專利名稱：含有降低的4′－o－甲基吡哆素和二黃酮含量的銀杏葉提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有降低的4’-O-甲基吡哆素和二黃酮含量的銀杏葉提取物、其制備方法和包含所述提取物的藥物，即使在較高劑量下也不表現(xiàn)出由4’-O-甲基吡哆素和二黃酮引起的不良副作用。
銀杏葉提取物在治療上已經(jīng)使用了30年。位于柏林的聯(lián)邦衛(wèi)生局E委員會(huì)(Bundesgesundheitsamt)已經(jīng)確認(rèn)，包含一定提取物的藥物在由腦機(jī)能不全、外周閉塞性疾病、眩暈和耳鳴導(dǎo)致的行為障礙的對(duì)癥治療中是有效的(BAnz No．133，7月19日，1994)。這些提取物的特征在于其成分為22至27％黃酮甙、5至7％萜烯內(nèi)酯、2．8至3．4％銀杏苦內(nèi)酯A、B和C、2．6至3．2％bilobalide、和最多5ppm的銀杏酚酸(烷基酚化合物)。該銀杏葉提取物及其制備方法是已知的，見DE3940091(EP-B-0431535)和DE3940092(EP-B-0431536)。
Wada等《化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》33(1985)，3555-3557發(fā)現(xiàn)銀杏種子中含有4’-甲氧基吡哆素(4’-O-甲基吡哆素)。在消耗大量銀杏種子后，這種化合物可能導(dǎo)致中毒癥狀，如驚厥和意識(shí)喪失(“銀杏食物中毒”和“銀杏食品中毒”)。因此，發(fā)現(xiàn)這種化合物的人員將其命名為“銀杏毒”。在以后的工作中，同一研究小組發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中不存在4’-O-甲基吡哆素(Wada等，《生物學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》16(1993)，210-212)。與此相反，最近有人報(bào)道從銀杏葉中分離和鑒別到了4’-O-甲基吡哆素(Arenz等，Planta Medica，62(1996)，548-551)。在這項(xiàng)工作中，對(duì)含有銀杏葉提取物的商品制劑中的抗維生素B6(4’-O-甲基吡哆素)成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了濃度介于4和10μg／ml液體藥物之間。該濃度相當(dāng)于在被加工成制劑的干提取物中100至250ppm的濃度。
治療用銀杏提取物另外包含高達(dá)1000ppm的二黃酮。我們自己所進(jìn)行的研究令人驚奇地揭示，除了文獻(xiàn)已知的生物活性以外，這些化合物還顯示出免疫毒理學(xué)作用。在小鼠腘淋巴結(jié)測(cè)定中，我們觀察到銀杏葉的醇-水總提取物的乙酸乙酯可溶性組分引起淋巴結(jié)反應(yīng)；見實(shí)施例1。對(duì)色譜分離所得的亞組分進(jìn)行試驗(yàn)，揭示了免疫毒理學(xué)作用僅發(fā)生在給藥含有超過70％二黃酮的亞組分之后。銀杏中發(fā)現(xiàn)的二黃酮是下列化合物sciadopitysin、銀杏黃素、異銀杏黃素、紅杉黃酮和bilobetin。
本發(fā)明所要解決的基本技術(shù)問題是提供基本上不含4’-O-甲基吡哆素和烷基酚化合物(銀杏酚酸、銀杏酚)的銀杏葉提取物，具有技術(shù)上可行的最小二黃酮含量，并含有公認(rèn)為活性決定性成分的黃酮醇甙和萜烯內(nèi)酯，濃度符合E委員會(huì)的要求(BAnz No．133，1994年7月19日)。根據(jù)本發(fā)明的提取物含有-20至30重量％黃酮醇甙-總計(jì)2．5至4．5重量％銀杏苦內(nèi)酯A、B、C和J-2．0至4．0重量％bilobalide-低于10ppm、優(yōu)選低于1ppm的烷基酚化合物(銀杏酚酸、銀杏酚)-低于10重量％的花色素原-低于50ppm的4’-O-甲基吡哆素-低于100ppm的二黃酮本發(fā)明進(jìn)一步涉及這樣一種銀杏葉提取物的制備方法。
所解決的技術(shù)問題在于，在銀杏提取物的已知制備方法中，引入了兩個(gè)另外的加工步驟1、用陽離子交換劑處理，以除去4’-O-甲基吡哆素2、在活性碳上吸附二黃酮這些措施是在按照DE 3940091權(quán)利要求3中的方法中，優(yōu)選在步驟g)之前或之后進(jìn)行。因此，將步驟f)所得溶液過濾后，使所述溶液通過陽離子交換柱，柱子用含水乙醇或含水甲醇洗脫。所得洗脫液用活性碳處理。至于陽離子交換劑的洗脫，可以使用含有20至80重量％、優(yōu)選為50重量％乙醇或甲醇的水溶液。根據(jù)本發(fā)明的這兩個(gè)步驟的順序是可互換的，所得結(jié)果不變。然后繼續(xù)進(jìn)行按照權(quán)利要求3下面的步驟，溶液用一種脂族溶劑或脂環(huán)族溶劑萃取，以除去烷基酚化合物。
