專利名稱：通過交叉流過濾純化或/和濃縮dna,從核酸制品中分離內(nèi)毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化或/和濃縮溶液中的核酸的方法，涉及一種從核酸制品中分離內(nèi)毒素的方法和交叉流過濾系統(tǒng)純化或/和濃縮溶液中的核酸的用途，并涉及從核酸制品中分離內(nèi)毒素。
核酸的純化方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域常用的方法?，F(xiàn)有技術(shù)所知的方法中，被分離的生物材料，例如大腸桿菌(E.coli.)細胞是經(jīng)裂解后離心(通常用溶菌酶或超聲波裂解)，上清與苯酚一起搖出。隨后在氯化銫梯度中進行超速離心(Birnboim和Doly，核酸研究(Nucl.Acid Res.)7(1979)1513-1523；Garger等人，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)117(1983)，835-842)。然而，這些制品通常含有細菌內(nèi)毒素、苯酚、氯化銫和/或溴化乙錠這樣的雜質(zhì)。
內(nèi)毒素是在所有的腸細菌例如沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)和大腸桿菌中都有發(fā)現(xiàn)的細菌毒素。在哺乳動物中，內(nèi)毒素作為熱原，除引起發(fā)燒外還有多種其它的病理效應(yīng)。脂質(zhì)A組分尤其會引起內(nèi)毒素毒性效應(yīng)。
在QIAGEN質(zhì)粒手冊(Qiagen Inc.，Chatsworth，美國)和EP-B 0 268946中描述了另一種純化核酸的方法。根據(jù)這一方法，用通常裂解方法獲得的細胞裂解物在一個含QIAGEN樹脂(一種以硅膠為基礎(chǔ)的載體材料)的QIAGENTIP上層析分離。這種方法的缺點是DNA結(jié)合蛋白質(zhì)不能完全從DNA中分開，以至于獲得的質(zhì)粒制品含有相當(dāng)多的蛋白質(zhì)，尤其是內(nèi)毒素(例如從大腸桿菌細胞膜中來的內(nèi)毒素)。
在另一種核酸純化方法中，如大腸桿菌細胞這樣的生物材料堿裂解后，按照Birnboim和Doly在高鹽條件下經(jīng)陰離子交換柱層析離心上清液(例如Pharmacia公司的MONO-Q、Source-Q，Biorad公司的Macroprep-Q，Perspective生物系統(tǒng)的Poros-Q或Biosepra的HyperD-Q，參閱Chandra等人，分析生物化學(xué)(Analyt.Biochem.)203(1992)169-172；Dion等，層析雜志(J.Chrom.)535(1990)127-147)。即使經(jīng)這一純化步驟后，質(zhì)粒制品仍然含有雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)，尤其是大量的內(nèi)毒素。
在另一種純化核酸的方法中，在堿裂解和隨后的苯酚-氯仿抽提后，通過凝膠過濾進行層析(McClung和Gonzales，分析生物化學(xué)177(1989)378-382；Raymond等人，分析生物化學(xué)173(1988)124-133)。這一純化方法也不能完全去除質(zhì)粒制品中的雜質(zhì)。
上述純化方法都有一個最后的脫鹽和濃縮步驟。這通常涉及核酸的異丙醇/乙醇沉淀，隨后進行離心并在緩沖液中重懸核酸沉淀(參閱如Sambrook J.等人(1989)，分子克隆(Molecular Cloning)，實驗手冊(ALaboratory Press)，第2版，冷泉港實驗室出版社)。在這一方法中，DNA溶液與例如1/10體積的4M LiCl混合后再與0.7體積的異丙醇在室溫下混合。然后離心核酸狀的沉淀，棄去上清。在隨后的步驟中用70％的乙醇溶解含核酸的沉淀，再次離心，棄去上清。沉淀經(jīng)干燥后，重懸在所需的緩沖液中。但是，異丙醇/乙醇沉淀方法只對在實驗室中的應(yīng)用切實可行，在實驗室使用的體積較小。
除了局限在小體積外，所述的異丙醇/乙醇沉淀方法有其它嚴重的缺點。因此由于操作安全和環(huán)境保護的原因，在工業(yè)工藝規(guī)模使用所需的大量異丙醇/乙醇非常不受歡迎。而且，異丙醇/乙醇沉淀方法不能滿足提供可治療使用的核酸的技術(shù)要求，因為在核酸溶液含有的內(nèi)毒素不能用這種方法完全去除。
