含有幽門螺桿菌FlgE多肽的疫苗組合物的制作方法

專利名稱：含有幽門螺桿菌FlgE多肽的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引發(fā)針對幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽和疫苗。本發(fā)明還涉及幽門螺桿菌多肽在生產(chǎn)治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的組合物中的用途。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌革蘭氏陰性細(xì)菌幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種重要的人類病原體，與幾種胃十二指腸疾病有關(guān)。細(xì)菌對胃上皮的定居引起活動炎癥和進(jìn)行性慢性胃炎，使發(fā)展成消化道潰瘍的風(fēng)險大大增加。胃粘膜的終身炎癥與胃癌的機(jī)率增加密切相關(guān)。
為了定居于胃粘膜，幽門螺桿菌使用多種毒力因子。這些毒力因子包括幾種粘附素，脲酶和蛋白水解酶，粘附素使細(xì)菌與粘膜粘附或與上皮細(xì)胞結(jié)合，脲酶幫助中和酸性環(huán)境，蛋白水解酶使粘膜流質(zhì)化。此外，幽門螺桿菌是高度運動性的，可在粘膜中游動并穿入腺管。運動性似乎是一種必須的毒力因子，因為在實驗?zāi)Ｐ椭蟹沁\動性幽門螺桿菌不能感染粘膜(Eaton et al.Infection & Immunity 64(7)，2445-2448，1996)。對此有多種可能的原因，最為明顯的是無法游動到粘膜細(xì)胞并進(jìn)行粘附，不能規(guī)避胃中的有毒成分。
盡管宿主對幽門螺桿菌會產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生局部(粘膜)和全身抗體，但該病原體在宿主胃粘膜中持續(xù)存在，通常是終身存在。原因可能是自動引發(fā)的免疫應(yīng)答不足或針對抗原的錯誤表位?；蛘?，可能是免疫應(yīng)答的類型錯誤，因為免疫系統(tǒng)可能把幽門螺桿菌作為共生對待(由終身宿主/細(xì)菌關(guān)系推測)。
為了理解幽門螺桿菌感染的發(fā)病機(jī)制和免疫學(xué)，闡明該細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)具有重要意義。具體而言，需要鑒定表面暴露的、表面結(jié)合的和分泌的蛋白，在許多細(xì)菌病原體中，這些蛋白已被證明構(gòu)成主要的毒力因子，可用于對幽門螺桿菌的診斷和疫苗組合物的生產(chǎn)。如果這些蛋白除了是表面結(jié)合的蛋白之外，對細(xì)菌的存活和/或定居也是必須的，則其作為疫苗介導(dǎo)的免疫治療靶標(biāo)的用途增加。
當(dāng)受到脅迫或威脅時，幽門螺桿菌細(xì)胞從桿狀轉(zhuǎn)變成球狀。在球狀形式下，幽門螺桿菌細(xì)胞對抗生素和其它抗細(xì)菌劑更不敏感。間接證據(jù)表明，球狀的幽門螺桿菌可在個體之間傳播，可能是通過水或間接接觸(口-口，或糞-口)。因此有效的疫苗組合物應(yīng)當(dāng)針對球狀和桿狀形式的幽門螺桿菌均可引發(fā)免疫應(yīng)答。由于全身免疫在對粘膜感染的保護(hù)中可能作用有限，疫苗組合物增加胃局部的保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制也有重要意義。
鞭毛鉤蛋白來自幽門螺桿菌的鞭毛鉤已被證明由78kDa的FlgE亞單位組成(O’Toole et al.Molecular Microbiology，14(4)，691-703，1994)。鞭毛鉤的作用是連接鞭毛與膜下的鞭毛發(fā)動器。鞭毛鉤伸出細(xì)胞膜外的部分較短，大約為60納米(相形之下鞭毛大約為10微米)。象鞭毛一樣，鞭毛鉤可能也覆蓋著鞘(Geis et al.(1993)J.Med.Microbiol.38(5)，371-377)。
FlgE多肽的氨基酸序列與其它已知的鉤蛋白具有明顯的類似性，包括與其它螺桿菌種類如鼴鼠螺桿菌的有限同源性(O’Toole etal.上文)。針對FlgE多肽的多克隆抗體顯示針對鞭毛蛋白A和B的交叉反應(yīng)性，表明可能存在共同的表位。FlgE敲除的幽門螺桿菌為無鞭毛的非運動性細(xì)菌，其中仍然產(chǎn)生FlgE多肽，但僅見于細(xì)胞質(zhì)中。
附圖簡述

圖1用FlgE多肽免疫接種幽門螺桿菌感染小鼠的治療作用。結(jié)果表示為竇內(nèi)(＝A)、體內(nèi)(＝B)或全部(A+C)(＝C)幽門螺桿菌數(shù)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤?？s寫含義為CFU＝集落形成單位(細(xì)菌的數(shù)量)；空白柱體＝DOC+CT，每只小鼠給予含0.5％脫氧膽酸的磷酸緩沖鹽水和10μg霍亂毒素；陰影柱體＝FlgE+CT，每只小鼠給予100μg FlgE和10μg霍亂毒素。在竇中的CFU和全胃的計算值下降明顯。