該方法的步驟c)起到除去親脂性組分的作用，它們是難溶于水的，包括大多數(shù)的二黃酮。
因此，根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求1的提取物的優(yōu)選制備方法是以下列數(shù)量和順序的步驟為特征的a)將銀杏葉用含水丙酮、具有1至3個(gè)碳原子的含水鏈烷醇或無水甲醇萃取，b)將溶劑濃縮至含量不超過10重量％，以分離有機(jī)溶劑，其中在最后的蒸餾步驟中可以加入水，c)將殘余水溶液用水稀釋至固體含量為5至25重量％，冷卻至25℃以下，放置直至有沉淀生成，d)將殘余水溶液用硫酸銨處理，然后用甲乙酮或甲乙酮與丙酮的混合物萃取至少一次，e)將所得萃取液濃縮，用乙醇-水混合物稀釋至溶液各含有50％重量％的水和乙醇，并含有10重量％固體，f)將溶液用一種鉛化合物或不溶性聚酰胺處理，g)將溶液過濾，使其通過強(qiáng)酸型陽離子交換劑，該陽離子交換劑用含水乙醇或含水甲醇洗脫，h)將洗脫液用活性碳處理，i)將過濾后的溶液用一種沸點(diǎn)為60至100℃的脂族溶劑或脂環(huán)族溶劑萃取，j)將殘余的水-醇溶液濃縮，隨后用硫酸銨處理，用甲乙酮和乙醇萃取，k)將所得有機(jī)相濃縮至固體含量為50至70重量％，和l)將濃縮物在真空下干燥，得到含水量低于5％的干燥提取物。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，步驟g)和h)互換。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該方法的步驟g)和h)僅在步驟i)之后進(jìn)行。
在利用吸附樹脂富集黃酮醇甙和萜烯內(nèi)酯的已知方法(EP-B-0360556，JP-A-04182434)中，根據(jù)本發(fā)明的這兩個(gè)步驟分別用解吸步驟所得提取物的甲醇-水溶液(參考EP-B-0360556，實(shí)施例Ⅲ，權(quán)利要求12)和根據(jù)JP-A-04182434的乙醇-水溶液進(jìn)行。
可用的陽離子交換劑的實(shí)例為酸性陽離子交換劑。最優(yōu)選的陽離子交換劑是強(qiáng)酸型陽離子交換劑，如Merck Ⅰ。
根據(jù)本發(fā)明所制備的提取物在藥理試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶C明具有促進(jìn)循環(huán)、防止局部缺血損傷、自由基清除劑和抑制血小板聚集的性質(zhì)，與迄今已知的銀杏提取物相反，即使在較高劑量下也不會(huì)產(chǎn)生可由4’-O-甲基吡哆素和二黃酮誘導(dǎo)產(chǎn)生的不良作用。
而且，本發(fā)明涉及以含有根據(jù)本發(fā)明的銀杏葉提取物為特征的藥物。
至于藥物的制備，可以按照常規(guī)方法將根據(jù)本發(fā)明的提取物例如加工成溶液、包衣片、片劑或注射制劑。該藥物可用于外周及腦動(dòng)脈循環(huán)疾患的治療。
實(shí)施例1腘淋巴結(jié)試驗(yàn)使用18至24g雄性C57BL／6小鼠(Charles River，Sulzfeld)。將動(dòng)物保持在標(biāo)準(zhǔn)化的環(huán)境條件下，可以自由進(jìn)食和飲水。為了誘發(fā)腘淋巴結(jié)反應(yīng)(PLR)，向左后爪內(nèi)跖下注射供試物的10μl DMSO溶液。對(duì)照組動(dòng)物僅注射一次10μl DMSO。單一提取物每次給藥2mg。不同的次級(jí)提取物的劑量對(duì)應(yīng)于其在初級(jí)提取物中的相應(yīng)比例。七天后，在乙醚麻醉下將試驗(yàn)動(dòng)物用頸脫位法處死。取下雙側(cè)腘淋巴結(jié)，除去粘連的組織后，收集在陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)的溫潤濾紙上。然后立即在靈敏度為0．1mg的電子天平測(cè)定淋巴結(jié)的重量。PLR強(qiáng)度表示為同側(cè)與對(duì)側(cè)腘淋巴結(jié)的重量差異。物質(zhì) 劑量 淋巴結(jié)重量(mg)乙酸乙酯組分 2．00mg4．2mg二黃酮組分 0．35mg3．4mg實(shí)施例2
向根據(jù)DE3940091實(shí)施例1(第4欄1．67)的鉛-單寧-沉淀的250ml上清液中加入2．5g活性碳，該上清液在含50％重量乙醇的溶液中含有10％干燥殘余物。所得混合物在室溫下攪拌30分鐘。過濾除去活性碳，使濾液通過裝有20ml強(qiáng)酸型陽離子交換劑(Merck Ⅰ)的柱子。洗脫溶液進(jìn)一步按照DE3940091實(shí)施例1所述方法進(jìn)行處理。
