專利名稱：：利用超低劑量雌激素治療絕經后婦女的方法
背景技術：
：內源性雌激素在自然或手術絕經后急劇減少，這種衰減導致骨損失和繼發性骨折明顯增加。顯然，內源性雌激素對于維持年輕婦女骨骼健康起重要作用。然而，內源性雌激素在老年婦女中的重要性較小。迄今為止已發現，65歲左右的婦女中的內源性雌激素水平與繼發性髖部或椎骨骨折無關。S．R．Cummings等人《骨骼礦物質研究雜志》(J．BoneMin．Res．)10(增刊I)S174(1995)。但是，雌二醇是一種比雌酮更有效的雌激素，對其與骨折的關系的研究尚無結果。絕經前婦女中的血清雌二醇水平平均高于100pg／ml。未經激素復原療法治療的絕經后婦女中的血清雌二醇水平降低至20pg／ml，并且多達30-50％的絕經后婦女的血清雌二醇水平降低至用常規的靈敏檢測方法都無法檢測到的水平(即低于5pg／ml)。對絕經后婦女的常規治療包括用有效劑量的雌激素復原療法將血清雌二醇濃度維持在40-60pg／ml之上。業已證明，常規的激素復原療法可以有效治療因絕經后雌激素減少所致的機體癥狀，包括降低骨密度損失，或甚至可以提高骨密度；減少骨折的危險。然而，現有研究表明，雌激素復原療法可用于患乳腺癌和子宮內膜癌，以及血栓和子宮出血的危險性的增加的防治。所以，該領域仍然需要用于治療絕經后雌激素減少或缺乏所致機體癥狀的方法。該
技術領域：
還需要在治療上述機體癥狀的同時減小雌激素復原療法的副作用。第二方面，本發明提供一種用于減小患有或易患有絕經后骨質疏松癥的個體中的骨質疏松性骨折危險的方法。該方法包括給所述個體施用一定量的雌激素以有效地使血清雌二醇水平達到約5pg／ml-約15pg／ml。第三方面，本發明提供一種適合患有或易患有因絕經后雌激素減少所致機體癥狀的用戶使用的試劑盒。該試劑盒包括a)能夠每天透皮給藥少于約20μg雌激素的透皮貼劑；和b)用來描述使用該透皮貼劑來減小用戶骨折危險性的方法的說明書。第四方面，本發明提供另一種用于治療絕經后個體中因雌激素減少所致的機體癥狀的方法。該方法包括在無外源性孕激素的條件下每天給藥少于約20μg雌激素。第五方面，本發明提供另一種用于減小患有或易患有絕經后骨質疏松癥的個體中的骨質疏松性骨質危險的方法。該方法包括在無外源性孕激素的條件下每天給藥少于約20μg雌激素。本發明的這些方面以及其它方面將進一步在附圖、優選實施方案和本發明的實施例中說明。圖2是本發明所述方法采用的第二類透皮貼劑的橫截面圖。“絕經后雌激素減少所致的機體癥狀”是指，在絕經后婦女中常見且至少部分是由體內雌激素減少導致的機體癥狀。這些癥狀包括但不限于骨質疏松癥、頭痛、惡心、抑郁、熱潮紅、骨骼礦物質密度降低，以及骨折(包括椎骨和／或髖部骨折)的危險或發病率的增加。“絕經后個體”是指處于絕經后生命期內的婦女。患有絕經后癥狀的個體包括，在絕經后表現出上述任何機體癥狀的婦女，和特別是有骨礦物質密度在椎骨、髖部或其它部位降低表現的絕經后婦女，或曾經椎骨或髖部骨折的絕經后婦女。易患有因絕經后雌激素減少所致機體癥狀的個體包括與絕經前婦女相比表現出血清雌二醇水平降低的接近絕經的婦女，以及表現出血清雌二醇水平降低但還未出現因絕經后雌激素減少所致的機體癥狀的絕經后婦女。表現出血清雌二醇水平降低的個體包括血清雌二醇水平處于或低于20pg／ml的個體，包括血清雌二醇水平無法檢測到的個體。鑒于本發明的目的，在提取和柱分離后采用放射免疫測定法來測量性激素水平，包括血清雌二醇水平。檢測下限是5pg雌二醇／ml。“骨質疏松性骨折”是指歸因于骨質疏松癥的骨折，通常為椎骨骨折或髖部骨折。本發明所述的方法可以有效治療絕經后個體，特別是患有或易患有上述類型的絕經后機體癥狀的個體。本發明的方法包括施用可以在所述個體中產生預期血清雌二醇水平的有效量的雌激素。在此所用的短語“治療機體癥狀”是指消除或降低患有上述癥狀的個體中所述機體癥狀的嚴重程度或發病率，并且預防了易患有絕經后雌激素減少所致上述癥狀的個體中絕經后機體癥狀的發生。盡管對這些絕經后機體癥狀的治療包括徹底消除患病個體中的上述癥狀，但對癥狀的徹底消除不一定符合本發明所述術語的定義。所以，本發明涉及用超低劑量雌激素來治療雌激素減少所致機體癥狀并用來降低患有或易患有絕經后骨質疏松癥個體中骨質疏松性骨折的危險性。本發明的方法還可包括一個測定被治療的絕經后個體中的血清雌二醇水平并且判斷被治療個體的血清雌二醇水平是否如相同年齡組絕經后婦女般正常的附加步驟。換言之，本發明的方法不適用于血清雌二醇水平低于相同年齡組絕經后婦女平均的正常水平的婦女。本發明的方法可以有效治療其血清雌二醇水平對于相同年齡組婦女來說是正常的絕經后個體。在此所用的“正常”血清雌二醇水平是較接近相同年齡組婦女的平均血清雌二醇水平的血清雌二醇水平。本發明人意外地發現，骨礦物質密度的損失在患有絕經后骨質疏松個體中不是唯一的導致骨質疏松性骨折的危險性增高的因素。低水平的血清雌二醇，即低于5pg／ml，特別是當伴隨有性激素結合球蛋白(SHBG)水平等于或高于1μg／dl時，實質上增加了髖部和椎骨骨折的危險性。此外，低血清1,25(OH)2維生素D水平也會造成髖部骨折危險性的增高。評估骨質疏松性骨折危險性的方法包括利用SAS學院(位于Cary，NorthCarolina)開發的邏輯模型來分析預示變量和椎骨骨折之間的關系，和利用考慮到病例-人群取樣設計的比例危害模型來分析預示變量和髖部骨折之間的關系。這些分析調整為基線年齡和體重，并且以相對危險性具有95％置信區間來報告結果。歸因于多種激素水平的骨折比例是采用W．S．Browner在《美國流行病學雜志》123∶143(1986)中公開的技術來評估，該文獻在此全文引入作為參考。所謂“降低骨質疏松性骨折的危險性”是指，按照上述技術來測定，利用本發明方法治療的個體和在用本發明方法治療前的同一個體相比，其骨折危險性降低。所以，利用本發明方法治療的個體和患有或易患有骨質疏松骨折的未治療的絕經后個體相比，其骨質疏松性骨折的危險性降低。本發明人還意外地發現，超低劑量的雌激素在不需要孕激素給藥的條件下就可以影響對雌激素減少所致機體癥狀的治療。本發明人現在發現，用雌激素給藥但不用孕激素給藥可以有效地治療具有子宮和卵巢的絕經后婦女。現有的激素復原療法卻依賴于孕激素的聯合給藥才能有效治療，特別是未實施子宮切除術卵巢切除術的婦女。本發明方法所用的外源性雌激素來源可以包括向個體給藥的任何適當形式的雌激素。適當形式的外源性雌激素包括天然或合成的具有雌激素活性的化合物。若干形式的外源性雌激素可以市購。例如，適當形式的外源性雌激素包括但不限于雌二醇，包括α-雌二醇、17β-雌二醇、炔雌醇、雌二醇苯甲酸酯和雌二醇17β-環戊丙酸酯，雌酮，雌三醇，結合馬雌激素和它們的鹽。上述化合物都是具有雌激素活性甾類化合物的例子。具有雌激素活性的非甾類化合物的例子是但不限于己烯雌酚雙磷酸酯、己烯雌酚雙丙酸酯和己烷雌酚。通常，本發明方法所用的優選形式的外源性雌激素是雌二醇。外源性雌激素對所述個體的給藥量應足以使血清雌二醇水平至少為約5pg／ml但不超過約20pg／ml且優選不超過15pg／ml。換言之，按照本發明所述的方法，以足夠的外源性雌激素給藥來達到總血清雌二醇水平至少為約5pg／ml-約20pg／ml。由于未治療個體的血清雌二醇水平對于每個人來說是不同的，所以不同人需要給予不同的雌激素劑量以獲得所需的血清雌二醇水平。相反，被治療個體的血清雌二醇水平不一定被增加到約5pg／ml-約20pg／ml；但各被治療個體的總血清雌二醇水平必須至少為約5pg／ml且不超過約20pg／ml。通常，外源性雌激素的給藥量足以獲得約5pg／ml-約10pg／ml的血清雌二醇水平。與先前理解相反的是，本發明人現發現，血清雌二醇水平處于5pg／ml-15pg／ml內有利于降低椎骨和髖部骨折的危險性。這種低于外源性雌激素常規劑量的給藥還進一步有利于降低與激素復原療法有關的不希望有的副作用的危險性。外源性雌激素可以經任何適當途徑給藥。例如，用于口服和非腸道給藥的外源性雌激素制劑是所屬