**p＜0.01；*p＜0.05(Wilcoxon-Mann-Whittney秩和檢驗)圖2ELISA測定的小鼠血清IgG對感染的應(yīng)答和對FlgE免疫接種的應(yīng)答。數(shù)值表示為平均滴度±標(biāo)準(zhǔn)誤。n＝每組9-10。ELISA用幽門螺桿菌244菌株包被作為幽門螺桿菌感染的指標(biāo)，在DOC+CT治療(＝A對照/244)的動物血清中可見到特異抗體。用FlgE+霍亂毒素(＝B FlgE/244)免疫接種之后，該活性增加了4倍(**p＜0.01；Wilcoxon-Mann-Whittney秩和檢驗)。C＝FlgE特異的。在給予FlgE+CT的動物中特異性FlgE IgG增加，但在對照動物中檢測不到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗原性幽門螺桿菌多肽，其可用于引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答和對幽門螺桿菌感染進(jìn)行診斷。通過編碼保守的必需多肽的幽門螺桿菌基因的重組克隆實現(xiàn)了該目的。該基因的核酸序列類似于O’Toole等(Molecular Microbiology，14(4)，691-703，1994)報導(dǎo)的flgE基因序列。由于是運動必需的蛋白，flgE基因在所有的幽門螺桿菌菌株中均有表達(dá)。
盡管只有小部分鉤蛋白存在于細(xì)菌外并且可能覆蓋有鞘，我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與佐劑霍亂毒素一起給藥，幽門螺桿菌FlgE多肽在幽門螺桿菌感染小鼠中可作為治療性抗原。因此以下實驗數(shù)據(jù)顯示，幽門螺桿菌FlgE多肽作為口服免疫原時，可刺激免疫應(yīng)答，引起實驗小鼠中幽門螺桿菌定居的顯著下降，實驗小鼠在免疫接種前1個月用幽門螺桿菌感染。
這些結(jié)果有力地支持在人用口服疫苗制劑中使用FlgE多肽來治療和預(yù)防幽門螺桿菌感染。因此，F(xiàn)lgE多肽可用于檢測幽門螺桿菌感染和生產(chǎn)疫苗組合物，該疫苗組合物在以合適的藥物制劑形式給藥時，可以引發(fā)針對這些感染的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明一方面提供幽門螺桿菌FlgE多肽，用于引發(fā)對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。“幽門螺桿菌FlgE多肽”指O’Toole等(Molecular Microbiology，14(4)，691-703，1994)公開的多肽，其編碼基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO1，或可獲自國家生物技術(shù)信息中心(入藏號U09549)，或者還包括抗原功能等價的所述多肽的基本類似的修飾形式。
“保護(hù)性免疫應(yīng)答”應(yīng)理解為使組合物適于治療和/或預(yù)防目的的免疫應(yīng)答。
“抗原功能等價”應(yīng)理解為能引發(fā)全身性和粘膜免疫應(yīng)答而降低胃粘膜中的幽門螺桿菌細(xì)胞數(shù)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知方法如體內(nèi)誘導(dǎo)抗體的表位作圖可以鑒定抗原功能等價的FlgE多肽的修飾形式。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用于引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的幽門螺桿菌FlgE多肽具有基本上如序列表中SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，或是抗原功能等價的其修飾形式。
因此，應(yīng)當(dāng)理解，幽門螺桿菌FlgE多肽的定義不僅限于氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2完全相同的多肽。本發(fā)明還包括具有置換、小缺失、插入或倒轉(zhuǎn)等修飾的多肽，但該多肽具有與幽門螺桿菌FlgE多肽基本相同的生物活性并且抗原功能等價。因此，幽門螺桿菌FlgE多肽的定義包括以下多肽其氨基酸序列與序列表中SEQ IDNO2所示氨基酸序列至少90％同源，優(yōu)選至少95％同源。
另一方面，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，用于引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，該組合物包括免疫有效量的如上所述幽門螺桿菌FlgE多肽，還可任選包括可藥用的載體或稀釋劑。
在本文中，“免疫有效量”應(yīng)理解為引發(fā)針對幽門螺桿菌的明顯保護(hù)性免疫應(yīng)答，在感染哺乳動物中根除幽門螺桿菌感染或在易感哺乳動物中預(yù)防感染的量。一般，口服時免疫有效量包括大約1μg到1000mg，優(yōu)選大約10μg到100mg幽門螺桿菌抗原，胃腸外給藥時包括大約少于100μg的幽門螺桿菌抗原。
疫苗組合物中除可藥用載體或稀釋劑外還可任選含有一種或幾種其它預(yù)防或治療用免疫活性抗原。生理相容的載體和稀釋劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括例如磷酸緩沖鹽水(PBS)或在口服疫苗時為基于碳酸氫鹽的制劑或腸道包衣粉劑。