在WO95/21177中描述了一種分離純化用于基因治療中的核酸的方法，在這一方法中，純化基本上通過是離心、過濾、親和層析或在無機層析材料上層析和在離子交換劑上層析。為了去除內(nèi)毒素，用含10％TritonX100和40mmol/L MOPS緩沖液(3-嗎啉-1-磺酸丙酯)的緩沖液處理核酸。該方法的一個缺點是用這種方式純化的核酸污染了藥學(xué)不安全的物質(zhì)Triton和MOPS。另外，盡管可能將內(nèi)毒素含量降到約100EU/mgDNA(QIAGEN消息1-96，3-5)，但不可能更進一步去除內(nèi)毒素。然而，治療應(yīng)用需要甚至更高純度的核酸制品，比如對基因治療要盡可能去除所有的雜質(zhì)(特別是基本上沒有內(nèi)毒素)。如Cotton等人，基因治療1(1994)239-246所述，所有上述質(zhì)粒DNA制品中內(nèi)毒素的含量到目前為止還是一個未解決的問題。
K.-G.Wahlund和A.Litzen(層析雜志，461(1989)，73-87；476(1989)，413-421)描述了一種稱為“場流分級分離(FFF)”的方法，適合分析和微量制備應(yīng)用，其能根據(jù)它們各自的分子量分離蛋白質(zhì)混合物和質(zhì)粒。象在交叉流過濾中一樣，在超濾膜上的流動途徑是切向的，但同交叉流過濾相反，分離是基于在載體液中分子的遷移差異。因此待分離分子的洗脫取決于它們的分子大小和相應(yīng)的擴散系數(shù)。分離是不連續(xù)的，即待分離的分子在分離過程中只流過膜一次。
F.M.Fernandez、J.M.Romano和M.A.Otero(生物工程學(xué)報(ActaBiotechnol.)12(1992)1，49-56)描述了用中空纖維膜交叉流過濾方法濃縮溶液中的RNA。然而，DNA或質(zhì)粒DNA的純化既沒有描述也沒有闡明。
G.W.Rembhotkar和G.S.Khatri(分析生物化學(xué)，176，337-374(1989))描述通過切向流過濾純化λ噬菌體裂解物。隨后通過常用方法使用氯仿、苯酚-氯仿處理和乙醇沉淀制備λ噬菌體DNA。
在WO96/36706和96/02658 A1中描述了一種大規(guī)模生產(chǎn)的從微生物中分離并純化質(zhì)粒DNA的方法。通過加入裂解液，在流式熱交換器中加熱到70℃至100℃裂解細胞，隨后通過分批離心和透濾法(diafiltration)獲得清澈的上清液。透濾是以盲端(dead-end)形式進行，而不是根據(jù)交叉流分離方法通過切向流過膜進行的。然后用陰離子交換層析和反相HPLC進行進一步純化。在這一方法中，只有細胞裂解在連續(xù)過程步驟中進行，進一步純化質(zhì)粒DNA是以分批形式在通常的離心和透濾設(shè)備中進行。
在EP-A 96 101 628.4中，為了獲得蛋白質(zhì)含量少于0.1％、沒有象溴化乙錠、苯酚、氯化銫和去垢劑這樣的雜質(zhì)，而且基本上沒有內(nèi)毒素的核酸溶液，建議通過陰離子交換柱使用高鹽梯度純化核酸制品。
因此在現(xiàn)有技術(shù)中沒有公知的純化或濃縮大量核酸的方法，也沒有公知的適于大量和以高純度形式制備核酸的方法，尤其是不含內(nèi)毒素并適合治療應(yīng)用的核酸制備方法。
因而本發(fā)明的目的之一提供一種純化和濃縮方法，其使得核酸能以大量并且簡單的方式純化。本發(fā)明的另一個目的是將核酸制品中內(nèi)毒素的含量減少到適合治療應(yīng)用的程度。
本發(fā)明的第一方面涉及純化或/和濃縮溶液中核酸的方法，其特征在于導(dǎo)引含核酸的溶液切向通過一層或幾層半透膜，這樣核酸分子被膜保留，低分子量物質(zhì)能穿過膜，從而獲得純化或/和濃縮的核酸溶液。
本發(fā)明的又一方面涉及從核酸制品中分離內(nèi)毒素的方法，其特征在于導(dǎo)引含核酸的制品切向通過一個或幾個半透膜，這樣核酸分子被膜保留，低分子量物質(zhì)能穿過膜或/和被膜吸附，從而獲得基本上沒有內(nèi)毒素的核酸溶液。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法使用交叉流過濾系統(tǒng)可以純化和濃縮核酸溶液。就此而論使人驚奇的新特征是核酸沒有被交叉流過濾(CFF)破壞。以前大家總是以為在CFF中出現(xiàn)的剪切力將導(dǎo)致核酸的損害，尤其是導(dǎo)致鏈的斷裂。因此，交叉流過濾以前只是用于濃縮和透濾蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明方法不僅能獲得大量的和所需純度的核酸，而且本發(fā)明的方法也能避免使用有機溶劑，這在毒理學(xué)上以及在安全和環(huán)境方面是主要的優(yōu)勢。
