檢測組織形態的方法

專利名稱：檢測組織形態的方法
政府支持本發明部分或全部由國家健康研究所的P41RR0259和CA53717的經費支持。政府擁有本發明的某些權利。相關申請此篇為1997年10月10日提交的美國序列號No.08/948,734申請的部分繼續申請，該申請的全文通過在此引述而收入本篇。
本發明的背景在早期階段診斷癌癥的方法對癌癥的預防和治療是很重要的。許多類型的癌癥是從覆蓋人體內外表面的上皮組織生長而來的。許多這些癌癥，如胃腸道內癌癥，要經過異常結構發展階段。異常結構可以確定為還不是惡性的腫瘤組織，但認為是惡性腫瘤的前體。如果在這個階段得到診斷，很多腫瘤可能治療。在胃腸腫瘤情況中，目前的診斷方法是依靠內窺鏡檢查法。然而，異常結構的組織在用內窺鏡檢查中常常不明顯。這樣，在胃腸道和其他部位中進行異常結構檢查常常依賴于從這種“不可視”惡性腫瘤前體獲取分散樣品。然而，分散活組織檢查很大可能會錯過異常結構變化。在一些情況中活組織檢查不可能實施。
為了在真正時間內，為活體內不同組織中的癌化組織提供精確診斷，已經努力在尋找一種替代標準活組織檢查法的方法。為此，無創傷性光學技術不需將組織移出并能在活體內實施。這種方法提供顯微鏡水平的信息，并能對用標準活組織檢查法可能漏掉的非常小的部位提供研究。雖然大部分人類器官能用光學技術方法診斷，但這些技術更適用于人類體腔中的組織，因為它們可容易地被光學探頭接近，光學探頭可插入到傳統內窺鏡管的一個槽內。
本發明的概述本發明涉及使用光確定材料結構層的物理特性，具體地，使用散射光確定有關組織結構形態的某些性質上的信息。反向散射法和透視法都可使用，取決于所檢測材料的厚度及結構的大小和分布。可檢測材料的性質實例包括表面粗糙度，寄生狀況，細胞計數測量，或任何材料中對應結構變化材料折射指數的變化。這種類型的散射光譜能與不能定量測量微粒形態的吸收光譜區分開來。
盡管作了廣泛地研究，還沒有可信的診斷活體異常結構的光學技術公開。一個現實存在的困難是異常結構變化局限于上皮層的最上層，其厚度為20μm，對光照射幾乎是透明的單細胞層。
如在胃腸道中的組織(其他中空器官也有相同的性質)，是由稱為上皮細胞的一層細胞覆蓋(從20μm到300μm，取決于胃腸道的部位)，由相對無細胞的富含血管的疏松結締組織，即固有組織(lamina propria)支持，其厚度可達500μm并含網狀膠原質和彈性纖維，和多種白血細胞類型。在固有組織下是肌肉層，即肌粘膜(達400μm厚)和另一層稱為亞粘膜的中等密度結締組織(400-600μm厚)含許多小血管和豐富的膠原質和彈性纖維。這些層的總厚度約為1mm。因為光照射到生物組織內的特征穿透深度通常不超過1mm，所以對于較好的具體實施，這就足以限制了對這些組織層的檢測。
食道腺癌發生在食道的組織轉化的柱狀上皮細胞中，稱為“Barretts食道”，它是長期胃腸倒流的并發癥。在這種情況中，末梢鱗狀上皮細胞被類似于在腸中發現的包括單層細胞的柱狀上皮細胞替換。Barretts食道常常與后來能發展成癌癥的異常結構有關。對患有Barretts食道的患者進行內窺監測試驗還沒有降低食道癌的死亡率。最可能的解釋是產生在食道中的異常結構不能用標準內窺造影觀察到，分散活組織檢查取樣還是必要的。這種方法只能獲取約0.3％有危險組織的樣品。這樣，有極大潛在取樣錯誤。
使用光學技術診斷Barretts食道的異常結構受到的限制是，組織內的初始變化發生在單細胞厚度(約20-30μm)的上皮層內，而大部分形成的熒光或反射光譜是更深的組織層的。異常結構上皮細胞一個最顯著的特征是存在增大的，染色過度的，擁擠的細胞核。實際上，這些細胞核的大小和空間分布的變化是病理學者用來診斷組織樣品異常結構的主要標記。在其他組織層中沒有觀察到顯著的變化。不幸的是，上皮細胞不含強的吸收體或熒光基團，并且由于上皮細胞的厚度相當小而被忽略。這些使得在Barretts食道中診斷上皮細胞變成困難問題。
漫反射光譜能為分析生物組織上皮細胞和檢測癌癥前期損害提供定量的生化和形態信息。通過結腸內窺鏡檢查，從患者的腺瘤結腸息肉(癌癥前體)和正常結腸粘膜收集漫反射光譜。用在含聚苯乙烯珠和血紅蛋白的物理組織模型上檢測的分析光漫射系統分析數據。獲取四個參數血紅蛋白濃度，血紅蛋白氧飽和度，有效散射體密度和有效散射體大小。正常的和腺瘤組織部位表現出不同的血紅蛋白濃度和有效散射體大小。這樣，漫反射可用來獲取活體內組織生化和形態信息。
本發明一個較好的具體實施涉及在粘膜組織反向散射光中檢測有定期波長的細微結構組成的系統。這種結構一般被漫射背景掩蔽，其必須移出以使結構可觀測。這種組成的起源是由于被上皮細胞核表面Mie-散射的光。通過分析定期結構的頻率和幅度，可獲得這些細胞核的密度和大小分布。這些量是生物組織中腫瘤癌癥前期變化的重要指示，這樣，這種技術可以為在進行內窺鏡檢查的患者中觀察這種變化提供有用的工具。
