緩激肽拮抗劑和它們的應用的制作方法

專利名稱:緩激肽拮抗劑和它們的應用的制作方法
本發明是關于生物學上有效的可作為拮抗緩激肽生物活性的新肽，它們的藥學上可以接受的鹽以及它們作為治療劑的應用。
自從Boissonnas等(Experientia 16∶326，1960)敘述和合成了對哺乳動物血管具有很強舒張作用的肽-緩激肽以來25年中合成了數百個有關順序的肽類似物，并進行了生物系統評價[(Schroeder，in Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Springer Verlag)pp 324～350，1970)(Stewart，Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Supplement)，(Springer Verlag)pp 227～272，1979]。上述研究的目的是研究緩激肽的各種生理和藥理作用。
緩激肽與在生理學上有關的重要肽-卡里定(Lys緩激肽)和，Met-Lys-緩激肽可以收縮平滑肌(例如引起腹瀉、炎性腸疾病和氣喘)，降低血壓，作為引起變應性炎癥、關節炎和氣喘的媒介，參與體內凝血反應和間接補體反應，作為引起鼻炎(病毒的，變應性的和非變應性的)的媒介，并且在病理條件下(如膿毒性休克、急性胰腺炎、遺傳的血管神經性水腫、胃切除術后綜合癥、類癌瘤綜合癥、過敏性休克、精子游動能力降低以及某些其他疾病)會產生過剩。從血漿中產生的緩激肽可引起病理部位的疼痛，并且緩激肽過剩會直接加劇疼痛，或者通過能產生前列腺素和白三烯(leukotrienes)的花生皿烯酸通路激活的緩激肽的刺激而引起疼痛。在Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Springer-Verlag 1970和25 Supplement，1979可以找到敘述緩激肽及有關肽上述作用的參考文獻。
緩激肽產生于腸道的炎癥反應，使平滑肌收縮以及腸液和離子分泌。Manning等在Nature(229256～259，1982)中證明，在腸粘膜里和腸平滑肌中存在著特異性的緩激肽受體，并且很低溫度的緩激肽就可影響腸液和離子的分泌。
已經研究了在絞痛時產生的緩激肽和伴生的疼痛的關系，并由Kimura等在American Heart Journal(85∶635～647，1973)和由Staszewska-Barczak等在Cardiovasculav Research(10∶314-327，1976)中報道。他們認為，緩激肽和前列腺素的聯合作用是感覺受體興奮的固有刺激，這是心肌缺血性疼痛的予兆。
緩激肽和與緩激肽有關的激肽不僅可由動物產生，而且也可以由于刺傷和叮咬而注入。已經知道，昆蟲(如大黃蜂和黃蜂)可注入與緩激肽及與緩激肽有關的肽從而引起疼痛，腫脹和炎癥。
由于缺少與緩激肽排列順序有關的有效的競爭性拮抗劑，所以嚴重地阻礙了對于認識緩激肽作用機制的探索研究，而機制的探索對研究診斷用的方法和研究減輕由于緩激肽的產生和過剩所引起劇烈疼痛的治療劑是必需的。
已經報導過能拮抗緩激肽的一種或多種生物活性的拮抗劑，這些拮抗劑為非肽、非特異性和非選擇性的物質，如各類止痛劑和抗炎劑類化合物，它們通過前列腺素系統而起作用，并且不直接地作用于緩激肽的生物受體(Rocha I Silva and Leme，Med.Exp.8∶287，1963)。例如抗組織胺劑(Gecse等，J，Pharm.Pharmacol.21∶544，1969);緩激肽抗體(Grez等，Eu.J.Pharmacol.29∶35，1974);苯并二氮類衍生物(Leme and Rocha e Silva，Br，J.Pharmacol.25∶50，1865);高分子量環氧乙烷聚合物(Wilkens and back，Arch.Intl.Pharmacodynam.209，305，1974);沒食子酸酯類(Posati等，J.Argi.Food Chem.18∶632，1970)和5-羥色胺抑制劑(Gomazkon and Shimkovich，Bull.Exptl.Biol.Med.80∶6，1975)。上述各個化合物或各類化合物中沒有一個是緩激肽特異性抑制劑。
有人報道，含有各種氨基酸的庚酯，如含單個堿基氨基酸(即Arg和Lys)的庚酯(Gecse，Adv.Exptl.Bial.Med.70∶5，1976)，二肽Phe-Gly的庚酯(Geese等，Int.Aech.Allergy 41∶174，1971)和緩激肽C-末端肽碎片類似物(即Pro-Phe-Arg)的庚酯(claessom等，Adv.Exptl.Med.Biol.120 B∶691，1979)可作為抗緩激肽物質。用緩激肽試驗系統證實，它們可以是弱的局部激動劑/抗拮劑，其作用性質，取決于劑量的大小，但對緩激肽的抑制作用均沒特異性。
已有報道，受損的血管組織標本對缺乏C-末端Arg殘基的緩激肽類似物有反應，但對緩激肽本身不起反應，并且已將這些脫-Arg-緩激肽的類似物作為緩激肽的非生理活性的抗拮劑。這些抗拮劑沒有緩激肽那樣的激動作用，并且對于生理上有顯著激肽反應的系統也沒有任何緩激作用(Regoli and Barabe，Pharmacol.Revs.32∶1，1980)。
有人報道，在Tyr殘基的5和/或8位上含有O-甲基醚的幾個緩激肽類似物，對于用半乳糖血(galactosemic)處理的大白鼠離體子宮具有激動/抗拮的混合作用，但對正常大白鼠則無此作用。在上述動物中，抗拮作用不能可靠地重復(Stewavt and Woolley，in Hy Potensiv Peptides，Springer Verlay，p.23～33，1966)。
緩激肽分子中的其他變化是在N-末端加入氨基酸，在體內試驗中，它可影響緩激肽的酶降解速率。
在全身循環中，緩激肽的半衰期小于30秒(S.H.Ferreira and J.R.Cane，Br.J.Pharmacol.Chemotherap.30∶417，1967)。在麻醉的大白鼠上，在主動脈內(IA)(肺循環分路)和靜脈(Ⅳ)內注射后測定激動劑的降壓效果，結果表明，在一次通過肺循環后，緩激肽被完全破壞(破壞98～99%)(J.Roblero，J.M.Ryan和J.M.Skewart，Res，Commun.Pathol.Pharmacol.6∶207，1973)。通過將單個堿基(即DArg-，DLys-，Lys-)和二個堿基DLys-Lys-)的氨基酸殘基加到緩激肽順序的N-末端上，可提高緩激肽激動劑在體內對肺激肽酶破壞作用的耐受性。將二肽Lys-Lys加到緩激肽激動劑的N-末端上，可以完全耐受在體內首次通過肺循環的破壞作用Roblero，Ryan和Stewart，Res.comm.p Pathol.Pharmacol.6∶207，1973)。
本發明是關于哺乳動物肽激素～緩激肽順序(Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)的變更，它的藥學上可以接受的鹽，在第7位取代Pro殘基，以獨特的方式首次得到相關順序的類似物，該類似物對于緩激肽的生物活性具有特異的競爭性抑制劑的作用。本發明特別是關于在第7位上用D構型的芳香族氨基酸取代L-Pro，該變更可使緩激肽激動劑轉變成拮抗劑，并且本發明還包括在第7位變更了的緩激肽拮抗劑中，在其他位置上進行另外的變更，結果提高了拮抗劑的效力，增強對酶降解作用的耐受性和/或提高了具有緩激肽順序的D-氨基酸的組織特異性。本發明尤其是關于具有通式Ⅰ的肽，A-Arg-B-C-D-W-X-Y-Z-Arg，(0 1 2 3 4 5 6 7 8 9)(位置)其中，A是氫原子或者是D-，L-構型的單個酸性、堿性、中性或芳香族氨基酸殘基，如D-Arg、D-Lys或L-Thi，含有酰基類型保護基、芳香族氨基甲酸乙酯類型保護基、烷基類型保護基的N-末端酶保護基，或者A是含有D-或L-構型氨基酸的二肽或多肽，如Lys-Lys、Met-Lys或Gly-Arg-Met-Lys;
B是L-Pro殘基，或者是其他D-或L-環狀或非環狀脂肪族氨基酸殘基，如L-羥基脯氨酸，或者是L-芳香族或取代芳香族氨基酸殘基;
C是D-或L-Pro殘基，或者是D-或L-構型的其他環狀、芳香族或取代芳香族氨基酸殘基;
D是Gly殘基，或者是L-構型的其他脂肪族、芳香族或取代芳香族氨基酸殘基，如Ala;
W是L-構型的Phe殘基，或者是取代的Phe或其他脂肪族或芳香族氨基酸殘基，如Leu，β-2-噻吩基-丙氨酸(Thi)或2-吡啶基-丙氨酸(Pal);
X是L-構型的Ser殘基，Gly殘基，或者為其他的D-或L-脂肪族或芳香族或取代芳香族氨基酸殘基，如PCl-D-Phe或D-Phe;