令人驚奇的是還發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明方法也能獲得基本上沒有雜質(zhì)尤其是內(nèi)毒素的核酸制品，這樣它們就能用于治療方法或應(yīng)用中。因此本發(fā)明解決了可用于治療的核酸需求量大大增長所產(chǎn)生的問題，尤其是可用于治療的DNA的需求預(yù)計在將來會進一步增長。
本發(fā)明的方法用于純化或/和濃縮線性或環(huán)狀核酸，優(yōu)選的是質(zhì)粒DNA，最優(yōu)選的是環(huán)狀質(zhì)粒DNA。就此而論，核酸的大小優(yōu)選在≥150堿基對的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選的是1千堿基對-200千堿基對。根據(jù)本發(fā)明方法可以分批純化或/和濃縮核酸，但優(yōu)選使用連續(xù)方式進行?？梢蕴幚砣魏未笮〉捏w積，但優(yōu)選處理1到10,000L的體積，尤其優(yōu)選的是1-100L。在適合的壓力條件下含核酸的溶液被導(dǎo)引通過膜或多層膜，優(yōu)選的交叉流壓力大于跨膜壓力。尤其優(yōu)選的是在跨膜壓力0.2到0.3巴下操作，最優(yōu)選的是0.8-1.5巴，在這種情況下交叉流壓力大于跨膜壓力。滯流液的流速(RF)能在一個較寬的范圍變化，優(yōu)選的是在RF 100L/h·m2到4000L/h·m2操作。這一方法也能在不同溫度下進行，優(yōu)選的在4℃-25℃溫度范圍操作。
為了分離出含核酸溶液中的低分子雜質(zhì)尤其是內(nèi)毒素，使用了普通膜比如聚醚砜(PES)、改性PES、聚二氟乙烯(PVDF)、纖維素三乙酸酯或再生纖維素制成的膜。中空纖維螺旋膜件也適用于根據(jù)本發(fā)明的這一方法。排阻大小在1-1000千道爾頓(KD)的膜是優(yōu)選使用的，更優(yōu)選的是10-300KD，最優(yōu)選的是10-100KD。內(nèi)毒素去除因數(shù)(在交叉流過濾前核酸制品的內(nèi)毒素含量與交叉流過濾后核酸溶液的內(nèi)毒素含量之比)在本發(fā)明中能達到至少10∶1，優(yōu)選的至少200∶1。溶液中內(nèi)毒素的含量在交叉流過濾后非常低，優(yōu)選的是小于0.1EU/mg核酸。在本發(fā)明中獲得的核酸基本上未遭破壞，基本上沒有單鏈或雙鏈斷裂。
尤其是根據(jù)本發(fā)明純化的質(zhì)粒DNA在凝膠電泳分離后只顯出一條主帶，這與“共價閉合環(huán)狀”構(gòu)型對應(yīng)。而且，除了少量開環(huán)和線性化環(huán)狀構(gòu)型外，沒有出現(xiàn)其它的帶。
本發(fā)明的又一方面涉及使用交叉流過濾系統(tǒng)純化或/和濃縮溶液中的核酸。
本發(fā)明的又一方面涉及使用交叉流過濾系統(tǒng)從核酸制品中分離內(nèi)毒素。
前面發(fā)明的又一方面涉及通過交叉流過濾純化或/和濃縮的核酸用于克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射進細胞、用于基因治療方法、DNA接種疫苗或/和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的用途。實施例在所述的實驗中使用了購自Filtron公司(定貨號δS 100CO1排阻大小100KD)的改性聚醚砜制成的OMEGA型膜，購自Sartorius公司的醋酸纖維素制成的膜和購自Millipore公司的PVDF膜。特別使用排阻范圍是100千道爾頓的膜分離內(nèi)毒素。為了檢驗內(nèi)毒素的分離，使用從Sigma公司購買的E-toxate(定貨號210)作同位素示蹤溶液。內(nèi)毒素通過固體膠的方法檢測，含內(nèi)毒素的溶液加到鱟變形細胞裂解溶液(LAL溶液)導(dǎo)致混合物膠體的形成。