照射在組織表面薄層上的光不是完全隨機的。在這個薄層區域內可保留彈性散射過程的清晰度。襯于身體中空器官內的粘膜組織，一般包括上皮細胞薄表面層，由下面相對無細胞的結締組織支持。在健康的組織中上皮層常常由單一的、排列整齊的、端面直徑約10-20μm、高度約25μm的細胞層構成。在癌變和癌癥前期(異常結構)的上皮層中，細胞擴增，細胞層常常較厚并變得較緊密地堆積，細胞核增大，染色時表現較暗(過度染色)。這可能表示核酸密度增加，從而增加了折射指數。
本發明的一個較好具體實施使用寬帶光源照射組織中的有關區域，照射光范圍在350到700nm之間。可使用光纖探頭輸送和/或收集從組織來的光。這個系統可在患者進行內窺鏡檢查期間使用，在患者內光學監測體腔，從而消除作活組織檢查移出組織的需要，或者，能用來協助定位適于作活組織檢查的組織。
收集反向散射光較好地是在小角度范圍2度到12度之間，更好的范圍是在3度到8度之間。當使用光纖系統收集散射光時，光纖數值孔徑在0.05到0.22之間，較好可使用的在0.77到0.1之間的光纖。在這個范圍的收集角度減少背景光水平且不損失返回光中的定期組成。
附圖簡要說明

圖1是依據本發明的光纖探頭示意圖。
圖2是依據本發明的內窺鏡末端放大視圖。
圖3A，3B和3C演示了正常結腸細胞的細胞單層(R＝0.46)，T84細胞(R＝0.38)，(C)硫酸鋇漫射板(R＝1.0)的反射光譜。
圖4表示從圖3A和3B的數據推得的核大小分布，分別是正常結腸細胞，和T84細胞。在每個情況中，實線是從數據中得到的分布，虛線是用光學顯微鏡測得的分布。
圖5A，5B和5C分別是從Barretts食道獲得的，對正常部位(實線)，異常結構部位(虛線)和模型(粗實線)的漫反射反射光譜；對應的細微結構；和產生的核大小分布。
圖6圖示說明比較用標準病理學方法和依據本發明的光學方法分析的樣品。
圖7是依據本發明用于體外組織分析的系統。
圖8是演示依據本發明實施組織光學分析方法的流程圖。
圖9是含氧的(細線0)和脫氧的(粗線)血紅蛋白的摩爾消光系數譜(單位血紅素)。顯示在415，542和577nm(含氧血紅蛋白-HbO2)及在430和555nm(脫氧血紅蛋白-Hb)的特征峰值。
圖10是遞減散射橫斷面光譜σ’(λ)，使用Mie理論計算。表示出四種不同直徑的結果，ds(0.2，0.6，1.0和2.0μm)。光譜的斜度與直徑反比。假定散射微粒的折射指數為1.4，環境介質為1.36。
圖11表示在相應四種不同Hb濃度(a)0.0mg/dl，(b)50mg/dl(C)125mg/dl(d)250mg/dl下，在物理組織模型(粗線)上測得的漫反射光譜。也顯示了使用在制備物理組織模型中應用的相同光學參數的分析模型預測圖(細線)，分析模型與組織模型之間吻合的很好。
圖12表示典型正常組織的和腺瘤息肉的光譜(粗線)，及對于使用模型數據的最佳模式(細線)。Mie理論用來近似計算模型使用的遞減散射系數(見圖13)。
圖13表示從圖12中顯示的數據中得到的散射光譜(細線)，使用Mie理論的最佳模式(粗線)。Mie理論模式將有效散射體大小ds賦值給遞減散射光譜。與正常粘膜(ds＝1.5μm)相比，息肉的特點是有效散射體尺寸較大(ds＝0.35μm)。
圖14A-D表示從下列數據分析獲得的參數(A)總Hb濃度，CHb(B)Hb氧飽和度，α(C)有效散射體密度，Ps(D)有效散射體大小，dso觀察到的正常粘膜(方塊)和腺瘤息肉(星形)之間最大的區別是總Hb濃度。
圖15是總Hb濃度CHb對有效散射體大小ds的二元標繪圖。正常粘膜的數據趨于形成完好確定的數據簇，而腺瘤息肉的數據標記變化范圍較寬。
本發明的前述內容及其他目的，特性和優勢，在下面對本發明的較好具體實施的更具體的描述中會更清楚，如在所附示圖中顯示的，其中同樣的參考特性在不同考察過程中表示相同的部分。示圖沒有必要按比例，其重點是在演示本發明的原理上。本發明的詳細敘述本發明的一個較好具體實施涉及使用光纖系統輸送和收集從有關區域來的光，檢測表面層的一種或多種物理特性。這樣的系統如圖1所示。這個系統可以包括光源50如寬帶光源，光纖裝置10輸送和/或收集從組織來的光，監測器系統80監測從組織來的散射光，有存儲器122的計算機120分析及儲存監測到的光譜，和顯示器124顯示測試結果。透鏡60可用來將從光源50來的光連接到探頭10的激勵光纖30中。濾片110和透鏡系統90，100可用來將收集光有效地連接到光譜攝制儀70。與時鐘50和脈沖器150連接的控制器140控制光源50。
探頭10的末端15在圖2中顯示，其中中間激勵光纖30被六條外圍收集光纖20包圍。裝置的末端可包含在光罩25中，如在美國專利No.5,199,431中所描述的，其全文參考收入本篇。可以使用的其他內窺鏡檢查裝置如光針，如在上述參考專利中所描述的，或如在美國專利No.5,280,788中所描述的，其全文也參考收入本篇。
為了提供所需的測量材料的收集角度，收集光纖20較好地具有數值孔徑范圍為0.05到0.22。這樣有助于減少從散射光譜中移出且不損失定期組成的背景光。
收集光纖還可以由末端安裝影像傳感器35如電荷耦合裝置或CMOS造影器替換或補充，傳感器是像元(pixellated)結構的，對包含在記錄的散射光譜中的不同顏色敏感。有關使用末端安裝傳感器的其他詳細材料可在1996年11月12日提交的美國序列No.08/754,509中找到，其全文參考收入本篇。
