通過(guò)nf－kappab的抑制治療梗塞的制作方法

專利名稱：通過(guò)nf－kappab的抑制治療梗塞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及局部缺血和再灌注損傷的治療，其包括預(yù)防血管閉合后引起的栓塞或降低栓塞大小。
所有組織對(duì)低灌注以及由此帶來(lái)的氧氣缺乏、局部缺血都是敏感的。長(zhǎng)時(shí)間的局部缺血可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷。損傷的程度以及挽救組織的可能性取決于局部缺血的程度和時(shí)間長(zhǎng)短。長(zhǎng)時(shí)間的局部缺血可以發(fā)生細(xì)胞死亡(梗死)，并且在這種情況下，損傷是不可逆的。另一方面，如果適時(shí)應(yīng)用藥物，可以通過(guò)藥物治療對(duì)死亡的或?qū)⒁劳龅募?xì)胞進(jìn)行挽救。
與治療有關(guān)的主要局部缺血事件包括(但不限于)心臟病和中風(fēng)。在人類中，中風(fēng)占所有早期死亡的10％。對(duì)于那些經(jīng)過(guò)損傷存活下來(lái)的人來(lái)說(shuō)，其中的50％留下了嚴(yán)重的殘疾，僅有一小部分(10％)的患者完全恢復(fù)了功能。
每年大約有超過(guò)1,500,000的美國(guó)人患上心肌梗塞。其中的半數(shù)到醫(yī)院后未能存活。然而，隨著人們對(duì)溶解血栓治療方法(例如鏈激酶或組織纖維溶酶原活化(TPA)的逐步接受，對(duì)于到醫(yī)院的患者來(lái)說(shuō)，一個(gè)月的存活率可高達(dá)93.6％(Werns，S.W.Textbook ofInterventional Cardiology，ED.Topol，E.J.WB Saunders1994，PP142-153)。通過(guò)在梗塞過(guò)程中溶解血凝塊，可以挽救局部缺血的肌肉和組織。然而再灌注本身導(dǎo)致了組織損傷。
再灌注損傷源于以下一或多個(gè)原因細(xì)胞酸中毒導(dǎo)致了鈣超載；分解代謝引起細(xì)胞內(nèi)滲透量增加，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹；來(lái)自中性白細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞的游離基。
再灌注后，立即可以在再灌注的心肌層中看到中性白細(xì)胞。單細(xì)胞/大噬菌體在24-48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)。再灌注的心肌層中中性白細(xì)胞是局部缺血心肌層中中性白細(xì)胞的3-5倍。其由內(nèi)皮細(xì)胞的粘附引發(fā)，在再灌注10分鐘內(nèi)發(fā)生。其中的中性白細(xì)胞或其本身可被毛細(xì)管捕獲，并妨礙再灌注。血管內(nèi)的中性白細(xì)胞可阻斷高達(dá)27％的毛細(xì)管，并顯示與局部血流的降低有關(guān)(Forman et al.，Acute MyocardialInfarction，eds.Gersh et al.Elsevier1991，pp 347-370)。這一情況可以導(dǎo)致“無(wú)再流動(dòng)”現(xiàn)象，其中的血流在再灌注后繼續(xù)降低。
已知，中性白細(xì)胞必須首先通過(guò)與吸附分子間的相互作用將其本身附著在內(nèi)皮細(xì)胞壁上，然后中性白細(xì)胞驅(qū)使自己在鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞之間運(yùn)動(dòng)，進(jìn)入腦組織，在那里釋放細(xì)胞毒細(xì)胞分裂素。在細(xì)胞損傷(包括局部缺血)后，這類粘附分子的表達(dá)增加。另外，由于一氧化氮(NO)的釋放，對(duì)于浸潤(rùn)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，內(nèi)皮細(xì)胞壁變得更具可滲透性。因此，抑制中性白細(xì)胞這種從外周血管進(jìn)入損傷組織的運(yùn)動(dòng)(紅細(xì)胞滲出)，對(duì)于允許死亡細(xì)胞從局部缺血損傷中及時(shí)進(jìn)行恢復(fù)來(lái)說(shuō)具有價(jià)值。
因此，本領(lǐng)域需要一個(gè)有效的治療方法，其可以用來(lái)預(yù)防或降低局部缺血導(dǎo)致的結(jié)果。
第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物局部缺血損傷的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。優(yōu)選地，是在暫時(shí)性的血管閉合發(fā)生之后且永久性的局部缺血損傷產(chǎn)生之前給予這些藥劑。
第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)再灌注損傷嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。
第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或降低梗塞大小或減輕梗塞嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，此方法可以預(yù)防或減輕腦血管或心血管發(fā)生閉合后的梗塞嚴(yán)重程度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，此方法可以預(yù)防閉合引起的中風(fēng)，或減輕由于腦血管閉合所引起的中風(fēng)的嚴(yán)重程度。
