活性成分的新脂質體載體的制作方法

專利名稱：活性成分的新脂質體載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于活性成分穩定的，呈粉末狀的脂質體，更具體講，該活性成分對消化和/或血漿的降解是敏感的，例如蛋白質，本發明還涉及所述脂質體作為醫藥產品的應用。
眾多載體已被提議用來保護脆弱的活性成分；其中，可提到的有脂質體，它已被考慮作為入選的載體。
脂質體口服的首先研究尚未被下結論(Deshmukh DS.et al.，LifeSciences，1981，28，239-242)。所得結果指出，具有下列配方二乙醚卵磷脂(未消化的卵磷脂同系物)/膽固醇-7∶1可對包封的肽有胃腸道保護，但它不能過腸道屏障。
有幾種理由可提出來解釋通道的不存在脂質體過分地大和未校準的尺寸，結構的低穩定性，或被包封的化合物滲透到脂質體介質外。
最近，Robert Greenwood的研究組(Drug Dev.and Ind.Pharm.，1993，19，11，1303-1315)在美國Campbell大學已經成功地指出，脂質體載體化的胰島素的十二指腸插管，導致高度的低血糖效應，這比游離胰島素溶液的十二指腸插管所得的結果要高。
已進行許多試驗，以獲得具有良好運送活性成分能力的脂質體，特別是就活性成分的吸收百分率的作用以及脂質體的穩定性和活性成分的生物利用度而言。可提到的這方面研究有——S.B.Kulkarni et al.(J.Microencapsulation，1995，12，3，229-246)指出參與脂質體醫藥產品微包封的因素為脂質體的大小，脂質體的類型，脂質體的表面電荷，雙層的剛性，加入的包封佐劑。從評價角度講含有幾個雙層并具有100nm-20mm直徑MLVs(多片層囊泡)對包封與雙層作用的疏水性醫藥產品是需要的；而含有單一雙層并具有粒徑100-1000nm的LUVs(大的單片層囊泡)則最適用于包封親水性醫藥產品。
——I.De Miguel et al.，(Biochemica et Biophysica Acta，1995，1237，48-49《sic》)提議由一種內核組成的毫微粒子，內核由交聯的多糖形成，后者用脂肪酸移植到其外表上，并被一層磷脂所包圍；——P.S.Uster et al.，(FEBS Lettters，1996，386，243-246)建議在經過初步加工的脂質體中，植入用聚乙二醇修飾的磷脂，以改善其生物利用度。
有關肽類口服的一系列實驗已被進行，并采用了不同的脂質體包封法或者用通過移植親脂性官能團對脂質的活性成分作改良。在所有情況中，目標是將脂質活性成分轉變為“前藥”；該前藥具有抵擋胃腸道運送的性質，即，耐胃中pH，耐生理去污劑(膽汁鹽)，耐蛋白酶(腸內肽鏈端解酶和肽鏈內切酶)以及耐通過腸內菌絲產生的代謝。例如，跨過1，3-甘油二酯的2-位到五肽上面，使得如此修飾的藥物的這些性質成為可能。
可是，先有技術的各種各樣脂質體如不修飾活性成分不能既獲得良好穩定性以及可以接受的活性成分包封產率，又獲得所述活性成分口服生物利用度的明顯改進，并由此保留活性成分所有的功能和性質。術語“生物利用度”意指藥物的藥理學活性形式達到全身循環時吸收劑量的程度和速度的綜合參數。
J.C.Hauton描述了帶有凝膠化內核的脂質體(商品名lipogelosomes)，其懸浮在含有凝膠化物質的水相介質中，特別是他已經開發一種制造這種脂質體的方法(歐洲專利0 393 049)，其不同于常規的脂質體在于包封的水相呈半固體的凝膠狀，而不是液體狀，這防止了脂質體在碰撞時熔化。這種lipogelosomes完全從天然物質產生而得，因此將不可承受的風險降低到最低限度。具體講，在歐洲專利0 393 049中，這些lipogelosomes由一種雙層界面相所組成，在單層lipogelosomes或許多雙層界面相情況下，其是中心疊架的，在多層lipogelosomes以及凝膠化的包封的內部極性水相情況下，其中凝膠化物質可以是聚合或不聚合的，其選自多糖、多肽、聚丙烯基酰胺；例如，非聚合的膠凝化物質選自明膠、瓊脂糖或角叉菜膠，而聚合的膠凝化物質選自聚丙烯酰胺凝膠。這些lipogelosomes，與先有技術中的脂質體相比具有顯著提高的穩定性，特別是因為不存在碰撞過程中發生顆粒間的熔化。
可是，它們有在液相中脂質體為分散形式的弊端，這不適宜于制備易儲存和服用的固體配方。
因而，申請人目的是提供新的載體，與先有技術中脂質體相比，其可有效地獲得活性成分的顯著包封產率，以及活性成分明顯改進的口服生物利用度，與此同時還顯示出良好的儲存穩定性和體內穩定性。所述載體適合于口服給藥；含水溶液也適合于其它給藥途徑例如透皮、經肺、經鼻、生殖器、靜脈、皮下或眼睛，這取決于所選擇的賦形劑。