疫苗組合物還可任選含有或與酸分泌抑制劑一起給藥，優(yōu)選為奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑(PPI)。疫苗可配制在已知的運送系統(tǒng)中，如脂質(zhì)體、ISCOM、匙形體(cochleate)等(見Rabinovich et al(1994)Science 265，1401-1404)，或者結(jié)合于或包含在降解性或非降解性聚合物微球中。抗原可以與活減毒細(xì)菌、病毒或噬菌體或其殺死的載體結(jié)合?？乖梢曰瘜W(xué)或遺傳上與惰性或佐劑型(即霍亂B亞單位)載體蛋白偶聯(lián)。因此，本發(fā)明另一方面提供了上述疫苗組合物，其中也包含霍亂毒素等佐劑。這些可藥用形式的霍亂毒素在本領(lǐng)域是已知的，如可參見Rappuoliet al(1995)Int.Arch.Allergy & Immunol.108(4)，327-333；Dickinson et al(1995)Infection & Immunity63(5)，1617-1623。
本發(fā)明的疫苗組合物可用于治療和預(yù)防目的。因此，本發(fā)明包括一種上述疫苗組合物，可用作感染了幽門螺桿菌的哺乳動物包括人的治療或預(yù)防疫苗。在本文中“預(yù)防目的”是指誘導(dǎo)保護(hù)免于將來的幽門螺桿菌感染的免疫應(yīng)答，而“治療用途”是指誘導(dǎo)可根除現(xiàn)存的幽門螺桿菌感染的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選給予任何哺乳動物粘膜，例如頰、鼻、扁桃體、胃、腸(小腸和大腸)、直腸和陰道粘膜。為此目的粘膜疫苗可以與合適的佐劑一起給藥。疫苗也可經(jīng)口服、胃腸外、皮下、皮內(nèi)或肌肉給藥，任選與合適的佐劑一起給藥。疫苗組合物也可任選與抗微生物治療劑一起給藥。
另一方面，本發(fā)明提供了上述幽門螺桿菌FlgE多肽在以下產(chǎn)品的生產(chǎn)中的用途(i)治療、預(yù)防或診斷幽門螺桿菌感染的組合物；(ii)用于引發(fā)針對幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗；(iii)診斷幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒。
另一方面，本發(fā)明提供了體外診斷幽門螺桿菌感染的方法，包括至少一個步驟，其中使用上述幽門螺桿菌FlgE多肽，可任選以固相載體標(biāo)記或與其偶聯(lián)。該方法可包括例如步驟(a)使幽門螺桿菌FlgE多肽與哺乳動物體液接觸，所述多肽可任選與固相載體結(jié)合；和(b)檢測與所述FlgE多肽結(jié)合的所述體液的抗體。檢測抗體的優(yōu)選方法是本領(lǐng)域熟知的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)方法。
另一方面，本發(fā)明提供了檢測哺乳動物包括人中的幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒，其中包括可以進(jìn)行上述體外診斷方法的成分。所述診斷試劑盒可包括例如(a)幽門螺桿菌FlgE多肽；(b)檢測與該FlgE多肽結(jié)合的抗體。所述檢測抗體的試劑可以是例如酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白和該酶的顯色底物。
再一方面，本發(fā)明提供了引發(fā)哺乳動物包括人的針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該哺乳動物給予免疫有效量的上述幽門螺桿菌FlgE多肽的步驟，或向該哺乳動物給予免疫有效量的上述疫苗組合物。
實驗方法在本說明書中，在涉及分子克隆技術(shù)時“標(biāo)準(zhǔn)方法”或“標(biāo)準(zhǔn)步驟”應(yīng)理解為普通實驗手冊上的方法和步驟，實驗手冊如《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，F(xiàn).Ausubel等編輯，John Wiley and Sons，Inc.1994，或Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY 1989。
重組幽門螺桿菌FlgE多肽的制備DNA序列信息編碼FlgE多肽的基因的序列信息獲自國家生物技術(shù)信息中心(入藏號U09549；SEQ ID NO1)。
含有幽門螺桿菌J99菌株膜蛋白和分泌蛋白ORF的DNA序列的PCR擴(kuò)增和克隆所述序列使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通過擴(kuò)增克隆克隆自幽門螺桿菌J99菌株?；虻?’和3’末端特異的合成寡核苷酸引物(見下文)由廠家設(shè)計并購買(GibcoBRL Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)。FlgE的正向引物(特異針對序列的5’末端)被設(shè)計成在5’最末端包括一個NcoI克隆位點，而反向引物在最末端包括一個EcoRI位點，以便允許每一個幽門螺桿菌序列被克隆進(jìn)pET28b載體的讀框中?？寺〉絧ET-28b載體的NcoI-EcoRI位點的插入片段與一段載體DNA序列融合，該載體序列編碼包括6個組氨酸殘基(在C端最末端)的20個羧基末端氨基酸。