用這個系統收集的反向散射光可分析確定上皮組織的某些物理特性。收集光和使用這種光確定的物理特性之間的關系在下面描述。
上皮細胞核可被表示為類球狀Mie散射體，其折射指數比周圍細胞質的高。正常細胞核的特征直徑是l＝4-7μm。相反，異常結構細胞核大小有20μm，占據幾乎全部細胞體積。這樣，在可視范圍內，波長λ＜＜1，由細胞核散射的光組成會表現出波長定期性，其清晰度取決于細胞核大小的分布。可使用Van de Hulst近似法描述細胞核的光散射橫斷面σs(λ,1)=12π12⟨1-sin(2δ/λ)δ/λ+⟨sin(δ/λ)δ/λ⟩2⟩----(1)]]>其中δ＝πlnC(n-1)，nC是細胞質的折射指數，n是細胞核相對于細胞質的折射指數。
當一束光照射到組織的上皮細胞層上時，這束光部分從上皮細胞細胞核反向散射，而剩余部分穿過到較深組織層中，它經過多重散射變成隨機的。所有這些沒有被組織吸收的漫射光最終返回到表面，再一次穿過上皮細胞層，它再一次被細胞核散射。這樣，產生的光包括大量漫射背景光加上從上皮層內細胞核正向散射的和反向散射的光的組成。對于含有大小分布為N(1)的細胞核[單位面積(mm2)和核直徑(μm)單位間隔的細胞核數]的薄層上皮組織，光學探頭以可接受的固定角度ΩC收集的反射系數R(λ)的傳遞方程的近似解由下列表達式表示1.粘度使用一Brookfield粘度計(HAT系列)，具有一8C4-27芯軸的5C4-13R室。這種布置是由一0.465英寸(1.12cm)的芯軸“測錘”組成。樣品室的內徑為0.750英寸(1.87cm)。在65℃(149°F)下校準該儀器，并在65℃(149°F)下測定所有樣品。
將待測定的14.0克組合物樣品放置在樣品室中。然后將該樣品室插入帶夾套室夾持器中。為了補償通過管線等的熱量損失，進入夾套室夾持器的水的溫度應略高于所需樣品溫度65℃(149°F)幾度。當樣品溫度達到65℃(149°F)之后，將樣品以50rpm預剪切5分鐘。然后將速度變為100rpm，在刻度盤讀數停留在一恒定值之后進行測定。在100、50、20、10和5rpm下記錄總共5個級別的讀數。通常，讀數之前的時間應如表I所示。表I
將刻度盤讀數和rpm分別乘以17和0.34從而轉變成剪切應力和剪切速率值。根據本發明的組合物的粘度是在20rpm或6.8秒-1下測定的。剪切應力的平方根與剪切速率的平方根的關系曲線為一條直線。刻度盤指針超過滿刻度值的讀數忽略不計。對這些數據進行最小平方線性回歸以計算其斜率和截距。
使用該數據計算兩個值。第一個值是塑性粘度，它等于直線斜率的平方。塑性粘度是在無窮大剪切速率下測定的組合物的粘度。它精確地預測在泵送、移動或混合時流動的阻力。測得的Casson塑性粘度以泊計。
第二個值是致流力值，它與X截距(橫坐標)的平方相等。該致流力值是使產品開始移動所必需的力或剪切量。該致流力值以dynes/cm2計。方程顯示上皮細胞核將定期細微結構組成引入到與波長有關的反射率中，與相應的散射橫斷面的反射率相似。其定期性與核直徑成近似比例，其幅度隨上皮細胞層中細胞核的數量和大小的變化而變化。這些量可通過分析反射率R(λ)確定。
作為方程式(2)所表示的結果的實例，測量并分析從正常T84腫瘤人類結腸細胞單層(分別為10和12部位)散射的彈性光。這些細胞約15μm長，在緩沖液中粘貼在玻璃片上，并放置在硫酸鋇(高反射的)漫射板上。硫酸鋇板用來近似計算下層組織的漫反射率。正常細胞核的直徑通常范圍在5到7μm，而腫瘤細胞在7到16μm。
光學纖維探頭用來將白光從氙弧光閃光燈輸送到樣品，并收集返回反射信號，如圖1所示。探頭頂端，直徑1mm，由被六條收集光纖包圍的中心輸送光纖構成，所有這些由1mm厚的石英光罩覆蓋。光纖是200μm的核心熔融石英，NA＝0.22(Ωi＝Ωc＝πNA2)。為了消除鏡面反射，探頭對正常組織傾斜17度。在鄰近端，收集光纖排列成直線并在光譜攝制儀的輸入口上成像。二極管陣列監測器記錄從360到685nm的反射光譜。
圖3A和3B分別表示正常組織和T84腫瘤細胞樣品校正反射率R(λ)/R(λ)。光譜特征的不同是顯然的。為了作比較，硫酸鋇板自身的反射光譜在圖3C中演示。這個光譜缺少結構并沒有表現顯著特征。
為了從反射率數據中獲得有關核大小分布的信息，方程式(3)需要轉換。核大小分布N(l)，可從光距離τ-τ0≌(1-R(λ))/q的定期組成的傅立葉(Fourier)變換中獲得。參數q＝1-b0-f0+(b1-f1)與正向和反向散射有關，并與探頭幾何形狀，射入光的角度分布和反射光有關。在這個具體實例中q≈0.15。通過引入有效波數k＝2πnc(n-1)/λ-k0，和k0＝2πnc(n-1)/λmax，k＝27πnc(n-1)<λmin-1-λmax-1>我們可以獲得k0＝27πnc(n-1)/λmax，k＝2πnc(n-1)<λmin-1-λmax-1>(4)方程式(4)用來分析數據。為了排除亂真振蕩，通過用高斯濾過函數褶合進一步處理N(l)。圖4中的實線表示從圖3A和3B推得的正常組織和T84細胞單層樣品的核大小分布。使用核-對-細胞質相對折射指數n＝1.06，細胞質折射指數nc＝1.36。虛線表示通過光顯微鏡形態測得的對應大小分布。大小分布可以用高斯分布近似計算。參數在表1中列出。對于正常組織和T84細胞樣品，測得的大小分布與推得的吻合的很好。