所述載體的特征在于——基本上由單層狀脂質體所組成的粉狀組合物，其包括外部類脂相和內部含水核，脂相由4類脂(磷脂類)，及選擇性與2類物質(長鏈三甘油酯類、膽固醇酯類)，3類物質(膽固醇，非離子化的長鏈脂肪酸類)和/或5類物質(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)結合而組成含水核形成了溫度可逆的含水凝膠，其輻射到外部類脂相，內部含水核基本上由，至少兩種不同的非聚合的膠凝劑G1和G2的混合物M組成，G1和G2的凝膠-溶膠相過渡點高于或等于37℃，G1是選自明膠和角叉菜膠，如k-角叉菜膠的凝膠劑；G2選自角叉菜膠，但其性質不同于為G1選擇的角叉菜膠(例如i-角叉菜膠)以及纖維素，例如羥丙基甲基纖維素；脂質體直徑20nm-1mm，優選20nm-500nm；粒子單位形式的平均直徑為10mm-1000mm，形成自一種或多種上述脂質體，其被選自脫水的溫度可逆含水凝膠、糊精或其混合物所組成的基質包圍，該水凝膠和上述內核的水凝膠是同樣的，以致于包括平均1016-1018脂質體/克粉末，以及—至少包括一種活性成分，取決于在所述組合物的凝膠化內核中，或外部親脂相中。意想不到的是該載體克服了常規脂質體有關的缺陷，特別是能—增加脂質體的穩定性，因為不存在碰撞過程中顆粒間的融合。
—增加活性成分的生物利用度(在胃腸道得到保護并通過腸道屏障)；特別是在大鼠體上，按照本發明(LGS)，從口服載體算起，載體通過腸屏障的時間在2-4小時內，即一小時胃排空，1-3小時從腸腔通道進入全身循環；于是當用本發明載體包封活性成分時，不用改進活性成分的活性或組分，細胞內在化容量是低的或不存在的活性成分能有效地混入分化的腸上皮細胞中。
—降低包封的活性成分的毒性，以及—較少地導致包封的產物泄漏，因為在膠凝化包著的水相中降低了分子流動性。
意想不到的是，通過選擇膠凝劑，可得到脂質體(SUVs或小單層囊泡)，它適宜以干燥形式(粉末)使用，而且作為活性成分的載體具有特別有利的性質；按專門術語來說，所述活性成分具有意外的口服生物利用度，特別是對消化降解敏感的，吸收差的，具有高度毒性的活性成分而言，生物利用度有顯著增加(當它們，用本發明載體包封或結合時)。
此外，該粉狀載體保存了脂質體所有的完整性，它們既以粉末狀又以懸浮狀隨時間保持穩定，基于維持了脂類組成的完整性(無降解產物)以及維持膠凝劑特征的完整性，特別是對G1和G2的混合物(粘度、凝膠強度、破裂力、分子質量)。
在此上下文中，為了活性成分口服給藥的目的，應用lipogelosomes受益于穩定的脂質體形式(J.C.Hauton et al.，Eur.J，Surg.，1994，suppl.574，117-119)。生產LGSs的方法使有可能獲得膠凝化親水相的包封平均程度接近10％。這一百分率會改變，特別根據活性成分的分子量，并可按此比率計算包封活性成分的量/所用活性成分的量。例如，對500Da的分子，可觀察到至少5％包封；對20kDa的分子，可觀察到至少50％包封。例如，就肽類而言，大體上可觀察到10-50％包封；而對于活性成分，大體上包封的百分率范圍為5-80％，視情況而定。
膠凝劑G1和G2之不同，特別在于以下方面粘度、分子質量和凝膠-溶膠過渡點(即熔點)。對膠凝劑G1，該溫度小于或等于45℃，而對膠凝劑G2，則大于或等于45℃。
如上定義的至少兩種膠凝劑G1和G2混合物M具有織構特征(凝膠強度和斷裂力)，從所得脂質體穩定性和包封活性成分的生物利用度的觀點看，這是特別有益的。因而，至少兩種膠凝劑G1和G2的混合物M于5℃優先具有70-100％松弛特性，優選81-89％，和1000-1600g斷裂力，優選1109-1503g。
根據所述組合物的另一有利實施方式，所述脂質體的含水內核也至少包含一種配糖性質穩定劑和/或至少一種用來調節介質和/或至少一種表面活性劑，如膽質鹽和/或非離子表面活性劑的滲透性的試劑。
所述脂質體優選包括，以％(m/m)表示25-75％4類類脂類，5-45％膠凝劑，0-70％具配糖性質的穩定劑，0-15％調節介質容積滲克分子濃度(滲透性)的試劑，0-20％表面活性劑以及0-15％糊精，優選8-12％；該組合物不包括活性成分。
按照本發明所述粉狀組合物的另一優選實施方式，所述含水內核包括70-95％膠凝劑G1以及5-30％膠凝劑G2。
按照本發明所述粉狀組合物另一優選實施方式，具有糖苷性質的穩定劑是果糖、海藻糖或任何其它的保護劑。
本發明的主題也包括制備本發明粉狀脂質體的方法，其中顆粒單位的外部基質包括溫度可逆的含水凝膠的部分，其特性在于包括下列步驟(1)，在含水相中制備帶有膠凝內核(lipogelosomes)的脂質體分散體，其是通過下面步驟制備的(a)制備至少一種合適的膠凝劑溶液，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M，即通過將所述膠凝劑伴隨慢速攪拌于高于所述膠凝劑的凝膠-溶膠相轉移溫度的溫度下溶于水相溶液中，該水溶液的pH與被包封的活性成分是相容的，(b)將活性成分摻入得自(a)所得溶液，(c)將類脂摻入(b)所得溶液，慢速攪拌混合物，歷時少于5小時，優選在真空下，于是形成乳劑，(d)通過快速攪拌得自(c)的乳劑，優選真空下，在含有所述膠凝劑的含水相中得到上述帶有膠凝內核的脂質體(lipogelosomes)；和(2)將所得的分散體作合適的干燥處理，以生產粉末狀產品。根據所述方法的一個優選實施方式，干燥是通過霧化、凝聚，薄層或成粒進行的。