技術領域：
已知的，并且可以采用本發明所述方法。適于口服給藥的制劑可以以獨立的單位存在，例如膠囊、扁囊劑、錠劑或片劑，各單位中含義預定量的活性化合物；粉劑或顆粒劑；或存在于水或非水液體中的溶液、分散體或懸浮劑。上述制劑可以通過任何適當的制藥方法來制備，其中包括將活性化合物與適當載體(可以包括一種或多種輔助組分)組合的步驟。通常，本發明制劑的制備是通過將活性化合物與液體或微粉化固體載體或兩者均勻且完全地混合，隨后若需要將所得混合物成形。例如，將含有活性化合物、任選的一種或多種輔助組分的粉末或顆粒壓縮或模制來制備片劑。壓縮片劑可以在適當機器中壓縮自由流動形式的化合物，如粉末或顆粒來制備，該化合物任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和／或表面活性劑／分散劑混合。模制片劑可以在適當的制片機器中將用惰性液體粘合劑濕潤的粉狀化合物模制來制備。外源性雌激素在口服制劑中的含量是超低劑量的雌激素，這將取決于雌激素給藥的精確形式，但通常是小于0．5mg／天。優選的雌激素口服給藥量是約0．1mg-約0．25mg雌激素／天。譬如，雌二醇的口服給藥量是約0．1mg-約0．25mg／天。所屬
技術領域：
普通技術人員很容易判斷出雌激素其它形式的等效劑量。在本發明的優選實施方案中，雌激素是經非腸道或透皮途徑給藥而非口服給藥。前兩種給藥途徑優于口服給藥，因為雌激素給藥給藥可以導致性激素結合球蛋白水平增高。性激素結合球蛋白減小了雌激素給藥為絕經后個體所產生的有益功效，特別是出現骨質疏松癥或骨礦物質密度損失的跡象的個體。盡管口服給藥不是優選的給藥途徑，但是可以利用口服制劑實施本發明的方法。本發明的制劑適用于非腸道給藥，通常包括活性化合物的滅菌含水制劑，這些制劑優選與指定接受者的血液等滲。這些制劑可以通過皮下、靜脈內、肌肉內、透皮注射或陰道環給藥。此類制劑一般是通過將活性組分、雌激素與水或甘氨酸緩沖劑混合并將所得溶液滅菌且與血液等滲來制備。外源性雌激素在非腸道制劑中的含量是超低劑量的雌激素，這取決于雌激素給藥的精確形式，但通常是不超過20μg／天。優選的雌激素非腸道給藥量是約5μg-約15μg雌激素／天，更優選約10μg雌激素／天。譬如，雌二醇的非腸道給藥量是約5μg-約15μg／天。所屬
技術領域：
普通技術人員很容易判斷出雌激素其它形式的等效劑量。更優選的，本發明方法包括外源性雌激素的透皮給藥。用于雌激素透皮給藥的適當制劑是該
技術領域：
中已知的，本發明的方法中可以采用。例如，適當的外源性雌激素給藥的透皮貼劑公開在Campbell等人的美國專利4，460，372、kwiatek等人的美國專利4，573，996、Nuwayser的美國專利4，624，665、Eckert等人的美國專利4，722，941和Nelson等人的美國專利5，223，261中，這些文獻中對透皮貼劑技術的探討在此引入作為參考。適用于本發明方法的一種適當類型的透皮貼劑如圖1所示。通常，適當的透皮貼劑10包括非通透背層12、通透表層13、基本上連續涂敷在通透表層13上的粘合層(未顯示)，以及位于或夾在背層12和通透表層13之間的儲庫16，以使背層12延展在儲庫16的周圍且在通透表層13的邊緣處與通透表層13相連。儲庫16含有雌激素，且以流體形式與通透表層13相接觸。該透皮貼劑10通過通透表層13上的粘合層粘著在皮膚上，這樣，當透皮貼劑10粘著在皮膚上時通透表層13基本上連續接觸皮膚。當透皮貼劑10粘著在所述個體的皮膚上時，含在透皮貼劑10的儲庫16中的雌激素通過通透表層13從儲庫16經粘合層轉移至并穿過所述個體的皮膚。透皮貼劑10還可以在儲庫16中任選地含有一種或多種滲透促進劑以提高雌激素經過皮膚的滲透作用。透皮貼劑給藥領域熟知可以構成背層的適當材料的例子，并且本發明的透皮貼劑中可以采用任何常規背層材料。適當的背層材料的特定例子包括但不限于聚酯膜，例如高密度聚乙烯、低密度聚乙烯或聚乙烯的組合物，聚丙烯，聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯，乙烯乙酸乙烯酯共聚物等等。透皮貼劑給藥領域對適當的通透表層材料的例子也很熟悉，并且本發明的透皮貼劑中可以采用任何可以通透給藥活性組分，即雌激素的常規材料。適用于通透表層的材料的特定例子包括但不限于致密或微孔聚合物膜，例如那些含有聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺、改性聚丙烯共聚物、聚砜、鹵代聚合物、聚氯醚、縮醛聚合物、丙烯酸樹脂等的聚合物膜。這些類型的常規通透膜材料的特定例子公開在Zaffaroni的美國專利3，797，494中。所屬
技術領域：
對于可以涂敷在背層上形成粘合層的適當膠粘劑的例子也很熟知，其中包括，例如壓敏膠粘劑，例如那些含有丙烯酸和／甲基丙烯酸聚合物的膠粘劑。適當膠粘劑的特定例子包括丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(例如其正丁醇、正戊醇、異戊醇、2-甲基丁醇、1-甲基丁醇、1-甲基戊醇、3-甲基戊醇、3-甲基戊醇、3-乙基丁醇、異辛醇、正癸醇或正十二烷醇酯)本身或與烯屬不飽和單體共聚而成的聚合物，所述烯屬不飽和單體例如是丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、衣康酸、乙烯乙酸酯、N-支鏈C10-24烷基馬來酰胺酸、乙二醇二乙酸酯，以及它們的混合物；天然或合成橡膠，例如硅橡膠、苯乙烯-丁二烯橡膠、丁基醚橡膠、氯丁橡膠、丁腈橡膠、聚異丁烯、聚丁二烯、和聚異戊二烯，聚氨酯高彈體，乙烯聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、和聚乙烯乙酸酯，脲甲醛樹脂，酚醛樹脂，雷瑣辛醛樹脂，纖維素類衍生物，例如乙基纖維素、甲基纖維素、硝基纖維素、乙酸丁酸纖維素和羧甲基纖維素，和天然樹膠，例如瓜爾膠、阿拉伯樹膠、果膠、淀粉、destria、明膠、酪蛋白等。對于所屬領域技術人員很顯然，粘合層對于活性組分雌激素應呈惰性，并且應不干擾雌激素經通透表層進行透皮給藥。透皮貼劑的粘合層優選壓敏膠粘劑，以便于將貼劑貼敷在個體的皮膚上。所屬領域技術人員對于適當的滲透促進劑也已熟知。常規滲透促進劑的例子包括鏈烷醇類，如乙醇、己醇、環己醇等，烴類，例如己烷、環己烷、異丙基苯，醛類和酮類，例如環己酮、乙酰胺，N，N-二(低級烷基)乙酰胺類，例如N，N-二乙基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-(2-羥基乙基)乙酰胺，酯類，例如N，N-二-低級烷基亞砜，揮發油類，例如丙二醇、甘油、甘油單月桂酸酯、肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯，水楊酸鹽類，和上述物質的混合物。