表1正常細胞 腫瘤T84細胞
在胃腸內窺鏡檢查期間，人類受試體食道和結腸粘膜的漫反射中的定期細微結構可以測得。在Barretts食道情況中，其中上皮層包括胞單層柱狀細胞，與使用在細胞培養試驗中的相似，如在細胞培養研究中一樣收集數據。光纖探頭插入到內窺鏡活組織檢查槽中，并實施與組織表面接觸。本文所描述的方法也可用來檢測其他GI組織的結構特性，如在腹腔，子宮，膀胱內的組織和皮膚。
細微結構組成，其是細胞核的散射信號，一般少于整個信號的5％，并且一般被從下層組織來的漫反射背景光掩蔽，由于吸收和散射，其自身表現出光譜特性，如圖5A中所示。它的光譜特性被典型的血紅蛋白和膠原質散射吸收帶占據。為了觀察到細微結構，這個背景必須排除。吸收帶長度，μa-1，范圍從0.5到250mm隨波長的變化而變化，有效散射長度(μs’)-1范圍從0.1到1mm。這樣，在減去或排除背景信號時，散射和吸收不得不都考慮。
為了表示背景光照射在組織上的光假定是指數遞減的，在任何給定的深度，z，一定量的與消減散射系數μa成比例的光被散射回表面并進一步指數遞減。因為光的遞減取決于散射和吸收，所以遞減系數假定是吸收系數μa和有效散射系數的μa(e)＝βμs’的和。參數β通過比較Monte Carlo仿真和更精確的光輸送模型來確定，得到β＝0.07。因為光僅穿透到組織中1mm，所以大多數漫反射返回的光被限制在粘膜層。
因此組織表示為兩層介質，忽略從低層漫反射回的光。那么可獲得有關撞擊在上皮細胞層的從下層組織漫射的光的近似表達式Id(λ,s)=F(s)⟨Ii(λ,s)⟩Ωi1-exp[-μx(e)+cμ0L]1+c(μa/μs(e))----(5)]]>F(s)是Lambertian(亮度)函數表示從粘膜層產生的光與角度的關系，L是表示粘膜層厚度的參數，c，是血紅蛋白的濃度，我們發現與膠原質相比它是主要的吸收體，它是光散射的主要原因。因為含氧和脫氧血紅蛋白都存在，所以總的血紅蛋白吸收作用表示為
其中氧飽和度參數為α(0≤α≤1)。
圖5A表示從兩個Barretts食道組織部位得到的反射光譜，兩個都獨立地用標準病理學分析診斷顯示(1)正常的(2)癌癥前期(即低等級異常結構)。如可以看到的，在這些未處理的光譜中區別很小。為了分析它們，通過改變參數c，α和L，方程式(5)首先適合數據的主要特性。如在圖5A中所看到的，結果模型相當精確。通過計算R(λ)/R(λ)排除這種漫射背景結構后，定期細微結構在圖5B中表示出來?？梢宰⒁獾綇漠惓＝Y構部位得到的細微結構比從正常部位得到表現出較高頻率內容。然后使用方程式(4)推得各自的核大小分布，得到圖5C。正常組織和異常結構組織部位的區別很明顯。從異常結構部位獲得的細胞核分布比從正常部位獲得的要寬的多，并且峰值直徑從約7μm移到約10μm。此外，大細胞核(＞10μm)的相對量和細胞核的總量都顯著地增加了。
根據計算機的分析，推算核大小數據的上述方法的不確定性估計為5％到30％，取決于噪音水平和模型的精確性。對正常的細胞核和異常結構細胞核使用相同的折射指數計算分布。這一點不是完全正確的，因為在染色的組織斷面中異常結構細胞核表現出過度染色，這可能說明折射指數增加了。這樣，從異常結構部位測得的分布中的大細胞核的相對量可能有點過高估計了。
能檢測活體中核大小分布，在臨床醫學應用中具有很大價值。擴大的細胞核是癌癥，異常結構和細胞再生的最初表現。此外，對不同大小細胞核的檢測能提供有關存在具體細胞的信息，這樣能起到，如作為生物組織發炎反應的一種指示。這說明粘膜層中不同的形態/病理狀況產生了核分布的不同模式。
已發現的對區分Barretts非異常結構和異常結構上皮組織有用的物理特性是細胞核的總量和大細胞核(1＞10μm)的百分比。因此，比較對樣品的病理分析和光學分析可以得到圖6中的示圖(細胞核總量對直徑大于10μm的細胞核的百分比)。從50個部位獲得的，對于這個分析的累積靈敏性和特異性，分別是83％和100％。這項研究的正預測值(positive predictive value)是100％。由n’s表示的點是正常的或是發炎的，由d’s表示的點是異常結構的。范圍20-30％的百分比發現是對這種類型的精確診斷，25％使用在這個具體實例中。
用來收集從激勵組織樣品反向散射光譜數據的，使用光譜攝制及電荷耦合裝置(CCD)，CMOS或其他集成固體造影陣列的光譜攝制系統300的較好具體實施在圖7中演示。
系統300可使用寬帶光源或可調激光314來照射樣品46。光源314產生光束316，光束用鏡子318定向，通過聚焦鏡片320將光束撞擊在安裝在散射底物325上及透明窗321之后的樣品46上。光束以射入角聚焦在樣品上。收集角330可以通過光孔徑或瞄準儀確定，在2度和12度之間，較好地在3度和8度之間。
