防護和處理人皮膚經時性衰老的方法和組合物的制作方法

專利名稱：防護和處理人皮膚經時性衰老的方法和組合物的制作方法
相關的申請本申請部分基于1997年2月25日提交的待批臨時申請60/040,594和1997年4月7日提交的待批臨時申請60/042,976，其內容納入本文作為參考。
發明的背景1.發明的領域本發明涉及用于改善中老年皮膚中角朊細胞和成纖維細胞增殖、減少基質金屬蛋白酶(MMP)表達和改善膠原合成、從而提供起使老年皮膚回春作用的相應方法和組合物，特別是包含視黃酸類的組合物，且以局部施用為佳。
2.本領域現狀就哺乳動物而論，人基本上是無毛的，即可不受毛發的干擾而見到人體的大部分皮膚。因此，皮膚暴露于環境所包含的任何損害(天然和人為的)。人們第一次認識到太陽引起紅斑，因此采取措施避免它的“有害射線”。一個世紀以前，在伊麗沙白女王的英國流行不惜代價避免太陽光。但那些伊麗沙白們的皮膚仍然起皺和顯示其它經時性衰老的癥狀。
人的皮膚是一個復雜的器官，它延伸復蓋全身。身體的不同部位有不同類型的皮膚；例如，臉的皮膚不同于頭皮，甚至手前部(掌)的皮膚不同于手背的皮膚。雖然人體表面皮膚的類型可以不同，但皮膚通常都是由主要的兩層組織組成的。表皮(epidermis或cuticle)，即最外層，由淺表層(從外向內角質層、透明層和粒層)和深層(棘層和基底層)組成。真皮(dermis或cutis vera或the true skin)由上面的乳頭層和下面的網狀層組成。
自古以來，各種各樣物質被施用于皮膚，一般通過影響皮膚的最外層改善其外觀，或通過影響真皮來治療皮膚疾病。最近所作的努力是使皮膚回春和恢復因暴露于陽光(紫外線輻射)和氣候而失去的彈性和柔軟性。
經時性衰老或內在衰老的皮膚(intrinsically-aged skin)(老皮)與光致衰老皮膚(photo aged skin)(即由于太陽紫外光輻射顯得衰老的皮膚)的生理學之間有差異。老皮典型地保持光滑和無瑕疵的外觀，與之相比，光致衰老皮膚則堅韌粗糙、有斑、常有深深的皺紋。老皮的表皮典型地比正常皮膚薄，而光致衰老皮膚的表皮典型地比正常皮膚厚(棘皮癥的)，并經時性萎縮。光致衰老皮膚典型地有大片境界帶(Grenz zone)(緊靠表皮下嗜酸性物質寬帶，膠原形成和指示傷口愈合的結構)，這在經時性衰老皮膚上是沒有的。見N.A.Fenske & C.W.Lober，“正常衰老皮膚的結構和功能變化”，J.Am.Acad.Dermatol.，15571-185(1986)。
Kligman等在EP-A2-0 379,367中描述了一種用視黃酸類治療或預防內在衰老皮膚的方法。Kligman等在無毛小白鼠和5名中年以上白種婦女身上試驗了全反式視黃酸(維生素A乳劑(Retin A cream)]，只在研究前和研究后對婦女作了臨床觀察，只報告做了一例活組織檢查，是在治療6個月后(即該出版物沒有公開治療前或治療早期從接受活組織檢查的受試者上得到的對比活組織檢查)。
美國專利No.3,932,665和4,934,114分別公開了使用視黃醛(維生素A醛)治療痤瘡和治療皮膚角化病。還見美國專利No.3,060,229。視黃醛及其衍生物還被建議用于治療如皺紋、疣、牛皮癬、濕癥、頭皮屑等(見EP-A2-0 391 033)。還有證據表明，維A酸(全反式視黃酸)改善光致衰老皮膚的外觀。Albert M.Kligman，“光致衰老皮膚治療中維A酸局部給藥的現狀”，Drugs & Aging，2(1)7-13(1992)；Chas.N.Ellis等，“維A酸在光損傷修復中的應用”，及A.S.Zelickson等，“光致衰老中維A酸的局部給藥超微結構研究”，Journal ofCutaneous Aging & Cosmetic Dermatology，vol.1，No.1，p.33-40和41-47(1988)。
Burger等在美國專利5,665,367中描述了局部施用于皮膚的組合物，它們包含柑桔素和/或槲皮黃素和一種視黃酸；描述了這些組合物能有效治療很多互不相關的皮膚疾病，如皺紋、痤瘡、皮膚白化和老年斑；所論這些組合物對人皮膚的作用是以酶(轉谷氨酰胺酶)對細胞膜形成和表皮形成的重要性來描述的。相反，本發明針對真皮的變化和有益真皮細胞的增生及結構。
發明的概述主要的發明是發現使人皮膚回春的方法。本發明的說明書和權利要求書中所用的術語“回春”包括在老年人的皮膚中同時預防膠原降解和刺激新膠原的形成的步驟。本發明對比了受處理和不受處理的老年(80歲以上)志愿者的防日曬人皮膚的活組織檢查與青年志愿者防日曬皮膚的活組織檢查。與青年人的皮膚相比，老年人的皮膚較薄，表皮(角朊細胞)和真皮(成纖維細胞)中細胞較少，密度較低，結構破壞的結締組織較多，cJun激酶活性和基質金屬蛋白酶(MMP)的水平較高，ERK活性、細胞周期蛋白D2和I型、III型前膠原的水平降低。
簡言之，我們的一個發明是發現局部施用其量能有效抑制膠原降解和促進前膠原合成的一種或一種以上化合物能使老年人皮膚回春，以有規律地施用為宜。起這兩種作用的一類較佳的化合物為視黃酸類，特別是視黃醇和全反式視黃酸。
促進前膠原合成可使老年人皮膚受益。我們的另一個發明是發現有規律地對皮膚施用有效量的視黃酸可增加老年人皮膚的前膠原水平。在優選實施方案中，處理還包括用MMP抑制劑抑制膠原降解。