Y是D-芳香族氨基酸殘基，或者是取代的芳香族氨基酸殘基，如D-phe、β(2-噻吩基)-DAla(DThi)、β-(2-吡啶基)-DAla(DPal)、β-2-萘基-DAla(DNal)、DHis、D-同-Phe(Dh Phe)、O-甲基-DTyr(DOMT)、D-α-苯基-Gly(D Phy)、DTrp、DTyr或PCl-DPhe(CDF);
Z是L-構型的Phe殘基，或者為取代的Phe或其他脂肪族或芳香族氨基酸殘基，如Leu、Thi或Pal。
通式Ⅰ較好的化合物中，取代基有下述特定A＝H，B＝Pro或Hy P，C＝Pro或Hy P，D＝Gly，W＝Z＝Phe或Thi，X＝Ser，并且Y＝D-構型的芳香族氨基酸。
通式Ⅰ的肽的鹽包括與HCl、TFA、ACOH形成的鹽及其他藥學上可以接受的鹽。
下述表Ⅰ和Ⅱ表明，在緩激肽多肽中的取代基及該取代基的作用。同時也表明，在緩激肽的0，1，2，3，5，7和8位上的氨基酸殘基用取代基取代，可以得到更好的緩激肽拮抗劑。
表1緩激肽拮抗劑中的取代基
Thi＝β-(2-噻吩基)丙氨酸Pal＝β-(2-吡啶基)丙氨酸Hyp＝4-羥基脯氨酸Azt＝氮雜環丁烷-2-羧酸Thz＝噻唑烷-2-羧酸Inip＝4-哌啶甲酸OMT＝O-甲基酪氨酸CDF＝對-氯-D-苯基丙氨酸Nal＝β-(2-萘基)丙氨酸CLF＝對-氯-L-苯基丙氨酸PNF＝對-硝基苯基丙氨酸△Pro＝2，3-脫氫脯氨酸表Ⅱ緩激肽拮抗劑中的特征
具有通式Ⅰ的肽及其衍生物的合成，活性及被保護的氨基酸殘基的偶合，它們的純化及測定特性和純度的分析方法屬于肽化學的一般基礎知識，如在Houben WeylMethoden der Organische Chemie vol.16，part Ⅰ和Ⅱ(1974)中有關于溶液-相合成的敘述，在Stewart和Yaung(1984)“Solid Phase Peptide Synthesis”中有關于梅里菲爾德(Merrifield)固-相合成方法的論述。熟悉肽合成技術的化學家均能夠用標準的溶液方法或者用人工操作的或自動的固相方法合成通式Ⅰ的肽。
用于氨基酸，它們的衍生物和保護基，肽及它們的鹽的符號和縮寫是在肽化學中普遍使用的(Biochem.T.126∶773，1972)。為方便起見，若干縮寫的解釋列于表Ⅲ中。除Gly之外，在本說明書中敘述的所有氨基酸殘基，除非另有說明，均為L-構型(但在權利要求
書中不是如此)。
下述實例具體說明具有通式Ⅰ的化合物但這些實例并不是對本發明的限制。當涉及固體時，百分比和比例為重量比，涉及液體時，百分比和比例為體積比。
表Ⅲ氨基酸殘基的縮寫Aib -α-氨基異丁酸Azt -氮雜環丁烷-2-羧酸CDF 對-氯-D-苯基丙氨酸CLF 對-氯-L-苯基丙氨酸hphe -同-苯基丙氨酸Hyp -4-羥基-脯氨酸Inip 4-哌啶甲酸MDy -O-甲基-D-酪氨酸Nal -β-(2-萘基)丙氨酸△Pro -2，3-脫氫脯氨酸Pal -β-(3-吡啶基)-丙氨酸Phg -α-苯基甘氨酸Sar -肌氨酸Thi -β-(2-噻吩基)-丙氨酸Thz -噻唑烷-2-羧酸[所有其它縮寫均按國際純粹化學和應用化學聯合會(IUPAC)關于氨基酸殘基規定]
實例1制備Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-D Phe-Arg(DPhe-BK)將6.4克叔丁氧基羰基-(g-對甲苯磺酰基)-Arg[BOC-Arg(TOS)](15毫摩爾)和183毫克N，N-二甲氨基吡啶(1.5毫摩爾)的混合物溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)和125毫升二氯甲烷(DCM)的混合液中，于室溫下加入15克羥甲基-聚苯乙烯-聯乙烯苯(1%交聯度，每克樹脂含0.74毫摩爾游離羥基)，再加入60毫升0.25M二環己基碳二亞胺(DCC)在DCM中的溶液。懸浮液于室溫攪拌過夜，過濾，樹脂用60毫升DCM洗滌三次，再用60毫升甲醇(Me OH)洗滌三次，并在120毫升DCM中再溶脹。在上述樹脂上進行另一部分BOC-Arg(TOS)的偶合，樹脂經過濾和洗滌后再在120毫升DCM中再溶脹，并加入2.1毫升苯甲酰氯和1.5毫升三乙胺(Et3N)，懸浮液于室溫攪拌30分鐘后，過濾樹脂，依次用DCM和Me OH洗滌三次，每次60毫升，再用Me OH洗滌三次，每次60毫升，最后用DCM洗滌三次，每次60毫升。樹脂經空氣干燥至恒重，得到18.5克BOC-Arg(TOS)-羥甲基樹脂，每克樹脂實際氨基酸Arg含量為0.272毫摩爾，它是氨基酸樹脂樣品在6N鹽酸/丙酸中于130℃水解4小時后，經氨基酸定量分析而測定的。
將1.5克含總量為0.4毫摩爾Arg的樹脂置于自動固相合成裝置(Beckman model 990)的反應容器內，按如下方法進行一輪加成循環，偶合BOC-phe;
程序A.規范的DCC偶合樹脂用DCM洗滌三次，每次20毫升，然后用20毫升1∶3三氟乙酸(TFA)在DCM(含0.1%吲哚)中的溶液平衡1.5分鐘，平衡再重復30分鐘。樹脂用DCM洗滌六次，每次20毫升，隨后用10%(Et3N)在DCM中的溶液中和11/2分鐘，再重復中和一次。樹脂用20毫升DCM洗滌六次，然后用1.0毫摩爾BOC-phe在DCM中的溶液平衡11/2分鐘。加入4毫升0.25N DCC在DCM中的溶液，混合物攪拌2小時，樹脂用DCM洗滌三次，每次20毫升。
按程序B進行第二輪加成循環程序B反相加成重復程序A的方法，直到中和與洗滌。然后，加入1.0毫摩爾DCC在4毫升DCM中的溶液，將樹脂與溶液混合11/2分鐘。再將1.0毫摩爾BOC-D-Phe在12毫升DCM中的溶液加入，使樹脂和溶液混合2小時。樹脂用DCM洗滌六次，每次20毫升。
按下述順序脫去N-末端保護基程序C末端脫去保護重復程序A的方法直到用三乙胺中和。然后，樹脂用乙醇洗滌六次，每次20毫升，肽-樹脂經空氣干燥，得1.66克DPhe-Phe-Arg-樹脂的三氟醋酸鹽。
用410毫克DPhe-Phe-Arg-樹脂TFA鹽繼續合成，按程序D加成下面的殘基。
程序D.去偶合肽-樹脂鹽首先用DCM洗滌三次，每次20毫升，然后用10%Et NDCM中和1.5分鐘。重復中和步驟，肽-樹脂-鹽用DCM洗滌六次，每次20毫升。肽-樹脂用1.0毫摩爾Boc-Ser(OBzl)的DMF溶液平衡1.5分鐘。加入4毫升0.25N DCC在DCM中的溶液并與樹脂一起混合2小時。產物用DCM洗滌三次。
按列出的程序，可將下述氨基酸衍生物加到不斷增長的肽鏈上BOC-Phe(A)，BOC-Gly(A)，BOC-Pro(A)，BOC-Pro(A)，接著偶合BOC-Pro(D)，BOC-Arg(TOS)(溶于2毫升DMF+9毫升DCM)(A)，再進行程序C，得530毫克保護的九肽樹脂，為TFA鹽。
在-70℃將510毫克上述肽-樹脂懸浮在含1毫升苯甲醚的10毫升液態無水HF中，并于0℃攪拌45分鐘。真空除去HF和苯甲醚(1小時水泵，1小時真空泵)，肽與樹脂用乙醚(Et2O)洗滌三次，每次20毫升，用冰醋酸萃取三次，每次6毫升，使肽萃取到冰醋酸中。醋酸溶液冷凍干燥，得185毫克脫去保護基的粗制肽。
應用溶劑系統n Bu OH1% TFA(1∶1)，用逆流分配法(CCD)在Post CCD裝置中進行上行相轉移)將肽純化。用定量的口(Sakaguchi)試劑進行測定，收集含有主要肽峰的相應管內容物，減壓蒸去溶劑，殘余物溶于冰醋酸(ACOH)并冷凍干燥，得140毫克肽，逆流分配(CCD)系數K為5.7。在溶劑系統n Bu OH∶ACOH∶H2O(4∶1∶5)中重復進行逆流分配，按上述方法進行測定和檢查，得73毫克Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Y-Phe-Arg，為TFA鹽(K＝0.2)。在默克(Merck)廠予制涂硅膠的玻璃板上進行涂層層析(TLC)，以n Bu OH∶ACOH∶H2O(8∶3∶4)和Et OAC∶吡啶∶ACOH∶H2O(5∶5∶1∶3)為溶劑系統，以氯-聯甲苯胺進行肽鑒別噴霧顯影，純肽的Rf(834)為0.17和Rf(5513)為0.36。在酸水解(在氮氣下，于110℃，在含2滴2-巰基乙醇和40微升苯酚的2毫升6N HCl中，于封閉的玻璃小管中水解17小時)后，進行定量的氨基酸分析，氨基酸的比例如下Arg(2.12);Pro(1.93);Gly(1.01);Phe(2.98);Ser(0.96)。
實例2制備Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-Ser-DThi-Phe-Arg(DThi-BK)