將終產(chǎn)物的甲乙酮／乙醇溶液干燥，得到22．25g干燥提取物，其中含有23．9％銀杏黃酮甙、3．3％銀杏苦內(nèi)酯、2．9％bilobalide、7．1％花色素原、低于1ppm的烷基酚化合物、低于50ppm*)的4’-O-甲基吡哆素和60ppm二黃酮**)。
*)分析方法根據(jù)Arenz等，Planta Medica，Vol．62(1996)，548-551**)分析方法根據(jù)Gobbata等，F(xiàn)itoterapia，Vol．67(1996)，152-158實(shí)施例3根據(jù)EP-B-0360556實(shí)施例Ⅲ，第5頁第41行，通過從吸附樹脂Duolite S-761上將黃酮和萜烯內(nèi)酯進(jìn)行解吸，得到250ml 90％甲醇-水溶液，其中含有10％干燥殘余物的90重量％甲醇溶液，使其通過裝有15ml強(qiáng)酸型陽離子交換劑的柱子過濾。加入3．75g活性碳，在真空下從該溶液中除去一部分甲醇，加入水，使溶液的甲醇濃度為50重量％，在室溫下攪拌30分鐘。通過濾床吸濾法過濾除去活性碳，用20ml50％甲醇清洗。將溶液在真空下濃縮至于，得到23．2g銀杏提取物，其中含有22．8％銀杏黃酮甙、3．1％銀杏苦內(nèi)酯、2．8％bilobalide、9．6％花色素原、低于1ppm的烷基酚化合物、低于50ppm的4’-O-甲基吡哆素和28ppm二黃酮。
實(shí)施例4
銀杏提取物片劑的配制
***)DAB 10=Deutsches Arzneibuch 10=德國藥典10按照通常的操作，在混合機(jī)或渦旋噴淋裝置中將各成分混合，用水造粒，然后在旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)上壓片。
權(quán)利要求
1.銀杏葉提取物，含有-20至30重量％黃酮醇甙-總計(jì)2．5至4．5重量％銀杏苦內(nèi)酯A、B、C和J-2．0至4．0重量％bilobalide-低于10ppm、優(yōu)選低于1ppm的烷基酚化合物-低于10重量％的花色素原-低于50ppm的4’-O-甲基吡哆素-低于100ppm的二黃酮
2.根據(jù)權(quán)利要求1的提取物的制備方法，是以下列數(shù)量和順序的步驟為特征的a)將銀杏葉用含水丙酮、具有1至3個(gè)碳原子的含水鏈烷醇或無水甲醇萃取，b)將溶劑濃縮至含量不超過10重量％，以分離有機(jī)溶劑，其中在最后的蒸餾步驟中可以加入水，c)將殘余水溶液用水稀釋至固體含量為5至25重量％，冷卻至25℃以下，放置直至有沉淀生成，d)將殘余水溶液用硫酸銨處理，然后用甲乙酮或甲乙酮與丙酮的混合物萃取至少一次，e)將所得萃取液濃縮，用乙醇-水混合物稀釋至溶液各含有50％重量％的水和乙醇，并含有10重量％固體，f)將溶液用一種鉛化合物或不溶性聚酰胺處理，g)將溶液過濾，使其通過強(qiáng)酸型陽離子交換劑，該陽離子交換劑用含水乙醇或含水甲醇洗脫，h)將洗脫液用活性碳處理，i)將過濾后的溶液用一種沸點(diǎn)為60至100℃的脂族溶劑或脂環(huán)族溶劑萃取，j)將殘余的水-醇溶液濃縮，隨后用硫酸銨處理，用甲乙酮和乙醇萃取，k)將所得有機(jī)相濃縮至固體含量為50至70重量％，和l)將濃縮物在真空下干燥，得到含水量低于5％的干燥提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟g)和h)是可互換的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中步驟g)和h)僅在步驟i)之后進(jìn)行。
5.藥物，是以含有根據(jù)權(quán)利要求1的銀杏提取物為特征的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的提取物在藥物制劑制備中的用途，該藥物制劑用于由腦機(jī)能不全、外周閉塞性疾病、眩暈和耳鳴導(dǎo)致的行為障礙的治療。
7.由腦機(jī)能不全、外周閉塞性疾病、眩暈和耳鳴導(dǎo)致的行為障礙的治療方法，其中該方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的提取物或根據(jù)權(quán)利要求5的藥物給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有降低的4’－O－甲基吡哆素和二黃酮含量的銀杏葉提取物、其制備方法和包含所述提取物的藥物。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1282252SQ98812437
公開日2001年1月31日 申請(qǐng)日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者K－P·施瓦布 申請(qǐng)人:威廉施瓦布博士有限公司