膠體的形成歸因于在幾個步驟中就發(fā)生的級連凝結(jié)。1.質(zhì)粒DNA溶液的交叉流過濾(CFF)為了檢驗CFF作為濃縮質(zhì)粒DNA的方法，通過堿裂解法裂解2000g大腸桿菌菌體，由Q-Sepharose和羥基磷灰石層析處理生產(chǎn)制品，獲得的質(zhì)粒DNA溶液用作CFF的起始溶液。1.1起始溶液的制備把2000g從發(fā)酵罐獲得的濕大腸桿菌菌體添加入去熱原的離心杯中，加入22.5L重懸緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA-Na2，pH8±0.2)，在5±4℃緩慢攪拌(約35轉(zhuǎn)/分)至少24小時，直到菌體完全懸浮。在這一步把懸浮物溫度慢慢提高到25℃。
在約80轉(zhuǎn)/分攪拌下向懸浮液中加入22.5L 0.2mol/L NaOH、1％SDS，在25℃保溫5分鐘。在攪拌下加入22.5L醋酸鉀緩沖液(3mol/L醋酸鉀緩沖液，pH5.5)，同時盡快地將菌體的溫度降到4℃。在26,000xg和4C下將菌體離心30分鐘。分離出含質(zhì)粒DNA的上清液并在5μm過濾棒濾器過濾澄清。
下一步中進行了Q-Sepharase層析分離。通過加入TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.5±0.2)，將倒出的離心上清液的電導(dǎo)率調(diào)整為49-50mS/cm，并冷卻到5±4℃。整個層析分離都是在這一溫度下進行的。把離心上清液吸附到平衡的柱上。隨后用約8 CV 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.65mol/L NaCl pH8.5±0.2洗柱。
對柱子采用梯度(5CV緩沖液A(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA，0.65mmol/L NaCl，pH8.0±0.2)，5 CV緩沖液B(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.85mmol/L NaCl，pH8.0±0.2))進行洗脫，在流速5到8CV/h下分級分離洗脫液，在254nm下進行檢測。從主峰上升的側(cè)面開始在單獨的容器中收集主峰，將前面的峰(雜質(zhì))與主峰(質(zhì)粒DNA)分開。
隨后在5±4℃下進行羥基磷灰石(HA陶瓷)層析。
平衡液0.1mol/L磷酸鉀，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
淋洗液10.15mol/l磷酸鉀，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
淋洗液20.02mol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0±0.2。
洗脫液0.5mol/L磷酸鉀，pH7.0±0.2。
在254nm下用UV檢測/記錄單元進行檢測。以1％的產(chǎn)品溶液(質(zhì)粒DNA)作為標定溶液，標定溶液用標定的光度計測定。
把Q-Sepharose上柱液(pool)調(diào)整到氯化鈣終濃度1.1mmol/L，并吸附到經(jīng)平衡的柱上。
然后在流速5-8 CV/h下依次用如下溶液淋洗柱子1).0.1mol/L磷酸鉀，6mol/L脲，pH7.0±0.2，洗至檢測器不再檢測到吸收。
2).2-4 CV，0.15mol/L磷酸鉀，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
3).5 CV，0.02mol/L磷酸鉀，pH7.0±0.2。