按實例1的方法制備該肽，但用BOC-β-2-噻吩基-D-Ala(BOC-DThi)代替BOC-DPhe，K(415)＝0.24;Arg(2.02);Pro(2.18);Gly(1.00);Phe(1.99);Ser(0.89)，Thi(0.99)。
實例3制備Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-Ser-DPal-Phe-Arg(DPal-BK)按實例1的方法制備該肽，但用BOC-2-吡啶基-DAla(BOC-D-Pal)代替BOC-DPhe，K(1∶1)＝0.22;Arg(2.03);Pro(2.01);Gly(1.02);Phe(1.99);Pal(1.02)。
實例4制備Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-DPhe-DPhe-Phe-Arg6.7(DPhe-BK)按實例1的方法制備該肽，但用BOC-DPhe代替BOC-Ser(Bzl)，K(415)＝1.3;Arg(2.12);Pro(1.94);Gly(1.00);Phe(3.94)。
實例5制備Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-DPhe-CDF-Phe-Arg6 7(D Phe CDF-BK)按實例1的方法制備該肽，但用BOC-DPhe代替BOC-Ser(Bzl)，用BOC-PCl-D-Phe(BOC-CDF)代替BOC-DPhe，K(415)＝0.82;Arg(1.98);Pro(1.93);Gly(0.97);Phe(3.10)，CDF(1.02)。
實例6制備Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg5.8 7(Thi DPhi-BK)按實例1的方法制備該肽，但在二輪加成循環中，應用BOC-β-2-噻吩基-Ala(BOC-Thi)，其中BOC-Phe用于實例1，K(415)＝0.21;Arg(1.98);Pro(1.94);Gly(1.04);Phe(1.04)，Ser(0.96)，Thi(2.05)。
實例7制備Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DThi-Thi-Arg5.8 7(Thi DThi-BK)按照實例6的方法制備該肽，但用BOC-DThi代替BOC-DPhe，K(415)＝0.18;Arg(2.07);Pro(2.08);Gly(1.00);Ser(0.93)，Thi(2.88)。
實例8制備Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPal-Thi-Arg5.8 7(Thi DPal-BK)按照實例6的方法制備該肽，但用BOC-DPal代替BOC-DPhe，K(1∶1)＝0.15;Arg(2.00);Pro(2.20);Gly(1.09);Ser(0.89)，Thi(1.92)，Pal(0.89)。
實例9制備Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg5.8 6 7(Thi DPhe CDF-BK)按實例5的方法制備該肽，但在二輪加成循環中應用BOC-Thi代替BOC-Phe，K(415)＝0.75;Arg(1.89);Pro(2.08);Gly(1.06);Phe(1.02)，Thi(1.88)，CDF(1.07)。
實例10制備Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg0 7(DArg DPhe BK)按實例1的方法制備該肽，但應用BOC-(TOS)-DArg，按程序A進行一次另外的加成循環，接著按程序C進行末端脫保護，K(1∶1)＝3.55;Arg(2.89);Pro(2.07);Gly(1.02);Phe(3.05)，Ser(0.98)。
實例11制備DArg-Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-Ser-DPhe-0 3 7Phe-Arg(DArg Pro DPhe-BK)按實例10的方法制備該肽，但在第一次加成BOC-Pro中，應用BOC-DPro代替BOC-Pro，K(415)＝0.15;Arg(3.12);Pro(1.90);Gly(1.05);Phe(3.02)，Ser(0.92)。
實例12制備Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-3 5.8 6 7Arg(DPro Thi DPhe CDF-BK)按實例9的方法制備該肽，但在第一次加成BOC-Pro中，應用BOC-DPro代替BOC-Pro，K(415)＝0.18;Arg(2.00);Pro(1.98);Gly(1.04);Phe(0.99)，Thi(1.89)，PCF(1.11)。
實例13制備Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-7Phe-Arg(Lys-Lys-DPhe-BK)按實例1的方法制備該肽，但用BOC-(e-Clz)Lys進行二輪另外的加成循環，開始用程序D，然后用程序A，接著用程序C，K(1∶1)＝0.52;Arg(2.04);Pro(1.99);Gly(0.96);Phe(3.00)，Ser(0.96)，Lys(2.01)。
實例14制備Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-5.8 7Thi-Arg(Lys-Lys-Thi DPhe-BK)按實例13的方法制備該肽，但在二輪加成BOC-Phe的循環中，用BOC-Thi代替BOC-Phe，K(1∶1)＝0.33;Arg(1.98);Pro(1.97);Gly(1.01);Phe(1.03)，Ser(0.97)，Thi(1.96)，Lys(2.08)。
實例15制備DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi0 5.8 7Arg(DArg Thi DPhe-BK)按實例6的方法制備該肽，但首先按程序D，用BOC-(TOS)DArg進行一輪另外的加成循環，然后按程序C進行，K(1∶1)＝2.33;Arg(3.00);Pro(1.99);Gly(0.96);Phe(0.99)，Ser(0.95)，Thi(2.11)。
實例16制備DArg-Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-Ser-DPhe-T0 3 5.8 7hi-Arg(DArg DPro Thi DPhe-BK)按實例15的方法制備該肽，但在第一次加成BOC-DPro代替BOC-Pro，＝0.22;Arg(2.10);Pro(1.96);Gly(1.05);Phe(0.98)，Ser(0.94)，Thi(1.96)。
實例17制備Lys-Lys-Arg-Pro-Hy P-Gly-Phe-Ser-DPhe3 7-Phe-Arg(Lys-Lys-Hy P-DPhe-BK)按實例13的方法制備該肽，但在第一次加成BOC-Pro中，用BOC-(4-羥基)-Pro-(BOC-Hy P)代替BOC-Pro，K(1∶1)＝0.35;Arg(2.00);Pro(1.03);Gly(1.00);Phe(3.08)，Ser(0.94)，Lys(1.95)，Hyp(1.01)。
實例18制備Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(2 5.8 7Hyp Thi DPhe-BK)按實例6的方法制備該肽，但在第二次加成BOC-Pro中，用BOCHyp代替BOC-Pro，用程序D再次偶合，K(1∶1)＝2.45;Arg(2.03);Pro(0.98);Gly(1.06);Phe(1.05)，Ser(0.95)，Thi(1.97)，Hyp(0.95)。
實例19制備Lys-Lys-Arg-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-2 5.8 7Arg(Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK)按實例18的方法制備該肽，但用BOC-(e-Clz)Lys進行二輪另外的加成循環，開始用程序D，然后用程序A，接著用程序C，K(1∶1)＝0.27;Arg(2.07);Pro(0.92);Gly(0.99);Phe(1.03)，Ser(0.93)，Thi(1.92)，Lys(2.06)，Hyp(1.10)。