正向引物(SEQ ID NO3)5’-TAT ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3’反向引物(SEQ ID NO4)5’-GCC AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3’由幽門螺桿菌J99菌株制備的基因組DNA用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板來源(《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，F(xiàn).Ausubel等編輯，John Wileyand Sons，Inc.1994)。為了擴(kuò)增含有幽門螺桿菌ORF的DNA序列，將50ng基因組DNA加入反應(yīng)管中，反應(yīng)管中含有2mM氯化鎂，1μM與幽門螺桿菌ORF互補(bǔ)并延伸至其側(cè)翼的合成寡核苷酸引物(正向和反向引物)，dATP，dGTP，dCTP，cTTP各0.2mM，和2.5單位熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(Amplitaq，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ，USA)，終體積為100μl。使用以下熱循環(huán)條件和Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600熱循環(huán)儀獲得每種ORF的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物94℃變性2分鐘；94℃ 15秒，30℃ 15秒和72℃ 1.5分鐘2個循環(huán)；94℃ 15秒，58℃ 15秒和72℃ 1.5分鐘23個循環(huán)；72℃ 6分鐘后反應(yīng)結(jié)束。
熱循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，洗滌各擴(kuò)增DNA樣品并使用Qiaquick SpinPCR純化試劑盒純化(Qiagen，Gaithersburg，MD，USA)。擴(kuò)增的DNA樣品按標(biāo)準(zhǔn)方法使用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI消化，然后在1.0％ NuSeive(FMC BioProducts，Rockland，ME USA)瓊脂糖凝膠上電泳。DNA使用溴化乙錠和長波UV輻射觀察。使用Bio 101GeneClean Kit方法(Bio 101 Vista，CA USA)純化由凝膠膠條中分離的DNA。
將幽門螺桿菌DNA序列克隆進(jìn)pET-28b原核表達(dá)載體用于克隆的pET-28b載體按照標(biāo)準(zhǔn)步驟通過NcoI和EcoRI消化制備。消化后，DNA插入片段根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟克隆進(jìn)事先消化的pET-28b表達(dá)載體。連接反應(yīng)產(chǎn)物然后用于轉(zhuǎn)化以下所述大腸桿菌BL21菌株。
用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用攜帶有克隆的幽門螺桿菌序列的重組pET表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌大腸桿菌BL21菌株或大腸桿菌BL21(DE53)菌株。簡而言之，1μl連接反應(yīng)物與50μl電感受態(tài)細(xì)胞混合，并施以高電壓脈沖，然后，樣品在0.45ml SOC培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，2.0％胰胨，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4以及20mM葡萄糖)中37℃振蕩溫育1小時。樣品然后涂布在含25μg/ml硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板上生長過夜。然后挑取轉(zhuǎn)化的BL21菌落并進(jìn)行分析以便如下所述評價克隆的插入片段。
鑒定攜帶幽門螺桿菌序列的重組pET表達(dá)質(zhì)粒用重組pET-28b幽門螺桿菌基因轉(zhuǎn)化的單獨BL21克隆如下分析使用與原來的PCR擴(kuò)增克隆反應(yīng)中相同的、各幽門螺桿菌序列特異的正向和反向引物對克隆的插入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟的成功擴(kuò)增證實了幽門螺桿菌序列整合在表達(dá)載體中。
從BL21轉(zhuǎn)化子中分離和制備質(zhì)粒DNA挑取攜帶有正確克隆的幽門螺桿菌ORF的重組pET-28b載體的單獨克隆，在5ml添加了25μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中溫育過夜。次日使用Qiagen質(zhì)粒純化方法(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，USA)分離和純化質(zhì)粒DNA。