在清洗步驟后用0.5mol/L磷酸鉀，pH7.0±0.1的緩沖液洗脫。收集峰并用作CFF中的質(zhì)粒DNA起始溶液。1.2交叉流過濾質(zhì)粒DNA起始溶液中的質(zhì)粒DNA濃度約200μg/ml，體積約3750ml。CFF在滯流液流速100-200L/h·m2下進行，跨膜壓力約0.8巴，交叉流壓力約1.2巴。利用CFF將體積濃縮到約50ml，滯流液隨后對TE緩沖液(10mmol/L Tirs-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)透濾直到滯流液的pH和電導(dǎo)率與TE緩沖液一致。完成透濾操作后用透濾緩沖液稀釋，調(diào)整滯流液至質(zhì)粒DNA濃度為1mg/ml。取制備的質(zhì)粒DNA溶液樣品，按照在3.1項描述的方法分析。2.測量由CFF去除的內(nèi)毒素將1000EU的E-toxate內(nèi)毒素標準溶液補充到體積為100ml質(zhì)粒DNA溶液中至10EU/ml，并用作實驗的起始溶液。溶液用TE緩沖液稀釋到1000ml，然后再利用CFF濃縮到100ml的初始體積(濃縮液1)。稀釋和濃縮步驟連續(xù)重復(fù)四次。在每一次濃縮步驟后從各個濃縮液中取樣(樣品濃縮液2、3、4、5)用鱟變形細胞溶解溶液法分析樣品的內(nèi)毒素濃度。3.結(jié)果3.1質(zhì)粒DNA溶液的CFF使用CFF可以毫無困難地濃縮和透濾質(zhì)粒DNA溶液。檢測結(jié)果總結(jié)在下面的表中
在完成CFF后把等分樣品質(zhì)粒DNA以不同濃度加到瓊脂糖凝膠上。所示的瓊脂糖凝膠在泳道1和10顯示DNA長度標準號II(片段大小125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23230堿基對)，在泳道2和9顯示DNA長度標準號III(片段大小125，564，831，647，1375，1584，1904，2027，3530，4268，4973，5148，21226堿基對)，在泳道3加入用傳統(tǒng)的氯化銫梯度法純化的pBR322(4162堿基對)作參照質(zhì)粒。公知用這種方法純化的質(zhì)粒DNA基本上含的是相應(yīng)于共價閉合環(huán)狀構(gòu)型(主要是超螺旋帶)的DNA。在泳道4、5和6使用不同量的用根據(jù)本發(fā)明方法純化的質(zhì)粒DNA(pCMV-CAT)。根據(jù)本發(fā)明純化的質(zhì)粒DNA，如參照質(zhì)粒DNA(泳道3)，基本上顯示一條主帶。這一質(zhì)粒DNA帶對應(yīng)于共價閉合環(huán)狀構(gòu)型(主要是超螺旋帶)。這表明根據(jù)本發(fā)明分離的質(zhì)粒DNA沒有受到損壞并保持原有的構(gòu)型。因此這就排除了質(zhì)粒DNA在CFF中片段化或變成不期望的質(zhì)粒DNA構(gòu)型的可能。圖注1％瓊脂糖凝膠通道1DNA長度標準II(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號236250)通道2DNA長度標準III(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號528552)通道3pBR322(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號481238)(0.4μg)通道4經(jīng)CFF后的pCMV-CAT，0.19μg(散裝活性物質(zhì)溶液)通道5經(jīng)CFF后的pCMV-CAT，0.45μg(散裝活性物質(zhì)溶液)通道6經(jīng)CFF后的pCMV-CAT，0.71μg(散裝活性物質(zhì)溶液)通道7TE緩沖液通道8pBR322(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號481238)(0.4μg)通道9DNA長度標準III(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號528552)通道10DNA長度標準II(Boehringer Mannheim Gmbh；目錄號236250)1.2用CFF去除內(nèi)毒素下表說明的是經(jīng)第一步濃縮后已經(jīng)基本去除內(nèi)毒素。額外的CFF能將內(nèi)毒素濃度減少到檢測方法的檢測范圍之下
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權(quán)利要求
1.純化或/和濃縮溶液中的核酸的方法，其中，導(dǎo)引含核酸的溶液切向通過一層或幾層半透膜，以使核酸分子被膜保留，低分子量物質(zhì)能穿過膜，從而獲得純化或/和濃縮的核酸溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸是質(zhì)粒DNA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中核酸的大小≥150堿基對。