第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療局部缺血或再灌注損傷的方法，包括預(yù)防或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)梗塞嚴(yán)重程度的方法，其包括除了給予NF-kB活化抑制劑外，再給予所述的哺乳動(dòng)物附加治療劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。一些優(yōu)選的附加治療劑包括(但不限于)這樣一些藥劑，可以進(jìn)一步抑制NF-kB活化或抑制前炎癥細(xì)胞因子或細(xì)胞粘附分子的表達(dá)或作用的甾體；可對(duì)再灌注或氧化的組織起作用的藥物，例如抗水腫藥物，血栓溶解劑，例如TPA，鏈激酶和尿激酶，聚陰離子，例如肝素，抗凝劑；以及有助于溫度正?；乃巹?br> 優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑抑制NF-kB活化。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑抑制IkB-α的磷酸化。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑為蛋白酶體抑制劑。優(yōu)選地，蛋白酶體抑制劑選自肽基醛，硼酸或硼酸酯，乳胱氨蛋白(lactacystin)或乳胱氨蛋白同類物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑為遍在蛋白抑制劑。
圖表簡(jiǎn)述

圖1顯示了導(dǎo)致再灌注損傷(包括梗塞)的NF-kB活化的系列過(guò)程。圖上給出了本發(fā)明方法的干預(yù)點(diǎn)。
圖2顯示了遍在蛋白蛋白酶體途徑。
圖3顯示了在中等程度的腦動(dòng)脈(MCA)閉合后，給予蛋白酶體抑制劑N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸所導(dǎo)致的梗塞體積的降低。
圖4顯示了給予蛋白酶體抑制劑N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸后梗塞體積降低的情況，其以對(duì)側(cè)半球的百分比來(lái)表示。
圖5顯示了在中等程度的腦動(dòng)脈(MCA)閉合后，給予蛋白酶體抑制劑7-正丙基-斷裂(clasto)-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺所導(dǎo)致的梗塞體積的降低。
圖6顯示了在中等程度的腦動(dòng)脈(MCA)閉合后，給予蛋白酶體抑制劑7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺所導(dǎo)致的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)降低的情況。
圖7顯示了給予蛋白酶體抑制劑7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺所導(dǎo)致的梗死體積的降低。
圖8顯示了給予蛋白酶體抑制劑7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺所導(dǎo)致的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)降低的情況。
本發(fā)明涉及局部缺血和再灌注損傷的治療，其包括預(yù)防血管閉合后引起的梗塞或減輕梗塞的嚴(yán)重程度。這里引證的專利申請(qǐng)，專利以及參考文獻(xiàn)指出了這一范圍內(nèi)涉及的知識(shí)，它們?cè)诖吮徽w引入作為參考文獻(xiàn)。在有矛盾的情況下，以本發(fā)明為準(zhǔn)。
現(xiàn)已出人意外地發(fā)現(xiàn)遍在蛋白蛋白酶體途徑是治療血管閉合后(例如發(fā)生于心臟病或中風(fēng)期間)局部缺血和再灌注損傷，包括預(yù)防血管閉合后引起的梗塞、降低梗塞大小或減輕梗塞的嚴(yán)重程度的目標(biāo)，這些通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑的NF-kB活化抑制劑可以有效地治療這些疾病狀況。本發(fā)明令人驚奇地提供了治療局部缺血和再灌注損傷的有效方法。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，阻斷蛋白酶體功能，可以降低局部缺血的作用，例如降低血管閉合后梗塞的大小。這可以通過(guò)直接的蛋白酶體抑制(見(jiàn)N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸和7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺所顯示)或通過(guò)阻斷蛋白酶體目標(biāo)蛋白(例如IkB-α)的遍在蛋白化來(lái)實(shí)現(xiàn)。任何通過(guò)真核生物細(xì)胞中遍在蛋白蛋白酶體途徑影響NF-kB活化的抑制劑均可預(yù)期有效地預(yù)防或治療梗塞，包括血管閉合后引起的梗塞，因此，它們也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，治療包括再灌注損傷的局部缺血、預(yù)防血管閉合后引起的梗塞、降低梗塞大小或減輕梗塞的嚴(yán)重程度可以通過(guò)給予哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。