本發明另一目的是制備本發明粉狀載體的方法，其中顆粒單位的外部基質包含溫度可逆性含水凝膠和/或糊精部分，其特征在于包括如下步驟(1)，在含水相中制備帶有膠凝內核(lipogelosomes)的脂質體分散體，其通過如下步驟制備(a)制備至少一種合適的膠凝劑溶液，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M溶液，即通過將上述膠凝劑伴隨溫和攪拌于高于上述膠凝劑的凝膠-溶膠相轉移溫度的溫度下溶于在水相溶液中，水相溶液pH與包封的活性成分是相容的，(b)將活性成分摻入得自(a)的溶液，(c)將類脂摻入得自方法(b)的溶液，緩慢攪拌混合物，歷時少于5小時，優選在真空下，于是形成乳劑，(d)通過快速攪拌得自方法(c)的乳劑，優選在真空下，在含有上述膠凝劑的外部含水相中得到上述帶有膠凝內核的脂質體(lipogelosomes)，和(2)部分除去含有所述膠凝劑的含水液相，其中脂質體被分散，(3)添加至少一種合適的糊精，以及(4)通過霧化干燥得自步驟(3)的產品制備粉狀產物。
根據所述方法的一個優選實施方案，至少部分除去含有上述膠凝劑的含水液相步驟(2)是通過稀釋和/或過濾進行的。
按照本發明的制備方法，步驟(a)中的水溶液也包括用于調節介質的滲透性的試劑(例如0.9％NaCl)和/或配糖性質的穩定劑和/或表面活性劑，優選5類物質(膽質鹽)。
作為一種變化，活性成分可在與得自步驟(a)的混合物摻合之前，加到外部類脂相中。
例如，降鈣素，AZT和阿霉素被摻入時的pH值分別為5、7.5和3。
令人驚奇地，這種方法可在一步中得到粉末狀載體，這基于帶有膠凝化內核(lipogelosomes)的穩定脂質體，其包括在低速下于水相中組成物的相成熟(即成熟之意)隨后在高速下相分散(形成lipogelosomes)，其包括一個步驟，其間在液相中得到形態均勻的穩定分散lipogelosomes隨后進行干燥；帶有有效凝膠化內核的脂質體分散體具有如下的形態學特征·直徑在20-500nm囊狀結構，優選20-80nm，·負染色顯微鏡觀察，冷破裂，冷傳導和原子力囊泡或囊泡集合，帶有磷脂雙層的特征表觀；負染色使有可能觀察到包封的外部磷脂層的膠凝劑混合物M的或多或少存在，以及·帶有10-55％(優選10-30％)膠凝化內相的脂質體的多分散度。
該方法具有可重復性并完全適用于工業規模的優點。
該方法也具有比先有技術中方法更少的處理步驟，其中在專利0393049中聲處理、擠壓或去污劑的除去是需要的。
按照上述方法的一個優選實施方案，步驟(C)優選在剪切速率小于200S-1下進行；通常，剪切速率基于如下比率得出攪拌設備的速度/反應器內壁和攪拌葉片末端之間的空間(也稱作空隙)。
本發明另一方面涉及藥物組合物，其特征在于其包含如上定義的粉末狀脂質體活性成分載體，以及至少一種藥用賦形劑。
按照所述組合物的一個優選實施方案，其為固體形式(凝膠囊，片劑或被溶入水中的粉劑)。
按照所述組合物的一個優選實施方案，其還包含cAMP活化劑。
除了前述以外，本發明也包含其它描述，這將隨著下面描述，參照實施本發明的實施例及附圖而變得更清晰，其中—

圖1表示血鈣隨時間的變化，(-D-＝游離降鈣素；-■-＝本發明LGS-降鈣素載體)；—圖2表示從游離降鈣素得到的血鈣和口服本發明LGS-降鈣素載體的血鈣之后所得AUC的差異；—圖3表示尿鈣隨時間的變化，(-■-＝500kDa LGS-降鈣素載體，-□-＝游離降鈣素，-□-＝300kDa LGS-降鈣素載體)；—圖4表示磷酸鹽血作為時間函數的評價(-D-＝游離降鈣素，-■-＝本發明LGS-降鈣素載體)；—圖5表示從游離降鈣素得到的磷酸鹽血和口服本發明LGS-降鈣素載體得到的磷酸鹽血之間AUC的差異；—圖6表示磷酸鹽尿隨時間的變化(-■-＝LGS-降鈣素載體((PA-載體)結構)，分子量至少大于500kDa，其相等于lipogelosomes包封的降鈣素且直徑至少大于40nm)，-□-＝游離降鈣素；-□-＝LGS-降鈣素載體((PA-載體)結構)，分子量至少大于300kDa，其相等于lipogelosomes包封的降鈣素且直徑至少大于20nm；—圖7表示SGOT(IU/1)隨時間的變化(-□-＝游離降鈣素；-◆-＝本發明LGS-降鈣素載體)；—圖8表示SGPT(IU/1)隨時間的變化(-□-＝游離降鈣素；-◆-＝本發明LGS-降鈣素載體)；—圖9表示用游離降鈣素處理的組和用本發明LGS-降鈣素載體處理的組之間SGPT的AUC差異。
但應清楚地明白為描述本發明主題給出的實施例不意味著對本發明任何限制。實施例1對膠凝劑G1和G2混合物的結構特征測量a)材料和方法在TA-XT2i機器(來自Rheo公司)上進行。研究涉及破裂和松弛試驗中凝膠的性質，凝膠由明膠，i-，k-角叉菜膠的混合物組成。
·樣品的濃縮凝膠/i-/k-角叉菜膠混合物(80/17.5/2.5)在5mM Na2HPO4及0.9％或2％NaCl介質中濃度為7.5％w/v。
·膠凝劑溶液的制備將氯化鈉在裝配有汽輪式混合器和行星齒輪構件并含有純化水(在10rpm下進行15分鐘)的混合器中溶解，混合器升溫到75℃(于10rpm攪拌45分鐘)，將膠凝劑(凝膠、i-和k-角叉菜膠)于75℃加入混合器中，汽輪式混合器設定在1500rpm溶解步驟持續約30分鐘。當溶液澄清且懸浮液里不含顆粒時，溶解完成。
·樣品的制備為作松弛試驗，45ml凝膠趁熱倒入平底Petri皿(外徑92±2mm)，為作破裂試驗，30ml凝膠趁熱倒入平底結晶皿(外徑50±2mm)。通過冷卻至溫度低于或等于37℃得到凝膠。凝膠成熟時間，即凝膠的最大水化程度，在研究的溫度下和在靜止的狀態中為2.5天。