圖2是適用于本發明雌激素透皮給藥的第二類型的透皮貼劑的例子。在該例中，活性組分混合在粘合層內而不是含在儲庫中。此類貼劑的例子是熟知的且包括，例如，Berlex出售的CLIMERA_。透皮貼劑20包括背層22和粘合／藥物層24。該粘合／藥物層24兼具有將貼劑20粘著在個體皮膚上和含有給藥的活性組分雌激素的作用。活性組分從粘合／藥物層24浸出并透過貼劑所粘著的個體的皮膚。本實施方案可以采用上述任何背層。此外，可以采用上述任何適當的膠粘劑。粘合／藥物層包括相當均勻的選定膠粘劑和活性組分的混合物。通常，粘合／藥物層包括一個基本覆蓋背層的一個表面涂層。該粘合／藥物層還可以含有滲透促進劑，例如上述滲透促進劑，這是通過將滲透促進劑加入到膠粘劑和活性組分基本均勻的混合物內。對于所屬領域技術人員很顯然的是，根據本發明的透皮貼劑可以含有多種常規使用的便于活性藥物，特別是甾類活性藥物透皮給藥的附加賦形劑。所述賦形劑的例子包括但不限于載體、膠凝劑、助懸劑、分散劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑等。這些賦形劑各自的特定例子為所屬領域技術人員所熟知，本發明透皮貼劑可以采用任何常規賦形劑。然而，應著重注意到，本發明的透皮貼劑不含有孕激素。所以，孕激素不是一種適用于本發明透皮貼劑的適當賦形劑。外源性雌激素在透皮貼劑中的含量為超低劑量雌激素，這取決于雌激素給藥的精確形式，但應足以釋放出少于20μg，通常是不超過15μg／天的雌激素。雌激素經透皮貼劑給藥的優選量是約5μg-約15μg雌激素／天。更優選的雌激素給藥量是約10μg／天。雖然根據本發明所述方法中雌激素的常規劑量低于20μg，但可以采用高達25μg的劑量。譬如，雌二醇的非腸道給藥量是約5μg-約15μg／天。所屬
技術領域：
普通技術人員很容易判斷出雌激素其它形式的等效劑量。意外地發現，本發明所述方法中所用的超低水平的雌激素從實質上降低了絕經后婦女中骨質疏松性骨折的危險性。通常，將透皮貼劑設計為使用若干天后才需要更換。所以，儲庫中雌激素的含量必須足以使以低于20μg／天持續給藥若干天。例如，被設計為給藥10μg雌激素／天達7天的本發明透皮貼劑含有近1mg雌激素。適于給藥15μg雌激素／天達7天的透皮貼劑應含有近1．4mg雌激素。基于這些具體例子，所屬領域技術人員應能夠確定用于獲得正確雌激素日給藥劑量的透皮貼劑中的雌激素的必要含量。為了便利，本發明也提供了供患有或易患有絕經后癥狀的用戶使用的試劑盒，該試劑盒中包括透皮貼劑和說明使用該透皮貼劑治療用戶的絕經后癥狀和／或減少骨質疏松性骨折危險性的方法的說明書。該說明書將指導用戶利用貼劑上的膠粘劑將透皮貼劑直接粘著在皮膚表面，例如前臂上，以從該貼劑獲得超低劑量雌激素的透皮給藥，并由此使用戶的血清雌二醇水平增加至約5pg／ml-約20pg／ml。該說明書還指導用戶在需要連續雌激素給藥時更換貼劑，從而利用透皮貼劑來維持必要的血清雌二醇水平。特別是，當使用試劑盒中的7天用貼劑時，該說明書可以指導用戶每隔7天更換透皮貼劑以確保給藥低于20μg雌激素／天，優選10μg雌激素／天。所述試劑盒可便利地以單劑量或多劑量貼劑單元包裝和出售。下列實施例用于說明本發明，并且不對本發明構成限定。實施例1下列實施例和數據證明了血清雌二醇水平和骨質疏松性骨折之間的關聯，并且也證明了利用超低劑量外源性雌激素降低骨質疏松性骨折危險性和治療絕經后癥狀的功效。1．試驗人群骨質疏松性骨質的研究是對9704名婦女人群的前瞻性研究，這些婦女征募自美國4個社區Baltimore、Minneapolis、Pittsburgh和Portland的全體人口名單。參見Cummings等人的N．Engl．J．Med．332∶767-773(1995)。年齡在65或以上的婦女通過信訪參與該研究。該試驗人群包括黑人婦女，因為她們髖部骨折的危險性低，以及兩側髖部復位的婦女或需要他人幫助行走的婦女。參與者回答有關現在或近期使用的雌激素、補鈣劑和含有維生素D的復合維生素。2．臨床測量骨礦物質密度(即跟骨骨質)是利用由OsteoAnlyzer，Siemens-Osteon，Wahiawa，Hawaii獲得的單光子吸光分析儀來測量。各臨床中心之間對于該測量的平均變異系數是1．2％。參見Steiger等人的《骨礦物質研究雜志》7∶625(1992)。3．血清樣本所有參與者被要求堅持在試驗前的前夜和早晨食用無脂肪飲食以使干擾試驗的脂血最小化。在800AM和200PM之間抽取血樣并將血清立刻冷凍至-20℃。所有樣本裝運兩周運抵Rockville，Maryland的生物醫學研究院，在那里它們被儲存在-190℃的液氮中。4．骨折研究每4個月通過明信片或定期診斷訪問與上述婦女聯系，對生活狀況和個別骨折發生的跟蹤調查超過全體的99．7％。通過研究前瞻性放射照片來確定髖部骨折。在基線放射照片拍攝后平均3．3年時，7299名婦女(幸存者的79％)再次回來進行脊柱側索照片；經判斷有7238對放射照片足以作出偶發性椎骨骨折的結論。我們利用Black等人在《骨礦物質研究雜志》10∶890(1995)中公開的定量形態測定法來評估放射照片是否骨折。如果基線放射照片和跟蹤放射照片之間的任何椎骨高度減小≥20％和≥4mm，那么該婦女被歸為具有偶發性椎骨骨折。參見“國家骨質疏松癥基礎研究組對于椎骨骨折的研究”(NationalOsteoporosisFoumdationWorkingGroup)《骨礦物質研究雜志》10∶518(1995)。這些研究者在不知道參與者血清分析結果下對放射照片作出評估。5．對病例和人群樣本(cohortsample)的選擇利用Prentice，R．L．《Biometrika》73∶1(1986)中公開的病例-人群方法并將在基線時采用激素復原療法的婦女排除，我們從133個繼發有首次髖部骨折的參與者和138名具有偶發性椎骨骨折的參與者中隨機選擇血清樣本。我們還從人群中隨機選擇了359名婦女的樣本，其中包括12名患有繼發性髖部骨折和14名患有繼發性椎骨骨折的婦女。為了進行髖部骨折測定，我們排除了在基線訪查前患有髖部骨折的對照者(n=4)；為了分析椎骨骨折，我們排除了未進行跟蹤放射照相的婦女或其基線或跟蹤放射照片在技術上不足以進行形態測定的婦女。6．生物化學測定我們通過測定基線和在-190℃下儲存3．5年之后時的激素水平來判斷51名絕經后婦女中被選種類的激素測量結果的穩定性。兩個測量之間的相關性(顯著性為P＜0．001)如下中區甲狀旁腺激素(r=0．99)、25(OH)維生素D(r=0．88)、睪酮(r=0．99)和雌酮(r=0．98)。若有的話，這些物質的平均值存在很小的減少。當進行基線測量時，對甲狀旁腺激素還無法進行免疫放射分析(IRMA)；通過IRMA和中區技術所測量的水平之間的相關性為0．78。所有分析是在混合批次的病例和對照者中進行，對于參與者的骨折病史并不了解。樣本由儲存處直接送到分析實驗室而不進行融化。初始計劃是分析雌酮而不是雌二醇的水平。當完成首批分析后，我們在測量組中增加雌二醇并在89名髖部骨折病例、96名椎骨骨折病例和204名未患有上述兩種骨折的婦女中進行測量。由位于CalabasasHills，California的內分泌科學院來分析性激素和性激素結合球蛋白(SHBG)。