部分由樣品46發出的散射光322被收集鏡片324相對于射入光小的角度收集。在另一個較好的具體實施中射入光和收集光角度能沿用單一共同的軸。收集鏡片324為光譜攝制儀310瞄準及F/調配收集光。在進入光譜攝制儀310入口狹縫之前，收集光穿過一組消減收集光中不需要的散射組成的濾片326。
圖8演示了對從有關材料如組織獲取的散射光譜收集及分析的一般處理過程400。這種方法可以使用顯微鏡系統或使用如圖7所示的彩色造影系統在體外實施，或在患者體內實施。從光源來的照射光402可使用輻射光范圍300nm-200nm，包括紅外線范圍。收集404和監測406輻射光之后，可以排除漫射背景光408并計算所需特性。這些結果可用來對有關區域進行診斷。
本發明的一個較好具體實施是根據具有固定輸送和收集幾何形狀的光學纖維探頭收集的數據，使用一種分析方法。數據分析采用光漫射，或更直接地使用模型來分析組織光譜，在漫反射光譜和包括散射和吸收體的具有已知光學特性的物理組織典型之間建立一致性。通過使用分析公式分析從這種組織模型獲得的光譜，提供簡單轉化及精確預測散射體和吸收體濃度的校準系統。一旦這種校準系統建立，這個方法就適用于組織光譜。
下面涉及對體內組織粘膜表面使用光譜分析。在這個實例中檢測的是腺瘤結腸息肉，結腸癌的前體。這些息肉是結腸異常結構的一種形式，組織上類似于視覺上不可檢測的平坦異常結構，但可容易地檢測出來。與標準組織學試驗相關的結果，可用于疾病的早期檢測，最重要的是，示例了怎樣能在體內使用這種光譜攝制方法來獲得形態學和生化信息。
對13個患者實施常規的結腸內窺檢查，體內收集從腺瘤息肉來的漫反射光譜。數據與多-激勵熒光光譜同時收集使用脈沖持續時間10μs平均輸入能量4Ji/脈沖的氙弧光閃光燈作為白光光源。造影光譜攝制儀分散收集的光，使用門二極管陣列監測器作光譜范圍在360-685nm的光監測。使用與燈脈沖同步的12μs門最小化內窺鏡檢查照射來的背景光。監測器由筆記本電腦控制，數據在其中轉換及儲存。
使用光學纖維探頭輸送及收集光，探頭通過結腸內窺鏡的附件槽前置，并實施與組織接觸。探頭包括用于光輸送的中心光纖，被六條用于光收集的同中心光纖包圍著。所有光纖核心直徑200μm，NA＝0.22。探頭頂端安裝有石英光罩長和直徑約1.5mm，其用統一的圓形輸送及收集點，以重疊錐形形式，半徑分別約為rd＝0.35mm和rc＝0.55mm，提供固定的輸送/收集幾何形狀。頂端以角度17度傾斜，以消除從光罩/空氣界面來的不需要的反射光譜。
20％體積比硫酸鋇粉末懸浮液的漫反射光譜用作參考，以考慮氙燈的光譜特性和總強度。探頭浸入到懸浮液中，在收集每個數據組前記錄參考漫反射光譜。通過用這種參考光譜劃分校準組織光譜。在每個腺瘤息肉的幾個不同部位及在周圍正常粘膜上相應部位測得漫反射光譜。為了避免運動產生的人為影響，使用單一脈沖激勵。然后將息肉移出并作組織檢查，而正常粘膜部位不作活組織檢查。
為了表示漫反射系數，生物組織近似作為均勻半無限混亂介質，遞減散射及吸收系數分別為μs’(λ)和μa’(λ)(λ是光的波長)。部分射入光被組織吸收，而未被吸收的部分經過多重散射，最終從表面作漫反射產生。用探頭收集一定量的返回光，而余留部分逃逸光未被檢測。收集光的量取決于光學特性μs’(λ)和μa’(λ)，也取決于探頭直徑rP。因為rP是限定的，它作為衡量長度，使μs’(λ)和μa’(λ)分別得到確定。
為了描述由光學探頭收集光的特點，需要確定組織表面上漫反射的空間和角度的知識。使用造影方法實施輻射轉換方程漫射近似計算法，在從半無限混亂介質的表面上的光射入點的r距離上，漫反射半徑密度，R(λ，r)表示為R(λ,r)=Z0μs4πμs+μs{(μ+lr1)e-μr1r12÷(1+43A)(μ+1r2)e-μr2r22-----(6)]]>其中μ=(3μa(μa-μs′))1/2,z01μs′+μa]]>r1=(z02+r2)1/2,r2=(z02(1+23A)2+r2)1/2]]>參數A取決于介質的折射指數n(n＝1，A＝1；n＞1，A＞1)。對結腸組織的平均折射指數的合理假定是n≌1.4，則A≌3.2。
為了得到由探頭收集光的總量，方程(6)必須對半徑分別為rd和rc的輸送及收集面積的整個空間延伸積分。假定在整個輸送面積的射入光強度是統一的，由探頭收集的漫反射系數Rp(λ)表示為R0(λ)=1rd2∫0rcrdr∫02πdΦ∫0rdR(λ,r‾-r‾)r′dr′----(7)]]>其中|r′|＝(r2+r2-2rr′cosΦ)1/2。
方程式7的積分可數值上估計。然而，為了得到Rp(λ)簡化解析表達式，我們假定尖端輸送光(rp＝0)半徑rc圓形一圈點收集光，那么我們得到Rp(λ)=2π∫0rcR(r)rdr]]>=μs′μs′÷μa{e-μz0×e-(1+13A)μa0-z0e-μr′r1′-(1+43A)z0e-μr2′r2′}----(8)]]>其中r2′=(z02+rc2)1/2,r2′=(z02(1+23A)2+rc2)1/2]]>
通過在已知特性的物理組織模型上校準方程式8確定rc的最優值。使用方程式8的優點是它比方程式7更容易轉化，方程式7需要數值積分。方程式8給出組織表面垂直方向的漫反射系數。因為由探頭收集的光的方向與表面垂直方向最大偏差僅約10度，所以這一點是可以接受的。