第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物局部缺血的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。所有組織對(duì)低灌注帶來(lái)的氧氣缺乏(局部缺血)都是敏感的。與治療有關(guān)的主要局部缺血事件包括(但不限于)心臟病和中風(fēng)。局部缺血還可以影響其它組織，包括視網(wǎng)膜、肝臟、腎臟、骨骼、胎盤以及脊柱組織。長(zhǎng)時(shí)間的局部缺血可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷，明顯的，在腦局部缺血的情況下可以導(dǎo)致神經(jīng)功能失調(diào)?，F(xiàn)行使用的治療中風(fēng)的藥劑以下列內(nèi)容為目標(biāo)1)扭轉(zhuǎn)與局部缺血事件有關(guān)的過(guò)度中毒現(xiàn)象；或2)使局部缺血組織的血流增加。
局部缺血通常是由血管閉合導(dǎo)致的，例如由栓或血栓，出血，淹溺以及窒息引起的血管閉合。按照不受理論束縛的想法，人們認(rèn)為局部缺血引發(fā)了大腦突觸前神經(jīng)末端中大量促毒素氨基酸、谷氨酸的釋放，它們可以作用于鄰近細(xì)胞中的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體。一旦活化，NMDA受體允許過(guò)量的鈣進(jìn)入細(xì)胞，其反過(guò)來(lái)活化一系列的次級(jí)途徑，它們最終導(dǎo)致了細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解和細(xì)胞死亡。在尋找有效治療方法的過(guò)程中，人們進(jìn)行了各種努力，目標(biāo)是既能有突觸前谷氨酸的釋放(經(jīng)過(guò)對(duì)k-鴉片制劑受體的刺激)，又可以阻斷NMNA受體的活化(或直接用NMDA拮抗劑，或間接用甘氨酸拮抗劑)。對(duì)鈣通道阻斷劑以及依鈣蛋白(calpin)抑制劑也進(jìn)行了研究。當(dāng)各種藥物在臨床前期和臨床中顯示出活性時(shí)，由于系列反應(yīng)發(fā)生的速度、用藥時(shí)間以及治療的有效性等原因，它們的有益之處有所限制。臨床上唯一能增加血流的藥物是組織纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)，其有助于阻斷血管的凝血的迅速溶解。盡管在中風(fēng)患者身上的有有限程度的療效(事實(shí)上其促進(jìn)出血)，TPA這種藥物對(duì)那些患有腦出血的病人來(lái)說(shuō)可以使其致死。因此，在患者被確診患有中風(fēng)而不是出血之前，不能給予TPA。對(duì)于中風(fēng)病人來(lái)說(shuō)，用于此項(xiàng)分析所需要的時(shí)間明顯地增加了局部缺血的時(shí)間，因此使得可搶救組織的量降低。象NF-kB活化抑制劑等可以作用于局部缺血系列反應(yīng)系統(tǒng)本身的藥劑則不受這類延長(zhǎng)診斷期的影響，因?yàn)樗鼈儗?duì)腦出血病人是無(wú)害的。
優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑抑制NF-kB的活化。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑抑制IkB-α的磷酸化。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑為蛋白酶體抑制劑。在這類實(shí)施方案中，對(duì)蛋白酶體的抑制優(yōu)選小于完全抑制。蛋白酶體優(yōu)選抑制劑選自肽基醛，硼酸或硼酸酯，乳胱氨蛋白或乳胱氨蛋白同類物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-kB活化抑制劑為遍在蛋白途徑抑制劑。
轉(zhuǎn)錄因子NF-kB是Rel蛋白質(zhì)家族中的一員。轉(zhuǎn)錄活化劑蛋白的Rel家族可以分成兩組。第一組需要蛋白分解操作，包括p105和p100，它們可以相應(yīng)地加工成p50和p52。第二組不需要蛋白分解操作，包括p65(Rel A)，Rel(c-Rel)以及Rel B。NF-kB包含兩個(gè)亞單位，p50以及另一個(gè)Rel基因家族的成員(例如p65)。未經(jīng)加工的p105也可與p65以及Rel家族的其它成員連結(jié)。在大多數(shù)細(xì)胞中，p50-p65二雜合體在胞漿中以一種與IkB-α相連的非活化的形式存在。對(duì)IkB-α進(jìn)行分離和破壞可使三元復(fù)合體得以活化，而p65/p105二雜合體可通過(guò)對(duì)p105進(jìn)行加工得以活化。
遍在蛋白蛋白酶體途徑在NF-kB活性的調(diào)節(jié)中起著必要的作用，其對(duì)p105至p50的加工以及抑制劑蛋白IkB-α的降解均負(fù)有責(zé)任(Palombella等人，WO95/25533)。為了通過(guò)蛋白酶體達(dá)到降解的目的，IkB-α必須首先在絲氨酸殘基32和36上經(jīng)過(guò)選擇的磷酸化作用，然后是遍在蛋白ation(Alkalay等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599(1995)；Chen，WO97/35014)。