4.如上述的權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中該方法是連續(xù)進行的。
5.如上述的權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中處理體積是1-10,000L的溶液。
6.如上述的權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中處理體積是1-100L的溶液。
7.如上述的權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中在壓力下導(dǎo)引該溶液通過一層或幾層膜，籍此交叉流過濾的壓力大于跨膜壓力。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中使用0.2-3.0巴的跨膜壓力。
9.如上述的權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中使用100-4000L/h·m2的滯流液流速。
10.從核酸制品中分離內(nèi)毒素的方法，其中導(dǎo)引含核酸的制品切向通過一層或幾層半透膜，以使核酸分子被膜保留，低分子量物質(zhì)能穿過膜或/和被膜吸附，從而獲得基本上不含內(nèi)毒素的核酸溶液。
11.如權(quán)利要求1-10中任何一項所述的方法，其中膜的排阻大小是1-1000KD。
12.如權(quán)利要求1-10中任何一項所述的方法，其中膜的排阻大小是10-100KD。
13.如權(quán)利要求10-12中任何一項所述的方法，其中該方法是連續(xù)進行的。
14.如權(quán)利要求10-13中任何一項所述的方法，其中處理體積是1-10,000L，優(yōu)選的是1-100L的制品。
15.如權(quán)利要求10-14中任何一項所述的方法，其中內(nèi)毒素去除因數(shù)，即在交叉流過濾前制品中的內(nèi)毒素含量與在交叉流過濾后溶液中的內(nèi)毒素含量之比至少是10∶1。
16.如權(quán)利要求10-14中任何一項所述的方法，其中內(nèi)毒素去除因數(shù)至少是200∶1。
17.如權(quán)利要求10-16中任何一項所述的方法，其中溶液中內(nèi)毒素的含量在交叉流過濾后小于0.1EU/mg核酸。
18.如前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其中獲得的核酸基本無鏈斷裂。
19.交叉流過濾系統(tǒng)在純化或/和濃縮溶液中的核酸的用途。
20.交叉流過濾系統(tǒng)從核酸制品中分離內(nèi)毒素的用途。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法純化或/和濃縮的核酸用于克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射進細胞、用于基因治療方法、DNA接種疫苗或/和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種純化或/和濃縮溶液中的核酸的方法,導(dǎo)引含核酸的溶液切向通過一層或幾層半透膜,以使核酸分子被膜保留,低分子量物質(zhì)能穿過膜或/和被膜吸附,從而獲得純化或/和濃縮的核酸溶液。同一方法可用來從核酸制品中分離內(nèi)毒素。另本發(fā)明還涉及交叉流過濾系統(tǒng)純化或/和濃縮溶液中的核酸以及從核酸制品中分離內(nèi)毒素的用途。本發(fā)明也涉及使用交叉流過濾系統(tǒng)純化或/或濃縮的核酸用于克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射進細胞、用于基因治療方法、DNA接種疫苗或/和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的用途。
文檔編號A61K39/00GK1243543SQ98801764
公開日2000年2月2日 申請日期1998年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月10日
發(fā)明者W·庫恩 申請人:羅切診斷學(xué)有限公司