重組幽門螺桿菌序列在大腸桿菌中的表達(dá)為克隆或制備質(zhì)粒，pET載體可在任何大腸桿菌K-12菌株如HMS174，HB101，JM109，DH5α等中增殖。表達(dá)宿主包括含有T7 RNA聚合酶基因的染色體拷貝的大腸桿菌菌株。這些宿主是細(xì)菌噬菌體DE3的溶源菌、攜帶有l(wèi)acI基因，lacUV5啟動子和T7 RNA聚合酶的λ衍生物。T7 RNA聚合酶通過加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄攜帶其目標(biāo)基因的任何靶質(zhì)粒如pET-28b。我們實驗室中使用的菌株包括BL21(DE3)(Studier，F(xiàn).W.，Rosenberg，A.H.，Dunn，J.J.和Dubendorff，J.W.(1990)酶學(xué)方法，185，60-89)。
為了表達(dá)重組幽門螺桿菌序列，50ng上述分離的質(zhì)粒DNA用來轉(zhuǎn)化上述感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)菌(由Novagen以pET表達(dá)系統(tǒng)試劑盒的一部分提供)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時，然后培養(yǎng)物涂布含25μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板。次日，合并細(xì)菌菌落，在含硫酸卡那霉素(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基中生長至600納米光密度為0.5到1.0 O.D.單位，此時向培養(yǎng)基中加入1mM IPTG 3小時，以誘導(dǎo)幽門螺桿菌重組DNA構(gòu)建物的基因表達(dá)。
用IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)之后，用Sorvall RC-3B離心機(jī)在3500×g，4℃離心15分鐘使細(xì)菌沉淀。沉淀重懸于50毫升冷的STE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl和0.1mM EDTA)中。細(xì)胞然后在4℃，2000×g離心20分鐘。濕沉淀稱重并在-80℃凍存以備進(jìn)行蛋白純化。
分析方法純化蛋白制備物的濃度使用由氨基酸含量計算的吸收系數(shù)以分光光度法確定(Perkins，S.J.1986 Eur.J.Biochem.157，169-180)。蛋白濃度也使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以另一種方法確定(Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248-254，Lowry，O.H.，Rosebrough，N.Farr，A.L.&Randall，R.J.(1951))。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠(12％或4-25％的梯度丙烯酰胺)購自BioRad(Hercules，CA，USA)，并用考馬斯亮藍(lán)染色。分子量標(biāo)記包括兔骨骼肌肌球蛋白(200kDa)、大腸桿菌β-半乳糖苷酶(116kDa)、兔肌肉磷酸酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(45kDa)、牛碳酸酐酶(31kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(21.5kDa)，卵白溶菌酶(14.4kDa)和牛抑酶肽(6.5kDa)。
由包涵體純化FlgE在4℃進(jìn)行以下步驟。細(xì)胞沉淀重懸于裂解緩沖液中，緩沖液中含有10％甘油，100μg/ml溶菌酶，5mM EDTA，1mM PMSF和0.1％β-巰基乙醇。通過細(xì)胞破碎器后，所得的勻漿物加入0.2％DOC，攪拌10分鐘，然后離心(10000g×30min)。沉淀首先用含有10％甘油，10mM EDTA，1％Triton X-100，1mM PMSF和0.1％β-巰基乙醇的裂解緩沖液洗滌，然后用含有1M尿素，1mM PMSF和0.1％β-巰基乙醇的裂解緩沖液洗滌。所得的白色沉淀主要由包涵體組成，不含未破碎的細(xì)胞和膜成分。
在室溫進(jìn)行以下步驟。包涵體溶解于20毫升含有1mM EDTA，1mMPMSF和0.1％β-巰基乙醇以及8M尿素的裂解緩沖液中，室溫溫育1小時。不溶的物質(zhì)通過離心(100,000×g，30分鐘)除去。過濾清亮的上清液，上樣于用含8M尿素的裂解緩沖液平衡的Ni2+-NTA瓊脂糖柱。用250毫升(5倍床體積)含1mM PMSF、0.1％β-巰基乙醇以及8M尿素的裂解緩沖液洗柱，依次用含8M尿素、1mM PMSF、0.1％β-巰基乙醇以及20，100，200和500mM咪唑的裂解緩沖液洗脫。通過OD280的吸收值監(jiān)測各級分，峰值級分用SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍(lán)染色可見到兩條帶，主要帶的分子量為78kDa，次要帶的分子量為60kDa。經(jīng)分析重組FlgE(78kDa)的純度大于90％。同可溶性蛋白的純化一樣，含有重組蛋白的級分用100mM咪唑洗脫下來。