一旦活化，NF-kB向細(xì)胞核易位，在那里，在明顯不同的一整套涉及免疫和炎癥反應(yīng)的基因的調(diào)節(jié)中，它起著中心的作用(Grilli等人，International Review Of Cytology 1431-62(1993))。例如在炎癥反應(yīng)中涉及的許多基因的表達(dá)需要NF-kB，如TNF-α基因以及編碼細(xì)胞粘附分子E-選擇蛋白，P-選擇蛋白，ICAM以及VCAM(Collins，T.，Lab.Invest.(1993)68499)。大量細(xì)胞因子基因(例如IL-2，IL-6，粒性白細(xì)胞集落刺激因子以及IFN-β)的表達(dá)也需要NF-kB?？烧T導(dǎo)的一氧化氮合成酶也是在NF-kB的調(diào)控之下。
蛋白酶體抑制劑阻斷IkB-α的降解和NF-kB的活化(Palombella等人，WO95/25533，發(fā)表于9/28/95；Traenckner等人，EMBO J.(1994)135433)。蛋白酶體抑制劑還可以阻斷IFN-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附分子E-選擇蛋白，VCAM-1以及ICAM-1的表達(dá)(Read等人，Immunity(1995)2493)。這些細(xì)胞粘附分子在支持從血流到血管外損傷處(例如局部缺血組織)的白細(xì)胞滲出方面起了關(guān)鍵的作用。盡管想獲得修復(fù)作用，但所導(dǎo)致的細(xì)胞流入(尤其是中性白細(xì)胞)可以通過(guò)細(xì)胞因子的釋放促進(jìn)損傷，結(jié)果加速了細(xì)胞死亡，并且為其它細(xì)胞(例如噬菌體)進(jìn)攻該區(qū)域提供了信號(hào)。
第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)再灌注損傷嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。再灌注損傷源于以下一或多個(gè)原因細(xì)胞酸中毒導(dǎo)致了鈣超載；分解代謝引起細(xì)胞內(nèi)滲透量增加，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹；來(lái)自中性白細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞的游離基。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白途徑抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。
第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或降低梗塞大小或減輕梗塞嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，此方法可以預(yù)防腦血管或心血管發(fā)生閉合后梗塞的發(fā)生，降低梗塞大小，減輕梗塞的嚴(yán)重程度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，此方法可以預(yù)防閉合引起的中風(fēng)，或減輕由于腦血管閉合所引起的中風(fēng)的嚴(yán)重程度。
最常見(jiàn)的中風(fēng)是血栓形成性中風(fēng)，其中腦血管的閉合被認(rèn)為是由于聚集的血小板的栓引起的。通常，這些血小板栓從主頸動(dòng)脈或腦血管動(dòng)脈粥樣硬化斑上的血小板血栓中以栓子的形式釋放出來(lái)。血栓形成性中風(fēng)通常具有類似于“口吃”的特征，其最初的發(fā)作較輕微，通常是可逆的，在一個(gè)更嚴(yán)重的不可逆的中風(fēng)后，出現(xiàn)了神經(jīng)損傷。最初的事件通常反映了由血小板血栓引起的暫時(shí)性的腦血管阻礙，其實(shí)際上是可逆的。事實(shí)上，從臨床的角度來(lái)說(shuō)，一次溫和的中風(fēng)可被視作為暫時(shí)性局部缺血攻擊(TIA)系列反應(yīng)的一種極端的結(jié)束方式-一種可逆性的神經(jīng)缺損，其中腦血管被栓性的血小板血栓暫時(shí)性的堵塞，結(jié)果發(fā)生聚集，故只得重新建立流動(dòng)。因此，本發(fā)明提供了在暫時(shí)性的血管閉合發(fā)生后，給予本發(fā)明中公開(kāi)的藥劑的方法。如前討論的，另一種重要的中風(fēng)形式是腦出血后的中風(fēng)。我們相信這里公開(kāi)的的藥劑在預(yù)防各種原因引起的梗塞、降低梗塞大小或減輕梗塞嚴(yán)重程度方面具有廣泛的療效，包括血栓形成性中風(fēng)以及腦出血后的中風(fēng)。就實(shí)際應(yīng)用而言，梗塞大小的降低或梗塞嚴(yán)重程度的減輕可以從與梗塞有關(guān)的癥狀的減弱來(lái)推測(cè)，包括未加限制的神經(jīng)癥狀以及心功能癥狀。