除了處理和/或預防皮膚的經時性衰老外，我們的發現，即有效量視黃酸施用于皮膚可增加前膠原合成，提供了預防皮膚潰瘍的另一個發明。提高皮膚的膠原含量，則皮膚的形態結構、強度和功能均提高。前膠原合成增加，則皮膚膠原含量增加、緩和了由于膠原減少、降解所致的強度和支撐作用的減弱，這樣改善的前膠原合成可望減輕皮膚潰瘍的發生和/或嚴重程度。
與上述有關，我們的另一個發明是發現局部施用視黃酸(較佳也是有規律地反復施用)使有益于皮膚完整性的角朊細胞和成纖維細胞數目增加。成纖維細胞營養表皮，在正常情況下，它們分泌一些生長因子(如FGF、IGF和KGF等)和產生前膠原，后者進入真皮基質，成為結構膠原。
還有一個發明是對衰老皮膚局部施用有效量的視黃酸，使衰老皮膚中cJun活性和/或皮膚中c-Jun蛋白的量降低，并且ERK活性提高兩者并存。
在另外的實施方案中，與選自如下附加化合物的至少一種活性成分合用，增強對皮膚的經時性衰老的預防和治療作用，這些化合物為用于長波紫外線1(UVA1)、長波紫外線2(UVA2)和長波紫外線3(UVB)中至少一種的遮光劑；抗氧化劑；MMP(基質金屬蛋白酶)抑制劑，及其混合物。
附圖的簡要說明

圖1描繪在理想的皮膚細胞中某些ERK和ASP途徑。
圖2描繪在所研究的各年齡群體中由活組織檢查得到的成纖維細胞密度(2A)、真皮結締組織特征(2B)、表皮厚度(2C)和角朊細胞密度(2D)。
圖3描繪在所研究的各年齡群體中人角質細胞(3A)和成纖維細胞(3B)的相對生長潛力(以每一活檢的細胞集落數計)。
圖4描繪在所研究的每個年齡群體中發現的三種MMP(4A.MMP-1；4B.MMP-9；4C.MMP-2)的相對活性。
圖5描繪在體內試驗中青年和老年皮膚間質膠原酶表達的差異。
圖6描繪在體內試驗中青年和老年皮膚I型前膠原表達的差異。
圖7描繪在體內試驗中青年和老年皮膚ERK活性的差異。
圖8描繪在體內試驗中青年和老年皮膚磷酸化(活化)ERK表達的差異。
圖9描繪在體內試驗中青年和老年皮膚細胞周期蛋白D2表達的差異。
圖10描繪在體內試驗中青年和老年皮膚cJUN激酶活性的差異。
圖11描繪使用一種視黃酸(1％視黃醇，使用一次，封閉，7天后檢查)在老年人(80歲以上)皮膚中成纖維細胞密度(11A)、真皮結締組織特征(11B)、表皮厚度(11C)和角朊細胞密度(11D)。
圖12描繪視黃酸(視黃醇)處理對取自活檢樣本的體外培養人角朊細胞和成纖維細胞生長的影響。
圖13表示青年個體(13A和13B)、老年個體(13C和13D)和單次使用1％視黃醇(封閉，保留7天，然后作活檢)后同一老年個體(13E和13F)的皮膚染色后的橫切面及特寫鏡頭。
圖14描繪老年人皮膚單次使用視黃醇后活檢測得的對三種MMP酶(MMP1、2和9，與圖4類似)活性的效應。
圖15描繪在培養的人皮膚成纖維細胞中視黃酸介導的I型膠原合成的誘導。
圖16描繪對老年人皮膚使用視黃醇引起的III型前膠原α1(III)mRNA的體內誘導。
圖17描繪對老年人皮膚使用視黃醇引起的ERK活性的體內誘導。
圖18是一張，單次使用1％視黃醇7天后老年人皮膚活檢切片染色的顯微照片顯示cJUN蛋白減少，皮膚中I型和III型前膠原的量增加。
本發明優選實施方案的描述圖1描繪了基于我們的發現，實現理想的皮膚細胞的功能的某些降解途徑。在老年人群中人皮膚經時性衰老的特別重要的原因似乎是不同的，包括如飲食、遺傳和環境等因素。但一般說來，我們相信，皮膚經時性衰老是由于應激激活途徑(SAP)的活化和促細胞分裂劑激活的途徑(ERK)的阻遏。與常識相反，將我們的有關與人皮膚的光致衰老的發明相比，我們發現，人皮膚的經時性衰老和光致衰老有相似的分子病理生理。ERK介導健康皮膚所需要的生長因子的作用。干擾ERK可導致經時性衰老皮膚的變薄，因為表皮和真皮中細胞的數目減少。幾乎相反，SAP激活促進前膠原合成抑制和成熟膠原降解的因子(如cJun)，從而導致皮膚形態結構、強度和功能的減弱。皮膚經時性衰老可認為包括對ERK的某種干擾和/或對SAP的某種激活我們發現這兩種情況均出現于經時性衰老的人皮膚。如圖1所示，理想皮膚細胞101具有細胞膜103，各種化合物通過該膜或在膜上經細胞表面受體與細胞相互作用。以105表示的一組輸入信號激活ERK途徑，通過磷酸化作用啟動ERK。活化的ERK在細胞核中誘導細胞周期蛋白D2生成(107)，其結果是促進細胞生長。以109表示另一組輸入信號，它激活應激激活的途徑，導致cJUN激酶活性的提高。一旦激活(也通過磷酸化)，cJUN變成激活蛋白(AP-1)組份，導致MMP生成(111)，MMP輸出細胞，其結果是真皮基質中的膠原降解。基質金屬蛋白酶(MMP)包括膠原酶、明膠酶和其它天然存在于人皮膚的酶，它們降解細胞外基質分子，如膠原。雖然不想束縛于特定的理論，我們還是相信，cJUN激酶活性的提高干擾前膠原(可溶性膠原前體)的合成，后者輸出細胞(113，參見圖1)，進入基質，變成結構膠原(不溶性膠原)。我們相信，活化的cJUN抑制前膠原合成中的一個或多個步驟，如圖中所示。
本發明總的涉及將一定量的視黃酸類化合物(較佳為視黃醇或視黃酸)局部施用(較佳為有規律地)于老年人的皮膚，其量足以誘導老年人皮膚中角朊細胞和成纖維細胞中的至少一種細胞增殖，降低MMP的表達，刺激老年人皮膚中前膠原的合成，使之回復到正常水平，及/或提高老年人皮膚中活化ERK的水平，降低cJUN激酶的活性和降低cJUN蛋白的水平。