雌二醇和雌酮是在提取和1H2O柱分離后的通過放射免疫分析來測量。雌二醇和雌酮的測定間差異分別為8％-12．5％和6．2％-7．0％。雌二醇的檢測下限為5pg／ml。在提取和Al2O3柱色譜后利用放射免疫分析法來測量總睪酮，其測定間差異為6．1％-13．4％。SHBG的結合能力直接在血清中利用置換技術來測量，其測定間差異為4．1％-14．4％。游離睪酮濃度是按照Furuyama等人在《甾類物質》16∶415(1970)；和Mayes在《臨床內分泌和代謝雜志》28∶1169(1968)中所述的硫酸銨沉淀法來測定。其測定間差異為10．7％-15．5％。向鈣激素(calciotropichormones)是由位于加利弗尼亞州舊金山的UCSF向鈣激素參照實驗室來測定。完整的甲狀旁腺激素是通過放射免疫分析來測量，其測定內差異為5．2％且測定間差異為8．5％。我們利用放射免疫技術測量25(OH)維生素D和1，25(OH)2維生素D，兩者的測定內差異均為6．6％，并且測定間差異分別為15％和24．4％。利用自動化學分析儀來測量肌酸酐的水平。7．數據分析通過近五分位(quintile)，我們分析了作為連續變量的激素和維生素水平，并且當兩者有關系時，作為二分變量(高于或低于檢測限)。我們利用位于Cary，NorthCarolina的SAS學院開發的邏輯模型來分析預示變量和椎骨骨折之間的關系，并利用考慮到病例-人群取樣設計的比例危害模型(Epicure，HirosoftInternational，Seattle，WA)來分析預示變量和髖部骨折之間的關系。所有分析均調節為基線年齡和體重，并且作為相對危險性(近似為優勢率或危害率)來報告，其置信區間為95％。我們根據多種激素水平和Browner公開在《美國流行病學雜志》123143(1986)中的標準技術來評估骨折比例。我們利用通用線性模型對不同組中的進行了年齡調整的骨質進行比較。8．結果表1給出了有關患有偶發性髖部或椎骨骨折的參與者的特征數據。*用于髖部骨折分析的對照者的數量從240變為343，因為在分析雌二醇時丟失數據。用于椎骨骨折分析的對照者的數量從193人變為264人；該變化較小，因為排除了那些技術上沒有足夠的基線和跟蹤椎骨x射線照片對的婦女。人群樣本中的偶發性骨折病例被包括在病例中。與對照者比較，P＜0．1與對照者比較，P＜0．5上述數據顯示，患有偶發性髖部或椎骨骨折的參與者與對照者相比年長、體重輕、很可能是吸煙者，并且骨質低。在人群隨機樣本中，大約三分之一的婦女(81對247人)的雌二醇水平無法檢測到(＜5pg／ml)。對體重和年齡作了調整后，有關相對危險性的數據列在表2中。表2年齡和體重經調整后的激素和維生素水平與髖部骨折和椎骨骨折危險性之間的關系相對危險性(95％C．I．)*變量流行率(％)髖部骨折椎骨骨折總雌二醇＜5pg／ml32．82．48(1．35-4．55)2．46(1．43-4．22)性激素結合球蛋白76．42．04(1．06-3．85)2．27(1．19-4．35)＞O．9dg／dl性激素結合球蛋白1．25(0．97-1．60)1．49(1．15-1．95)(／1．0μg／dl)雌酮≥1．5ng／dl77．41．30(O．76-2．17)1．72(1．01-2．94)游離睪酮≤0．7pg／ml19．41．63(1．00-2．66)1．40(O．83-2．35)25(OH)維生素21．51．16(0．70-1．92)1．08(0．64-1．80)D≤19ng／ml1，25(OH)2維生素D≤2315．42．05(1．21-3．46)1．60(0．92-2．79)pg／ml§總PTH＞50pg／ml11．21．05(O．52-2．12)0．49(O．20-1．17)*按照椎骨骨折的優勢率和髖部骨折的危害率估計的相對危險性。C．I．=置信區間人群隨機樣本中的流行率對25-羥基維生素D最高點的轉化值nmoles／L，乘以2．496§對1，25．二羥基維生素D的轉化值，皮摩爾／L，乘以2．4上述數據證實，雌二醇水平無法檢測到的婦女患有髖部骨折和椎骨骨折的危險性比雌二醇水平可檢測到婦女的危險性高2．5倍。我們評估出該人群中有33％的髖部骨折和32％的椎骨骨折與雌二醇水平無法檢測到有關。該數據似乎反映出閾值在與雌二醇濃度有關的危險性中降低至≥5pg／ml。與雌二醇水平低于5pg／ml的婦女相比，總雌二醇水平為5-10pg／ml的婦女髖部骨折的危險性降低了62％(危害率=0．38；0．20-0．72)，椎骨骨折的危險性降低了57％(優勢率=0．43；0．25-0．76之間的置信區間為95％)。SHBG水平升高與個別和椎骨骨折的危險性增加有關。在調整年齡后，SHBG每升高1．0μg／dl，髖部骨折的危險性就增加1．44倍(1．16-1．80)，椎骨骨折的危險性增加1．65倍(1．30-2．10)。對于髖部骨折，該影響似乎部分是由體重介導的。在該人群的隨機樣本中，26％(244人中63人)同時具有無法檢測到雌二醇水平和SHBG水平≥1μg／dl；這些婦女與其它婦女相比髖部骨折的危險性和椎骨骨折的危險性分別高14倍(95％的置信區間；3．0-62)和12倍(3．3-41)。體重的變化對于髖部骨折(危害率=6．9；1．5-32)和椎骨骨折(優勢率=7．9；2．2-28)的上述關系起些許鈍化作用。在基線時患有椎骨骨折的婦女小組與基線時無椎骨骨折小組中雌二醇、SHBG和偶發性椎骨骨折之間的關系相似。對于上述同時具有無法檢測到雌二醇濃度和SHBG濃度≥1μg／dl的26％的婦女來說，其髖部骨折的危險性為60％，椎骨骨折的危險性為64％。表2中有關椎骨骨折的數據進一步擴展為表3中的數據。表3椎骨骨折的預示變量多變量模型*優勢率(95％置信區間)變量(單位)調整的多變量對于骨質的調整雌二醇＜5pg／ml2．65(1．50-4．68)2．34(1．30-4．22)SHBG(每增高1μg／dl)1．62(1．16-2．26)1．51(1．07-2．12)雌酮≥1．5ng／dl2．04(1．034．17)2．33(1．12-4．76)年齡(每增加5年)1．17(0．89．1．54)1．09(0．82．1．44)體重(每增加10kg)0．71(0．53．0．94)0．86(0．64．1．16)跟骨骨質(每降低1SD)2．27(1．52-3．33)*表中所有結果均相對于其它變量調整。跟骨SD(標準偏差)為0．098g／cm2。基線處測量的跟骨骨質表2的數據表明，雌酮值處于最低五分位時(quintile)(≤1．4ng／dl)的婦女比高雌酮水平的婦女具有較低的椎骨骨折危險性。雖然低雌酮婦女趨于具有較低的雌二醇水平，但是雌酮和雌二醇水平之間的相關性是適當的(r=0．57)，在調整雌二醇水平后，低水平雌酮仍然與椎骨骨折危險性降低有關，如表3所示。1,25(OH)2維生素D水平處于最低五分位時(≤23pg／ml[≤55．2pm／L])的婦女髖部骨折的危險性明顯增高(危害率=2．1；1．2-3．5)，如表4所示。表4髖部骨折的預示變量多變量模型*危害率(95％置信區間)變量(單位)調整的多變量對于骨質的調整雌二醇＜5pg／ml2．37(1．27-4．45)1．92(1．01．3．64)SHBG(每增高1gg／dl)1．34(0．92-1．95)1．25(O．85．1．84)1，25(OH)2維生素D<23pg／ml§2．20(1．00-4．80)2．16(0．93-5．00)年齡(每增加5年)2．