第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療局部缺血或再灌注損傷的方法，包括(但不限于)降低梗塞大小或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)梗塞嚴(yán)重程度的方法，其包括除了給予NF-kB活化抑制劑外，再給予所述的哺乳動(dòng)物附加治療劑。優(yōu)選的NF-kB活化抑制劑選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白途徑抑制劑，IkB-α絲氨酸磷酸化抑制劑以及它們的混合物。一些優(yōu)選的附加治療劑包括(但不限于)這樣一些藥劑，可以進(jìn)一步抑制NF-kB活化或抑制前炎性細(xì)胞因子或細(xì)胞粘附分子的表達(dá)或作用的甾體；可對(duì)組織進(jìn)行再灌注或氧化的藥劑，抗水腫藥物，血栓溶解劑，例如TPA，鏈激酶和尿激酶，聚陰離子，例如肝素，抗凝劑；以及有助于溫度正?；乃巹Ｒ种拼傺仔约?xì)胞因子或細(xì)胞粘附分子作用的藥劑包括(但不限于)抗體或抗體衍生物，其更優(yōu)選的是單克隆抗體，人類抗體，人類化抗體，單鏈抗體，嵌合抗體或與抗原連接的抗體片斷。這里討論或公開(kāi)的任何藥劑與任何其它在中風(fēng)或心肌梗塞治療中使用的藥劑的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本描述中，使用了下列定義。
“治療”是指預(yù)防或減輕局部缺血損傷或再灌注損傷，其包括預(yù)防血管閉合后的梗塞或降低梗塞大小或減輕梗塞的嚴(yán)重程度，包括無(wú)限制梗塞。按照治療方法，采用任意的蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，或通過(guò)抑制劑干擾NF-kB活化的藥劑所觀察到的梗塞癥狀的任意改善均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括人類。
“NF-kB活化的抑制劑”或“NF-kB活化抑制劑”是指任何通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑抑制NF-kB活化的物質(zhì)，包括下列任意物質(zhì)1)抑制蛋白酶體或其活性；2)抑制IkB-α或p105的普遍存在；或3)抑制IkB-α或p105的磷酸化。
“遍在蛋白途徑抑制劑”是指直接或間接抑制遍在蛋白ation或遍在蛋白向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移的任意物質(zhì)。非限定性的遍在蛋白抑制劑包括那些在Berleth等人，Biochem.35(5)1664-1671(1996)中所描述的抑制劑。IkB-α磷酸化的抑制劑也是已知的(Chen，Cell84853(1996))。
“蛋白酶體抑制劑”是指直接或間接抑制蛋白酶體或其活性的任意物質(zhì)。本發(fā)明中使用的非限定性的蛋白酶體抑制劑包括肽基醛(Stein等人于1995年9月21日公開(kāi)的WO 95/24914；Siman等人于1991年9月19日公開(kāi)的WO 91/13904；Iqbal等人，J.Med.Chem.382276-2277(1995))，肽基硼酸(Adams等人于1996年5月9日公開(kāi)的WO 96/13266；Siman等人，WO 91/13904)，乳胱氨蛋白和乳胱氨蛋白同類物(Fenteany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)913358；Fenteany等人于10/17/96公開(kāi)的WO96/32105)。
優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的肽基醛蛋白酶體抑制劑為Stein等人在1995年9月21日公開(kāi)的WO 95/24914中或Siman等人在1991年9月19日公開(kāi)的WO 91/13904中提到的那些化合物，上述兩篇文獻(xiàn)均被全文引入作為參考。
優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的硼酸或酯類化合物為Adams等人在1996年5月9日公開(kāi)的WO 96/13266中或Siman等人在WO 91/13904中提到的那些化合物，上述兩篇文獻(xiàn)均被全文引入作為參考。
更優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的硼酸或酯類化合物選自N-(4-嗎啉)羰基-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸。N-(8-喹啉)磺?；?β-(1-萘基)-L丙氨酸-L丙氨酸-亮氨酸硼酸。N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸以及N-(4-嗎啉)羰基-[O-(2-吡啶甲基)]-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的乳胱氨蛋白和乳胱氨蛋白同類化合物為Fenteany等人在10/17/96公開(kāi)的WO 96/32105中提到的那些化合物，上述文獻(xiàn)被全文引入作為參考。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的乳胱氨蛋白同類物選自乳胱氨蛋白，斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺，7-乙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺以及7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺。最優(yōu)選的乳胱氨蛋白同類物為7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺。
這里公開(kāi)的藥劑可以任何途徑給藥，包括皮內(nèi)、皮下、口服、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈等途徑。優(yōu)選的給藥途徑是靜脈給藥。優(yōu)選的非腸道給藥方式為一次性注射或靜脈滴注。