老年人皮膚的分析將得自18-80歲以上40個人的避光皮膚的同樣4mm鉆取活檢樣本進行比較，我們發現，存在與年齡相關的角朊細胞和成纖維細胞數目的減少。角朊細胞是組成表皮的主要細胞。表皮的細胞通過基礎角朊細胞的分化而形成，基礎角朊細胞中有一些穿過逐層的被覆蓋的各層分化成角質層(皮膚的最外層)。圖2A、2B、2C和2D表示根據我們進行的整個人口調查得到的形態結構(morphometic)資料。如圖2A和2D所示，從我們的志愿者的活檢證明，最年輕的年齡組(18-29歲)與最老的年齡組(80歲以上)相比，角質細胞平均減少27％，成纖維細胞平均減少39％(兩種細胞均是p＜0.1)；我們還注意到皮膚上與年齡相關的變化見于30歲以上成纖維細胞有一次減少和80歲以上成纖維細胞有另一次減少(圖2A)。我們的人口調查還證明，60歲以上不合需要的真皮結締組織特征數目增加(圖2B)及60歲以上表皮厚度減少(圖2C)。這些數據表明，存在如圖2B所示的與年齡相關的結締組織結構破壞和/或降解(最年老組比最年輕組增加2.25倍，p＜0.05)。通過從老年受試者得到的活檢皮膚組織的顯微鏡組織學檢查測定結締組織的結構破壞和降解，并與青年人皮膚活檢的組織學檢查進行比較。
這些發現被我們的以下發現進一步證實，從活檢組織培養物中的細胞集落數測得與年齡相關的角朊細胞(減少54％)和成纖維細胞(減少50％)生長減少，還是上述相同的兩年齡組間比較(對此兩型細胞，P＜0.1)，如圖3所示。
如圖4所示，我們還發現，青年和老年組相比，MMP-1、MMP-2和MMP-9的相對活性有與年齡相關的增加(分別增加40％、82％和53％，p值分別為p＜0.01、p＜0.001和p＜0.01)。這些結果是用得自我們的40個志愿受試者的同樣4mm鉆取活檢樣本測得的。
如圖5所示，我們測定了兩組(青年組和老年組)各16人的活檢皮膚的間質膠原酶，揭示在老年組皮膚中存在膠原酶蛋白的相對表達，其量約雙倍于在青年受試者中所發現的。
圖6描繪了我們從兩組受試者(青年和老年)得到的未暴露皮膚的體內樣本中確定I型前膠原存在的分析。我們發現，未暴露(遮避陽光)的青年皮膚中I型前膠原的表達約兩倍于未暴露的老年人皮膚。
圖7提供了我們按本發明所述方法關于老年(80歲以上)和青年(19-29歲)志愿者皮膚活檢中ERK的穩態活性的發現。圖7直方圖顯示老年志愿者皮膚中ERK的相對活性幾乎是年輕人皮膚中該活性水平的一半。
ERK活性的降低可以起因于衰老皮膚中ERK水平的降低或ERK激活的減低，或兩者兼有之。一次，我們測試了15名志愿者以確定皮膚中存在的ERK的相對量，總量和活化(磷酸化)形式，及活化形式刺激細胞生長。如圖8所示，老年受試者他們的皮膚中ERK的總量基本上與年輕半個世紀的受試者相同，但活性磷酸化形式的ERK明顯降低。據此，我們發現老年人皮膚中ERK活性的降低并不是由于ERK總量的降低，而是由于活化形式的低濃度。
在圖1所示ERK途徑中，ERK誘導細胞周期蛋白D2，后者是細胞生長所需要的。干擾此ERK效應器會預料到導致細胞生長和修復的延緩由此可促進皮膚的衰老。圖9描繪了我們關于12名青年受試者和11名老年受試者正常被覆的(避光)皮膚中細胞周期蛋白D2的表達的分析結果。圖9直方圖顯示經時性衰老的皮膚中表達的細胞周期蛋白D2量比青年人皮膚中的表達明顯地減少。
我們測試了兩個年齡組的15名受試者(19-29歲青年受試者和80歲以上老年受試者)，測定各組中應激激活的蛋白激酶(“SAPK”)的活化程度，SAPK活性用cJUN蛋白的磷酸化來測定。圖10顯示，青年受試者未暴露皮膚的體內樣本中cJUN激酶活性為老年受試者未暴露皮膚的25％。從這些結果，我們可預言老年人皮膚中活化cJUN水平的升高將導致MMP活性提高。
視黃酸類化合物對老年皮膚的處理再回到圖1，SAP的激活(應激激活的途徑109)通過產生包括膠原酶和92kDa明膠酶的MMP來促進皮膚膠原的降解。SAP可被紫外光輻照(我們的待批申請08/588,771(1996年1月16日提交)和臨時申請60/048,520(1997年6月4日提交)、60/057,976(1997年9月5日提交)有描述，它們均涉及人皮膚的光致衰老，其公開內容納入本文作為參考)、腫瘤壞死因子(如TNF-α)、白介素(如IL-1α)和其它應激狀況所激活或上調。如前面注為′771的申請和′520、′976的臨時申請中所述，激活蛋白-1(AP-1)包括降解膠原的酶MMP。在上述列為參考的光致衰老專利申請中，我們指出可干擾紫外光誘導的膠原酶的產生，但是經時性衰老所涉及的有其它途徑，當處理患者皮膚的光致衰老時并不必然預期到產生皮膚經時性衰老的這些途徑(如ERK途徑)會受到影響(例如，用只抑制MMP形成的化合物并不必然影響ERK途徑)。
為了研究經時性衰老皮膚的處理，用1％視黃醇或只用賦形劑對至少80歲的17名受試者進行局部處理，將試驗區封閉7天，然后作活檢。賦形劑為乙醇和聚乙二醇按70∶30體積比組成的混合物。將來自同一老齡范圍的個體的賦形劑處理和未處理皮膚作比較，圖2所描述的任何參數，即成纖維細胞和角朊細胞數、表皮厚度和不合需要的真皮結締組織特征，均無統計學意義的顯著差異。如圖11所示，比較來自相同個體的視黃醇處理皮膚和賦形劑處理皮膚如圖11所示，則在視黃醇處理的皮膚中，每個切片的角質細胞數(11A)和成纖維細胞數(11D)增加(分別平均增加273％(p＜0.001)和30％(p＜0.05))。此外，視黃醇處理實質上增加表皮厚度(11C)。由于視黃酸類化合物(視黃醇)處理時間短，因此有害真皮結締組織特征數(11B)顯然變化極少。