實例20制備Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(3 5.8 7Hyp Thi DPhe-BK)按實例6的方法制備該肽，但在第一次加成BOC-Pro中，應用BOC-Hyp代替BOC-Pro，K(1∶1)＝2.23;Arg(2.08);Pro(0.98);Gly(1.04);Phe(1.01),Ser(0.99),Thi(1.95),Hyp(0.94)。
實例21制備DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D Phe-Thi0 3 5.8 7Arg(D Arg-Hyp Thi D Phe-BK)按實例20的方法制備該肽，應用BOC－(TOS)D Arg進行一輪另外的加成循環，首先按程序D，接著用程序C,K(11)＝0.18;Arg(3.01);Pro(1.02);Gly(0.98);Phe(1.02),Ser(0.92),Thi(2.07),Hyp(0.97)。
實例22制備Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-Dphe-Thi-Arg(H2.3 5.8 7yp Thi Dphe-BK)按實施6的方法制備該肽，但在其中應用BOC－Pro,K(1:1)=1.56;Arg(2.04),Gly(1.06),Phe(1.02),Ser(1.01),Thi(1.94),Hyp(1.93)。
實例23制備Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Dphe-CDF-Thi-Arg2.3 5.8 0 7(Hyp Thi Dphe CDF-BK)按實例9的方法制備該肽，但在應用BOC－Pro的上述循環中，用Boc-Hyp代替Boc-Pro,K(415)=0.89;Arg(2.06),Gly(1.00),Phe(1.03),PCF(1.05),Thi(1.92),Hyp(1.93)。
實例24制備Arg-Pro-Pro-Gly-Leu-Gly-Dphe-Leu-Arg(G6 5.8 7ly leu Dphe-BK)按實例1的方法制備該肽，但在實用Boc-Phe的上述循環中，用Boc-Leu代替Boc-Phe,并且當實例1中應用了BOC-(OBZI)Ser時，則應用Boc-Gly來代替Boc-(OBZI)Ser,K(415)=0.30;Arg(2.04),Pro(2.05)Gly(1.98),Phe(0.98),Leu(1.95)。
對于具有類似取代基的肽，可按上述相同的方法制備，下述實例不是對本發明限制725.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DNal-Phe-Arg(NDal-BK):k(415)=0.37;Arg(2.09);Pro(2.02),Gly(0.98),Phe(2.06),Ser(0.96),Nal(0.95).
726.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-MDY-Phe-Arg(MDY-BK):k(1:1)=4.88;Arg(2.10),Pro(1.91),Gly(0.96),Phe(2.08),Ser(0.94),MDY(1.04).
727.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhg-Phe-Arg(DPhg-BK):k(1:1)=3.55;Arg(2.01),Pro(1.90),Gly(1.03),Phe(2.07),Ser(0.99),Phg(0.98).
728.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(DHis-BK):k(1:1)=0.30;Arg(2.04),Pro(2.09),Gly(0.94),Phe(2.00),Ser(1.00),His(0.93).
729.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(DTrp-BK):k(415)=0.30;Arg(2.04),Pro(1.95),Gly(1.02),Phe(2.05),Ser(0.95),Trp(0.98),730.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(DTyr-BK):k(1:1)=2.70;Arg(1.94),Pro(1.88)Gly(1.04),Phe(2.10),
Ser(0.97)，Tyr(1.08).
731.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(DhPhe-BK)k(415)＝0.37;Arg(1.99)，Pro(1.94)，Gly(0.97)，Phe(2.02)，Ser(0.88)，hPhe(1.20).
6 732.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DThi-Phe-Arg(DPhe DThi-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.14)，Pro(1.87)，Gly(1.00)，Phe(3.01)，Thi(0.98).
6，733.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DThi-DThi-Phe-Arg(DThi -BK)k(415)＝0.54;Arg(2.04)，Pro(2.00)，Gly(1.01)，Phe(2.04)，Thi(1.91).
6 734.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DNal-Phe-Arg(DPhe DNal-BK)k(415)＝1.04;Arg(2.02)，Pro(2.04)，Gly(1.01)，Phe(2.94)，Nal(0.99).
6 735.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-MDY-Phe-Arg(DPhe MDY-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.11)，Pro(1.90)，Gly(0.97)，Phe(3.02)，MDY(1.01).
6 736.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DPal-Phe-Arg(DPhe DPal-BK)k(415)＝0.16;Arg(1.86)，Pro(2.12)，Gly(1.07)，Phe(2.90)，Pal(1.05).
6 737.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-DVal-Phe-Arg(Gly DVal-BK)k(415)＝0.20;Arg(2.08)，Pro(2.00)，Gly(1.96)，Phe(1.98)，Val(0.98).
2 738.Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝3.76;Arg(2.00)，Pro(0.93)，Gly(1.02)，Phe(3.16)，Ser(0.94)，Hyp(0.94).
3 739.Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝3.35;Arg(1.96)，Pro(0.97)，Gly(1.01)，Phe(3.10)，Ser(0.94)，Hyp(1.02).
2，3 740.Arg-Hyp-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝2.33;Arg(2.03)，Gly(1.02)，Phe(3.10)，Ser(0.94)，Hyp(1.91).
5，8 6，741.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DPhe-Thi-Arg(Thi DPhe - BK).
5，8 6，742.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DThi-Thi-Arg(Thi DThi - BK)k(415)＝0.37;Arg(2.08)，Pro(2.08)，Gly(0.99)，Thi(3.86).