方程式8可用來分析由探頭收集的光譜的漫反射系數。在對組織光譜的檢測中，血紅蛋白是光譜可視范圍內在結腸組織中唯一顯著的光吸收體，并且以含氧和脫氧的形式都測得。兩種形式的光吸收特性已作了研究，它們的摩爾消光系數譜∈Hbo2(λ)和∈Hb(λ)在圖9中演示。含氧血紅蛋白吸收作用在415nm最大，兩個第二大值在524和577nm，而脫氧血紅蛋白在430nm最大，僅有一個第二大值在555nm?？偽障禂郸蘪(λ)表示為μu(λ)=2.3Chb′(αϵhbo2(λ)+(1-a)ϵhb(λ))----(9)]]>其中
是Hb氧飽和度參數，Chbo2和CHb分別是含氧和脫氧Hb的濃度，C’hb＝Chbo2+CHbHB的總濃度。
用下列方法確定CHb和α。對于給定組織光譜，Rp(λ)，指定初值(通常CHb＝0.0，α＝0.5)。然后將方程式8數值轉化得到μs’(λ)，其表現出HB吸收作用的殘留光譜特性。然后修正參數CHb和α，這個過程遞歸重復直至μs’(λ)顯示出沒有Hb光譜特性的平滑譜形。用這種方法，μs’(λ)與CHb和α同時確定。
表2<
>上面的方法是基于假設μs’(λ)是波長相對平滑的函數，其分析有效，將成為下面討論的根據。通常，μs’(λ)是組織多種散射體的總貢獻。不幸的是，有關那些個體散射體的詳細信息沒有獲得。這樣，μs’(λ)可表示為μs(λ)＝ρsσ(λ)(10)其中ρs是有效散射體密度，σ’(λ) 是有效遞減散射橫斷面，即組織散射特性以平均方式模擬，即如組織包含單一明確定義的類型的散射體。通常，σ’(λ) 取決于折射指數，散射體的形狀和大小，以及環境介質的折射指數。對于直徑ds的球狀散射體，可采用Mie散射理論數值計算σ’(λ) 。
圖10表示這樣計算的σ’(λ)?？勺⒁獾溅摇?λ) 傾斜度與ds簡單相關，即傾斜度與散射體大小成反比。用這種方式，對每個σ’(λ)賦值散射體大小是可能的，從而在ds＝0.2-2.0μm范圍內對每個μs’(λ)賦值散射體大小。如，通過檢查正常結腸粘膜的μs’(λ)，根據體外檢測的預先記錄，可以看到它們對應散射體大小ds＝0.35μm。一旦ds確定，密度ρs可通過用μs’(λ)除以σ’(λ)得到?？傊?，對每一個組織漫反射光譜都得到四個參數CHb，α，ρs和ds。
在計算圖10中所示的結果中，散射體和環境介質折射指數假設與在組織中可能確定的折射指數相同。對散射體合理的近似值是折射指數約1.4，對環境介質是約1.36。通過指出由水的折射指數所定的組織折射指數低限，在可視范圍約為1.33，以及記錄的軟組織最大折射指數所定的高限，約1.45，這些值可得到證實。這些值與通常對軟生物組織觀察得到的數據相符。
物理組織典型可作為證實演變方程式8中產生的各種近似算法的可行性的一種方法。樣品包括各種濃度的含Hb的球狀微粒的混合物。建立的模型使混合物模擬組織樣品的光學特性。此外，建立了分析模型在光學特性方面的有效性范圍，以及參數r的最佳值，方程式8被確定。
在去離子水中的聚苯乙烯珠懸浮液(聚合科學，公司)用來模擬組織的光散射，從凍干人類Hb(Sigma，H0267)制備的Hb溶液用來模擬吸收作用。采用Mie理論計算珠的散射特性。珠直徑是1.07μm，聚苯乙烯折射指數np從表達式np＝15607+10002/λ2(26)，(λ是nm)得到，聚苯乙烯濃度是0.625％體積比。遞減散射系數在400nm從約1.7mm-1變化。這種光譜曲線與圖10中所示的ds＝1.0μm的曲線相似，不同的是由于聚苯乙烯的折射指數較大，所以傾斜度較大。
因為聚苯乙烯的光吸收作用在可視范圍內可以忽略，所以吸收作用僅僅歸因于含氧血紅蛋白。物理組織模型約3×3×0.5cm，模擬正常結腸粘膜的平坦幾何形狀。其他幾何形狀也作了研究，如1cm高0.5cm直徑的柱狀幾何形狀，模擬息肉的幾何形狀，但沒有發現顯著的光譜區別。使用的光學參數范圍是根據體外實施的結腸組織光學參數預先記錄的獨立測量選取的。
圖11表示不同濃度的Hb下物理組織模型上測得的漫反射光譜與分析模型所預測的相比，預測結果是通過設定方程式3中rc＝0.45mm獲得的。這被認為是rc的最佳值，在整個數據分析過程中保持固定。還發現參數Z0＝1/(0.6μd+μs’)提高了分析模型和物理組織模型數據之間的吻合，特別對于吸收值大的情況。在圖11中所示的物理組織模型光譜與在下面顯示的組織光譜非常相似。這個事實間接證實了在演變模型中所作的有關組織散射體(模擬作微粒)和組織吸收作用(歸因于Hb)的假設。
對于在有關的生理學范圍內的Hb濃度，發現分析模型精確地預測了物理組織模型光譜。對于Hb濃度低于100mg/dl的情況，兩個模型之間的偏差在整個波長范圍內一直小于10％。最大的偏差出現在當吸收作用變得與散射作用可比的時候。這顯示在圖11的曲線(d)中，鄰近Hb吸收作用的峰值，約415nm處。這時Hb的濃度是250mg/dl，在415mm處對應吸收系數約5mm-1，而在相同的波長下散射系數為約2.8mm-1。