22(1．50-3．28)2．09(1．41．3．10)體重(每增加10kg)0．56(0．39．0．79)0．67(0．46-0．98)跟骨骨質(每降低1SD)1．61(1．03-2．56)*表中所有結果均相對于其它變量調整。跟骨骨質SD(標準偏差)為0．098g／cm2。§對1，25-二羥基維生素D的轉化值，皮摩爾幾，乘以2．4在調整雌二醇和SHBG水平(危害率=2．2；1．0-4．8)后該關系仍然很明顯。進一步調整血清肌酸酐也無顯著變化(危害率=2．3；1．0-5．2)。在將攝取維生素D補品的婦女排除之后，樣本中的25(OH)維生素D的水平(平均值±SD)在1月-6月(28．4±10．2ng／ml[83．6±25．5nm／L])明顯高于7月-12月的水平(25．5+10．4ng／ml[63．6±25．9nm／L]，P＜．01)。當將4-9月中的維生素D水平與10-3月間的維生素D水平進行比較時無明顯差別。在低血清25(OH)維生素D水平和髖部或椎骨骨折危險性之間沒有統計學意義上的顯著相關性(參見表2)，甚至在調整月份、季度或診所后，或者是排除或包括攝取維生素D補品的婦女后也是如此。將骨質增加到激素和骨折危險性的多變量模型中僅僅略微減弱了雌激素、SHBG和髖部或椎骨骨折危險性之間的相關性的強度。參見表3和4。調整骨質對1，25(OH)2維生素D和髖部骨折之間關系或雌酮和椎骨骨折之間關系的強度無本質上的影響。上述聯合數據表明，當血清雌二醇濃度低于5pg／ml，即分析的檢測限時，65歲左右婦女中的髖部和椎骨骨折的危險性大體上是增加的。約三分之一的偶發性髖部和椎骨骨折歸咎于這種雌二醇水平過低。雌二醇水平略高，處于5-10pg／ml的婦女發生上述骨折的危險性很低。雌二醇濃度無法檢測到的婦女還具有較低的骨質。然而，調整跟骨骨質只能使骨折危險性的增高略微降低。這說明，極低水平的雌二醇和骨折危險性之間的關系至少部分獨立于骨質。SHBG水平也對髖部和椎骨骨折的危險性具有強有力和獨立的影響。SHBG濃度≥1．0μg／dl且雌二醇水平無法檢測到的婦女比SHBG水平較低但雌二醇水平較高婦女患有髖部和椎骨骨折的危險性高7倍。SHBG極易與循環中的雌二醇結合，所以SHBG水平的增高應與雌二醇生物利用度的降低有關。因此，生物可利用的雌二醇濃度可能比我們在此試驗中測定的總的雌二醇水平與骨折的關聯更加密切。利用單光子吸光分析來測量基線處以及平均5．9年后的、在1993-94年間進行的跟蹤訪問時的跟骨骨質。在幸存的82％的原始人群中，通過雙X射線吸光分析法在1988-1990間的第二次訪問中測定髖部及其亞區的骨密度。在平均3．5年后的1993-1994的跟蹤訪問中重復測量髖部骨密度。利用多個訪問每個現場的試驗成員所得的測量結果評估的跟骨頸中心和股骨頸中心之間的平均變異系數(CV)為1．2％。沒有足夠數量的個體供本試驗進行椎骨骨密度測量。3．血清樣本在基線檢測時，在800AM和2．00PM之間取血并儲存在-20℃。在2周內，將樣本運抵生物醫學研究院(Rockville，MD)并儲存在-190℃的液氮中。在1994年，將入選參與者的血清融化，并分析其循環激素的水平和其它生物化學測量結果。完成分析試驗的人員不了解參與者的骨折情況。在51名婦女中，通過測定基線和在-190℃下儲存3．5年后再次試驗時的激素水平來測試被選激素對于時間的穩定性。測量結果對之間的相關性如下雌酮(r=0．98)，總睪酮(r=0．99)，中區甲狀旁腺激素(r=0．99)和25(OH)維生素D(r=0．88)。所有的相關性均為p＜0．001，皆很顯著。在進行基線測量時，不采用免疫放射分析法來測定PTH。PTH(IRMA)和在儲存3．5年后測定的中區樣本之間的相關性為0．78。兩種樣本之間的平均激素水平基本上沒有差別。4．生物化學分析利用放射免疫分析法來測定雌二醇、雌酮和總睪酮的血清濃度。性激素結合球蛋白的結合能力是利用置換技術來測定。游離睪酮水平計算為總睪酮占根據硫酸銨沉淀法測定的結合了甾類物質的非SHBG的百分比的產物。通過放射免疫法來測定完整甲狀旁腺激素、25(OH)D和1，25(OH)2D。所有分析的精度如表5所示，表5中還給出了平均偏差和標準偏差的描述性數據以及各激素的四分位區間(quartile)。表5有關生物化學分析的描述性數據*N，平均值(SD)和四分位割點是用于計算股骨骨損失人群。對于總髖部骨損失人群的N在表4中給出。指定四分位的數值范圍5．統計學分析除了雌二醇的全部生物化學變量是通過四分位分析并作為連續變量。由于36％的雌二醇水平低于檢測最低限(5pg／ml)，所以，將無法檢測到的水平設定為最低等級，且將可檢測出的水平分為三級，從而將雌二醇數據按等級分為四組。雌二醇的等級在表中簡單地分為四區。對于連續模型，將無法檢測的雌二醇水平規定為0。線性回歸分析法是用來分析調整年齡和體重的激素水平和BMD的年百分變化率之間的相關性。由于BMD的年絕對變化值和包括診所位置作為協變值的結果與上面相類似，所以未列出其結果。與整個髖部比較，激素水平和骨損失之間的相關性相對于股骨頸來說較弱，轉子區也如此，因此我們只給出總的髖部骨損失。年齡和體重經修正的BMD平均百分變化率和95％的置信區間是利用各激素的四分位(quartile)通過最小二乘方評估法來計算，并且利用趨交叉四分位(修正年齡和體重)的試驗來評估統計顯著性。連續激素水平和BMD的年百分變化率之間的相關性表示為標準化β系數，它代表了各激素水平中每增高1個標準偏差時BMD的年百分變化率的差別。多變量模型可以用來測定生物化學變量，這些變量是在其它激素水平得到控制后骨損失的獨立預示變量。由于雌二醇和雌酮的水平在此人群中適當相關(r=0．64)，所以只在獨立模型中分析這些變量。6．結果本研究中所采用的隨機子樣本的特征如上表2所示，子樣本與那些抽樣人群基本上沒有差別。該子樣本中的婦女的平均年齡為71．3歲。年均骨損失對于跟骨來說近1．5％，對于整個髖部和股骨頸來說為0．5％。表6跟骨骨損失人群中參與者的特征<tablesid="table1"num="001"><table>特征跟骨骨損失人群生物化學樣本數量231平均年齡，歲(SD)71．3(4．8)平均體重，kg(SD)68．1(11．7)日常鈣補品，n(％)102(44．2)日常維生素補品，n(％)100(44．1)平均飲食鈣，mg／天，(SD)687(390)平均機體活動，kcal／周(SD)1698(1791)平均跟骨BMD，g／cm2(SD)0．409(0．088)平均總髖部BMD，g／cm2(SD)0．765(0．124)平均股骨頸BMD，g／cm2(SD)0．658(0．108)平均脊椎BMD，g／cm2(SD)0．850(0．154)平均跟骨骨損失，％／年，(SD)1．48(1．80)平均總髖部骨損失，％／年，(SD)0．49(1．49)平均股骨頸骨損失，％／年，(SD)0．50(1．70)</table></tables>激素與跟骨BMD變化之間的關系如表7所示。在年齡和體重修正了的線性回歸模型中，只有SHBG是顯著的跟骨骨損失預示變量。表7激素和跟骨BMD變化之間的關系修正*的BMD年均百分變化率(95％CI)*對年齡和體重進行修正，除ERT用戶以外。￥激素／因子的水平每增加1SD時BMD年百分變化率的差別p＜O．10，§p＜0．05，p＜0．01對于每1SD的差別的顯著性試驗是基于試驗H0對于由各激素評估的線性參數，β=0顯著性試驗交叉四分位基于趨勢試驗。