·操作條件為作松弛試驗，對凝膠在給定時間施加壓力，所用流動元件是鋁圓筒(直徑25mm)，初速為1.0mm/s，速度為0.5mm/s，后速為10.0mm/s。流動元件的置換為30秒1.0mm。為了做破裂試驗，所用流動元件為硬質膠筒(直徑為10mm)，初速，速度及后速為1.0mm/s，流動元件的置換為12mm。
b)在5℃下的研究結果，用0.9％氯化鈉。
松弛(％)最小值81±2.2最大值89±0.8破裂力(克)最小值1109±25最大值1503±35c)溫度和不同氯化鈉含量的作用結果操作條件相同于a)所敘述的那些，但不同于松弛試驗中的流動元件的置換(凝膠總厚度20％的置換)。
松弛作用(％)在5℃ 0.9％ NaCl 89±0.82％ NaCl 90±0.2在25℃ 0.9％ NaCl 32±3.9
2％ NaCl 38±4.4在37℃ 0.9％ NaCl 36±3.72％ NaCl 40±4.9破裂力(g)在5℃ 0.9％ NaCl 1413±662％ NaCl 1114±143在25℃ 0.9％ NaCl 211±2.72％ NaCl 173±1.5在37℃ 0.9％ NaCl 25.7±2.42％ NaCl 44.7±3.9實施例2制備含有降鈣素的本發明粉狀載體的方法1)制備帶有凝膠化內部相脂質體的分散體(lipogelosomes)組分大豆卵磷脂11.915kg(7.943％)明膠B150 7.149kg(4.766％)i-角叉菜膠1.565kg(1.043％)k-角叉菜膠0.222kg(0.148％)蔗糖 8.936kg(5.957％)氯化鈉1.073kg(0.715％)純化水119.15kg(79.43％)總含量150.01kg(100％)a)脂質體分散體的制備下列物質的混合物—明膠B150 7.149kg—i-角叉菜膠 1.565kg—k-角叉菜膠 0.222kg—蔗糖 8.936kg
—氯化鈉 1.073kg—鵝脫氧膽酸鈉1.131kg—純化水 118.00kgq.s.150kg上述物質置混合器內(速度10rpm)預混合，其平面構件的轉速為1500rpm/1.5小時(在真空下)。
b)降鈣素的摻合用6N濃醋酸降低混合物的pH值，通過持續添加達到穩定的pH值4.5。然后加入4.075克鮭降鈣素(Bachem，加利福尼亞)，其比活性為7017IU/mg。
c)磷脂類摻入得自a)的溶液混合器中將大豆卵磷脂(11.915kg)加入先前的混合物中，混合器轉速為10rpm，其中平面構件的轉速為1500rpm，在真空下進行5小時，直到乳劑形成。最后的分散通過平面構件(25rpm)和汽輪混合器(2500rpm)攪拌速度增加來進行，歷時足以獲得多分散度(小于40％)。在含水相中得到lipogelosomes的分散體。
負染色顯微鏡觀察，低溫斷裂，低溫透射和原子力顯微鏡法囊泡或囊泡的集群具有磷脂雙層的特征面貌，負染色使得有可能或多或少觀察到外部膠凝劑的顯著存在(按照所選定的制備和/或分離方法)。
d)正切過濾一個體積lipogelosomes的分散體(得自上述步驟的分散體)被稀釋于20倍體積的熱的0.9％NaCl溶液中，并攪拌。稀釋物(0.9％NaCl)用8.25×10-4％鵝脫氧膽酸酯補充，這取決于先前分散體中表面活性劑的存在。未被包封的相經過連續的熱正切超過濾被排除。超過濾在帶選擇性的多孔膜(300或500kDa)上進行，這取決于所得lipogelosomes所需的顆粒大小。該產物是至少包封17％鮭降鈣素的lipogelosomes懸浮體，其中當懸浮體通過300kDa超過濾時脂質體的直徑范圍為20-500nm；以及當懸浮體通過500kDa超過濾時，為40nm-500nm。
2)所得分散體的干燥所形成的在含水相中的lipogelosomes分散體被轉移到干燥器中(50-100毫巴真空度)，約需要4小時。得到十分均勻的深灰稻草黃色粉末，所含顆粒直徑為0.1-1mm。
在電子顯微鏡下觀察到類脂包囊的自身收縮是由于脫水的緣故。進一步在液態情況下被注意到，LGSs經常聚集在均勻的膠凝化基質內側，處于無數被分離的泡囊結構的環境里。干燥步驟在聚集體的表面改變了膠凝化基質成為干燥膠凝劑的絲狀體，但也在游離的囊狀結構的表面發生了所述變化。
作為一個變型，干燥步驟如下在含水相中lipogelosomes的分散體被直接分布到旋轉鼓形干燥器中(溫度為120-150℃，轉速為3-6rpm)。所得“削下薄片”被研磨，并在合適的柵板上校準。得到具有如上定義特征的lipogelosomes(以下也稱為LGS)粉末。通過加入填料賦形劑，例如，麥芽糊精或β-環糊精，使干燥最佳優化。實施例3大鼠口服后，按實施例2得到的游離或包封的降鈣素(在載體內)的比較作用與游離態降鈣素口服效應相比，分析實施例2制劑對鈣血、鈣尿、磷酸鹽血和磷酸鹽尿的效應，對服用兩種形式的降鈣素的藥物動力學也作了比較。
其它參數也做了分析轉氨酶(SGOT的SGPT)和血糖。
重要的是注意到在血鈣正常的大鼠和人體上的降鈣素的效應難以顯示，而處于病理狀態的個體(高鈣血個體)對此激素的反應是比較敏感的。
實驗原始記錄·LGS-降鈣素的制備 見實施例2。
·動物和藥理學治療動物10組，每組10只Wistar Ico大鼠(IOPS AF/Han，IFFA CREDO)，即總共100只大鼠，6周齡，體重160-180克。動物體重在實驗開始時稱量，就此參數而言，能確保個組每一只大鼠均勻分配。6個實驗組事先喂食7天，生活制度基于消毒的“AO4(UAR＝Usined’Alimentation Rationelle(方案提供者))。大鼠被禁食，并在服用實驗劑量前24小時隨意給予葡萄糖。動物的體重在服用實驗劑量前加以監控。
