號7B04201；和標記F，提取物軟膠囊批號5N03338。膠囊中人參皂甙的HPLC檢測按如下進行。測定膠囊的平均重量。內容物溶解于提取物溶劑中，按照HauserPart號4129．000(Boulder，CO)進行HPLC分析，只是在凝膠膠囊樣品制備中省略固相提取物凈化步驟。根據對于6個人參皂甙標準物(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd，從Indofine化學公司(Sommerville，NJ)獲得)中每一個的柱反應進行定量。結果如圖4所示。圖4中報道的濃度根據每個樣品的平均囊片內容物重量，代表兩個獨立測定的平均值。和上面提到的包括固相提取物凈化步驟獲得的結果(未顯示)相比，結果沒有相差10％。繪制圖4的數據在表19中列出。表19指示的人參皂甙和總人參皂甙的濃度。本文中描述和要求的本發明不只限于本文公開的具體實施方案的范圍，因為這些實施方案只是想作為本發明幾個方面的舉例說明。任何等同的實施方案應在本發明的范圍內。實際上，除了本文展示和描述的修改之外，本領域技術人員還可以從上文描述明顯地得出許多修改。這些修改也應落在后面的權利要求范圍內。在本申請中，在括號中引用了許多出版物和專利。它們的內容在這里引用作為本申請的參考。權利要求1．一種用于制備藥用級人參的方法，該方法包括以下步驟將含有多種成分的人參材料的有代表性部分分成多個標記組分，其中至少一種標記組分中含有至少一種活性成分；測定每個標記組分的生物活性程度，以提供有代表性部分的生物活性指紋；和將有代表性部分的生物活性指紋和已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。2．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中一個或更多的標記組分含有至少一種活性成分。3．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中該方法還包括以下步驟測定至少一種標記組分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；和將有代表性部分的定量組成指紋和已建立的給定藥用級人參的定量組成指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。4．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中該方法還包括其它步驟測定人參材料中有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和生物活性指紋標準中的總體生物活性相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。5．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為超臨界二氧化碳提取物，醇提取物，水提取物，有機提取物，油狀或粉末狀植物藥材。6．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為均一的材料。7．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為植物藥材的混合物。8．按照權利要求7的用于制備藥用級人參的方法，其中植物藥材混合物含有重量比至少10％的人參根。9．按照權利要求1、2、3或4的用于制備藥用級人參的方法，其中至少一種活性成分選自人參皂甙，碳水化合物，脂肪酸，脂肪酸酯，酚和萜類化合物。10．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中生物活性指紋是用于治療或改善下列病癥或疾病壓力疾病，炎癥，心血管疾病，胃腸道疾病，代謝疾病和腎上腺疾病的指標。11．一種用于制備藥用級人參的方法，該方法包括以下步驟提供一種含有多種成分的人參材料，其中這些成分具有給定的生物活性，并且每一個成分具有標準化的生物活性譜；將人參材料中有代表性的部分分成許多標記組分，其中至少一種標記組分中含有至少一種活性成分；測定在每一個標記組分中存在的每一個活性成分的量；根據存在的每一個活性成分的量和標準化的成分生物活性譜，計算每一個標記組分的生物活性，以提供有代表性部分的計算生物活性指紋；和將有代表性部分的計算生物活性指紋和已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。12．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中該方法還包括其它步驟測定人參材料中有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和標準的總體生物活性相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。13．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為提取物。14．按照權利要求13的用于制備藥用級人參的方法，其中提取物為水或有機提取物。15．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為粉末狀植物藥材。16．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為均一的材料。17．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中人參材料為植物藥材的混合物。18．按照權利要求17的用于制備藥用級人參的方法，其中植物藥材混合物含有重量比至少10％的人參根。19．按照權利要求11或12的用于制備藥用級人參的方法，其中活性成分選自人參皂甙，碳水化合物，脂肪酸，脂肪酸酯，酚和萜類化合物。20．按照權利要求11的用于制備藥用級人參的方法，其中生物活性指紋是用于治療或改善下列病癥或疾病壓力疾病，炎癥，心血管疾病，胃腸道疾病，代謝疾病和腎上腺疾病的指標。21．一種用于制備藥用級人參的方法，該方法包括以下步驟提供一種含有一種給定生物活性的人參材料，其中所述的人參材料含有多種成分；將人參材料中有代表性的部分分成多個標記組分，其中至少一種標記組分中含有至少一種活性成分；測定每一個標記組分的給定生物活性的程度，以提供有代表性部分的生物活性指紋；將有代表性部分的生物活性指紋和已建立的藥用級人參的生物活性指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。22．按照權利要求21的用于制備藥用級人參的方法，其中活性成分選自人參皂甙，碳水化合物，脂肪酸，脂肪酸酯，酚和萜類化合物。23．一種用于制備藥用級人參的方法，其中包括應用選自血小板激活因子受體檢測，GABAA受體檢測，谷氨酸受體檢測，和磷脂酶A2檢測的生物檢測測定有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和標準的相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。24．按照權利要求1、11、21或23的用于制備藥用級人參的方法，其中一個或更多的標記組分含有一組相關成分。25．一種用于制備藥用級人參的方法，該方法包括以下步驟測定人參材料的多個標記組分中至少一種標記組分的活性成分的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；和將有代表性部分的定量組成指紋和和已建立的藥用級人參的定量組成指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。26．一種用于制備藥用級人參的方法，其中該方法包括以下步驟測定人參材料有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和總體生物活性指紋標準相比較，以確定該人參材料是否為藥用級人參。27．按照權利要求9的用于制備藥用級人參的方法，其中人參皂甙選自人參皂甙Rc、人參皂甙Re、人參皂甙Rb1、人參皂甙Rf、人參皂甙Rd、人參皂甙Rb2、和人參皂甙Rg1。28．按照權利要求19的用于制備藥用級人參的方法，其中人參皂甙選自人參皂甙Rc、人參皂甙Re、人參皂甙Rb1、人參皂甙Rf、人參皂甙Rd、人參皂甙Rb2、和人參皂甙Rg1。29．按照權利要求22的用于制備藥用級人參的方法，其中人參皂甙選自人參皂甙Rc、人參皂甙Re、人參皂甙Rb1、人參皂甙Rf、人參皂甙Rd、人參皂甙Rb2、和人參皂甙Rg1。30．一種按照權利要求1、11、21、23、25或26的方法制備的藥用級人參。31．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中一種或多種標記組分含有至少兩種活性成分。32．按照權利要求1的用于制備藥用級人參的方法，其中至少一種標記組分含有至少一種選自下組的成分人參皂甙Rb1，人參皂甙Rg1、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸。33．按照權利要求1、11或21的用于制備藥用級人參的方法，其中至少一種活性成分選自人參皂甙Rb1，人參皂甙Rg1、和γ-氨基丁酸。全文摘要本發明一般性涉及人參材料和用于制備該材料(醫學有用,并且具有藥學可接受的劑型)的方法。更具體地,本發明涉及組合物和在將人參材料制備成藥物的加工過程中的活性指紋的應用,其中限定為藥用級組合物,其中適合于臨床或獸醫應用,以治療和/或改善疾病、病癥或癥狀。文檔編號A61K31/704GK1283118SQ98812472公開日2001年2月7日申請日期1998年10月23日優先權日1997年10月23日發明者塔斯尼姆·A·赫瓦賈,埃利奧特·P·弗西德曼申請人:法瑪普林特公司,南加州大學