與SHBG水平處于最低四分位的婦女(＜1．1μ．g／dL；平均變化率=-1．2％；-1．6％，-0．7％)相比，SHBG水平處于最高四分位內(≥2．4μg／dL)的婦女每年跟骨經歷兩次骨損失(平均變化率=-2．2％；95％CI=-2．9％，-1．6％)。甚至在對血清雌二醇、雌酮和睪酮水平進行修正之后，這種相關性仍然極其顯著(p＜0．002)。跟骨骨損失隨激素水平降低而增加的趨勢對于所有甾類性激素來說都很明顯(參見表7)，但無一具有統計顯著性差異。作為連續變量模型的血清雌酮濃度和跟骨骨損失之間的關系呈臨界(p＜0．10)反統計學相關。有關激素和整個髖部的BMD變化之間相關性的數據(參見表8)表明，較低水平的雌酮和雌二醇與髖部骨損失的增多明顯相關。表8激素和整個髖部BMD變化之間的關系修正*的BMD年均百分變化率(95％CI)*對年齡和體重進行修正，除ERT用戶以外。￥激素／因子的水平每增加1SD時BMD年百分變化率的差別p<0．10，§p<0．05，p<0．01對于每1SD的差別的顯著性試驗是基于試驗H0對于由各激素評估的線性參數，β=0顯著性試驗交叉四分位基于趨勢試驗。例如，在修正了年齡和體重后，雌激素水平等于或高于10pg／ml的婦女在跟蹤訪問期間的骨損失略微增加(年均變化率=0．1％；-0．5，-0．7)，但雌二醇水平低于5pg／ml的婦女卻經歷高于平均比率的髖部骨損失(年均變化率=-0．8％；-1．2，-0．3)。由四分位睪酮水平測定的年均髖部骨密度提供了一定的閾值總睪酮水平等于或高于26ng／dL(最高四分位)的婦女的年均百分變化率僅為-0．1％(-0．5％，0．3％)，這是與總睪酮水平低于26ng／dL(加合1-3四分位)的婦女的-0．6％(-0．8％，-0．4％)相比而言。該差別具有統計顯著性(p＜0．05)。在SHBG交叉四分位觀察到髖部骨損失有所增高，雖然這種趨勢在年齡和體重修正的回歸模型中不具有統計顯著性差異(p=0．27)。在包括SHBG、雌二醇和睪酮水平的多變量模型中，除了年齡和體重之外，較低的總睪酮濃度和較高的SHBG濃度獨立地和髖部BMD變化有關。數據如表9所示。表9多變量模型性激素、SHBG和整個髖部的骨損失髖部BMD百分變化率的差別**所有分析只包括雌二醇測量結果具有可比性的婦女￥第一欄代表各激素單獨回歸模型所得的年齡和體重經修正的結果，第二欄代表包括SHBG、雌二醇、總睪酮、年齡和體重的單一回歸模型的結果p＜0．05因為有許多婦女無雌二醇測量結果，所以還不清楚在其他激素水平調整后所得的SHBG與多變量模型中髖部骨損失之間是否顯著相關，或SHBG是否與該婦女亞人群中的骨損失密切相關。因此，再次在具有雌二醇測量結果的婦女中，對年齡和體重修正后的SHBG與髖部骨損失之間的相關性進行測試，并且發現它們具有統計顯著性差異。參見表9。當表示為連續變量時，雌二醇與髖部BMD變化之間沒有顯著的相關性，無論是在睪酮和SHBG調整之前還是之后。但是，在調整SHBG和睪酮水平后，對于雌二醇的趨交叉四分位的試驗仍然差異顯著，而雌酮的趨交叉四分區則屬于臨界顯著差異(p＜0．06)。只有25(OH)D在冬季期間(1-6月)和該年的其他時間(7-12月)明顯不同，其冬季平均值為24．0而其他月份的平均值為26．9(p=0．01)。在將5-10月與11-4月間的向鈣激素水平進行比較時無顯著性差異。調節年齡和體重后，向鈣激素或鈣水平無一明顯地與跟骨BMD變化有關。參見表7。甚至在更換了季節和診所后，以及在調整或排除了日常使用了鈣或含維生素D復合維生素的用戶后，該結果也仍然確實如此。較低水平的25(OH)D與髖部骨損失增高明顯相關。參見表9。25(OH)D水平處于最高四分位(≥32pg／ml)的婦女的BMD年均變化率為-0．1％(-0．5，0．3)，這是與25(OH)D水平處于最低四分位(＜21pg／ml)的婦女的BMD年均變化率-0．7(-1．1，-0．4)相比較而言。該趨勢在調整了診所、季節、鈣和含維生素D復合維生素用戶后仍然很顯著。甲狀旁腺激素(PTH)水平與跟骨和髖部的骨損失之間沒有一致的相關性。參見表7和8。對PTH的趨交叉四分位的試驗揭示出不尋常的圖譜，也就是，PTH水平處于中央范圍(第2和第3四分位)時髖部骨損失較高，PTH水平處于極端值(最低和最高四分位)的婦女的骨損失較少。7．結論上述數據證實，在老年婦女中，較低水平的血清雌激素與髖部骨損失的增高明顯相關，甚至在調整了年齡、體重以及SHBG和睪酮水平之后也是如此。事實上，雌二醇水平等于或高于10pg／ml的婦女在跟蹤訪問期間的平均骨質有較小的增加(年均變化率=0．1％；95％CI=-0．5，0．7)，但雌二醇水平無法檢測到的婦女(＜5pg／ml)幾乎以每年1％的速度失去髖部骨質(-0．8％；-1．2，-0．3)。由于骨損失對于老年婦女來說是髖部骨折的一個重要的危險因素，所以上述發現表明，適度增加循環激素的水平可以有效降低骨損失和骨折的發生率。SHBG濃度與跟骨和髖部骨損失密切相關，這不依賴于年齡、體重和雄激素水平。SHBG以高親和力與血清雌二醇和睪酮結合，這種相關性可以反映出骨損失的危險性隨著可生物利用的性激素水平的減小而增高。然而，該相關性甚至在修正了血清雌二醇和睪酮水平后也很強，這說明SHBG對骨骼可能存在其他影響。較低的25(OH)水平與髖部骨損失加速有關，但與跟骨的無關。將抽樣研究的上述結果相結合有兩個研究試驗發現，具有較低25(OH)水平的絕經后婦女具有較低的骨礦物質密度(參見Villareal，《臨床內分泌和代謝雜志》72(3)628-634(1991)；Martinez等人CalcifiedTissueInternational55(4)253-256(1994))，但至少在另一個抽樣研究試驗中發現，25(OH)D和撓骨遠端、中撓骨和腰椎處的骨礦物質密度沒有顯著的相關性(參見Tsai等人CalcifiedTissueInternational40(5)241-243(1987))。然而，Tsai等人的研究是在很寬的年齡范圍(33-94)之間進行的，并且沒有單獨報導老年婦女的相關性。在我們的研究中，PTH水平與跟骨或髖部的骨損失無關。該結果甚至在更換了季節并排除了攝取鈣或維生素D補品的婦女之后也確實如此。本研究是前瞻性研究，其中測定了骨折的變化率而不是橫斷面的骨質。血清樣本是在測量骨質變化之前獲得的。樣本量明顯大于其他多數有關研究中的樣本量，并且試驗個體樣本是從美國四個分散的社區的老年人群中抽取。所以，上述結果證實，SHBG和外源性雌激素是老年婦女中骨損失的重要決定因素。較低的25(OH)D水平與髖部骨損失加快有關，但與跟骨的無關。PTH和其他向鈣激素對老年婦女中的骨損失沒有顯著的影響。9704名SOF參與者在1986-1988年的基線訪問期間在臨床中心接受訪談和測試。在這些訪談中，收集有關主治醫師診斷的病情和用藥史的詳細數據。我們獲得了身高、體重和強壯度的標準評估數據。我們通過單光子吸光分析法測出了跟骨和鄰近第三撓骨的BMD。還獲得了胸廓和腰椎的側面放射照片。收集各參與者的血清樣本。參與者每年填寫調查表并且每兩年一次到診所進行跟蹤訪談，共三次。在第一次跟蹤訪談時(在1988-1990年間)，我們利用雙能X射線吸光分析法(DXA)測量股骨遠端的BMD。有關這些測量方法和對測光密度術的質量控制的詳細情況公開在Steiger等人的《骨礦物質研究雜志》7625-632(1992)中。