圖12表示從一個腺瘤息肉部位和一個正常粘膜部位獲取的典型漫反射光譜。可容易地觀察到顯著光譜區別，特別在光譜的藍光區域，其中在約420nm處的Hb吸收波谷是光譜的顯著特征。這個波谷在息肉光譜中特別顯著，其還顯示出從光譜的紅光區域(約700nm)開始向綠光區域(約500nm)強度持續降低，而在正常粘膜光譜的相同區域表現出強度穩定增加。含氧血紅蛋白的第二吸收波谷(542和577nm)在腺瘤息肉光譜中也非常顯著，顯示增加的Hb濃度。依據模型分析，正常粘膜光譜的特點是Hb濃度CHb＝22.5mg/dl，而腺瘤息肉的相應值為約6倍高(CHb＝165mg/dl)。發現的Hb飽和度分別為0.65+-0.05和0.55+-0.05。
圖13表示從圖12中所示的數據計算出的散射光譜μs’(λ)，以及最佳Mie理論模型。在光譜中觀察到的兩種組織類型之間光譜的主要區別是傾斜度，其對應不同的預先散射大小，對于息肉ds＝1.5μm，對于正常粘膜ds＝0.35μm。確定的散射體密度值，正常粘膜為ρs＝1.5×108mm-3，腺瘤息肉為ρs＝1.3×108mm-3。圖12還顯示使用方程式8適合數據的最佳分析模型。盡管存在兩種組織類型間光譜形狀的顯著區別，及μs’(λ)是通過假定球狀散射體均勻分布近似計算的事實，模型還是精確地描述了數據。數據和模型之間的偏差對于大部分波長范圍一般小于10％。
圖14A-14D表示對所有研究的組織部位四個參數的計算值(A)Hb總濃度CHb(B)Hb氧飽和度α(C)有效散射體密度ρs(D)有效散射體大小ds。腺瘤息肉明顯特點是增加的Hb濃度，而在Hb氧飽和度方面沒有可觀察到的不同。雖然兩種組織類型間這些參數分布有顯著重疊，在腺瘤息肉中有效散射體密度一般較低，有效散射體大小較大。表2總結了圖14A-14D中所示的結果，并給出了每個參數的平均值和標準偏差。
圖15表示Hb濃度CHb對有效散射體大小ds的標繪圖。將兩組參數一起顯示，是為了總結和演示在結腸中正常粘膜和腺瘤息肉的散射和吸收特性中發現的區別?？勺⒁獾降?，對于有效散射體大小和Hb濃度，正常粘膜數據趨于形成簇，而腺瘤息肉數據分散，特點是廣泛分散不規則分布。
根據漫反射測量，提供有關體內結腸粘膜組織定量信息的方法已作了描述。這種方法的主要組成是(a)用有固定輸送/收集幾何形狀的光纖探頭收集數據，(b)根據光漫射進行數據分析的分析模型，(c)校準分析模型的物理組織模型。
使用有固定幾何形狀的光學探頭能使數據收集一致，并分別確定散射和吸收。造型探頭幾何形狀可通過使用參數rc變得更為方便，其也可限定探頭對吸收的敏感性。rc大的探頭與rc小的探頭相比會使得收集的光譜對組織吸收作用更敏感。在圖4中，在正常粘膜的光譜中幾乎不能看到Hb第二吸收峰值rc大的探頭會使這些特征更顯著。
分析漫射理論模型適合于數值上轉化，并在由聚苯乙烯珠和含氧血紅蛋白的物理組織模型上校準后成功地描述了組織數據。其他研究者已經使用了本文所描述的分析模型的變通體，研究IR范圍內物理組織模型和組織的漫反射。據我們了解，本研究是第一個在可視范圍內，對用光纖探頭測得的從人類粘膜組織獲取的體內數據使用該模型。在可視范圍內實施而不是在IR范圍，光穿透限制在約0.5mm，即癌癥前期變化出現的粘膜層。使用這種模型，我們已經顯示可能獲取有關所研究組織的定量信息，如Hb濃度，Hb氧飽和度，有效散射體大小和有效散射體密度。結果顯示漫反射為定量分析體內粘膜組織表面提供了一種工具。
在模型中作的基本近似是，在光譜的可視范圍內在結腸粘膜中Hb是唯一的顯著吸收體，雖然這種假定缺少直接證實，但數據有力地表現出Hb吸收作用特征的事實，清楚地說明Hb是主要的吸收體。此外，在組織物理模型上測得的光譜中Hb是唯一的吸收體，非常類似組織光譜。
用同樣的方式，組織散射被模擬為是由于已知折射指數的均勻球狀散射體的散射。這種近似使得可以定量描述量兩個基本參數，有效散射體大小和有效散射體密度。這些參數提供了平均散射特性評估。在物理組模型上測得的光譜再生實際組織光譜的事實，再一次(如在Hb情況中)可作為這種近似有效性的間接證實。
數據分析顯示腺瘤結腸息肉特點是Hb濃度增加。已經知道腫瘤和癌變組織表現出微脈管系統增加，從而血液含量增加。使用形態測定法和脈管鑄法與掃描電子顯微鏡技術結合，癌癥前期組織如結腸腺瘤息肉也有上面微脈管量增加的特點，與觀察到有關Hb濃度增加的報告相符。結腸粘膜的微脈管增加的其他報告與Crohn疾病和潰瘍性大腸炎有關。雖然我們沒有研究這些組織類型，本文所用的技術可以證明對體內研究這些疾病是有用的。
對于正常粘膜和腺瘤息肉，Hb氧飽和度發現平均為約60％。這個結果是合理的，因為測量基本上是在粘膜的毛細管網中實施的，在這里氧從Hb轉移到組織中。Hb氧飽和度在毛細管內下降從約97％(動脈血)到約40％(靜脈血)，測量值(約60-60％)適于放在這個范圍中間。在兩種組織類型間沒有觀察到區別的事實，可能能歸因于腺瘤息肉新陳代謝沒有被顯著改變的事實，至于解釋Hb氧含量的變化，這可能涉及這樣組織的擾亂的新陳代謝。本文提供的技術能用在體內進行中空器官的表面腫瘤的研究，或進行需要Hb飽和度知識的其他組織類型的研究。