43.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DPal-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DThi DPal-BK)∶k(1∶1)＝0.70;Arg(1.93)，Pro(2.11)，Gly(1.08)，Thi(2.86)，Pal(1.02).
44.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DNal-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DThi DNal-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.19)，Pro(2.08)，Gly(1.00)，Nal(0.93)，Thi(2.88).
5，8 6 745.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-CDF-Thi-Arg(Thi DThi CDF-BK)k(415)＝0.54;Arg(2.16)，Pro(1.97)，Gly(1.00)，
PCF(1.06)，Thi(2.81).
46.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DAla-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DPhe DAla-BK)k(415)＝0.32;Arg(2.06)，Pro(1.89)，Gly(0.97)，Phe(1.02)，Ala(0.96)，Thi(2.12).
5，8 6 747.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-CDF-DAla-Thi-Arg(Thi CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.39;Arg(1.96)，Pro(1.93)，Gly(1.00)，Ala(0.99)，Thi(2.05)，PCF(1.08).
0 5，848.Thi-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-Thi-7DPhe-BK)k(415)＝0.27;Arg(2.16)，Pro(1.89)，Gly(1.03)，Phe(1.04)，Ser(0.93)，Thi(2.95).
0 749.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhg-Phe-Arg(DArg-DPhg-BK)k(1∶1)＝2.03;Arg(3.05)，Pro(2.00)，Gly(0.97)，Phe(2.04)，Ser(0.94)，Phg(1.00).
0 750.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(DArg-DTrp-BK)∶k(1∶1)＝4.88;Arg(3.07)，Pro(1.99)，Gly(1.00)，Phe(2.04)，Ser(0.89)，Trp(0.97).
0 751.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(DArg-DTyr-BK)∶k(1∶1)＝1.56;Arg(2.96)，Pro(2.09)，Gly(1.03)，Phe(1.99)，Ser(0.90)，Tyr(1.04).
0 752.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(DArg-DHis-BK)∶k(1∶1)＝0.18;Arg(3.08)，Pro(1.99)，Gly(1.02)，Phe(2.07)，Ser(0.89)，His(0.96).
053.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(DArg-7DhPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(3.06)，Pro(1.98)，Gly(0.95)，Phe(2.05)，Ser(0.86)，DhPhe(1.11).
54.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-7DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.52;Arg(2.04)，Pro(2.01)，Gly(0.96，Phe(3.00)，Ser(0.96).
55.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(Lys-Lys-7DTrp-BK)∶k(1∶1)＝0.67;Arg(2.01)，Pro(2.00)，Gly(1.01)，Phe(2.03)，Ser(0.91)，Trp(0.88)，Lys(2.03).
56.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(Lys-Lys-7DTyr-BK)∶k(1∶1)＝0.21;Arg(2.01)，Pro(2.11)，Gly(0.99)，Phe(2.02)，Ser(0.97)，Tyr(1.02)，Lys(1.90).
57.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(Lys-Lys-7DHis-BK)∶k(1∶1)＝0.08;Arg(1.91)，Pro(2.06)，Gly(0.94)，Phe(2.08)，Ser(0.93)，His(0.95)，Lys(2.12).
58.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-7DhPhe-BK)∶k(1∶1)＝1.13;Arg(1.99)，Pro(1.93)，Gly(0.98)，Phe(2.06)，Ser(0.92)，DhPhe(1.11)，Lys(2.01).
3 759.Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(DPro DPhe-BK)k(415)＝0.27;Arg(2.07)，Pro(1.97)，Gly(0.98)，Phe(3.02)，Ser(0.95).
3 6 760.Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-CDF-DAla-Phe-Arg(DPro CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.59;Arg(1.99)，Pro(2.03)，Gly(0.97)，Phe(2.02)，Ala(0.99)，PCF(1.02).
61.Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg3 5，8 7(DPro Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.22;Arg(2.10)，Pro(1.96)，Gly(1.05)，Phe(0.98)，Ser(0.94)，Thi(1.96).
062.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DAla-Thi-Arg(DArg-5，8 6 7Thi DPhe DAla-BK)∶k(1∶1)＝4.00;Arg(2.89)，Pro(1.95)，Gly(1.03)，Phe(0.98)，Ala(1.01)，Thi(2.14).
063.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-CDF-DAla-Thi-Arg(DArg-5，8 6 7Thi CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.19;Arg(3.00)，Pro(1.99)，Gly(1.00)，Ala(0.96)，Thi(2.03)，PCF(1.02).
64.DArg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg0 2 5，8 7(DArg Hyp Thi DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝1.50;Arg(3.11)，Pro(0.97)，Gly(1.03)，Phe(1.04)，Ser(0.95)，Thi(1.88)，Hyp(1.02)65.DArg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(DArg-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝0.96;Arg(3.19)，Gly(0.97)，Phe(0.98)，Ser(1.00)，Thi(1.95)，Hyp(1.90)066.Thi-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-2 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)
