對映體富集的n－衍生的內酰胺類化合物的制備方法

專利名稱：對映體富集的n－衍生的內酰胺類化合物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種對映體富集的N-衍生的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮類化合物的制備方法。
由EP 0434 450可知，abacavir是一種下列結構式(I)的2-氨基嘌呤核苷類似物，具有抗人免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的潛在活性。
現實需要合成大量abacavir以供臨床試驗。將來，一旦abacavir被國家藥品管理機構批準，作為治療HIV感染的處方藥還需要大量的abacavir。
作為生產abacavir的重要一步，就是制備對映體純的取代的環戊烯環。現有的公知方法均始于式(II)內酰胺。
EP-A-0424064公開了一種方法，其中通過將環戊二烯與甲苯磺酰基氰化物反應制備外消旋內酰胺(II)，其可以與內酰胺酶反應，得到下列開環化合物(III)的單一一種順式對映體或者相對于其中一種對映體而言對映體富集的順式對映體的混合物，以及相對于一種或其它對映體而言對映體富集的未反應內酰胺。
現在，我們已開發了一種高產率并且高效的由其外消旋體制備基本上對映體純的式(IV)中間體的方法。
其中P是活化基團和保護基我們現已發現，將帶有P基團的式(II)化合物中內酰胺氮原子(如下列式(V))衍生化，可活化所述內酰胺鍵以進行水解。我們驚奇地發現，比EP-A-0424064中所述酶更容易獲得的、并且在正常條件下表現出對如EP-A-0424064所述的式(II)內酰胺無活性的酶，可以用于生產式(IV)化合物。
因此，本發明一方面，提供了一種通過用酰基酶處理所述混合物，對映體拆分N-保護的(±)2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物，以生成基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(IV)的方法。
其中P是活化基團和保護基本發明另一方面，提供了一種上述式(IV)(其中P是活化基團和保護基)基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備方法，其中將上述式(V)(其中P是活化基團和保護基)N-保護的(±)2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋混合物用酰基酶處理并按常規方法從所述反應混合物中分離出未反應的式(IV)對映體。
優選的是，所述活化基團/保護基是酰基或取代的氧羰基基團。優選的酰基基團包括甲酰基或低級鏈烷酰基(烷基部分含有例如1-4個碳原子)，特別是乙酰基。優選的取代的氧羰基基團可以是式ROC(O)-，其中R可以是烷基或芳烷基。優選的烷基是叔丁基。芳烷基可能是芐基。
由于我們還發現，這些酰基保護的化合物基本上可在含水條件下進行脫保護，因此，優選的是，所述反應可在有機溶劑和水的混合物中進行。優選的是，使用水可混溶的有機溶劑，例如環醚如四氫呋喃或1，4-二氧雜環己烷。為了使脫保護減至最小程度，優選的是使用小于70％的水，更優選50％左右或者更低(體積比)。現已發現，最適宜的是約50∶50(v/v)四氫呋喃和水的混合物。
當如上使用時，所述反應可在單相中進行。但是，沒有理由認為使用有機溶劑形成的兩相系統會是不成功的，例如用芳香烴。
反應完成后，可用常規方法，例如溶劑萃取法，從所述反應混合物中分離出未反應物和式(IV)基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。
現在已經發現了大量可對映體選擇性水解所述內酰胺鍵以生成所需異構體的酶。我們現在已經發現了由桿菌屬衍生的酶，特別是體現在活性方面，例如枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin carlsberg)(ALTUS)以對映體過量73％由所述外消旋混合物(V)中生成N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮[(IV)，P＝叔丁氧羰基]。其他的酶包括桿菌屬蛋白酶、Neutrase、Novozyme 243、Alcalase和Savinase以及由ALTUS和NOVO市售獲得的酶。由其他來源獲得的具有對映體選擇性水解作用的酶也可以使用，例如豬肝酯酶(ALTUS)、豬胰脂酶(Biocatalysts)、Flavorpro-192(肽酶，Biocatalysts)、Flavorpro-373(谷氨酰胺酶，Biocatalysts)、Promod-TP(肽鏈內切酶，Biocatalysts)、脂酶-CE(Humicolalanuginosa，Amano)、蛋白酶-M(曲霉屬，Amano)、曲酶生成酶-6(曲霉屬，Amano)、脂酶PGE(腓腸根和唾液腺，Amano)和曲霉屬酰基酶(Sigma)。
特別是現已發現，在此優選使用市售的酰胺酶Savinase(NOVO)表現出N-保護的(1S，4R)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物轉化率適于工業規模上應用。Savinase是一種經嗜堿芽孢桿菌屬(alkalophilic species of Bacillus)浸入發酵制備的蛋白分解酶，它是一種絲氨酸型內切蛋白酶。在我們所進行的試驗中，在通常使用的條件下，該酶沒有表現出任何能水解式(II)未酰化的內酰胺外消旋混合物的能力。