2．血清樣本和生物化學試驗要求所有參與者堅持在試驗的前夜食用無脂肪飲食以使在早晨的測試中干擾測試的脂血最小化。在上午800到下午200間抽取血樣并將血清冷凍至-20℃。兩周內將所有樣本運抵生物醫學研究院(Rockville，MD)，在那里它們被儲存在液氮中(近-190℃)。這些樣本的長期穩定性通過儲存在-20℃兩周后所得的雌二醇和儲存在-190℃3．5年后所得的雌二醇相比較而測得。對于這51個樣本來說，相關系數為0．94，兩周后的平均值(±SD)為11．8(9．0)，3．5年后的平均值為10．9(9．0)。在最初的人群研究中，生物化學試驗使用的基線血清從400名隨機抽取的參與者獲得。在此次測試中，我們排除了那些檢測不到血清雌二醇的婦女(n=134)和那些聲稱當前正接受全身雌激素治療的婦女(n=39)，剩下247名婦女進入此次測試。對每個個體進行下面的生物化學測試向鈣激素因子包括鈣、25(OH)維生素D、1．25(OH)2維生素D和甲狀旁腺激素；生長因子包括類胰島素生長因子-1和類胰島素生長因子結合蛋白3；骨形成標志物包括骨特異性堿性磷酸酶和骨鈣蛋白；性激素和腎上腺激素包括雌二醇、雌酮、睪酮(總的和游離的)、SHBG、脫氫表雄甾酮硫酸酯(DHEAS)；其它內分泌試驗包括甲狀腺刺激(TSH)。這些生物化學測試的方法公開在Reginster等人Calcif．TissueIntl．51∶340-343(1992)中。對于雌二醇的免疫分析法是由內分泌科學實驗室(Tarzana，CA)完成的，他們采用高靈敏分析法，其檢測下限為5pg／ml。為了驗證我們在獨立人群中的發現，我們測定了第二隨機樣本，即222名滿足與初始分析樣本相同的入選和排除標準的參與者的基線血清雌二醇。對第二人群血清雌二醇的測定是由CorningNicholsInstitute(SanJuanCapistrano，CA)來完成，他們采用了高靈敏度分析法，其靈敏度下限為2pg／ml。22份一分為二的血清樣本在兩個參照實驗室中的測定結果相同(相關系數=0．9，斜率1．3)。3．椎骨畸形的調查放射照片的形態分析用于診斷基線的流行性椎骨畸形；流行性畸形的標準是在至少1個椎骨的前、中或后椎骨的高度各降低了3SD以上。參見Black等人的《骨礦物質研究雜志》10∶890-902(1995)。4．統計學分析分析是在舊金山的加州大學的SOF協作中心中完成。在第一樣本(n=27)中，基于其血清雌二醇水平將婦女分為4組；在1等級中，包括了所有雌二醇無法檢測到(＜5pg／ml，n=81，32．8％)的婦女；其余的婦女是基于5-6pg／ml、7-9pg／ml和10-25pg／ml的雌二醇水平大致相等地分為三組；這些等級中的試驗個體數量為55(22．3％)、63(25．5％)和48(19．4％)。在第二檢驗樣本(n=222)中，采用相同的血清雌二醇截點；個體在這些組中的比例是25．2％、27．5％、24．8％和22．5％。在就個體的體重和年齡進行修正后對結果進行測定。這是因為體重和BMI極其相關，同時體重與BMD的相關性更強。參見Bauer等人的《內科紀事》118∶657-665(1993)。我們對入選后續模型中的體重進行篩選。隨后，我們利用第一試驗變量評估了協變量的可能性作用，我們認為這些第一試驗變量是骨密度或骨質疏松性骨折的有效預示變量。如果任何有效的混雜者在不同的雌二醇等級中顯示出一致的趨勢(在分析變量時測試線性趨勢)，我們將進一步評價其在多變量模型中的作用，所得結果是第四骨骼位點處的骨密度。這些模型包括年齡、診所位置和血清雌二醇以及入選者的預示變量。如果入選者的變量能夠在上述模型中保持，那么她被認為是混雜者(confounder)。我們還在模型中增加了握力強度和日常吸煙行為作為變量，因為這些變量在先于我們的研究中被證實是BMD(參見Bauer等人的《內科紀事》118∶657-665(1993))和骨折(參見Cummings等人的《新英格蘭醫學雜志》332∶767-773(1995))的預示變量。利用對變量的分析，可以計算出各等級雌二醇的經修正的平均BMD。利用Dunnett氏試驗來測定修正后的最低等級的BMD(雌二醇無法檢測到)相對于3個較高等級的BMD之間的差別的統計顯著性。用邏輯回歸模型來計算多變量修正的優勢率(OF)，以及3個相對于最低等級來說較高的雌二醇等級的流行性椎骨畸形的危險性的95％置信區間。所述分析采用SAS(SASInstitute，Cary，NC)完成。5．試驗個體雌二醇水平的特征在本試驗中婦女的臨床測量結果如表10所示表10在按照血清雌二醇水平分組的247名老年婦女中測定的臨床值和實驗值一般地，本研究中的婦女的年齡約為72歲(表l0)。平均雌二醇水平隨年齡而改變；那些年齡在65-74歲的婦女的平均(SD)雌二醇水平為5．8(5．1)pg／ml，那些年齡大于或等于80歲的婦女的平均雌二醇水平為6．3(4．9)。不同雌二醇等級間的身高無差別。在最高雌二醇等級的婦女中，體重在統計學意義上較高。生物化學試驗包括向鈣因子、生長因子、骨特異性堿性磷酸酶和DHEAS(未給出結果)的分析。該生物化學試驗未顯示出不同雌二醇等級之間存在較大或一致性差異。雌二醇水平處于最高等級的婦女中的雌酮和總睪酮約是雌二醇水平無法檢測到婦女中的2倍。數個變量包括那些與體重有關的變量，那些不同雌二醇等級之間的明顯且一致的差異。雌二醇水平較高時骨鈣蛋白趨于降低；雌二醇處于最高等級時要比處于最低等級(無法檢測到)雌二醇時的骨鈣蛋白低10．9％。因為不同雌二醇等級間存在差別，并且與4個BMD的結果相當一致，所以模型中包括體重和SHBG以及年齡、握力強度和日常吸煙。四個骨骼位點都同樣表現出，年齡和體重修正的基線BMD隨雌二醇水平增高而趨于增高。和血清雌二醇水平＜5pg／ml的婦女比較，那些雌二醇水平10-25pg／ml的婦女所有骨骼位點的平均BMD在統計學意義上較高；對于整個髖部、跟骨、撓骨遠端和椎骨，差別分別是4．6％，6．1％，5．8％和7．1％(相對于各對照P＜0．05)。在將多變量修正后，有關整個髖部、跟骨、撓骨遠端和椎骨的差別仍然具有統計學上的顯著性5．7％，6．35％，6．5％和6．9％。檢驗試驗中的婦女具有與在我們的初始試驗中的婦女相同的特征，其中包括血清雌二醇水平。由檢驗試驗的人群中發現，血清雌二醇水平和BMD之間具有類似的相關性。在全部四個骨骼位點處，修正了年齡和體重的BMD表現出與初始人群相似的趨勢。與血清雌二醇＜5pg／ml的婦女相比，那些雌二醇水平10-25pg／ml的婦女在整個髖部、跟骨、撓骨遠端和椎骨處的BMD分別增高4．9％，9．6％，7．3％和6．8％。在對多變量進行修正后，差別仍然具有統計顯著性整個髖部、跟骨、遠撓骨和椎骨處的BMD增高3．8％，7．0％，5．4％和6．9％。在最低雌二醇等級(＜5pg／ml)的婦女中，有30％的婦女呈≥1的流行性椎骨畸形，而在其他雌二醇水平為7-19％的三個等級中，該流行性較低。在對年齡和體重進行修正后，雌二醇水平介于5-25pg／ml內的婦女的流行性椎骨畸形似乎比雌二醇水平無法檢測到的婦女的低60％(OR=0．4，95％置信區間(CI)0．2-0．8)；多變量修正對該比率的影響很小(OR=0．4，CI0．2-0．7)。在檢驗試驗的人群中，我們未發現存在任何雌二醇水平和椎骨畸形流行性相關的趨勢；在所有雌二醇的等級中，該流行性相似且介于15％-19％。