實驗方案動物的實驗組A，B，C，D，E，F，G，H，I和J的組成如下A組10只對照大鼠，在0時分取血漿樣和尿樣。
B組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在45分鐘時取血漿和尿。
C組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時取血漿和尿。
D組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素近似濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在180分鐘時取血漿和尿。
E組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在300分鐘時取血漿和尿。
F組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在45分鐘時取血漿和尿。
G組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時取血漿和尿。
H組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在180分鐘時取血漿和尿。
I組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在300分鐘時取血漿和尿。
J組10只大鼠被插管，1.8ml 300kDa LGS-Cal懸浮體(降鈣素濃度36IU/大鼠，即228IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時取血漿和尿。
麻醉—用Rompun(2％甲苯噻嗪；10mg/kg)Imalgene(10％氯胺酮；60mg/kg)、按實驗方案所示時間經腹膜內注射。
取樣—在麻醉下通過導管插入，從腹主動脈取出血樣，A組在0時間；B組和F組在45分鐘；C，G和J組在90分鐘；D和H組在180分鐘；E組和I組300分鐘。膀胱也作插套管，按照取血樣規定時間定時取尿樣。用離心分離法，在含3.8％EDTA(非蛋白質抗凝血劑)的管中離心分離(3000rpm，15分鐘)血樣后，得到全血漿。
分析對每個血漿樣品用比色法測定鈣血、磷酸鹽血和轉氨酶。
數據的統計學處理—對每組10只大鼠的測定結果以平均±SEM表示。數據將用統計學測試的方法作比較，其適合于這種類型的實驗原始數據處理(參數和藥物動力學研究)。所選擇的統計學試驗是ANOVA試驗或方差分析，誤差的顯著性用Fisher試驗和更加有識別性的Scheffe試驗確定。
兩種方法用來表示實驗結果與所考慮的參數相關的10個數據平均值的圖解以及AUCs(曲線下面積)比較分析。該表達的方法能評定所得應答范圍內差別。
按照藥物動力學技術所得的結果表示作為時間的函數的程度變化。在此情況下并不是劑量效應的探索。
結果·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對鈣血的藥物動力學效應圖1表示鈣血隨時間的變化。測定鈣濃度的分析通過藥典中的比色法進行。鈣血的基礎值(在0時間)與先前的數據相關性甚好。每一個點代表10個數值的平均值，即10個獨立大鼠的9個組。平均值以±SEM表示。所得結果與變數的分析(ANOVA)相比較(對未成對的值)。顯著差別用**作記號，該記號相應于高分辯Scheffe試驗里的顯著性。
在口服游離降鈣素后，可觀察到鈣血的瞬間減少。可解釋的事實是在大量服用肽(例如降鈣素)期間，小量百分數的未變性肽跨過腸障礙(1％)。在此情況下，服用330IU，其相當于3.3IU通過淋巴(從腸腔到血漿，經由淋巴管通道)。但降鈣素IV-途徑的效應在0.9IU開始，因此觀察到游離降鈣素的效應是正常的。在口服降鈣素后觀察到低鈣血隨時間減少，90分鐘后回到了正常水平。
就LGS Calc而言，在45分鐘觀察到同樣效應，但這種低鈣血效應是180分鐘時的兩倍。該事實指出LGS制劑(等價降鈣素濃度)比游離降鈣素的藥理作用更為有效。該雙相現象被歸因于外層LGS(初始作用)相聯系的降鈣素活性，而且其第二效應可能是由于LGSs內部所含的降鈣素。于是通過PA活性(因素2)的增加而加倍的遲發效應被觀察到。
圖2代表游離降鈣素的鈣血和口服LGS-Calc的鈣血之間在AUC上的差別。該差別在Scheffe試驗中是高度顯著的。AUC相應于在實驗中獲得的所有數據的累積；這些數值被整合并加以比較。AUC相應于在曲線下的面積，曲線為隨時間的鈣血變化。AUC愈小，低鈣血效應愈大(因為曲線到達了X-軸)。
·游離降鈣素或以LGS-Calc包封的降鈣素對鈣尿的藥物動力學效應所提的限制(指通過原子吸收光譜所得血漿結果)是通過用包封或未包封降鈣素處理的大鼠尿所得的分析值確認的。從事實觀點看，圖3確證了圖1的數值，因為低血鈣常常伴隨著鈣尿的增加。
·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對磷酸鹽血的藥物動力學效應(圖4)LGS-Calc和游離降鈣素引起低磷酸鹽血(比色法測定)，其僅僅在用LGS-Calc處理的實驗組的情況下得以繼續。在Fisher試驗中結果是顯著的。各自的AUCs的比較(見圖5)，很清楚地確證了藥物動力學數據。兩種AUCs之間的差別在Scheffe試驗中是顯著的。
·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對磷酸鹽尿的藥物動力學效應(圖6)尿樣測定通過原子吸收光譜進行，如同鈣尿情況(見前所述)。這些結果不如鈣尿中的顯著。因此下結論有困難。然而，在180分鐘時，LGS-Calc的效應有大于非包封藥物的趨勢。
·毒理學方面的研究依靠所取得的樣品，可進行服用兩種活性成分的轉氨酶測定。隨時間SGOT含量分析顯示出包封降鈣素比起游離形式來有低毒性的傾向(圖7)。該差異在300分鐘的Fisher試驗中是非常顯著的。然而，AUCs的比較并不顯出任何顯著的差別，就SGOT含量隨時間變化而言。
該傾向接近轉氨酶適度增加(低毒性)，這可通過隨時間分析SGPT含量得到確證(圖8)。
這些數據顯示包封形式的降鈣素與游離形式相比有著強的低毒性。圖9顯示出在AUC中SGPT含量的差別(在用游離降鈣素及用包封降鈣素的實驗組中)。
在Scheffe試驗中，這兩種面積的差別是顯著的。該效應可用于，特別在服用高毒活性成分時的前后關系，以減少這些物質產生肝毒的影響。
結論—降鈣素的LGS形式包封加強了腸道屏障的通過。
—口服的比較效果顯示了LGS形式的潛力均是較大的，因為現在有可能使粉劑中的結構穩定。
—LGS-Calc的雙相低鈣血效應可解釋為降鈣素分布在LGSs表面及中心。
—該實驗可評價LGS-Calc形式的低毒性，因為與游離形式相比后者顯然毒性更大。
—利用藥典所推薦的鑒定方法，獲得表明LGS-Calc形式優于游離降鈣素的數據。
—口服兩種形式的PA之后帶來的低鈣血的兩個峰值被具體化服用后45和180分鐘。
—LGS-Calc的遲發效應也許應歸結于得自儲存基質微球LGS-Calc濃縮物，其逐漸穿透腸道屏障，逐步釋放到腸中。實施例4包封于lipogelosomes及其衍生形式中主成分生物利用度的增加；脂質體和lipogelosomes之間的比較1.lipogelosomes(LGS)和標準的脂質體(LS)形式的耐受或穩定性比較LGSs可制備用常規的脂質體形式不能制備的藥物劑型(粉劑)；只有LGSs經受得住這些生理學條件pH，溫度，腸能動性，酶；其給予它們能力，經口服或肺途徑使用；而LSs經由這些途徑被服用時被破壞。
a)耐pH和腸內膽質鹽類系列的LGS和LS在37℃于膽汁鹽(牛磺脫氧膽酸鹽)及去污粉存在下培養1小時，由此破壞類脂泡囊的粉末。結果表明膽汁鹽濃度為0.25mM，LGSs的耐受為LSs的3倍。結構的耐受通過激光顆粒學方法測試(粒子計數水平的變化通過激光衍射變化，以KHz計)。
LGSs和LSs在不同pH值時培養1小時之后，其結構比較(通過激光顆粒學方法觀察)表明在pH＝2.5-9時，LGSs是穩定的，而LSs僅在pH＝6.3時占優勢。
LGSs比LSs對pH水平以及在胃部遭遇的去污粉濃度更有耐受性；這可推理LSs在胃內被降解，而LGSs具有更長久的耐受抗性。
b)對絲膠介質，溫度，攪拌的耐受系列LGS和LS的培養在37℃攪拌下進行24小時。LGSs和LSs的類脂相(它們是嚴格相同的組成)，在同樣情況下用用同位素14C作標記。自兩個類型結構降解衍生出產物LS和LGS隨時間分析。結果LSs的類脂成分比LGSs的類脂成分更加容易釋放。
這些結果表明LGS類型比LS類型更加穩定。
c)從LGSs和LSs所得的包封活性成分的泄漏的比較小粒徑(500Da)的活性成分(AP)被包封于同量的LGSs及LSs中。其后，兩種制劑在37℃于絲膠介質中攪拌。測定包封的AP釋放量。從LSs釋放出的AP量比從LGSs釋放出的AP量高60％(AP 1.6單位對LS；AP 1.01單位對LGS)。
借助于LGSs的值得注意的較高穩定性，固態藥物劑型能被制備，而且可用于口服。但脂質體的常規制劑不能做到。
2.在細胞模型中，lipogelosomes劑型和常規脂質體劑型之間的生物利用度比較當這些分子被包封于LGS(lipogelosomes)形式或在LS(脂質體)形式中時，分析標記物或AP的細胞內在化差別。
a)脂質體和lipogelosomes細胞內在化比較LSs和LGS用放射性探針或熒光探針標記，經過一個時期在介質中培育(在人巨噬細胞THP1株存在的介質里于37℃培養)；兩種結構形式(LS和LGS)的內在化比較在培育終了時分析，培育時間是同樣的。內在化分析采用各種各樣的分析方法進行。
A.熒光顯微術圖象顯示LSs和LGSs的內在化。但在LSs的情況下，信號分布是均勻的，而LGSs信號的分布定位在點狀細胞內結構。
該結果指出LGSs細胞內降解不比LS結構快(其中LS結構在細胞內信號擴散得更快些)。
于是，在LGSs中包封的活性成分出現了緩慢的擴散效果，而它不存在于LSs中。
B.放射性標記放射性標記的LGSs和LSs的分子內計數指出在同樣實驗條件下LGSs被內在化程度是LSs的2.5倍。
LGSs被內在化的量比LSs要大這一事實指出LSGs的分子生物利用度要比LSs大，這是由于兩種脂質體結構之間的差別在LGS內部相中存在專一的溫度可逆凝膠(其輻射出來直達粒子表面)，產生一種優先的細胞攝入性質。