圖12A和12B證明視黃醇體內處理7天對取自我們80歲以上分別志愿者避光皮膚活檢樣本中的角朊細胞和成纖維細胞體外生長的效應。即用視黃醇處理(施用一次1％視黃醇，封閉7天)老年志愿者皮膚，處理部位作活檢，活檢得到的角質細胞和成纖維細胞進行體外培養。細胞的體內視黃醇處理導致這兩類細胞體外生長的實質性提高。特別是，角朊細胞生長提高約30％(12A)，而成纖維細胞生長提高約200％(12B)，兩者均為p＜0.05。一次，將視黃酸類化合物局部施用于老年皮膚可望增加皮膚中角朊細胞和/或成纖維細胞數目。
我們的新型處理的結果圖示于圖13。圖13A和13B是顯示22歲個體避光皮膚組織學外觀的顯微照相，圖13B是圖13A中方框區的放大視圖。如該圖所示，皮膚的組成是表皮E覆蓋于真皮D。表皮和真皮之間大的界面區加強了表皮和真皮的粘著部分。該界面由從表皮延伸到真皮中的表皮突(rete pegs)即嵴R和從真皮延伸到表皮中的真皮乳頭P來界定。這些突和乳頭構成了圖13A橫截面上見到的褶，增加了皮膚兩層之間界面的表面積。下面的截面(圖13B)顯示了真皮的更為詳盡的視圖，它含有很少細胞C，大部分是膠原L。如從此年輕個體的截面所見，真皮中膠原相對致密，結構均勻。
圖13C和13D顯示賦形劑處理的86歲老年個體避光皮膚的組織結構。如圖13C所示，老年皮膚的表皮較薄，基本上無表皮突和真皮乳頭。圖13D詳細視圖顯示老年皮膚真皮與年輕人相比細胞一般較少，膠原密度較低，分布不太均勻。表皮較薄和表皮真皮間界面表面積減少使老年人有挫傷和潰瘍病癥(如Bateman′s紫癜)高發傾向。
圖13E和13F描繪如前所述用視黃醇處理(施用一次視黃醇)7天后從與圖13C和13D所示活檢同一個體得到的避光皮膚。所顯示的皮膚的變化相當顯著和意想不到。表皮增厚，界面表面積增加，其證據是存在新的表皮突和真皮乳頭，及如詳細視圖所示，真皮膠原變得致密，外觀更均勻規則。因此，局部使用有效量的視黃酸類化合物有增加表皮厚度(如對應于年輕皮膚的正常化)、促進表皮突和真皮乳頭形成及提高真皮中膠原的量、密度和均勻規則性的作用。這些改變逆轉了老年皮膚上所見的明顯組織學變化，有助于預防老年皮膚的挫傷、撕傷、潰瘍和類似的創傷，這些在年輕人的皮膚上是不出現的。
我們還采用從前述志愿者的活檢來測定同樣的視黃酸類處理對膠原酶相對活性的影響，這些膠原酶與為得到圖4所示結果所研究的相同。圖14A、14B和14C描繪用視黃醇處理老年人后的平均MMP活性水平(分別為膠原酶MMP-1和明膠酶MMP-9、MMP-2)。如圖14所示，單劑視黃醇處理后7天，MMP-1和MMP-9活性均降低(分別降低48％和39％，兩種酶均為p＜0.01)；MMP-2活性未見明顯變化。與只用賦形劑的對照處理相比，MMP-1和9的酶活性水明顯降低。(圖14A-14C中，每個圖的受試者數目均為10；“*”表示相對18-29歲的值，p＜0.5，“**”表示p＜0.1，“**”表示p＜0.001。)用前面的和類似的技術，采用80歲以上7名志愿者的試樣和從其未暴露(避光)皮膚的活檢樣本培養的成纖維細胞，我們發現，視黃酸濃度0.25μg/ml提高膠原的相對表達三倍于未處理細胞，0.5和1.0μg/ml一般增高這些培養細胞中膠原的生物合成5倍于未處理細胞，如圖15所示。
用1％視黃醇乳劑對7名80歲以上老人進行臨床治療，對避光皮膚施用一次，蓋上敷料，使其7天不受干擾。敷料下的這些處理區的活檢揭示，這些個體的皮膚中，III型前膠原mRNA比用同樣方法處理(單劑施用和覆蓋7天)的對照(賦形劑處理)區域增加約2.5倍。這些結果見圖16。
用前面關于視黃酸處理(1％視黃醇施用于避光皮膚，封閉，7天后測定)，同樣的技術，我們處理并測試了3名80歲以上志愿者以測定視黃酸處理對ERK活性的影響。從這些個體的活檢結果表明，處理后體內ERK活性與相同志原者的用賦形劑處理和活檢區域相比，是兩倍以上。這些結果見圖17(其中將對照的賦形劑處理的皮膚標準化為數值1)。
圖18描繪了用視黃酸處理后志愿者中老年組(80歲以上)另外的橫截、染色活檢。如上所述AP-1誘導MMP形成，本身由c-Jun和c-Fos蛋白的異源二聚合而形成。圖18A顯示視黃酸(視黃醇，“ROL”)處理1周后老年皮膚中的c-Jun水平(c-Jun被染成紅色)與賦形劑處理皮膚的活檢切面相比明顯降低(幾乎沒有)。因此，我們的發明看來抑制c-Jun形成，從而抑制AP-1和該結果的MMP的形成。圖18B和18C顯示在視黃酸類處理的皮膚中I型和III型前膠原(染成紅色)水平提高。(18C中真皮中的前膠原密度明顯降低是切片制作的假象；視黃醇處理的切片中染色水平明顯地高于賦形劑處理的切片)。因此，本發明的一個實施方案包括施用有效、無毒量的視黃酸類有效的一段時間使衰老皮膚回春的方法。有效的一段時間一般是每天，較佳為每天僅施用/給于一次組合物。較佳的處理和維持方案是用有效量的約0.4％視黃酸類，盡管獲準可用較高的劑量。視黃醇是較佳的視黃酸類化合物。