N-保護的(1S，4R)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物轉化較理想地是在pH 6-11，優選7-9范圍內進行。優選使用的溫度范圍在20-50℃。最優選的方法是在pH約為8和溫度約為30℃下進行。Savinase底物的比例范圍為1∶1-10∶1，例如2∶1-5∶1(w/w)將獲得完全、迅速的反應，對于所述酶的最佳比例可通過簡單試驗容易地測定。
其中P是叔丁氧羰基的式(V)起始化合物可由相應的未被保護的式(II)外消旋內酰胺按照Taylor等人在Tet.Asymmetry，4，p.1117(1993)中所述相似方法制備。其中P是甲酰基或低級鏈烷酰基的式(V)化合物可由相應的未被保護的式(II)外消旋內酰胺按照T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesi s”，Wiley，NewYork，1981，pp.218-287和J.F.W.McOmie，“Protective Groupsin Organic Chemistry”，Plenam Press，New York，1973，pp.43-93所述方法或相似方法制備。
所述式(IV)化合物可容易地經水解轉變成相應的N-保護的氨基酸。用能夠將羧酸轉變成醇的試劑，例如氫化鋰鋁或硼烷，可將所述N-保護的氨基酸容易地轉變成相應的式(VI)氨基醇。
另外，按照例如Tet.Asymm，4，p.1117(1993)所述方法，式(IV)化合物可直接轉變成相應的式(VI)開環氨基醇。
下列實施例僅試圖闡明本發明，而對本發明保護范圍不起任何限定作用。
實施例1篩選幾種能對映體選擇性水解外消旋(±)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯[(V)，P＝叔丁氧羰基]內酰胺鍵的水解酶。室溫下，在機械攪拌下的含有1mg/ml所述外消旋化合物在50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(v/v)(50mM pH 7)中的溶液的玻璃瓶(4ml工作體積)中室溫下進行反應。加入每種酶，使最終濃度達到25mg/ml，這表明，酶與底物的比為25∶1(w∶w)，從篩選目的上講，這應當能檢測到任何可能的水解活性。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spherisorb C6(15×0.46cm)室溫1ml/min下平衡流動相30％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長200nm。
檢測表明，在反應條件下，(±)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯的化學水解作用可忽略不計。Chiralyser(HPLC光學旋光檢測儀)測得旋光性為負號，表明幾種酶對映體選擇性地水解所述外消旋化合物，得到(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯。選擇Savinase做進一步研究。將含有約50％所述原料的反應混合物經手性hplc分析，殘余的內酰胺顯示，其對映體過量96.3％。
另外，殘余底物具有合成abacavir的正確絕對構型。
手性hplc柱Chiralcel OD-H(25×0.46cm)5℃0.5ml/min下平衡流動相2％(v/v)異丙醇/庚烷檢測波長205nm。
對比實施例1在50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7)中，以1mg/ml(4ml工作體積)用Savinase(由NOVO獲得)處理含有外消旋內酰胺(±)2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)的溶液。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spherisorb C6(15×0.46cm)室溫1ml/min下平衡流動相4％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長200nm。
室溫下培養4天后，無反應。
實施例230℃下，將Savinase(30g，NOVO)加入到含有10g外消旋(±)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯[(V)，P＝叔丁氧羰基]的50∶50(v/v)四氫呋喃/50mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)溶液中。所述反應用手性HPLC監測至多2天。
反應完成后(轉化率約51％，(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯的對映體過量＞99.8％)，將所述酶過濾，用碳酸氫鈉溶液將澄清溶液的pH升至9。然后，將其用3×200ml己烷萃取。合并的有機相用100ml碳酸氫鈉溶液反萃取，隨后用100ml鹽水洗滌。蒸發并干燥，得到可自由流動的白色固體(4.2g，理論上分離產率的84％)。NMR鑒定其為(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯；手性HPLC測得對映體過量＞99.8％。
手性hplc柱Chiralcel OD-H(25×0.46cm)平衡，0.5ml/min流動相2％(v/v)異丙醇/庚烷監測波長205nm溫度5℃。