067.Thi-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)068.Thi-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)2 5，869.Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Hyp Thi6 7DPhe CDF-BK)∶k(415)＝1.04;Arg(2.02)，Pro(1.01)，Gly(1.00)，Phe(1.01)，PCF(1.09)，Thi(1.89)，Hyp(0.98)3 5，870.Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CFD-Thi-Arg(Hyp Thi6 7DPhe CDF-BK)∶k(1∶1)＝0.96;Arg(2.01)，Pro(1.11)，Gly(0.97)，Phe(1.06)，Thi(1.86)，PCF(1.06)，Hyp(0.95)2 3 5，871.Arg-Hyp-DPro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Hyp Pro Thi6 7DPhe CDF-BK)72.Lys-Lys-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-2 7Hyp DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.37;Arg(1.99)，Pro(0.96)，Gly(0.99)，Phe(3.13)，Ser(0.94)，Hyp(0.98)，Lys(2.00)73.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-2，3 7Hyp DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝0.28;Arg(2.03)，Gly(0.95)，Ser(0.94)，Phe(3.08)，Lys(2.08)，Hyp(1.92)74.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DThi-Thi-Arg(Lys-Lys-5，8 7Thi DThi-BK)∶k(1∶1)＝0.22;Arg(2.07)，Pro(2.01)，Gly(1.04)，Ser(0.89)，Thi(3.02)，Lys(1.96)75.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPal-Thi-Arg(Lys-Lys-
5，8 7Thi DPal-BK)∶k(1∶1)＝0.06;Arg(2.12)，Pro(1.94)，Gly(1.01)，Ser(0.87)，Thi(1.81)，Pal(0.98)，Lys(2.22)76.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-5，8 6 7Thi DPhe CDF-Bk)∶k(415)＝0.11;Arg(2.02)，Pro(2.00)，Gly(1.02)，Phe(1.00)，PCF(1.06)，Thi(1.85)，Lys(2.06)77.Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Lys-Lys-3 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.22;Arg(2.05)，Pro(0.96)，Gly(1.04)，Phe(1.03)，Ser(0.94)，Hyp(1.10)，Thi(1.84)，Lys(2.04)78.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Lys-Lys-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.15;Arg(2.00)，Pro(2.06)，Gly(1.01)，Phe(1.03)，Ser(0.94)，Thi(1.92)，Hyp(2.04)79.Lys-Lys-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-2 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-Bk)∶k(1∶1)＝6.69;Arg(1.96)，Pro(1.14)，Gly(0.96)，Phe(1.03)，Thi(1.77)，PCF(1.06)，Lys(1.93)，Hyp(1.14)80.Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-3 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-BK)∶k(1∶1)＝6.14;Arg(2.04)，Pro(0.97)，Gly(1.01)，Phe(0.98)，PCF(1.06)，Thi(1.89)，Hyp(1.01)，Lys(2.05)81.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-
2，3 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-Bk)∶k(1∶1)＝4.88;Arg(2.02)，Gly(0.99)，Phe(0.96)，PCF(1.10)，Thi(1.84)，Hyp(2.01)，Lys(2.06)2 5，8 782.Arg-Thz-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thz Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.24;Arg(1.97)，Pro(1.04)，Gly(1.02)，Phe(1.06)，Thi(1.91)3 5，8 783.Arg-Pro-Thz-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thz Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝5.2584.Arg-Thz-Thz-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Thz Thi DPhe-BK)∶K(1∶1)＝6.692 5，8 785.Arg-Aib-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Aib Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.183 5，8 786.Arg-Pro-Aib-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Aib Thi DPhe-BK)k(415)＝0.24;Arg(2.09)，Pro(0.99)，Gly(1.05)，Ser(0.95)，Phe(1.07)，Thi(1.94)，Aib(0.91)87.Arg-Aib-Aib-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Aib Thi DPhe-BK)∶k(415)＝4.002 5，8 788.Arg-Azt-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Azt Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(2.07)，Pro(0.99)，Gly(1.02)，Phe(1.04)，Ser(0.95)，Thi(1.97)，Azt(0.99)3 5，8 789.Arg-Pro-Azt-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Azt Thi DPhe-BK)
90.Arg-Azt-Azt-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Azt Thi DPhe-BK)91.Arg-Inip-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.2192.Arg-Pro-Inip-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg3 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(2.10)，Pro(0.95)，Gly(1.04)，Phe(1.03)，Ser(0.93)，Thi(1.95)93.Arg-Inip-Inip-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.185，8 794.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DNal-Thi-Arg(Thi DNal-BK)∶k(415)＝0.325，8 795.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-CDF-Thi-Arg(Thi CDF-BK)∶k(415)＝0.285，8 796.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DTyr-Thi-Arg(Thi DTyr-BK)∶k(415)＝0.125，8 797.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DVal-Thi-Arg(Thi DVal-BK)∶k(415)＝0.115，8 798.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DIle-Thi-Arg(Thi DIle-BK)∶k(415)＝0.165，8 799.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DLeu-Thi-Arg(Thi DLeu-BK)5，8 7100.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DTrp-Thi-Arg(Thi DTrp-BK)5，8 7101.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhg-Thi-Arg(Thi DPhg-BK)