可觀察到兩種組織類型間散射特性的內在區別。對于腺瘤息肉，與正常粘膜相比，平均有效散射體尺寸較大，平均有效散射體密度較小。有多種假設確定來自不同微結構，血管外的如膠原纖維，和血管內的如線粒體和細胞核對散射的貢獻。在腺瘤息肉內，一種模型提供血管內結構對光散射的貢獻是增加的，這是因為細胞占據較大的體積比例。此外，為了能貢獻光散射，其中膠原質很濃密地堆積的亞粘膜，一般位于遠離息肉表面的位置。只要平均血管內散射體比血管外散射體大，就可以用來解釋在腺瘤息肉中較小的散射體密度。等同物雖然本發明已參考其較好的具體實施作了具體地演示和說明，但此領域中的技術人員可以理解，在沒有背離如所附權利要求界定的本發明的精神和范圍的情況下，可以有很多在形式上和細節上的變通。此領域中的技術人員僅需常規試驗可識別或能確定，許多本文具體描述的本發明的特別具體實施的等同物。這樣的等同物包括在權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種檢測組織層內結構大小的方法，該方法包括對組織層內的有關區域進行照射；收集從組織來的光；檢測收集的光；以及確定組織層內結構的大小。
2.根據權利要求1的方法，進一步包括確定有關區域是否包括異常結構組織。
3.根據權利要求1的方法，進一步包括使用光纖探頭對組織進行照射。
4.根據權利要求1的方法，進一步包括用光纖探頭收集從組織來的光。
5.根據權利要求1的方法，進一步包括確定有關區域內細胞核的平均核大小。
6.根據權利要求1的方法，進一步包括檢測有關區域內組織細胞核直徑。
7.根據權利要求1的方法，進一步包括檢測隨波長變化的從組織來的光強度的定期組成。
8.根據權利要求7的方法，進一步包括從定期組成確定組織中的細胞核的大小。
9.一種光學檢測組織的方法，該方法包括對被檢測的組織的有關區域進行照射；收集從組織來的光；以及檢測隨波長變化的收集光的定期組成以確定組織的物理特性。
10.根據權利要求9的方法，進一步包括確定有關區域是否包括異常結構組織。
11.根據權利要求9的方法，進一步包括使用光纖探頭對組織進行照射。
12.根據權利要求9的方法，進一步包括用光纖探頭收集從組織來的光。
13.根據權利要求9的方法，進一步包括確定有關區域內細胞核的平均核大小。
14.根據權利要求9的方法，進一步包括檢測有關區域內組織細胞核直徑。
15.根據權利要求9的方法，進一步包括用內窺鏡收集光，內窺鏡在其末端有造影傳感器。
16.根據權利要求9的方法，進一步包括從定期組成確定組織中的細胞核的密度。
17.一種確定在組織中存在異常結構的方法，該方法包括對組織上皮細胞層的有關區域進行照射；收集從組織反向散射的光；用監測器監測收集的光；以及確定組織的有關區域內異常結構的存在。
18.根據權利要求17的方法，進一步包括確定是否有關區域包括異常結構組織。
19.根據權利要求17的方法，進一步包括收集350nm到700nm的光。
20.根據權利要求17的方法，進一步包括用光纖探頭收集從組織來的光。
21.根據權利要求17的方法，進一步包括確定有關區域內細胞核的平均核大小。
22.根據權利要求17的方法，進一步包括檢測有關區域內組織細胞核直徑。
23.根據權利要求17的方法，進一步包括檢測隨波長變化的從組織來的光強度的定期組成。
24.根據權利要求17的方法，進一步包括從定期組成確定組織中的細胞核的大小。
25.一種光學檢測材料的方法，該方法包括對被檢測的組織材料中的有關區域進行照射；收集從材料來的光；監測收集光的散射光譜；以及檢測隨波長變化的收集光的定期組成以確定材料的物理特性。
26.根據權利要求25的方法，進一步包括使用光纖探頭對材料進行照射。
27.根據權利要求25的方法，進一步包括用光纖探頭收集從材料來的光，探頭光纖數值孔徑在0.05-0.25范圍內。
28.根據權利要求25的方法，進一步包括確定有關區域內細胞核的平均核大小。
29.根據權利要求25的方法，進一步包括檢測有關區域內的單位面積的顆粒數。
30.一種光學檢測組織的設備，該設備包括照射在要檢測組織中有關區域的光源；收集從組織來的光的光學系統；感應收集光的監測器；以及確定隨波長變化的監測光的定期組成以確定組織物理特性的數據處理器。
31.根據權利要求30的設備，進一步包括產生350-700nm范圍的光的寬帶光源。
32.根據權利要求30的設備，進一步包括連接光源和組織的光纖探頭。
33.根據權利要求30的設備，進一步包括以2到12度間的收集角度收集光的光纖探頭。
34.根據權利要求33的設備，其中探頭可插入到內窺鏡中。
全文摘要
一種檢測材料的一種或多種物理特性的設備,用由組織散射的光,來確定如組織層中的細胞核大小。該設備包括光纖裝置(10,20,30)輸送并收集從有關組織區域來的光,來確定如組織是否是正常的或是癌癥前期的。
文檔編號A61B5/00GK1278153SQ98810747
公開日2000年12月27日 申請日期1998年10月9日 優先權日1997年10月10日
發明者利維·T·珀瑞爾曼, 瓦帝姆·貝克曼, 邁克·S·費爾德, 喬漢·祖尼奧斯, 歐文·艾特澤肯, 拉瑪薩米·曼奧哈蘭 申請人:麻省理工學院