在另一個實施方案中，本發明提供局部給予有效、無毒量的視黃酸類(較佳為視黃醇或全反式視黃酸)一段有效的時間來誘導體內角朊細胞和/或成纖維細胞的增生。處理較佳為每天進行一次或兩次，視黃酸類化合物的量較佳為約0.1％至約1.0％。
在還有一個實施方案中，本發明通過局部給予有效量視黃酸類化合物一段有效的時間來降低和/或抑制MMP-1和/或MMP-9在老年皮膚中的表達，較佳的視黃酸類化合物為視黃醇或全反式視黃酸。處理較佳為每天進行一次或兩次，視黃酸類化合物的量較佳為約0.1％至約1.0％。
如上所述，角朊細胞和成纖維細胞的減少和MMP表達的增加可視為與年齡有關的狀況，并不憑借于諸如日光損傷之類損傷。因此，本發明對任何這些與年齡有關參數的有害變化提供預防，以及提供處理方法以改善衰老引起的這些有害病原學變化。
另一方面，本發明涉及改善或刺激老年人皮膚中I性和III型前膠原的合成。我們發現，在很多(至少50％)衰老個體的避光皮膚中I型和III型前膠原合成明顯減少，這種情況可局部使用視黃酸類而加以處理。前膠原是由皮膚成纖維細胞合成、然后分泌到細胞外介質中的一種蛋白質，它在細胞外介質中被天然存在的酶轉變為膠原。老年人皮膚中前膠原合成的減少表明在真皮上部(細胞外)和整個真皮的成纖維細胞兩者中存在前膠原蛋白的減少，可用例如免疫組織化學方法加以測定。
總之，我們對圖1所示控制途徑的研究表明，ERK的失活和/或SAP的激活可引起皮膚的經時性衰老。事實上，我們發現這兩種情況均存在于老年人皮膚。圖7-9描繪的結果顯示，老年人的避日光皮膚(該皮膚一般不慢性暴露于日光)中活性ERK的量和細胞周期蛋白D2的量均減少，導致細胞生長的減緩。我們還證明，老年人皮膚中I型和III型前膠原的合成量減少(見圖6)。如果真皮中細胞生長少，那么表皮覆蓋似乎也受損。我們對人皮膚孕育生長的重要ERK途徑的各種信號組分試驗的結果表明，人皮膚的經時性衰老特征在于促進細胞生長的途徑中至少2個組分的激活減少。皮膚老化時，ERK激活的減少和細胞周期蛋白D2生成的減少導致細胞生長減緩，最終導致皮膚衰老。圖15-17所示結果證明視黃酸類化合物的處理在提高ERK活性水平和I型、III性前膠原的生成上的體內有效性。
在另一方面(與建立新的真皮相反的真皮的降解)，圖4、5和10描繪的結果表明，不暴露的老年人的皮膚中cJUN激酶和MMP活性提高。降解性MMP酶的上調和前膠原合成的下調導致膠原缺乏，引起皮膚衰老和衰老皮膚的修復受損。引起皮膚損壞速度增加的途徑活性的增加(如通過MMP介導的真皮基質的降解和前膠原合成的抑制)伴隨著促進細胞生長的途徑活性的降低(如ERK活性的降低)，兩者與人皮膚的經時性衰老有關。我們用于防護和使經時性衰老皮膚回春的方法雖然是在不暴露的、避日光皮膚上進行試驗的，還常將受處理皮膚封閉，但適用于處理全身經時性衰老的皮膚，包括面部和手。將涉及光致衰老的前述專利和臨時申請的教導歸結起來，對皮膚每天施用視黃酸類化合物，可改善皮膚的天然衰老作用及日光加劇皮膚天然衰老的作用。
因此，我們雖然并不想束縛于特定的功能理論，但我們相信，如圖13E和13F所示結果至少部分由于改善ERK激活、c-Jun量減少和I型和/或III型前膠原量增加的某種結合作用。用關于視黃酸類處理(1％視黃醇施用于避日光皮膚，封閉，7天后測試)同樣的技術，我們測試了3名80歲以上的志愿者。如圖13所示，這些人的活檢結果表明，處理后ERK體內活性為2倍以上(圖中，對照的賦形劑處理皮膚標準化為數值1)。
視黃酸類化合物是一類MMP抑制劑。MMP抑制劑可直接作用于MMPs和/或天然產生MMP的轉錄因子AP-1和k基因結合核因子(NF-κB)。阿斯匹林和E5510(Fujimori，T.等，日本藥理學雜志(1991)55(1)81-91)抑制NF-κB激活。視黃酸類化合物(如美國專利No.4,877,805所述)和對AP-1特異拮抗的解離視黃酸類(如Fanjul，et al.，Nature(1994)372104-110所述)，糖皮質激素和維生素D3靶向AP-1。增強維生素D3治療效應的化合物在待批申請No.08/832,865(J.Voorhees等，“評估1，25(OH)2D3在皮膚中的活性和提高1，25(OH)2D3治療價值的方法”，1997年4月4日提出申請)中有描述，其公開內容納入本文作為參考。除了視黃醇外，其它的視黃酸類化合物包括維生素A(視黃醇)、維A醛(視黃醛)、維A酸(視黃酸(RA，包括全反式、9-順式和13-順式視黃酸)的天然和合成類似物，依曲替酯(芳香維甲酸etretinate)和EP-A-0 379367、US4,887,805和US 4,888,342中所描述的其它化合物(其內容全部納入本文作為參考)。各種合成的視黃酸類和具有視黃酸活性的化合物可望在本發明中使用，其程度為顯示視黃酸體內活性，及在當面轉讓給Allergan Inc.的各專利中所描述的作用，如編號如下的美國專利5,514,825；5,698,700；5,696,162；5,688,957；5,677,451；5,677,323；5,677,320；5,675,033；5,675,024；5,672,710；5,688,175；5,663,367；5,663,357；5,663,347；5,648,514；5,648,503；5,618,943；5,618,931；5,618,836；5,605,915；5,602,130。還有其它描述為具有視黃酸活性的化合物在如下編號的其它美國專利中有描述5,648,563；5,648,385；5,618,839；5,559,248；5,616,712；5,616,597；5,602,135；5,599,819；5,556,996；5,534,516；5,516,904；5,498,755；5,470,999；5,468,879；5,455,265；5,451,605；5,343,173；5,426,118；5,414,007；5,407,937；5,399,586；5,399,561；5,391,753；等等，上面和下面的所有專利和文獻的內容均納入本文作為參考。