6．結論上述數據證實，血清雌二醇水平低于5pg／ml被認為有害于老年婦女的骨骼健康。在對年齡和體重進行修正后，數據顯示雌二醇水平低于5pg／ml的婦女在全部骨骼位點具有實質上減少的BMD。此外，數據還顯示，作為骨更新的標識物的骨鈣蛋白在血清雌二醇水平較低的婦女中趨于增高。因此，在臨床上，低濃度的雌二醇對老年婦女產生重要的影響。對此的可能解釋是，當雌二醇以低濃度存在時，可以減少骨骼畸形，有利于骨骼的質量，并且由此降低骨折率。我們發現BMD的差別很大，甚至在對多因子修正后仍然對應約0．4的標準偏差(SD)。該差別被推測可以使髖部骨折危險性減小30％(假定1．0SD=0．11g／cm2和1．0SD差別=RR2．8)。利用相同的計算方法，我們認為脊椎密度正相關于血清雌二醇10-25pg／ml，等效于約0．4SD，由此推測出可以使脊椎骨折的危險性降低23％(假定1．0SD=0．17g／cm2和1．0SD差別=RR2．1)。雌酮作為骨骼健康的一個預示變量在絕經后婦女中被廣泛測定。已發現BMD在白人和黑人婦女中都與血清雌酮水平典型相關(參見Cauley等人《美國流行病學雜志》(Am．J．Epid．)139∶1035-1046(1994))。然而，本研究也有局限性，因為半數以上婦女的雌二醇水平低于檢測限。雌酮不能預示偶然性髖部骨折。在絕經后婦女中，雌酮是數量上占優勢的雌激素，并且主要由腎上腺雄甾烯二酮轉化生成。雌二醇是通過還原雌酮且通過芳構化卵巢和腎上腺的睪酮來生成，其衍生自轉化的雄甾烯二酮和DHEA。(參見，Cauley等人，《美國流行病學雜志》139∶1035-1046(1994))。數據顯示，在初始樣本(r=0．65)和驗證樣本(r=0．78)中，血清雌酮水平和雌二醇之間具有高相關性。雌二醇而不是雌酮被認為是核受體的效應激素。(參見Grodin等人的《臨床內分泌和代謝雜志》36∶207-214(1973))。雌二醇的效能是雌酮的4-10倍。所以，雌二醇是主要的甾類性激素，因此可以預測出它對骨骼結果具有強有力的、持續的和正性關系。雌二醇可以通過若干可能性機制對骨骼產生有益作用降低骨代謝單位的活化；拮抗甲狀旁腺激素對骨吸收的刺激作用；通過局部細胞因子或其他生長因子來提高成骨細胞的存活；增強胃腸道對鈣的吸收和腎鈣保存的功效。上述作用中的一些或全部可以對極低水平的雌二醇產生反應。我們的數據也支持了雌二醇對減輕骨代謝的影響。雌二醇通過體重間接地影響骨骼，但我們的數據對體重進行了修正，但發現它們仍然具有密切的關系。過去，非靈敏的測試阻礙了雌二醇作用的研究。只有極其靈敏和精確的方法才可以區分開低水平(＜30pg／m1)和極低水平(＜5pg／m1)雌二醇。一些商用實驗室所提供的雌二醇分析法的檢測下限小于20pg／ml。缺乏上述靈敏分析方法將妨礙其他人發現上述相關性。與極低水平相比，低的內源性雌二醇水平產生的結果很細小并且需要許多年才能顯示出BMD的變化。我們的抽樣數據顯示出雌二醇水平在65歲以后不再隨著年齡的增加而降低。我們的結果表明，低水平的雌二醇具有對抗骨質降低和骨折的保護作用；該作用是肯定的，因為可以對若干骨骼位點處的骨密度，髖部和跟骨的骨損失，以及椎骨骨折的危險性進行觀察。這些發現由不同實驗室的高靈敏雌二醇分析法來重現。雌二醇在老年婦女中對骨骼的有益作用在預先確定無生理損傷的婦女中產生。上述對優選實施方案和實施例的描述是舉例說明本發明，并不對本發明構成限定。本發明由下列權利要求限定，其中包括等效力的權利要求。權利要求1．一種用于治療絕經后個體中因絕經后雌激素減少所致的機體癥狀的方法，該方法包括給所述個體施用一定量的雌激素以有效地使所述個體的血清雌二醇水平達到約5pg／ml-約15pg／ml。2．根據權利要求1所述的方法，其中所述機體癥狀選自骨質疏松性骨折的危險性增高和骨礦物質密度的損失。3．根據權利要求1的方法，其中所述雌激素的施用量能夠有效地使所述個體的血清雌二醇水平達到約5pg／ml-約10pg／ml。4．根據權利要求1所述的方法，包括經非腸道施用所述量的雌激素。5．根據權利要求1所述的方法，包括透皮施用所述量的雌激素。6．根據權利要求1所述的方法，包括透皮施用不超過約15μg雌激素／天。7．根據權利要求1所述的方法，包括透皮施用約5μg-約15μg雌激素／天。8．根據權利要求1所述的方法，其中所述雌激素是雌二醇。9．一種用于在患有或易患絕經后骨質疏松癥的個體中降低骨質疏松性骨折危險性的方法，該方法包括給所述個體施用一定量的雌激素以有效地使所述個體的血清雌二醇水平達到約5pg／ml-約15pg／ml。10．根據權利要求9的方法，其中所述雌激素的施用量能夠有效地使所述個體的血清雌二醇達到約5pg／ml-約10pg／ml。11．根據權利要求9所述的方法，包括經非腸道施用所述量的雌激素。12．根據權利要求9所述的方法，包括透皮施用所述量的雌激素。13．根據權利要求9所述的方法，包括透皮施用不超過約15μg雌激素／天。14．根據權利要求9所述的方法，包括透皮施用約5μg-約15μg雌激素／天。15．根據權利要求9所述的方法，其中所述雌激素是雌二醇。16．一種供患有或易患有因絕經后雌激素減少所致機體癥狀的用戶使用的試劑盒，該試劑盒包括a)能夠每天透皮給藥少于約15μg雌激素的透皮貼劑；和b)描述用該透皮貼劑來減小所述用戶骨質疏松性骨折危險性的方法的說明書。17．一種用于治療絕經后個體中因絕經后雌激素減少所致的機體癥狀的方法，該方法包括在基本無外源性孕激素的條件下，給所述個體透皮施用少于約20μg雌激素／天。18．根據權利要求17所述的方法，其中所述機體癥狀選自骨質疏松性骨折的危險性增高和骨礦物質密度的損失。19．根據權利要求17所述的方法，其中所述施用是在所述個體實施子宮切除術之前。20．根據權利要求17的方法，進一步包括測試所述個體的血清雌二醇水平，并且判斷被治療個體的血清雌二醇水平如相同年齡組絕經后婦女般正常的步驟。21．根據權利要求17所述的方法，該方法包括施用約5μg-約15μg雌激素／天。22．根據權利要求17所述的方法，該方法包括透皮施用約10μg雌激素／天。23．根據權利要求17所述的方法，其中所述雌激素是雌二醇。24．一種用于在患有或易患絕經后骨質疏松癥的個體中降低骨質疏松性骨折危險性的方法，該方法包括在基本無外源性孕激素的條件下，給所述個體施用少于約20μg雌激素／天。25．根據權利要求24所述的方法，其中所述的施用是在所述個體實施子宮切除術之前。26．根據權利要求24的方法，進一步包括測試所述個體的血清雌二醇水平，并且判斷被治療個體的血清雌二醇水平如相同年齡組絕經后婦女般正常的步驟。27．根據權利要求24所述的方法，其中所述方法包括施用約5μg-約15μg雌激素／天。28．根據權利要求24所述的方法，其中該方法包括透皮施用約10μg雌激素／天。29．根據權利要求24所述的方法，其中所述雌激素是雌二醇。全文摘要本發明提供用了治療絕經后個體中因絕經后雌激素減少所致的機體癥狀的方法,特別是用于降低絕經后個體中骨質疏松性骨折危險性的方法。本發明還提供了用于實施本發明方法的試劑盒。文檔編號A61P19/10GK1279611SQ98811359公開日2001年1月10日申請日期1998年11月19日優先權日1997年11月21日發明者史蒂文·卡明斯,赫爾曼·埃爾曼,布魯斯·埃廷格申請人:加利福尼亞大學董事會,凱撒基金健康計劃公司,珀曼恩特醫療集團公司,伯萊克斯實驗室公司