藥用混合物中所公開(kāi)化合物的濃度可以根據(jù)幾個(gè)因素變化，上述因素包括給予化合物的劑量，所用化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特性以及給藥途徑。用于治療局部缺血或再灌注損傷的藥劑的有效劑量可以在一個(gè)比較寬的范圍內(nèi)變化，為約10μg-50mg/kg受試哺乳動(dòng)物體重。藥劑可以單一或重復(fù)劑量給予受試對(duì)象。根據(jù)以下因素，治療可以每日進(jìn)行，也可以采取更頻繁的方式進(jìn)行，這些因素包括患者的整體健康狀況，所選化合物的配方和給藥途徑。
公開(kāi)的化合物可以在例如局部缺血發(fā)生之前、期間或之后的任何時(shí)候進(jìn)行給藥。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，是在局部缺血發(fā)生之后，但又來(lái)得及逆轉(zhuǎn)受影響組織的部分或全部損傷。優(yōu)選地，是在局部缺血發(fā)生之后12小時(shí)之內(nèi)，更優(yōu)選的是6小時(shí)之內(nèi)，最優(yōu)選的是3小時(shí)之內(nèi)給予藥劑。治療可以在對(duì)局部缺血組織進(jìn)行再灌注之前、期間或之后開(kāi)始。在許多情況下，無(wú)法精確決定再灌注的時(shí)間，但是優(yōu)選的是在再灌注之前、期間或再灌注剛剛結(jié)束之后開(kāi)始治療，目的是預(yù)防或減輕由再灌注導(dǎo)致的額外損傷。
在凝血導(dǎo)致的局部缺血事件中，可以給予類似于TPA這樣的可以破壞凝血的藥物，以降低潛在的組織損傷。一旦給藥，藥物迅速發(fā)揮作用，去除血管內(nèi)阻礙物，因此可以測(cè)定局部缺血的終止時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在凝血溶于藥物的同時(shí)或剛剛?cè)苡谒幬镏蠼o予NF-kB活化抑制劑。
在一些其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，是在局部缺血發(fā)生之前給予NF-kB活化抑制劑。在一些醫(yī)療操作的情況下(例如外科手術(shù))，局部缺血的發(fā)生是可以預(yù)測(cè)的。在另外一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，公開(kāi)的化合物是在上述醫(yī)療操作過(guò)程中(例如血管成形術(shù))局部缺血發(fā)生及再灌注開(kāi)始之前或剛剛開(kāi)始之后進(jìn)行給藥的。
下列實(shí)例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，但其實(shí)質(zhì)上不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1方法用鹵代乙烷使六只雄性Sprague Dawley大鼠(300g)麻醉，然后使用尼龍纖維將其中腦動(dòng)脈(MCA)閉合2小時(shí)。隨后，移去纖維，在對(duì)大鼠進(jìn)行斬首前，對(duì)發(fā)生梗塞的組織進(jìn)行24小時(shí)再灌注。
取自整個(gè)大腦的冠狀部分(2.0mm×7-8)用氯化三苯基四唑鎓進(jìn)行染色，然后在雙盲操作下，用圖象分析對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定梗塞大小。
還可以對(duì)側(cè)(未梗塞的)半球的百分比來(lái)表示梗塞的程度，用以提供一個(gè)指標(biāo)上述操作究竟對(duì)同側(cè)(梗塞)的半球有多大的損傷。按由于在梗塞的半球存在水腫，實(shí)際上通常無(wú)法直接確定被損傷的同側(cè)半球的百分比。劑量方案在開(kāi)始閉合30分鐘、2小時(shí)以及6小時(shí)后，經(jīng)靜脈給予大鼠一次性注射(1.0mL/kg)載體(10％PEG200/鹽水；n＝3)或N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(0.03mg/kg；n＝3)。結(jié)果接受處理的動(dòng)物，其同側(cè)半球的梗塞體積降低了62％(見(jiàn)圖1)。這一結(jié)果反映了該半球的總損傷降低了19％-2％(圖2)。實(shí)施例2方法用鹵代乙烷使雄性Sprague Dawley大鼠(250-400g)麻醉，然后使用尼龍纖維將其中腦動(dòng)脈(MCA)閉合2小時(shí)。隨后，移去纖維，在對(duì)大鼠進(jìn)行斬首前，對(duì)發(fā)生梗塞的組織進(jìn)行24小時(shí)再灌注。
在撤掉纖維后，立即用神經(jīng)學(xué)記分系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)用0-10的數(shù)字來(lái)表示，0代表沒(méi)有神經(jīng)學(xué)損傷，10代表有嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)損傷。24小時(shí)后以及斬首前，用同樣的神經(jīng)學(xué)記分系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行第二次評(píng)價(jià)。