MMP還被BB2284(Gearing，A.J.H.et al.，Nature(1994)370555-557)、GI129471(McGeehan G.M等，Nature(1994)，370588-561)和TIMP(金屬蛋白酶的組織抑制劑，抑制脊椎動物膠原酶和其它金屬蛋白酶，包括明膠酶和溶基質素)抑制。還有其它化合物可用于本發明，包括異羥肟酸鹽和羥基脲衍生物，如Galardin、Batimastat和Marimastat，以及EP-A1-0 558635和EP-A1-0 558648中公開的化合物(其中公開的在治療其它病因如治療皮膚潰瘍、皮膚癌和大皰性表皮松解中用于抑制MMP)。Goldsmith，L.A.(皮膚的生理學、生物化學和分子生物學，第2版(紐約牛津大學出版社，1991)，第17章)報告視黃酸類引起TIMP mRNA穩態水平提高，這提示轉錄控制；但是，根據我們的研究，我們發現在人活體皮膚內并不是如此。還有其它可局部使用在實施本發明中有用的MMP抑制劑，包括四環素類及其衍生物，如米諾環素、羅利環素、金霉素、美他環素、土霉素、多西環素、地美環素以及它們的各種鹽。由于可能的變態反應或過敏反應，局部使用四環素類需小心監測這些不良反應。其它MMP抑制劑包括染料木黃酮和槲皮素(在US 5637703、US 5665367和FR-A-2,671,724中有描述，其內容納入本文作為參考)及相關的化合物，以及其它抗氧化劑，如NAC(N-乙酰半胱氨酸)、綠茶提取物等。
施用于皮膚的活性成分的有效量較佳為組合物總重量的約0.001-5wt％，更佳為約0.01-2wt％，還要更佳為月0.1-1wt％。組合物配制成在施用時約提供5μg/cm2皮膚的制劑。例如，用于本發明的較佳組合物是Retin-A視黃酸凝膠和乳劑(購自Ortho Pharmaceuticals，用于治療尋常痤瘡)，其濃度為0.01％-0.1％；根據特定的制劑，賦形劑較佳包括丁基化羥基甲苯、醇(用叔丁醇和硫酸番木鱉堿變性的酒精)、硬脂酸、肉豆蔻酸異丙酯、硬脂酸-40-聚烴氧基酯、十八烷醇等中的至少一種，及其可相容的混合物。
我們測試了兩個年齡組15名受試者，青年受試者(19-29歲)和老年受試者(80歲以上)，測定每組SAP激酶激活的程度。用c-Jun的磷酸化來測定SAP激酶的活性。圖10顯示青年受試者不暴露皮膚的體內樣本約為老年不暴露皮膚的相對cJUN激酶活性的25％。從這些結果，可以相應地預言老年人的皮膚中AP-1和MMP的水平升高。
出乎意料地發現，用視黃酸局部處理老年人經時性衰老的皮膚，引起細胞內前膠原蛋白水平的恢復類似于在青年人(如40歲和更年輕的人)中所見。特別是，對經時性衰老皮膚單次施用1％視黃醇，蓋上透氣粘合帶，7天后測試，發現前膠原蛋白水平可以與明顯年輕的人(如40歲以下)的避光皮膚相比。老年人施用視黃酸類每天一至二次以維持治療制度則更好，盡管該物質可以較低的頻度但規則地施用(如隔天一次或一周一次)。較適宜的還可使皮膚隔離環境損害，特別是紫外光源、去污劑和其它苛性化學品等。因此，較佳為給視黃酸類組合物加上UV遮光劑、抗氧化劑等。
刺激前膠原的生成是維持經時性衰老皮膚的完整性的重要因素。衰老的皮膚部分由于膠原含量降低和膠原纖維結構松散而變簿、易碎。用視黃酸類刺激前膠原合成、繼而轉變為膠原，可望減輕易碎性，增加厚度和改善老年皮膚的外觀。因此，本發明提供提高經時性衰老皮膚中細胞內和細胞外膠原含量、從而也改善膠原含量的方法。此外，如本文所示，老年人皮膚中MMP水平比青年人皮膚中的提高。如果皮膚中產生的膠原發生降解，則前膠原生成的改善就無效了，因此，用視黃酸類和MMP抑制劑處理老年人皮膚對于獲得改善前膠原生物合成的滿意效果是重要的。事實上，我們發現在膠原水平不降低的皮膚中用視黃酸類處理并不使膠原水平升高到正常以上；我們的發明從而顯示，施用視黃酸類混合物可使膠原水平恢復到所需要的基線水平。因此，我們發明的用視黃酸類化合物的處理方法既增加(前)膠原的成纖維細胞的產生，又干擾引起表皮變簿的MMP的活性。雖然視黃醇是局部使用的較佳化合物，然而有望對實施本發明有用的視黃醇的有效衍生物包括視黃醛、視黃酸(包括全反式、9-順式和13-順式異構體)和衍生物(諸如7，8-雙脫氫視黃酸)和其它如Kligman等(參見上文，其內容納入本文作為參考)描述的化合物，包括化妝品上可接受的鹽、酯、逆酯(reverse ester)，及其醚、其軛合物和其混合物。
本文所述的制成商品的組合物可包括各種常規的著色劑、香料、增稠劑(如黃原膠)、防腐劑、濕潤劑、潤滑劑、緩和劑、表面活性劑、分散劑、促進滲透劑等，加上它們后可提供額外的益處和改善局部用制劑的感覺和/或外觀。組合物還可配制成乳劑、洗劑、軟膏、肥皂或沐浴劑、洗發劑或面膜。