對含有0.5％DOC的TBS透析，按以下次序依次減少尿素濃度6M，4M，3M，2M，1M，0.5M然后是0M，從FlgE多肽中慢慢除去尿素。每一個透析步驟至少在室溫下進(jìn)行4小時。
透析后，使用Amicon攪拌室通過加壓過濾使樣品濃縮。然后通過Perkins，Bradford和Lowry方法測定蛋白濃度。
實施例實施例1治療性免疫接種1.材料與方法1.1動物雌性SPF BALB/c小鼠購自Bomholt育種中心(丹麥)。在普通makrolon飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)，自由取食和飲水。抵達(dá)時動物為4到6周齡。
1.2感染在馴化至少一周后，用幽門螺桿菌2型菌株(菌株244，最初分離自潰瘍病人)感染動物。該菌株以前已被證實容易定居于小鼠胃內(nèi)。-70℃保存的原種細(xì)菌在37℃于微需氧氣氛下(10％ CO2，5％O2)在補(bǔ)加有10％胎牛血清的Brucella培養(yǎng)液中生長過夜。動物口服給予奧美拉唑(400μmol/kg)，3-5小時后口服接種幽門螺桿菌(每只動物大約107-108CFU)。接種2-3周后在對照動物中檢查感染。
1.3免疫接種感染1個月后，兩組小鼠(每組10只)在34天內(nèi)接種4次(第1、15、25、35天)。純化重組FlgE溶解在添加有0.5％脫氧膽酸(DOC)的PBS中，給藥劑量為每只小鼠100微克。
每次免疫接種時，對照組和FlgE組每只小鼠均給予10微克霍亂毒素作為佐劑。免疫接種前3-5小時，口服給予奧美拉唑(400μmol/kg)用來保護(hù)抗原免于酸降解。最后一次免疫后1-2周處死動物。
第1組300μl PBS+0.5％ DOC+10μg CT第2組300μl PBS+0.5％ DOC+10μg CT+100μg FlgE1.4感染分析小鼠通過CO2和斷頸處死。打開胸腔和腹腔，通過心臟穿刺取血樣。然后取出胃。沿胃大彎切開胃，用鹽水洗滌，然后切成相等的兩片。用手術(shù)刀分別自胃竇和胃體刮下25mm2的粘膜。刮下的粘膜懸浮在Brucella培養(yǎng)液中，稀釋并涂布在Blood Skirrow平板上。平板在微需氧條件下溫育3-5天，計數(shù)集落數(shù)量。通過脲酶和觸酶試驗和直接鏡檢或革蘭氏染色確認(rèn)培養(yǎng)物為幽門螺桿菌。
1.5抗體測定自血樣中收集血清抗體。濃縮前，血樣以等量PBS稀釋。血清在-20℃保存以待分析。使用ELISA測定血清抗體，平板用幽門螺桿菌菌株244顆粒部分或FlgE覆蓋，然后加入不同稀釋度的血清。ELISA用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體顯色?？笽g抗體為抗重鏈/抗輕鏈型，應(yīng)能檢測各種類型的抗體。
2.結(jié)果2.1治療性免疫接種對CFU的影響本試驗中的動物在免疫接種前1個月用幽門螺桿菌菌株244感染。每組10只小鼠然后用霍亂毒素(CT)或CT與重組FlgE多肽免疫接種。最后一次免疫接種后4周，處死動物，測定CFU(圖1)。僅用CT處理的動物胃體和胃竇均大量感染。用重組FlgE多肽和CT免疫接種的動物與CT處理動物相比胃竇和全胃CFU值明顯下降(分別為p＜0.01，p＜0.05；Wilcoxon-Mann-Whittney符號等級試驗)。
2.2治療性免疫接種對抗體形成和分泌的影響作為感染幽門螺桿菌的指示，在血清中可見到特異性抗體(對照/244)。在給予FlgE+CT的動物中，抗244菌株的滴度(作為膜蛋白)增加了4倍(p＜0.01)。僅在給予FlgE+CT的動物中可檢測到抗FlgE的特異血清IgG滴度(圖2)。
FlgE特異的IgG在給予FlgE+CT的動物中增加，但在對照動物中檢測不到。
本文結(jié)果表明在口服給藥并給予霍亂毒素作為佐劑時重組FlgE幽門螺桿菌多肽是高度免疫原性的，可檢測到全身FlgE特異性Ig抗體的增加。用FlgE免疫接種也導(dǎo)致抗幽門螺桿菌顆粒組分的Ig滴度的顯著增加。此外，在免疫接種FlgE和霍亂毒素后，感染小鼠胃粘膜定居幽門螺桿菌的數(shù)量顯著下降。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)收件人Astra AB(B)街道Vastra Malarehamnen 9(C)城市Sodertalje(E)國家Sweden(F)郵編S-151 85(G)電話+46855326000(H)傳真+46855328820(ii)發(fā)明名稱疫苗組合物V(iii)序列數(shù)4(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度2550個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)有機(jī)體幽門螺桿菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置321..2477(D)其它信息/產(chǎn)物＝“FlgE鞭毛鉤蛋白”(x)公開信息(A)作者O’Toole，Paul W.