取自整個(gè)大腦的冠狀部分(2.0mm×7-8)用氯化三苯基四唑鎓進(jìn)行染色，然后在雙盲操作下，用圖象分析對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定梗塞大小。劑量方案在開(kāi)始閉合2小時(shí)后，經(jīng)靜脈給予大鼠一次性注射(1.0mL/kg)載體(50％丙二醇/鹽水；n＝8)或7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺(0.1mg/kg；n＝6)。結(jié)果經(jīng)7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺處理的動(dòng)物，其梗塞體積降低70％(見(jiàn)圖5)。
在局部缺血事件剛剛發(fā)生后2小時(shí)，所有動(dòng)物的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)為10±0。24小時(shí)時(shí)，用載體處理的大鼠的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)為8.7±0.6，而用單一劑量(0.1mg/kg)7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺處理的動(dòng)物的平均分?jǐn)?shù)為5.5±1(見(jiàn)圖6)。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于藥物處理過(guò)的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，其產(chǎn)生了40％的神經(jīng)學(xué)改善。結(jié)論7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺對(duì)神經(jīng)缺損以及梗塞大腦的損傷均有明顯的保護(hù)作用。實(shí)施例3方法用鹵代乙烷使雄性Sprague Dawley大鼠(250-400g)麻醉，然后使用尼龍纖維將其中腦動(dòng)脈(MCA)閉合2小時(shí)。隨后，移去纖維，在對(duì)大鼠進(jìn)行斬首前，對(duì)發(fā)生梗塞的組織進(jìn)行24小時(shí)再灌注。
在撤掉纖維后，立即用神經(jīng)學(xué)記分系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)用0-10的數(shù)字來(lái)表示，0代表沒(méi)有神經(jīng)學(xué)損傷，10代表有嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)損傷。24小時(shí)后以及斬首前，用同樣的神經(jīng)學(xué)記分系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行第二次評(píng)價(jià)。
取自整個(gè)大腦的冠狀部分(2.0mm×7-8)用氯化三苯基四唑鎓進(jìn)行染色，然后在盲操作下，用圖象分析對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定梗塞大小。劑量方案在開(kāi)始閉合2小時(shí)后，經(jīng)靜脈給予大鼠一次性注射(1.0mL/kg)載體(50％丙二醇/鹽水；n＝8)或7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺(0.3mg/kg；n＝7)。另外兩組大鼠在開(kāi)始閉合后0分鐘、2小時(shí)以及6小時(shí)后經(jīng)靜脈注射(1.0mL/kg)給予7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺。其中一組(0.1mg/kg×3；n＝6)在上述每一時(shí)刻接受0.1mg/kg，而另一組(0.3mg/kg×3；n＝7)在上述每一時(shí)刻接受0.3mg/kg。結(jié)果經(jīng)用單一劑量的7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺處理的動(dòng)物，其梗塞體積降低50％(見(jiàn)圖3)。用0.1mg/kg×3劑量組或0.3mg/kg×3劑量組的梗塞體積沒(méi)有明顯變化(見(jiàn)圖7)。
在局部缺血事件剛剛發(fā)生后2小時(shí)，所有動(dòng)物的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)為10±0。24小時(shí)時(shí)，用載體處理的大鼠的神經(jīng)病學(xué)分?jǐn)?shù)為8.7±0.6，而用單一劑量(0.3mg/kg)7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺處理的動(dòng)物的平均分?jǐn)?shù)為4±1(見(jiàn)圖8)。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于藥物處理過(guò)的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，其產(chǎn)生了60％的神經(jīng)學(xué)改善。就0.1mg/kg×3劑量組或0.3mg/kg×3劑量組來(lái)說(shuō)，沒(méi)有觀察到明顯的神經(jīng)學(xué)改善(見(jiàn)圖8)。結(jié)論7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺對(duì)神經(jīng)缺損以及梗塞大腦的損傷均有明顯的保護(hù)作用。