前面的描述和下面的方法是對本發明的參數而不是限制。細閱本說明書后，各種變化、修改和添加對于熟練技術人員來說都會變得明了的，意味著這些變化、修改和添加均在本權利要求書限定的范圍和精神實質中。
實施例中所用的方法本部分所注的文獻均納入本文作為參考。
組織學和形態測定法從每人的臀部皮膚得到復制的4mm鉆取活檢樣本。隨機和盲法地用福爾馬林固定，組織切片，以蘇木精和曙紅染色。用Olympus BX40顯微鏡結合SonyDCX-151高分辨照相機對切片進行檢測。用NIH Imager Software隔離每邊200μm的封閉區，在兩塊這樣的區域上的每塊的4個位點(隔開25μm)評估表皮深度。用這兩塊封閉區域作表皮細胞計數。測定整個組織切片上間質細胞核(即不與毛細管聯合的真皮-表皮結合部位下的核)的數目，作為真皮細胞構成的度量。將同樣的盲法制成的切片作組織纖維間隙、厚度、結構破壞程度和結構破壞深度的計分，每個參數用1-9分計。
用于生化分析的皮膚上清液的制備在液氮下用研缽和杵磨碎皮膚樣本，在Dounce組織研磨機中在緩沖液中制勻漿，緩沖液含有10mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(Hepes)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM乙二醇雙乙胺醚-N-N′四乙酸(EGTA)，10mM MgCl2，50mM甘油磷酸鹽，5mM NaVO4，2mM二硫芳糖醇(DTT)，5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，10μg/ml抑蛋白酶肽，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑胃酶肽和0.5％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。勻漿于14,000g離心15分鐘，收集上清液，用于本文所描述的生化測定。
體外細胞生長將活檢樣本剪切成小塊(每片組織片約15塊)，將組織碎塊轉到塑料細胞培養瓶中。培養基組成為Dulbecco的改良Eagle極限必需培養基，含Earle′s鹽、非必需氨基酸和10％胎牛血清。組織碎塊于37℃、5％CO2/95％空氣中培養達1個月。按照Varani，J.等，J.Clin.Invest.，96，1747-1756(1994)的方法，對每個碎塊是否有角朊細胞和/或成纖維細胞長到組織外進行計分，并據此確定分離出角朊細胞和成纖維細胞的碎塊的百分率。
基質金屬蛋白酶測定活檢后立即將組織片冷凍在液氮中，在20mM Tris HCl(pH7.6)+5mM CaCl2中制成勻漿，于3000×g離心10分鐘，除去顆粒。用從3H-標記的纖維I型膠原中釋放可溶性放射活性碎片的能力(Fisher，G.J.等，Nature，379，335-339(1996)和Hu，C-L等，Analytic.Biochem.，88，638-643(1978))作為膠原分解活性的評定。組織提取物用1mM氨基苯基乙酸汞(aminophenyl mercuric acetate，APMA)培養3小時，將失活型基質金屬蛋白酶轉變成活性型。接著將0.2μCi膠原底物(NEN-DuPont，Boston，MA)與50μl組織提取物一起培養24小時。24小時培養期末，將樣本于12,000×g離心10分鐘，使完整的蛋白質成團。然后測定保留在上清液中的放射活性，由此測得水解的底物的百分率。
用明膠酶譜法(Varani等，op.cit.)評估MMP-2(72-kD明膠酶；明膠酶A)和MMP9(92-kD明膠酶；明膠酶B)活性。將組織提取物在含1mg/ml明膠的8.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后，以1％Triton X-100相繼洗滌3次除去SDS。前兩次洗滌各20分鐘，最后一次洗滌過夜。用激光密度測定法對水解區帶的寬度進行定量。
ERK磷酸化和活性測定用購自Santa Cruz Biotechnology Inc.的抗體將皮膚上清液中的ERK1和ERK2作免疫沉淀，并按J.D.Weber等的方法(“細胞外信號調節的激酶I(ERK1)的持續激活是G1期細胞周期蛋白D1連續表達所需要的”，Biochem.J.，32661-68(1997))，用髓鞘堿性蛋白作底物測定酶活性。用購自New England Biolabs Inc.(Beverly，MA)的抗體作Western分析來測定上清液中總的和磷酸化的ERK1和ERK2。
C-JUN激酶活性測定用固相激酶測定法測定皮膚上清液中c-Jun的活性(如M.Hibi等，“結合和增強c-Jun活化功能區的癌基因蛋白和UV反應性蛋白激酶的鑒定”，GenesDev.，72135-2148(1993))。