C.流式血細胞計數法這些實驗基于用熒光探針標記的LGS和LS可比較的細胞攝粒作用。在培育之后，收集細胞。然后通過流式細胞計，定量每個細胞的熒光信號。所得光譜指出，用LGSs培育的細胞散發出2.5倍于LSs培育細胞的熒光信號。
LGSs以2.5倍于LSs的量被內在化該事實指出LGSs的細胞生物利用度大于LSs的生物利用度。
b)lipogelosomes-AP/游離AP的比較細胞藥理學A.在培養物中AZT和3TC對巨噬細胞的效應在這些實驗中，LGSs包封的AZT或3TC用人體巨噬細胞培育，分析游離產物或LGSs包封的產物的細胞毒性。結果指出包封Aps比游離AZT或3TC有效150倍，這針對于培養物中巨噬細胞。
這些實驗指出就巨噬細胞而言，在等劑量下包封的AP活性要比游離AP大150倍，這很可能是由于其更好的細胞內在化。
B.在培養基中的阿霉素和PEG 4000作用于肝細胞以及分化的腸上皮細胞兩個分子的細胞內在化按照它們是否是游離形式還是LGS包膠形式比較阿霉素和PEG 4000。
在同樣實驗時間和濃度的條件下，分子被包封的事實引起細胞摻合的增加或其(就肝或腸器官而言)藥理學活性增加，因數范圍為1.5-3。
這些實驗指出LGS分子包封形式的生物利用度相對其游離形式在腸上皮細胞或肝實質細胞上。
C.當它們處于LGSs的形式時，分子的改良生物利用度的解釋脂質體(LS)通常用膜融合方法被內在化于細胞內，也就是已知的被動擴散，即這種方法不會引起任何第二信使對膜受體的表達負有責任。可是，LGSs和LSs之間的不同點在于專一的溫度可逆凝膠的存在于LGS內部相中，其輻射出來到粒子表面，及通過凝膠膜的存在到達外部表面上。該凝膠具有蛋白-糖的本性(凝膠和k-角叉菜膠和i-角叉菜膠的混合物)。
按照本發明，細胞內在化和生物利用度在LSs和LGSs中的差別，實質上在于這種凝膠的組合物的存在。
分化的或未分化的腸細胞(細胞株HT29，HT29gal，T84)被置于半多孔濾器(擴散室)內培養。LGSs在cpt-cAMP存在或不存在的條件下與這些細胞培育。在cpt-cAMP的存在下，LGSs的內在化通過因素2被增加。
該實驗表明LGSs的內在化是一種cAMP-依賴現象。更進一步，LGS內在化作為劑量的函數的曲線表明LGS內在化是可飽和的。這兩個基本事實表明通過受體介導LGSs內在化。因而該內在化方法不同于通過常規的脂質體融合的細胞攝粒作用方法，其不依賴于受體。因而，包封于LGS中的藥物的最佳生物利用度被對LGSs有專一性的受體參與所解釋。
d)lipogelosomes劑型在大鼠體內的生物利用度見實施例3。
e)lipogelosomes劑型在擴散室模型上的生物利用度培養腸上皮細胞，匯合在半多孔濾器上，以獲得生物隔離系統，從腸腔介質中分離出“血漿”介質。LGSs被置于腸腔邊上，而后經過一段培育期，分析血漿介質。
在此隔室內，激光顆粒法揭示帶有與LGSs同樣特性的結構，其在實驗開始時儲存在腸腔隔室中。添加一定比例的CDCA(鵝脫氧膽酸鹽)到LGS的制劑中，增加了在血漿隔室中發現的顆粒數目。
這些實驗表明若干LGSs跨過腸上皮很可能是經過類細胞通道或轉細胞過程。當LGS制劑通過添加CDCA加以改良后，通道被增加。
因而，有可能使包封于LGSs中分子的腸經上皮通道最佳化(例如在口服以后)；LGS劑型使得有可能增加包封分子的腸生物利用度，而且當鵝脫氧膽酸鹽被包括在LGS制劑內時，這種性能加強。
作為來自上文事實的出現，本發明在任何情況下，不限于完成此發明的方法，或者是申請剛被敘述的大量細節。相反，其包括了所有的變化，其可發生在本領域技術的人員之中，只要不背離本發明的上下文或本發明的范圍。
權利要求
1.脂質體活性成分載體，其特征在于，它們組成如下—一種粉狀組合物，其基本上由單層狀脂質體組成，其包括外部類脂相，其由4類類脂(磷脂類)及選擇性結合有下列物質2類物質(長鏈三甘油酯類、膽固醇酯類)，3類物質(膽固醇，非離子化的長鏈脂肪酸類)和/或5類物質(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)所組成，以及形成溫度可逆含水凝膠的內部含水核，其輻射到外部類脂相，內部含水核基本上由至少有兩種不同的非聚合膠凝劑G1和G2混合物M所組成，其凝膠-溶膠相過渡點高于或等于37℃，G1是選自明膠和角叉菜膠的膠凝劑，G2則選自角叉菜膠，其性質不同于為G1選擇的角叉菜膠，以及纖維素，脂質體的直徑為20nm-1mm，優選20nm-500nm且粒子單位形式的平均直徑為10mm-1000mm，由上述一種或多種脂質體形成，被選自脫水的溫度可逆含水凝膠基質所包圍，該含水凝膠與所述的內核、糊精或其混合物的水性凝膠是一致的，平均來說，每克粉末中含有1016至1018個脂質體，和—至少包括一種活性成分，根據情況，其在膠凝內核中或在外部類脂相中。
2.權利要求1中的脂質體活性成分載體，其特征在于，在它們的內部水性核中，還包含至少一種配糖性質的穩定劑和/或一種用于調節介質滲透性的試劑和/或至少一種表面活性劑，如膽質鹽和/或非離子性的表面活性劑。
3.權利要求1或2中的脂質體活性成分載體，特征在于以％(m/m)計，其包含25-75％4類脂類，5-45％膠凝劑，0-70％配糖性質的穩定劑，0-15％用于調節介質滲透性的試劑，0-20％表面活性劑以及0-15％糊精。