實施例3將上述(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯(3.5g)的四氫呋喃(10ml)溶液加入到硼氫化鈉(1.27g)的甲醇(10ml)懸浮液中并將混合物于約20℃下攪拌約18小時。再加入一定量的四氫呋喃(10ml)和硼氫化鈉(1.27g)并再繼續攪拌約2小時。小心地加入2摩爾鹽酸(30ml)，隨后加入甲苯(20ml)。將兩層分層，水層進一步用甲苯(2×25ml)萃取，合并的有機萃取液用鹽水(20m1)洗滌，硫酸鈉干燥并蒸發，得到淺黃色膠狀(1R，4S)(4-羥甲基)-環戊-2-烯-1-基氨基甲酸叔丁基酯(3.23g)，手性hplc測得對映體過量為99.2％，光譜和色譜與真實樣品相同。
手性hplc柱Chiralcel OD(25×0.46cm)流速1.0ml/min流動相3％(v/v)異丙醇/庚烷檢測波長205nm溫度35℃。
實施例4對Savinase對映體選擇性水解外消旋順式-2-乙酰基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的內酰胺鍵的能力進行試驗。室溫下，在機械攪拌下的含有1mg/ml底物的50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(v/v)(50mM，pH 7)溶液的玻璃瓶(4ml工作體積)中進行反應。通過加入Savinase使最終濃度達到25mg/ml開始反應。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spheri sorb C6(15×0.46cm)20℃1ml/min下平衡流動相5％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長210nm。
手性hplc柱Chiralpak AD(25×0.46cm)20℃1ml/min下平衡流動相2％(v/v)乙醇/庚烷檢測波長215nm。
檢測表明，在無酶存在的情況下，所述底物在反應條件下的化學水解作用可忽略不計。但是，如果在反應混合物中省略四氫呋喃，則存在有明顯的底物的非酶水解作用。Chiralyser和手性hplc分析顯示旋光性為負號，表明Savinase可對映體選擇性地水解外消旋順式-2-乙酰基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮化合物，得到(-)(1R，4S)2-乙酰基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。2天后，對含有約50％所述原料的反應混合物進行手性hplc分析，殘余的內酰胺顯示，與真實樣品相比，其對映體過量＞99.8％，具有合成abacavir的正確絕對構型。
權利要求
1.一種制備基本上對映體純的下列式(IV)N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的方法，
其中P是活化基團和保護基，其中將N-保護的(±)2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物用酰基酶處理，
其中P是活化基團和保護基，并用常規方法從所述反應混合物中分離出未反應的式(IV)對映體。
2.一種對映體拆分N-保護的(±)2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物以生成基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(IV)的方法，
其中P是活化基團和保護基，該方法包括用酰基酶處理所述混合物。
3.權利要求1或權利要求2所述方法，其中P是酰基或氧羰基基團。
4.權利要求1-3中任一權利要求所述的方法，其中P是甲酰基或含有1-4個碳原子的鏈烷酰基。
5.權利要求1-3中任一權利要求所述的方法，其中P是烷氧羰基或芳烷氧羰基基團。
6.權利要求5所述方法，其中P是叔丁氧羰基或芐氧羰基基團。
7.上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述酰基酶是由桿菌屬(Bacillus sp.)衍生的。
8.權利要求7所述方法，其中所述酰基酶是Savinase。
9.上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述反應在有機溶劑和水的混合物中進行。
10.權利要求9所述方法，其中所述有機溶劑是水可混溶的有機溶劑并且使用體積少于70％水。
11.權利要求10所述方法，其中所述水可混溶的有機溶劑是四氫呋喃或1，4-二氧雜環己烷。
12.上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述反應在pH范圍為6-11和20-50℃溫度下進行。
13.權利要求12所述方法，其中所述反應在pH約為8和溫度約為30℃下進行。
14.上述權利要求中任一權利要求所述方法，其中所述未反應的式(IV)N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮經溶劑萃取法分離。
全文摘要
本發明涉及一種通過用桿菌屬衍生的酰基酶處理所述混合物,由其外消旋物制備基本上對映體純的式(Ⅳ)中間體(其中P是活化基團和保護基)的方法。
文檔編號A61K31/16GK1261405SQ98806479
公開日2000年7月26日 申請日期1998年8月20日 優先權日1997年8月22日
發明者M·J·道森, M·馬毛蒂安, C·J·瓦利斯 申請人:葛蘭素集團有限公司