5，8 7102.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DHis-Thi-Arg(Thi DHis-BK)5，8 7103.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DOMT-Thi-Arg(Thi DOMT-BK)∶k(415)＝0.18緩激肽拮抗劑活性的實例在自發或誘發動情期的離體大白鼠子宮和豚鼠回腸上，按通常可接受的Trautschold(Handbook of EXPt，pharmacol.Vol25，Springer Verlag，pp53-55，1970)所論述的試驗緩激肽和有關激肽的方法，測定緩激肽拮抗劑對緩激肽親肌活性的抑制作用。按通常測定生物活性化合物拮抗劑的方法(SchildBr.J.Pharmacol.2189 1947)，在離體大白鼠子宮(RUT)和離體豚鼠回腸(GPT)上，測定抑制強度。通過上述試驗，測定了參照物質緩激肽的劑量-反應曲線。緩激肽的ED50為使組織產生最大收縮幅度的一半所需的劑量。將一定劑量的拮抗劑與組織一起孵育30秒鐘，然后將緩激肽ED50的2倍量加入組織，不斷增加予先同組織孵育的拮抗劑的劑量，直到組織對緩激肽2倍ED50劑量的反應降低到相當于緩激肽1倍ED50劑量所引起的反應。PA2值表示將組織緩激肽的反應，由2倍ED50劑量降低到相當于1倍ED50劑量時所需拮抗劑克分子濃度的負對數。一個單位的PA2值代表效力值變化的一個數量級。為了便于比較，緩激肽劑量的負對數(使組織產生最大收縮的一半所需的劑量)通常稱作PD2值。用大白鼠子宮試驗時，緩激肽的PD2值是7.9，用豚鼠回腸試驗時，PD2值為7.4。
緩激肽拮抗劑的效力pA2/RUT pA2/GPI例號 結構71 DPhe-BK 5.072 DThi-BK 4.6
73 DPal-BK 5.0 4.86，74 DPhe-BK 5.26 75 DPhe CDF-BK 4.9 5.85，8 76 Thi DPhe-BK 6.5 6.35，8 77 Thi DThi-BK 4.2 5.85，8 78 Thi DPal-BK 4.20 710 DArg-DPhe-BK 5.60 3 711 DArg-DPro DPhe-BK 4.0713 Lys-Lys-DPhe-BK 5.15，8 714 Lys-Lys-Thi DPhe-BK 6.0 5.30 5，8 715 DArg-Thi DPhe-BK 5.5 6.10 3 5，8 716 DArg-DPro Thi DPhe-BK 5.22 5，8 718 Hyp Thi DPhe-BK 5.62 5，8 719 Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK 5.83 5，8 720 Hyp Thi DPhe-BK 7.0 4.70 3 5，8 721 DArg -Hyp Thi DPhe-BK 7.22，3 5，8 722 Hyp Thi DPhe-BK 6.72，3 5，8 6 723 Hyp Thi DPhe CDF-BK 6.50 2 5，8 764 DArg-Hyp Thi DPhe-BK 5.70 2，3 5，8 765 DArg -Hyp Thi DPhe-BK 7.12 772 Lys-Lys-Hyp DPhe-BK 5.63 5，8 777 Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK 6.7在平滑肌試驗中，激肽拮抗劑的特異性本發明緩激肽拮抗劑的特異性作用，是通過觀察其抑制緩激肽(BK)和兩種在生理上有重要作用的緩激肽類物質-卡里定(KAL，Lys-BK)和甲硫氨酰賴氨酰-BK(MK-BK)的親肌活性的能力來證實的，但對非激肽的肽物質，如血管緊張肽-Ⅱ(ANG)或P物質(SP)的親肌活性則無抑制作用。結果表明，所試驗的緩激肽拮抗劑僅抑制緩激肽類激動劑所產生的收縮效應，而對非激肽的親肌性物質則沒有作用。所列出的抑制效力，同上述一樣，用PA2值表示。
在豚鼠回腸試驗中，激肽拮抗劑的特異性豚鼠回腸例號 結構 BK KAL MK-BK ANG SP71 DPhe-BK 5.0 5.6 6.0 NO NO5，86 Thi DPhe-BK 6.3 6.4 5.2 NO NO0 7DArg -DPhe -BK 5.6 6.0 6.3 NO NO0 5，8 7DArg -Thi DPhe-BK 6.1 6.7 6.4 NO NO緩激肽拮抗劑拮抗作用的實例(大鼠血壓試驗)按照Roblero，Ryan和Stewart(Res.Commun Pathol.Pharmacol.6207，1973)所描述的方法，用整體動物觀察緩激肽拮抗劑對麻醉大白鼠血壓的影響，當6＃、10＃、15＃化合物以25微克/分的速度靜脈輸入時，對緩激肽25毫米降壓劑量(ED25毫米)的反應，由25毫米降到10毫米。拮抗劑輸入結束后，5分鐘內，緩激肽的降壓作用可回到正常水平。將緩激肽和拮抗劑做成混合劑，用動脈內注射或靜脈內注射給予試驗動物時，拮抗劑也可產生對緩激肽效應的抑制作用。
延伸緩激肽同類物的N-末端對酶降解作用的耐受性在體內緩激肽同類物耐受酶(如激肽酶)降解作用的能力容易測定。例如，在麻醉大白鼠肺循環中做一單通道后，主動脈內和靜脈給藥，測定特定同類物殘余的血管抑制劑的溶性(J.Roblero，J.W.Ryan，and J.M.Stewart，Res.Commun.Pathol.Pharmacol.6207 1973)，試驗中，用N-末端取代的緩激肽同類物(激動劑)進行試驗，獲得如下的結果。
改變N-末端的緩激肽同類物對大白鼠肺的破壞作用肽結構 破壞百分率(%)Bradykinin(BK) 98Lys-BK 95DArg-BK 92DLys-BK 89Lys-Lys-BK 05，8Thi -BK 955，8Lys-Lys-Thi -BK 0緩激肽延伸的N-末端同類物，特別是用Lys-Lys-延伸的同類物，能耐受激肽酶的降解作用，這意味著作用時間長的緩激肽拮抗劑，可用Lys-Lys-延伸的方法改變[D-Ph
]-BK抑制劑而獲得。另外，D-Arg殘基加到緩激肽激動劑的N-末端，有使子宮收縮效能增加的傾向，而對回腸的作用不影響，上述觀察促進了D-Arg-的D-ph
-BK同類物的合成，該同類物可作為組織的特異性抑制劑。
用Lys-Lys-或D-Arg殘基延伸D-Ph
-BK的N-末端，可降低對子宮激動劑的效力，但不影響對回腸的拮抗作用，同樣，將Lys-Lys-或D-Arg加到N-末端，
Dph
BK對子宮的抑制作用降低，在回腸試驗中將D-Arg加到作用很強的
Dph
BK拮抗劑上，對抑制效力僅有很小的影響。
在2，3位上改變緩激肽拮抗劑得到的組織選擇性作用改變緩激肽的九肽順序所產生的緩激肽激動劑，在經典的大白鼠子宮(RUT)和豚鼠回腸(GPI)試驗中，均顯示出類似的效能。近來，有人報告，在7位上帶有氨基異丁酸(Aib)(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，Peptides 1∶231，1980)和6，7位上帶多元D-氨基酸取代物(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，在kinins 1984 L.M.Greenbaum ed.Plenum Press，NY，1985)的緩激肽同類物，對平滑肌的活性產生分離的現象，即對子宮的活性明顯高于對回腸的活性。D-氨基酸殘基(DArg)加到對回腸具有選擇性的緩激肽拮抗劑Dph
-BK的N-末端(DAr
-Dph
-BK)，在回腸上未改變抑制緩激肽活性的選擇性。在DPh
-BK的3位上，用DPro殘基取代(即DP-r
Dph
-BK)，用回腸試驗，可消除拮抗劑的活性，但用子宮試驗，則使激動劑的活性受到破壞。置換DArg-Dph
-BK3位上的Pro殘基，逆轉了平滑肌的活性譜，對子宮平滑肌具有選擇性的拮抗作用，而在回腸平滑肌上完全喪失。對緩激肽的拮抗作用。同樣，用DPro殘基代替非特異性拮抗劑DAr
-
-Dph
-BK3位上的Pro殘基，消除了對緩激肽回腸作用的拮抗效應，但卻完全保持了在子宮上的拮抗活性。
3位結構的改變得到的拮抗劑的特異性(平滑肌試驗)
例號 結構 RUT CPI71 DPhe-BK (1%AG) pA＝5.00 7 210 DArg-DPhe-BK (0.1%AG) pA＝5.03 7 259 DPro-DPhe-BK 0 00 3 711 DArg-DPro-DPhe-BK pA＝4.6 00 5，8 7 215 DArg-Thi DPhe-BK pA＝5.2 pA＝6.12 20 3 5，8 7DArg-DPro Thi DPhe-BK pA＝5.2 02相對于BK的激動劑效力＝100;PA是由Schild(Br.J.pharm acol.2189，194))定義的抑制效力。
2位上Pro的變化也可改變緩激肽同類物對組織的選擇性。有人發現，在2位上，用Val、Sar、Pro、Ala、Hyp和Aib(α-氨基異丁酸取代，在豚鼠回腸與大白鼠子宮比較試驗中測定的親肌活性表明，緩激肽的多種同類物對組織具有不同的選擇性(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，Peptides，231-235，1980)。通過2位上的取代，可得到各種緩激肽同類物對組織的選擇性作用，這表明，任一緩激肽同類物，包括具有拮抗作用的緩激肽同類肽同類物，進行類似的取代，也會獲得對組織的選擇性作用。
新型緩激肽拮抗劑的應用于治療的范圍，不僅包括治療動物本身所產生的緩激肽或有關的激肽，而且也包括治療由于叮咬或蜂刺時注入動物的與緩激肽有關的多肽物質。單獨局部應用或與皮下注射聯合應用本發明緩激肽拮抗劑，可以治療與緩激肽有關的肽所致的痛疼，炎癥和腫脹。
本發明的緩激肽拮抗劑也可治療其它外傷，炎癥或由于緩激肽的中介作用而產生的病理狀況，或者因緩激肽產生過量所引起的病情加劇。上述這些情況，包括局部外傷如創傷、燒傷、疹子、絞痛、關節炎、哮喘、變態反應、鼻炎、休克、炎性腸道疾病、低血壓、全身性疼痛及炎癥、精子活動弱所致男性不育。本發明的緩激肽拮抗劑，可通過不同方法給藥，包括象硝酸甘油那樣舌下給藥，或用助吸收劑制成膏藥，通過皮膚給藥治療絞痛。根據本發明所顯示的PA2和ED50資料及先有技術中有關激動劑的效力，對于熟悉本項技術的人員決定本發明新型緩激肽拮抗劑的應用劑量是可能的。
因此，象疼痛、外傷炎癥、燒傷、疹子等，一般應用的劑量范圍估測是0.1～0.5毫克/毫升;用于治療鼻炎、變態反應和哮喘的鼻噴霧劑型、其劑量范圍為0.1～0.5毫克/毫升;靜注劑型，用于治療全身性炎癥、休克、關節炎、變態反應、氣喘和增加精子活力，其劑量范圍是0.1～10毫克/公斤;治療炎癥性腸道疾病或一般疼痛、炎癥，適用的劑量范圍是10～100毫克/公斤緩激肽拮抗劑也可通過陰道、直腸、口腔或任何其它可接受的體內途徑給藥。