4.權利要求1-3任意一項中所述的脂質體活性成分載體，其特征在于所述的含水內核包含70-95％膠凝劑G1和5-30％膠凝劑G2。
5.權利要求2-4任意一項中所述的脂質體活性成分載體，其特征在于配糖性質穩定劑為蔗糖，海藻糖或任何其它保護劑。
6.制備權利要求1-5任意一項中所述的粉狀載體的方法，其中，顆粒單位的外部基質包含脫水的溫度可逆水性凝膠成分，其特征在于包括下列步驟(1)在水相中通過下面步驟制備具有膠凝化內核的脂質體分散體，(a)在高于所述膠凝劑的凝膠-溶液相的轉換溫度下，于pH與被包封的活性成分相容水相溶液中，將所述的膠凝劑在慢慢攪拌下溶于水溶液中，以制備得到至少一種合適的膠凝劑，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M的溶液，(b)將活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速攪拌混合物，歷時少于5小時，優選在真空條件下，將類脂摻入得自(b)的溶液，形成乳劑；且(d)優選在真空條件下迅速地攪拌(c)中得到的乳化劑，得到所述的帶有存在于水相中的的膠凝化內核(lipogelosomes)的脂質體分散體，其中水相含所述凝膠劑，(2)適合的干燥得到的分散體，得到粉末狀產品。
7.權利要求6中所述的方法，其特征在于干燥步驟是通過霧化作用、凝聚作用、薄膜或顆粒化作用來進行的。
8.制備權利要求1-5任意一項中所述的粉狀載體的方法，其中，顆粒單位的外部基質包括脫水的溫度可逆的水性膠狀和/或糊精，其特征在于包括下列步驟(1)通過以下步驟，在水相中制備具有膠凝內核(lipogelosomes)的脂質體分散體，(a)在高于所述膠凝劑的凝膠-溶液相的轉換溫度下，于pH與被包封的活性成分相容水相溶液中，將所述的膠凝劑在慢慢攪拌下溶于水溶液中，可以制備得到至少一種合適的膠凝劑，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M的溶液，(b)將活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速攪拌混合物，歷時少于5小時，優選在真空條件下，將類脂摻入得自(b)的溶液，形成乳劑；且(d)優選的是在真空條件下迅速地攪拌(c)中得到的乳化劑，得到所述的帶有存在與水性外相中的膠凝內核(lipogelosomes)的脂質體分散體，其中水相含所述凝膠劑，和(2)至少部分地除去含有所述膠凝劑的水性液體相，其中分散有所述的脂質體，(3)加入至少一種合適的糊精，并且(4)霧化干燥(3)中得到的產品，得到粉末狀產品。
9.權利要求8中所述的方法，其特征是至少部分地除去含有所述膠凝劑的水性液體相的步驟(2)是通過稀釋和/或過濾來進行。
10.權利要求6-9中任一所述的方法，其特征是步驟(a)中的水溶液包含有用于調節介質滲透性的試劑(例如0.9％NaCl)和/或配糖性質的穩定劑和/或表面活性劑，優選5類物質(膽質鹽)。
11.權利要求6-10任意一項中所述的制備方法，其特征在于摻入活性成分的步驟(b)是在外部類脂相摻入到步驟(a)中所得的混合物之前在外部類脂相中進行的。
12.權利要求6-11中任一所述的方法，其特征是步驟(c)優選的是在小于200s-1的切變速率下進行的。
13.藥物組合物，特征在于其包含權利要求1-5任意一項中所述的活性成分載體以及至少一種制藥學上可接受的載體。
14.權利要求13中所述的組合物，特征在于其還包含cAMP活化劑。
15.權利要求13或14中所述的組合物，特征在于其以固體形式(凝膠膠囊，片劑或可溶于水的粉末)存在。
16.具有水性膠凝內核的脂質體分散體，其中含有權利要求1中所定義的凝膠劑混合物，該分散體中所述的脂質體顯示出下列形態學·具有直徑為20nm至500nm的囊性結構，優選20-80nm，并且·具有10-55％，優選10-30％膠凝化內相的脂質體的多分散性。
全文摘要
本發明涉及用于活性成分穩定的,呈粉末狀的脂質體,更具體講,該活性成分對消化和/或血漿的降解是敏感的,例如蛋白質,本發明還涉及所述脂質體作為醫藥產品的應用。脂質體活性成分載體由粉狀組合物組成,其基本上由單層狀脂質體組成,其包括外部類脂相,其由4類類脂(磷脂類)及選擇性結合有下列物質2類物質(長鏈三甘油酯類、膽固醇酯類),3類物質(膽固醇,非離子化的長鏈脂肪酸類)和/或5類物質(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)所組成,以及形成溫度可逆含水凝膠的內部含水核,其輻射到外部類脂相,內部含水核基本上由至少有兩種不同的非聚合膠凝劑G1和G2混合物M所組成,其凝膠－溶膠相過渡點高于或等于37℃,G1是選自明膠和角叉菜膠的膠凝劑,G2則選自角叉菜膠,其性質不同于為G1選擇的角叉菜膠,以及纖維素,脂質體的直徑為20nm－1nm,優選20nm－500nm且粒子單位形式的平均直徑為10mm－1000mm,由上述一種或多種脂質體形成,被選自脫水的溫度可逆含水凝膠基質所包圍,該含水凝膠與所述的內核、糊精或其混合物的水性凝膠是一致的,平均來說,每克粉末中含有10
文檔編號A61K9/127GK1264297SQ9880728
公開日2000年8月23日 申請日期1998年6月11日 優先權日1997年6月11日
發明者J－P·紗利斯 申請人:利波格爾公司