盡管上文中描述了一些特定的優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)該明白它們并沒(méi)有限制本發(fā)明。對(duì)于具有通常水平的本領(lǐng)域內(nèi)的專家來(lái)說(shuō)，可以對(duì)已公開(kāi)的實(shí)施方案進(jìn)行各種修飾，并且這樣的修飾亦被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其由下列權(quán)利要求來(lái)限定。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物局部缺血損傷的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑，通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑干擾NF-kB活化的藥劑，以及它們的混合物。
2.治療哺乳動(dòng)物局部缺血后導(dǎo)致的再灌注損傷的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑，它們選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑干擾NF-kB活化的藥劑，以及它們的混合物。
3.預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)栓塞、降低栓塞大小或減輕由局部缺血或再灌注損傷所引起的梗塞的嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述的哺乳動(dòng)物有效劑量的NF-kB活化抑制劑，它們選自蛋白酶體抑制劑，遍在蛋白抑制劑，通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑干擾NF-kB活化的藥劑，以及它們的混合物。
4.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中的局部缺血是血管閉合引起的。
5.權(quán)利要求4中所述的方法，其中的閉合是指腦血管。
6.權(quán)利要求4中所述的方法，其中的閉合是指心血管。
7.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中的方法可以預(yù)防或減輕中風(fēng)的嚴(yán)重程度。
8.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中的方法可以預(yù)防或減輕由腦血管閉合引起的中風(fēng)的嚴(yán)重程度。
9.權(quán)利要求6中所述的方法，其中的方法可以預(yù)防或減輕由心血管閉合引起的心肌梗死的嚴(yán)重程度。
10.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中的NF-kB活化抑制劑可以抑制IkB-α的磷酸化作用。
11.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中的NF-kB活化抑制劑包括蛋白酶體抑制劑。
12.權(quán)利要求11中所述的方法，其中的蛋白酶體抑制劑為肽基醛。
13.權(quán)利要求11中所述的方法，其中的蛋白酶體抑制劑為肽基硼酸或肽基硼酸酯。
14.權(quán)利要求11中所述的方法，其中的蛋白酶體抑制劑為乳胱氨蛋白類似物。
15.權(quán)利要求13中所述的方法，其中的蛋白酶體抑制劑為N-(2-吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸。
16.權(quán)利要求14中所述的方法，其中的蛋白酶體抑制劑為7-正丙基-斷裂-乳胱氨蛋白-β-內(nèi)酰胺。
17.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中是在局部缺血發(fā)作后12小時(shí)內(nèi)給予哺乳動(dòng)物NF-kB活化抑制劑。
18.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中是在局部缺血發(fā)作后6小時(shí)內(nèi)給予哺乳動(dòng)物NF-kB活化抑制劑。
19.權(quán)利要求1-3中所述的方法，其中是在局部缺血發(fā)作前給予哺乳動(dòng)物NF-kB活化抑制劑。
20.權(quán)利要求1-4中所述的方法，其進(jìn)一步包含給予第二種藥劑的步驟。
21.權(quán)利要求21中所述的方法，其中的第二種藥劑選自NF-kB活化抑制劑，抑制促炎癥細(xì)胞因子或細(xì)胞粘附分子的表達(dá)或作用的藥劑，可對(duì)組織進(jìn)行再灌注或氧化的藥劑，以及有助于溫度正?；乃巹?。
22.權(quán)利要求21中所述的方法，其中的第二種藥劑選自甾體，抗水腫藥物，血栓溶解劑，血凝塊助溶藥物，聚陰離子以及抗凝劑。
23.權(quán)利要求22中所述的方法，其中的第二種藥劑包含血栓溶解劑和血凝塊助溶藥物。
24.權(quán)利要求23中所述的方法，其中的血凝塊助溶藥物包含組織纖維蛋白溶酶原活化劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)給予蛋白酶體抑制劑,遍在蛋白抑制劑,通過(guò)遍在蛋白蛋白酶體途徑干擾NF－kB活化的藥劑,來(lái)治療局部缺血。
文檔編號(hào)A61K31/407GK1250376SQ98803396
公開(kāi)日2000年4月12日 申請(qǐng)日期1998年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月15日
發(fā)明者S·布蘭德, A·L·哥爾德伯格, L·普拉曼頓, F·蘇西 申請(qǐng)人:普羅斯克里普特公司