(B)名稱幽門螺桿菌非運動性突變體和鼴鼠螺桿菌鞭毛鉤生成缺陷體(C)雜志分子微生物學(xué)(D)卷號14(E)期號4(F)頁碼691-703(G)日期1994(xi)序列描述SEQ ID NO1AACAAAGCGA TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC60GCGCTTCAGC CGAAGAGATT CAAGATCATG AATGCGCGAT TTTGCACTAA AGCGAGTTAG 120ATTCTTAAAT TTGAGCGATA ACCTTTAAAA AGCGTAATTA AGGGGTGGTG TTACAAAACC 180CCCTATCCCC TTATGAATTT GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT 240CAATCATTCT AAAAAGCTAT TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT 300CTTTAAATTA AAGGATAACC ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT 350Met Leu Arg Ser Leu Trp Ser Gly Val Asn1 5 10GGG ATG CAA GCC CAC CAA ATC GCT TTG GAT ATT GAG AGT AAC AAT ATT 398Gly Met Gln Ala His Gln Ile Ala Leu Asp Ile Glu Ser Asn Asn Ile15 20 25GCG AAC GTG AAT ACC ACT GGT TTT AAG TAT TCT AGG GCT TCT TTT GTG 446Ala Asn Val Asn Thr Thr Gly Phe Lys Tyr Ser Arg Ala Ser Phe Val30 35 40GAT ATG CTT TCT CAA GTC AAA CTC ATC GCT ACC GCA CCC TAT AAA AAC 494Asp Met Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Thr Ala Pro Tyr Lys Asn45 50 55GGG TTA GCA GGG CAG AAT GAT TTT 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NO2資料(i)序列特征(A)長度719氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Arg Ser Leu Trp Ser Gly Val Asn Gly Met Gln Ala His Gln1 5 10 15Ile Ala Leu Asp Ile Glu Ser Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn Thr Thr20 25 30Gly Phe Lys Tyr Ser Arg Ala Ser Phe Val Asp Met Leu Ser Gln Val35 40 45Lys Leu Ile Ala Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Gly Leu Ala Gly Gln Asn50 55 60Asp Phe Ser Val Gly Leu Gly Val Gly Val Asp Ala Thr Thr Lys Ile65 70 75 80Phe Ser Gln Gly Asn Ile Gln Asn Thr Asp Val Lys Thr Asp Leu Ala85 90 95Ile Gln Gly Asp Gly Phe Phe Ile Ile Asn Pro Asp Arg Gly Ile Thr100 105 110Arg Asn Phe Thr Arg Asp Gly Glu Phe Leu Phe Asp Ser Gln Gly Ser115 120 125Leu Val Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Gln Gly Trp Val Arg Asn Gly130 135 140Ser Asp Thr Gly Asn Lys Gly Ser Asp Thr Asp Ala Leu Lys Val Asp145 150 155 160Asn Thr Gly Pro Leu Glu Asn Ile Arg Ile Asp Pro Gly Met Val Met165 170 175Pro Ala Arg Ala Ser Asn Arg Ile Ser Met Arg Ala Asn Leu Asn Ala180 185 190Gly Arg His Ala Asp Gln Thr Ala Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ser Ser195 200 205Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly Ile Asn Pro Val Tyr Asp Ser Gly Thr210 215 220Asn Leu Ala Gln Val Ala Glu Asp Met Gly Ser Leu Tyr Asn Glu Asp225 230 235 240Gly Asp Ala Leu Leu Leu Asn Glu Asn Gln Gly Ile Trp Val Ser Tyr245 250 255Lys Ser Pro Lys Met Val Lys Asp Ile Leu Pro Ser Ala Glu Asn Ser260 265 270Thr Leu Glu Leu Asn Gly Val Lys Ile Ser Phe Thr Arg Asp Ser Ala275 280 285Val Ser Arg Thr Ser Ser Leu Val Ala Ala Lys Asn Ala Ile Asn Ala290 295 300Val Lys Ser Gln Thr Gly Ile Glu Ala Tyr Leu Asp Gly Lys Gln Leu305 310 315 320Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Lys Asn325 330 335Ile Val Val Thr Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe Ala Asn Phe Leu Asp340 345 350Gly Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Lys Tyr Ser Tyr Thr His Ser Ile355 360 365Ser Pro Asn Ala Asn Ser Gly Gln Phe Arg Thr Thr Glu Asp Leu Arg370 375 380Ala Leu Ile Gln His Asp Ala Asn Ile Val Lys Asp Pro Ser Leu Ala385 390 395 400Asp Asn Tyr Gln Asp Ser Ala Ala Ser Ile Gly Val Thr Ile Asn Gln405 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Leu Ala Asn Phe Ala Asn Asp Ala Gly Leu625 630 635 640Gln Ala Leu Gly Gly Asn Val Phe Ser Gln Thr Gly Asn Ser Gly Gln645 650 655Ala Leu Ile Gly Ala Ala Asn Thr Gly Arg Arg Gly Ser Ile Ser Gly660 665 670Ser Lys Leu Glu Ser Ser Asn Val Asp Leu Ser Arg Ser Leu Thr Asn
675 680 685Leu Ile Val Val Gln Arg Gly Phe Gln Ala Asn Ser Lys Ala Val Thr690 695 700Thr Ser Asp Gln Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asn Leu Lys Gln *705 710 715(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“PCR引物”(xi)序列描述SEQ ID NO3TATACCATGG TGCTTAGGTC TTTAT 25(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“PCR引物”(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGAATTCAA TTGCTTAAGA TTCAA 2權(quán)利要求
1.幽門螺桿菌FlgE多肽或抗原功能等價的其修飾形式，用于引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的幽門螺桿菌FlgE多肽，具有基本上如序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，用于引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
3.引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，包括免疫有效量的權(quán)利要求1或2限定的幽門螺桿菌FlgE多肽，可任選包括可藥用載體或稀釋劑。
4.權(quán)利要求3的疫苗組合物，還包括佐劑。
5.權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中佐劑為可藥用形式的霍亂毒素。
6.權(quán)利要求3到5中任一項的疫苗組合物用作感染了幽門螺桿菌的哺乳動物包括人的治療性疫苗。
7.權(quán)利要求3到5中任一項的疫苗組合物用作保護(hù)哺乳動物包括人免于幽門螺桿菌感染的預(yù)防性疫苗。
8.權(quán)利要求1或2的幽門螺桿菌FlgE多肽在生產(chǎn)治療、預(yù)防或診斷幽門螺桿菌感染的組合物中的用途。
9.權(quán)利要求1或2的幽門螺桿菌FlgE多肽在生產(chǎn)引發(fā)針對幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗中的用途。
10.權(quán)利要求1或2的幽門螺桿菌FlgE多肽在生產(chǎn)診斷幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒中的用途。
11.體外診斷幽門螺桿菌感染的方法，包括至少一個步驟，其中使用權(quán)利要求1或2限定的幽門螺桿菌FlgE多肽，該多肽可任選以固相載體標(biāo)記或與其偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的方法，包括以下步驟(a)使所述幽門螺桿菌FlgE多肽與哺乳動物體液接觸，所述多肽可任選與固相載體結(jié)合；和(b)檢測與所述FlgE多肽結(jié)合的所述體液的抗體。
13.在哺乳動物包括人中檢測幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒，包括使權(quán)利要求11或12的方法得以進(jìn)行的成分。
14.權(quán)利要求13的診斷試劑盒，包括(a)幽門螺桿菌FlgE多肽和(b)檢測與所述FlgE多肽結(jié)合的抗體的試劑。
15.在哺乳動物中引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述哺乳動物給予免疫有效量的權(quán)利要求1或2限定的幽門螺桿菌FlgE多肽。
16.在哺乳動物中引發(fā)針對幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述哺乳動物給予免疫有效量的權(quán)利要求3到7中任一項的疫苗組合物。
17.權(quán)利要求書15或16的方法，其中所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及引發(fā)針對幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽和疫苗。本發(fā)明還涉及幽門螺桿菌多肽在生產(chǎn)治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的組合物中的用途。
文檔編號A61P31/00GK1259960SQ9880610
公開日2000年7月12日 申請日期1998年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月12日
發(fā)明者T·博格林德, B·梅爾加爾德 申請人:阿斯特拉公司