RNA的Northern分析通過鹽酸胍裂解和超速離心從皮膚樣本分離總RNA(如c-Jun、前膠原α1(III))(G.J.fisher等，“局部視黃酸處理的人皮膚的細胞、免疫和生化特征”，J.Investig.Dermatol.，96699-707(1991))。如G.J.Fisher等(“全反式視黃酸體內誘導人皮膚中細胞視黃醇結合蛋白”，J.Investig.Dermatol.，10580-86(1995))所描述的方法，用針對待測的特異mRNA的隨機引物32P標記的cDNA探針進行總mRNA的Northern分析(40μg/泳道)。用逆轉錄多聚酶鏈反應測定III型前膠原mRNA。
蛋白質的Western分析用G.J.Fisher等(“人皮膚中視黃酸和視黃酸類X受體蛋白的免疫學鑒定和功能定量”，J.Biol.Chem.，26920629-20635(1994))所描述的Western分析法檢測人皮膚核提取物中的Jun蛋白、細胞周期蛋白D2(二者抗體均購自Santa CruzBiotechnology Inc.)和磷酸化c-Iun(抗體購自New England Biolabs Inc.)。
免疫反應性蛋白用強化化學發光檢測法顯現，用激光密度測定法定量，或用強化化學熒光檢測法顯現，用Storm圖象儀(Molecular Dynamics，Palo Alto，CA)定量。
權利要求
1.使經時性衰老的皮膚回春的方法，其特征在于包括施用有效、無毒量的至少一種抑制MMP和促進前膠原合成的活性成分。
2.如權利要求1所述的方法，其中活性成分是既抑制MMP又促進前膠原合成的視黃酸類化合物。
3.如權利要求2所述的方法，其中視黃酸類化合物選自視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃酸鹽、其衍生物或類似物，或其混合物。
4.如權利要求3所述的方法，其中視黃酸類化合物為視黃醇或視黃酸。
5.如權利要求3所述的方法，其中皮膚是避光皮膚。
6.如權利要求1所述的方法，其中MMP抑制劑選自阿斯匹林、E5510、糖皮質激素、維生素D3、GI12947、TIMPs、異羥肟酸和羥基脲衍生物和四環素類及其衍生物，以及它們的鹽。
7.改善經時性衰老皮膚中角朊細胞和/或成纖維細胞增殖的方法，其特征在于包括對皮膚施用有效、無毒量的視黃酸類化合物。
8.如權利要求7所述的方法，其中皮膚是避日光皮膚。
9.防護經時性衰老的皮膚的方法，其特征在于包括提供可局部施用的無毒量的視黃酸類化合物在適用于化妝品的載體中，對皮膚施用所述視黃酸類化合物至少每周一次，其量能有效地使前膠原合成正常化和抑制膠原降解。
10.如權利要求9所述的方法，其中皮膚是避光皮膚。
11.如權利要求9所述的方法，其中視黃酸類化合物選自視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃酸鹽、其衍生物或類似物，或其混合物。
12.如權利要求11所述的方法，其中視黃酸類化合物為視黃醇。
13.如權利要求9所述的方法，其中視黃醇每天施用。
14.使經時性衰老的皮膚中前膠原的產生正常化的方法，其特征在于包括提供可局部施用的無毒的視黃酸類化合物和對皮膚施用所述視黃酸類化合物，其量能有效地使前膠原產生正常化。
15.如權利要求14所述的方法，其中視黃酸類化合物是視黃醇。
16.如權利要求14所述的方法，其中視黃酸類化合物規則地施用。
17.如權利要求16所述的方法，其中視黃酸類化合物每天施用。
18.如權利要求14所述的方法，進一步包括同時抑制膠原降解的步驟，所述方法進一步包括提供可局部施用的無毒量的MMP抑制劑和對經時性衰老的皮膚規則地施用有效量的所述MMP抑制劑的步驟。
19.如權利要求18所述的方法，其中MMP抑制劑選自阿斯匹林、E5510、糖皮質激素、維生素D3、GI12947、TIMPs、異羥肟酸和羥基脲衍生物和四環素類及其衍生物，以及它們的鹽和可配伍的混合物。
20.如權利要求18所述的方法，其中所述視黃酸類化合物和所述MMP抑制劑存在于單劑局部施用的制劑中。
21.如權利要求18所述的方法，其中經時性衰老的皮膚是避日光的皮膚。
22.改善老年人皮膚中ERK活性水平的方法，其特征在于包括對所述皮膚局部施用有效、無毒量的視黃酸類化合物。
23.如權利要求22所述的方法，其中視黃酸類化合物為視黃酸類或視黃酸。
24.降低老年人皮膚中c-Jun蛋白水平和/或cJUN激酶活性的方法，其特征在于包括對所述皮膚局部施用有效、無毒量的視黃酸類化合物。
25.如權利要求22所述的方法，其中視黃酸類化合物為視黃酸類或視黃酸。
全文摘要
時間的流逝對人皮膚的有害作用(即人皮膚的經時性衰老)可通過局部施用視黃酸類化合物(較佳為視黃醇)加以防護和處理。我們發現,人皮膚光致衰老(即日光引起的未成熟皮膚的衰老)中同一激活的途徑中的某些(即應激結合的途徑、SAP途徑)在老年人皮膚中有類似的提高。我們還發現,在同一皮膚中其它途徑(即促細胞分裂原活化的ERK途徑)受到抑制。用視黃酸類化合物處理經時性衰老皮膚既抑制真皮膠原的降解又促進前膠原的合成。老年人(80歲以上)皮膚活檢切片顯示。單劑處理可增加表皮厚度,改善真皮膠原密度和促進表皮突和真皮乳頭的形成(見圖13),并可減少c－Jun的數目和增加Ⅰ型和Ⅲ性前膠原的量(見圖18)。這些益處也有助于防護老年人皮膚的挫傷、撕裂和潰瘍。
文檔編號A61K31/19GK1251989SQ98803970
公開日2000年5月3日 申請日期1998年2月23日 優先權日1997年2月25日
發明者J·瓦拉尼, G·J·費希爾, J·J·沃里斯, S·坎格 申請人:密執安州立大學董事會