熟悉本項技術的人員可以認識到，本發明應用范圍廣泛，對那些由于疾病、損傷、休克所產生的緩激肽，提供了竟爭性抑制劑。本發明的優點是7位上L-pro用D-構型氨基酸取代，可把緩激肽激動劑變為拮抗劑，從而提供多種具有特異性和競爭性的拮抗劑，以減輕緩激肽的作用。本發明的另一個優點是改變7位上的L-Pro及改變新的緩激肽拮抗劑的其它位置，可提供多種有用的化合物。只要不超過下述權利要求
的范圍，在本發明所提供的參數以內，對于上述改變和其它的改變，本發明均是可行的。
權利要求
1.制備具有下式緩激肽拮抗劑類型的肽及其藥學上可以接受的鹽的方法，H-Arg-pro-pro-Gly-phe-ser-y-phe-Arg該方法包括用各種方法取代7位脯氨酸(pro)殘基，通過合成緩激肽類型的肽，賦予緩激肽拮抗劑活性，式中7位y可選自以下一組氨基酸D-芳香族氨基酸，取代的D-芳香族氨基酸、D-脂肪族氨基酸或D-雜環氨基酸殘基。
2.權利要求
1的方法還包括通過各種方法用選自下述一組氨基酸取代2位脯氨酸(pro)，合成緩激肽類型的肽，以提高組織選擇性，ⅰ)氨雜環丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)2，3-脫氫脯氨酸(△pro)ⅴ)4-羥基脯氨酸(Hyp)ⅵ)羥基脯氨酸ⅶ)α-氨基異丁酸(Aib)ⅷ)脫氫脯氨酸ⅸ)丙氨酸(Ala)ⅹ)纈氨酸(Val)ⅹⅰ)肌氨酸(sar)ⅹⅱ)甘氨酸(Gly)。
3.權利要求
1和2的方法還包括通過各種方法用選自下述一組氨基酸取代3位脯氨酸(pro)，合成緩激肽類型的肽，以提高組織選擇性，ⅰ)氮雜環丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)2，3脫氫脯氨酸(△pro)ⅴ)4-羥基脯氨酸(Hyp)ⅵ)α-氨基異丁酸(Aib)ⅶ)纈氨酸(Val)ⅷ)丙氨酸(Ala)ⅸ)肌氨酸(Sar)ⅹ)甘氨酸(Gly)。
4.權利要求
1、2和/或3的方法還包括通過各種方法用選自下述一組氨基酸取代零位H，合成緩激肽類型的肽，以提高對酶的耐受性，ⅰ)精氨酸(Arg)ⅱ賴氨酸-賴氨酸(Lys-Lys)ⅲ)苯基丙氨酸(phe)ⅳ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅴ)賴氨酸(Lys)ⅵ)甲硫氨酸-賴氨酸(Met-Lys)ⅶ)甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-賴氨酸(Gly-Arg-Met-Lys)。
5.權利要求
1、2、3和/或4的方法還包括通過各種方法用選自以下一組氨基酸取代5位苯基丙氨酸(phe)，合成緩激肽類型的肽，以提高其效力，ⅰ)苯丙氨酸(phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)O-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)對-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)對-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)賴氨酸-賴氨酸-β-(2-噻吩基)丙氨酸(Lys-Lys-Thi)ⅹ)絲氨酸(Ser)ⅹⅰ)酪氨酸(Tyr)。
6.權利要求
1、2、3、4和/或5的方法還包括通過各種方法用選自以下一組氨基酸取代8位苯基丙氨酸(Phe)，合成緩激肽類型的肽，以提高其效力，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)O-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)對-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)對-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)酪氨酸(Tyr)。
7.權利要求
1、2、3、4、5和/或6的方法還包括通過各種方法用選自以下一組氨基酸取代6位絲氨酸(Ser)，合成緩激肽類型的肽，以提高其效力，ⅰ)絲氨酸(Ser)ⅱ)甘氨酸(Gly)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)對-氯-D-苯基丙氨酸(CDF)ⅴ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅵ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅶ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅷ)對-氯-苯基丙氨酸(Pcl-Phe)。
8.制備具有下述緩激肽拮抗劑類型的肽及其藥學上可以接受的鹽的方法，A-Arg-B-C-D-W-X-Y-Z-Arg該方法包括通過各種方法取代7位氨基酸，以獲得拮抗劑活性，7位氨基酸以y表示，其中y可選自以下一組氨基酸，ⅰ)D-芳香族氨基酸，ⅱ)取代的D-芳香族氨基酸，ⅲ)D-脂肪族氨基酸，ⅳ)D-雜環氨基酸殘基;并且其中B、C、D、W、X和Z均為氨基酸，A為氨基酸或氫。
9.權利要求
8的方法還包括通過各種方法取代零位氨基酸，以賦予酶活性，零位氨基酸以A表示，其中A可選自以下一組氨基酸，ⅰ)精氨酸(Arg)ⅱ)賴氨酸-賴氨酸(Lys-Lys)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅴ)懶氨酸(Lys)ⅵ)甲硫氨酸-賴氨酸(Met-Lys)ⅶ)甘氨酸-精氨酸-甲酰氨酸-賴氨酸(Gly-Ary-Met-Lys)。
10.權利要求
8和/或9的方法還包括通過各種方法取代2位氨基酸，以賦予組織選擇性，2位氨基酸以B表示，其中B可選自以下一組氨基酸，ⅰ)氮雜環丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)脯氨酸(Pro)ⅴ)2，3-脫氫脯氨酸(△Pro)ⅵ)4-羥基脯氨酸(Hyp)ⅶ)羥基脯氨酸ⅷ)α-氨基異丁酸(Aib)ⅸ)脫氫脯氨酸ⅹ)纈氨酸(Val)ⅹⅰ)丙氨酸(Ala)ⅹⅱ)肌氨酸(Sar)ⅹⅲ)甘氨酸(Gly)。
11.權利要求
8、9和/或10的方法還包括通過各種方法取代3位氨基酸，以賦予組織選擇性，3位氨基酸以C表示，其中C可選自以下一組氨基酸，ⅰ)氮雜環丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)脯氨酸(Pro)ⅴ)2，3-脫氫脯氨酸(△pro)ⅵ)4-羥基脯氨酸(Hyp)ⅶ)α-氨基異丁酸(Aib)ⅷ)纈氨酸(Val)ⅸ)丙氨酸(Ala)ⅹ)肌氨酸(Sar)ⅹⅰ)甘氨酸(Gly)。
12.權利要求
8、9、10和/或11的方法還包括通過各種方法取代4位氨基酸，4位氨基酸以D表示，其中D可選自以下一組氨基酸，ⅰ)甘氨酸(Gly)ⅱ)丙氨酸(Ala)ⅲ)肌氨酸(Sar)。
13.權利要求
8、9、10、11和/或12的方法還包括通過各種方法取代5位氨基酸，以提高其效力，5位氨基酸以W表示，其中W可選自以下一組氨基酸，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)0-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)對-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)對-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)-丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)絲氨酸(Ser)ⅹ)酪氨酸(Tyr)。
14.權利要求
8、9、10、11、12和/或13的方法還包括通過各種方法取代6位氨基酸，以提高效力，6位氨基酸以x表示，其中x可選自以下一組氨基酸，ⅰ)絲氨酸(Ser)ⅱ)甘氨酸(Gly)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)對-氯-D-苯基丙氨酸(CDF)ⅴ)β-(2-萘基)-丙氨酸(Nal)ⅵ)β-(2-吡啶基)-丙氨酸(Pal)ⅶ)β-(2-噻吩基)-丙氨酸(Thi)ⅷ)對-氯-苯基丙氨酸(Pcl-Phe)。
15.權利要求
8、9、10、11、12、13和/或14的方法還包括通過各種方法取代8位氨基酸，以提高其效力，8位氨基酸以Z表示，Z可選自以下一組氨基酸，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)0-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)對-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)對-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸ⅸ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)。
16.權利要求
8的方法，其中通過叔丁氧基羰基-(g-對-甲苯磺酰基)-Y與下述肽鏈a或b反應進行耦合，a.A-Arg-B-C-D-W-X;或b.Z-Arg。
17.權利要求
8或16的方法還包括下述步驟(a)使Arg結合到不溶的聚合母體上，(b)使至少一個氨基酸殘基耦合到步驟(a)的Arg上;(c)使緩激肽拮抗劑類型的肽從上述不溶的聚合母體上去耦合。
18.權利要求
17的方法，其中耦合是在溶液中用結合到上述步驟(b)氨基酸殘基上的叔丁氧基羰基-(g-對甲苯磺酰基)進行的。
專利摘要
在肽激素緩激肽或緩激肽其他取代類似物的第7位用芳香氨基酸或D-構型芳香氨基酸取代，可以使激動劑緩激肽轉變成緩激肽拮抗劑。本發明還包括在7位已改變的新型緩激肽拮抗劑中其他位置的變化，它們可提高對酶的耐受性、拮抗劑效力和/或新的緩激肽拮抗劑的特異性。制備的類似物可用于治療由于緩激肽過量生成，或由于叮咬而進入體內所引起的哺乳動物和人體的病痛和疾病。
文檔編號C07K5/00GK87101721SQ87101721
公開日1988年9月14日 申請日期1987年3月6日
發明者約翰·M·斯蒂沃特, 雷蒙德·J·瓦夫里克 申請人:約翰·M·斯蒂沃特, 雷蒙德·J·瓦夫里克導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan