用于將治療活性物質轉移到靶細胞中的組合物及其在基因治療中的應用的制作方法

專利名稱：用于將治療活性物質轉移到靶細胞中的組合物及其在基因治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠用于將治療活性物質轉入靶細胞的組合物，特別是脊椎動物細胞，更具體說是哺乳動物細胞。更具體地說，本發明涉及用這種組合物制備一種載體，用該載體將治療活性物質，特別是一種多聚核苷酸轉移到靶細胞中。
遺傳性疾病特別是由于特異基因的異常表達或非功能性突變多肽的表達。例如囊性纖維化被認為是最常見的致死性遺傳疾病(1/2000)且平均壽命期望值為20到30年，且該疾病是以粘膜分泌物的大幅增稠，慢性肺病以及外分泌腺-胰臟的功能不全為特征的。所述疾病同電解質轉運的紊亂有關，特別是跨躍上皮細胞膜的氯離子，這種紊亂是CFTR(囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白)基因突變的結果(Rommens,科學(Science)245(1989),1059-1066；Rosenfeld,Chest109(1996),241-252)。看起來對這種類型的疾病最合適的治療方法是將編碼有功能CFTR蛋白的基因轉入靶細胞以糾正觀察到的細胞異常。對于這種方法，也叫基因療法，幾位文章作者認為可選擇呼吸道上皮細胞作為靶細胞，這特別地是由于呼吸道上皮的易接近性，尤其可通過肺內運輸的方法，例如向肺中滴注。已經證明必須使靶細胞內表達水平達到正常CFTR基因表達量的約5％～7％才能使所觀測的電解質轉運恢復。類似地，一些出版物描述了通過將基因轉入癌靶細胞的技術以消除腫瘤或延緩癌癥進一步發展的可能性。已經考慮過一些方法，特別是轉移能誘導或激活抗腫瘤細胞介導免疫反應的免疫刺激基因(免疫療法)，提及的可用于給藥的基因可以是編碼細胞因子的基因，將產毒素的細胞毒素基因轉移到能表達該基因的細胞中，例如1型單純皰疹病毒(HSV-1)的tk基因；或者轉移抗致瘤基因-即腫瘤抑制基因，例如成視網膜細胞瘤基因或p53基因；或者是能夠抑制致癌基因活性的多核苷酸，例如反義分子或能夠降解致癌基因特異信使RNA的核酶。
在過去的30年中，已建立了大量將不同異源基因引入細胞，特別是哺乳動物細胞的方法。可將這些不同的方法分為兩類。第一類涉及到象微注射，電穿孔或粒子轟擊一類的物理方法，這些方法雖然有效，但是在很大程度上限于體外應用，方法的實施是麻煩而棘手的。第二類涉及到分子及細胞生物學技術，將要轉移的基因與可促進所述物質轉移的生物或合成載體聯合起來。
目前最有效的載體是病毒載體，特別是腺病毒或逆轉錄病毒載體。這些已經開發出的技術是以這些病毒所具有的天然特性為基礎的，病毒所擁有的這些特性可使之穿過細胞膜，避免遺傳物質被降解并能使其基因組穿入細胞核。這些病毒已經在大量研究中作為實驗對象，而且其中有些病毒已經試驗性地用作人的基因載體，并著眼于用作如疫苗，免疫治療或為了補償遺傳性缺陷的療法。然而，這一使用病毒的方法受到大量限制，特別是由于病毒基因組有限的克隆能力，已經生產的感染性病毒粒子在宿主生物體和環境中傳播的危險性，在宿主細胞中因插入而導致人工突變的危險，以及就逆轉錄病毒載體而言，在體內治療過程中誘發強烈的免疫反應及炎性反應的事實，因此實際上限制了可以設想的用藥方法的數量(McCoy，人類基因治療(Human Gene Therapy)6(1995)，1553-1560；Yang，免疫(Immunity)1(1996)；433-442)。這許多缺陷，特別是用于人的病毒載體的情況，引導許多機構為轉移多核苷酸而開發設計可替代的方式。
目前有許多非病毒方法可供選用。例如，可用象DOTMA(Felgner,PNAS 84(1987),7413-7417),DOGS或Transfectam(Behr,PNAS 86(1989),6982-6986),DMRIE和DORIE(Felgner，方法(Methods)5(1993),67-75),DC-CHOL(Gao,BBRC 179(1991),280-285),DOTAP(MCLachlan，基因治療(Gene Therapy)2(1995),674-622)或Lipofectamine的陽離子脂同磷酸鈣共沉淀；使用模擬病毒系統的受體(參見Cotten，現代生物技術評論(Current Opinion in Biotechnology)4(1993),705-710)；以及使用象聚酰氨基胺(Haensler，生物共軛化學(BioconjugateChem.)4(1993)，372-379)。雖然是有希望的，但這些技術也受到了一些限制，特別是它們在體內低水平的效能，實際上限制了它們在基因治療上的應用。而且，這些技術中的一部分或者限于體外應用，特別是由于所用分子的毒性的緣故(Polybrene-1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物-可作為一個例子)，或者由于引入這些化合物后引起的炎性反應(就陽離子脂而言，例如Scheule，人類基因治療8(1997),689-707)，或者是難于控制，如就受體而言，在胞吞作用過程中，大量的核酸物質進入泡囊中，因而就不再在治療中起作用了。最終來講，這些技術對環境因素相當敏感而且為了使它們適用于靶細胞或所選擇的給藥方式，更具體地說是為了將其由體外模型轉移應用到體內模型，是需要長期而細致的工作的。
Wolff(科學2478(1990),1465-1468)描述了一種用于將多核苷酸引入肌細胞的引人注意的簡便的系統，該系統僅包括通過肌內途徑將純化的多核苷酸注射入靶細胞，而不與任何其它能夠促進多核苷酸進入靶細胞的化合物結合。最近通過氣管內注射的方法(Meyer，基因治療2(1995),450-460)及通過動脈內注射的方法(Riessen，人類基因治療4(1993),749-758)所得結果進一步肯定了這種系統所帶來的益處。盡管如此，被引入組織的基因的表達量仍然十分有限以致使這種技術不能有效地用于基因療法，特別是用于治療同肺病有關的疾病。一些研究提出了替代方法以促進這類多核苷酸進入細胞。例如，專利申請WO 95/26718是關于將遺傳物質引入細胞中的方法，該方法包括將基因疫苗促進劑和一核酸分子同所述細胞接觸。根據其中的一個特定的實施方案的描述，所述基因疫苗促進劑可以存在于DMSO中。盡管如此，在所述專利申請中沒有提供試驗數據并且由Aubin(體細胞分子遺傳學(Somatic Cell Mol.Genet.)14(1988),155-167)或Rhim(致癌基因(Oneogene)4(1989),1403-1409)所做的實驗強調了必須聯合使用DMSO和象Polybrene樣的靜電橋分子。更具體地說，Aubin描述了一種兩步法。第一步，也是必需的一步，將要轉染的DNA同靜電橋分子Polybrene相接觸，從而使該DNA吸附到細胞表面，第二步，將已經吸附到細胞表面的DNA同DMSO接觸以促進該DNA進入細胞。這些研究并沒有能夠提出詳細草案以適應體內應用方法，即目的是將多核苷酸，更具體地說是將不含有任何轉染促進化合物的多核苷酸有效地轉入不同細胞類型中并且提高所述靶細胞內的核酸表達水平的方法。此外，Oudhiri(PNAS 94(1997),1651-1656)證明了向氣管內注射不含有任何能夠協助質粒進入細胞的質粒后，螢火素酶基因在肺細胞中沒有表達。
因此，本發明的根本技術問題是提供有效地將治療活性物質轉入靶細胞的方法。
這一技術問題是通過在權利要求中表征的實施方案解決的，即申請人現在已經開發出了一種用于將治療活性物質，優選地是一種多核苷酸，轉入靶細胞內的組合物。可以設想將該組合物特別地用于體內基因治療過程中，這特別是因為該組合物的組分是無害的。
因此，本發明首先涉及到一組合物，該組合物的特征是由至少一種治療活性物質和至少一種選自一組特定非質子極性化合物的極性化合物組成的。
根據本發明，“非質子極性化合物”被理解為是指一種不含任何正電極化氫原子(非質子)的化合物。這樣的化合物的性質在文獻中作了大量描述(例如，見Vollhardt和Schore,1994,Traite de ChimieOrganique[有機化學論文]，第二版，De Boeck大學)。這樣的化合物特別地可從天然或由合成獲得，或者通過對本身不具備上述特性的一個化合物進行化學修飾而得到。本領域技術人員具有鑒定這種化合物所需的知識。本發明下面所描述的方法及應用中所要用到的非質子極性化合物可通過各種商業渠道獲得，或按現有技術的描述制備。有大量的極性化合物可供考慮在本發明中使用。
根據本發明的第一種情況，優選提到的非質子極性化合物被定義為
(a)式Ⅰ
其中R1和R2是相同或不同的1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基，或烷氧基團，這些基團可任選性地重復，可以是線性的或分支的并且可被任選性地取代，條件是當R1是1個或2個碳原子的基團時，R2是至少3個碳原子的基團，R2是1個或2個碳原子的基團時，R1是至少3個碳原子的基團，R1和R2可能連接形成環化分子；(b)式Ⅱ
其中R3和R4是相同或不同的，是1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基或烷氧基，這些基團可任選性地重復，可以是線性的或分支的并且可被任選性地取代，R3和R4可能連接形成環化分子；(c)式Ⅲ
其中R3和R4是相同或不同的1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基或烷氧基團。這些基團可任選性地重復的，可以是線性的或分支的并且可被任選性地取代，R5是(CH2)x，在每個[R5-S]n重復單元中是彼此獨立的，其中X=1到6，且R5可被任選性地取代，n=1到50，R3和R4可能連接形成環化分子，或(d)二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，四甲基脲及它們中的任何一個的衍生物。
所述的R1,R2,R3和/或R4基團優選地由2到6個碳原子組成，更優選的為2到4個碳原子，特別優選的為2到3個碳原子。
鏈烯基所表示的意思可被理解為在該碳鏈中可以包括一個或多個雙鏈。
根據本發明，這些極性化合物的R1,R2,R3和/或R5基團可被取代。特別地，這樣的取代可以由一個標記分子(見US 4711955)，一個細胞靶分子(配體)或一個錨定分子組成，經體內或體外給藥后，標記分子能夠使例如化合物或含有它的復合物的分布可以被觀測到。這些已在科學出版物上做了大量描述的因子，允許特異細胞類型的靶向，促進穿透進入細胞，核內體的裂解或甚至于向核的胞內運輸。這些因子可由全部或部分的下列物質組成糖，乙二醇，肽(例如GRP，胃泌素釋放肽)，寡核苷酸，脂，激素，維生素，抗原，抗體(或其片段)，特異膜受體配體，能夠與抗一配體反應的配體，融合劑肽，核定位肽，或所述化合物的組合，例如靶向肝細胞表面脫唾液酸糖蛋白受體的半乳糖殘基，起膜融合作用的從流感病毒血凝素HA-2亞基中得到的INF-7融合劑肽(Plank，生物化學雜志(J.Biol.Chem),269(1994),12918-12924)，從SV40病毒T-抗原(Lanford，細胞(Cell)37(1984),801-813)中或者從Epstein Barr病毒的EBNA-1蛋白(Ambinder，病毒學雜志(J.Virol.)65(1991)，1466-1478)中得到的核信號序列。
根據本發明，所述非質子極性化合物特別地選自二正丙基-亞砜(DPSO)，二甲基砜，環丁砜，環丁亞砜(TEMSO)，1-甲基-2-吡咯烷酮，甲基-二-甲基亞砜，甲基-二-乙基亞砜及其衍生物。按照本發明的有利形式，所述非質子極性化合物選自二正丙基-亞砜(DPSO)及其衍生物。如所附實施例中所描述的，發現用附加有DPSO的DNA給藥時，DPSO能夠顯著促進細胞吸收DNA。所述分子的對映體也包括在發明的范圍內。
為本發明的目的，前面提到的任何化合物的“衍生物”的意思是指該分子的化學結構是以上面描述的化合物為基礎并且可用來將某物質轉移到靶細胞中。同天然存在的非質子極性化合物以及上面所提到的化合物相比，在用這樣的衍生物轉染所述物質的過程中，促進細胞吸收所述物質的能力甚至可能增強。制備這樣的衍生物的方法對本領域技術人員來說是公知的而且這些方法已在例如，Beilstein，有機化學手冊(Handbook of Organic Chemistry,Springer edition New York Inc.美國紐約(10010)第5大街175號)以及有機合成(Organic Synthesis)，Wiley，紐約，美國)這些書中做了描述。根據現有技術或例如在所附實施例中所描述的方法，可將所述衍生物進行轉染試驗。而且，可根據現有技術中的方法，例如用計算機輔助設計出合適的衍生物和類似物。具體地說，可用DPSO和其他相關的非質子極性化合物的三維和/或晶體結構來設計具有促進DNA吸收能力的化合物(Rose，生物化學(Biochomistry)35(1996),12933-12944；Rutenber，生物藥物化學(Bioorg Med.Chem.)4(1996),1545-1558)。
根據本發明的另一個實施方案，所述非質子極性化合物選自二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基乙酰胺，四甲基脲(TMU)及其衍生物。
本發明組合物的活性物質包括，但不限于肽，蛋白，多核苷酸，抗體，小有機化合物配體，激素，肽模擬物，戊糖核酸(PNA)等等，優選的物質是能夠在實驗對象中誘導和/或介導生理反應的物質。根據本發明，優選的組合物的活性物質為多核苷酸，加上非質子極性化合物后就能使多核苷酸轉染入細胞的能力提高。
“多核苷酸”被認為是天然分離的或合成的，線性的或環狀的，雙鏈或單鏈的DNA和/或RNA片段，用這一術語來表示標記的或未標記的(例如，見US 4711955或EP 302175)，修飾的或未修飾(例如，見US 5525711)的核酸的確切序列并且在不限制核酸大小的情況下可定義一個片段或一個核酸的某區域。多核苷酸被認為指的是，特別是，cDNA，染色體DNA，質粒DNA，不含任何能促進多核苷酸進入細胞的化合物的多核苷酸；與至少一種多肽，特別是病毒來源的多肽，更具體地說是腺病毒或逆轉錄病毒來源的多肽結合的，或與合成多肽結合的多核苷酸；與配體結合的多核苷酸；與至少一種陽離子兩親性物，特別是脂類結合的多核苷酸；與至少一種陽離子或中性聚合物結合的多核苷酸，信使RNA；反義RNA；核酶；轉移RNA；核糖體RNA；或編碼這樣RNA的DNA。
根據本發明的一個特定實施方案，所述多核苷酸包含一個目的基因以及使該目的基因能夠表達的因子。在這一實施方案中，多核苷酸的有利形式為質粒，使表達能夠發生的因子是使所述DNA片段能夠轉錄為RNA(反義RNA或mRNA)以及將mRNA翻譯為多肽的因子的總和。這些因子具體來說是在所述細胞內起作用的啟動子序列和/或調節序列，在合適時，這些序列要能夠使所述多肽在靶細胞表面分泌或表達。例如，可提到的有RSV,MPSV,SV40,CMV或7.5k病毒啟動子，或痘苗病毒啟動子，或編碼肌酸激酶，肌動蛋白和肺表面活性物基因的啟動子。另外有可能選擇對給定細胞類型特異的或在一定條件下能夠被激活的啟動子序列。文獻中提供了大量關于這樣的啟動子的信息。而且，所述多核苷酸可包括至少兩個相同或不同的具有轉錄啟動子活性的序列和/或至少兩個相同或不同的DNA編碼序列，兩者位置連續或隔開一段距離，彼此之間同向或反向，只要轉錄啟動子的功能和所述序列的轉錄不受影響。類似地，在構建這類核酸時，可引入對轉錄沒有影響的以及在翻譯前被剪切的“中性”核酸序列或內含子。在文獻中對這種性質的序列及其應用作了描述。所述多核苷酸可以含有胞內運輸所需的，復制和/或整合所需的序列。這樣的序列對技術人員是公知的。另外，按照本發明的多核苷酸也可以是被修飾后不能整合到靶細胞基因組中的多核苷酸，或者是用象精胺一類的物質穩定化的多核苷酸。
本發明組合物還可包括一個選擇標記基因，該選擇標記或者連接到上述多核苷酸上或者作為一個單獨的核酸分子，例如在一個重組質粒上。這一實施方案特別適用于離體處理組織，細胞和器官。在引入外源DNA后，可將工程細胞在富集培養基上培養1-2天，然后轉移到選擇培養基中。重組質粒中的選擇性標記賦予選擇物以抗性并且使那些已經將質粒穩定地整合到其染色體中的細胞能被選擇出來從而生長形成轉化灶，然后可以被克隆并發展成為細胞系。可以用很多選擇系統，包括但不限于分別存在于tk-,hgprt-或aprt-細胞中的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，細胞11(1977),233)，次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶(Szybalska，美國科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48(1962),2026)，以及腺嘌呤轉磷酸核糖基酶(Lowy，細胞22(1980),817)。而抗代謝物抗性可作為選擇賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶dhfr(Wigler，美國科學院學報.，美國77(1980),3567；O’Hare，美國科學院學報.，美國78(1981),1527)，賦予霉酚酸抗性的gpt(Mulligan，美國科學院學報，美國，78(1981)，2072)；賦予氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)150(1981),1)；賦予潮霉素抗性(Santerre，基因(Gene)30(1984),147)；或嘌吟霉素抗性的hygro(pat，嘌呤霉素N-乙酰轉移酶)的基礎。另外對其他選擇性基因也作了描述，例如trpB使細胞能夠利用吲哚以代替色氨酸；hisD使細胞能夠利用組氨醇(histinol)來代替組氨酸(Hartman，美國科學院學報美國85(1988),8047)；以及賦予鳥氨酸脫羧酶抑制劑抗性，即2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，(DFMO)抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogue,1987；見現代分子生物學通訊(CurrentCommunication in Molecular Biology)，冷泉港實驗室編)。
在文獻中描述了本發明中用于體外或體內基因治療時所用組合物中的適宜的載體及質粒，這對于本領域技術人員來說是公知的；例如見Giordano,天然藥物(Nature Medicine)2(1996),534-539；Schaper，循環研究(Circ.Res.)79(1996)，911-919；Anderson,科學256(1992),808-813；Isner，柳葉刀(Lancet)348(1996),370-374；Muhlhauser，循環研究，77(1995),1077-1086；Wang，天然藥物2(1996),714-716；WO94/29469；WO97/00957或Schaper，現代生物技術評論7(1996),635-640，及其中所引用的參考文獻。優選地，所述載體為基因轉移或靶向載體。本領域技術人員可用公知的方法來構建上述多核苷酸，質粒和重組載體；例如見Sambrook在《分子克隆-實驗手冊》(Molecular Cloning A LaboratoryManual，紐約)，冷泉港實驗室(1989)中所記載的方法以及Ausubel在《現代分子生物學方法》，(CurrentProtocols in MolecularBiology,Green Pubilshing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989))中描述的方法。
在本發明中，多核苷酸可以與靶細胞是同源的或是異源的。選用編碼全部或部分多肽的多核苷酸，特別是具有治療或預防活性的多肽，更具體地說是細胞或體液型免疫活性的多肽是有利的。術語多肽應被理解為是對多肽大小和被修飾(例如被糖基化)程度沒有限制的。例如，可提及編碼酶、激素、細胞因子、膜受體、結構多肽、形成膜通道的多肽、轉運多肽、粘附分子、配體、調節轉錄、翻譯、復制或轉錄穩定性的因子的基因，或者編碼抗體的基因，例如，象編碼CFTR蛋白、營養不良蛋白、因子Ⅷ或因子Ⅸ、HPV E6/E7、MUC1、BRAC1、干擾素、白細胞介素(IL-2,IL-4,IL-6,IL-7以及IL-12)、腫瘤壞死因子(TNF)α或GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)的基因，或單純皰疹病毒1型(HSV-1)的tk基因，成視網膜細胞瘤基因或p53基因以及編碼全部或部分免疫球蛋白的基因，例如F(ab)2，Fab’以及Fab片段，或編碼抗獨特型免疫球蛋白的基因(US4,699,880)。應當理解，所提到的基因不是對本發明的限制，也可用其它基因。
根據本發明，可能希望得到一種含有最大可能濃度的多核苷酸的組合物，以便在需要的時候，可用最小可能量的本發明組合物給藥。技術人員有足夠的知識使他能夠根據溶液介質溶解多核苷酸的能力來調整其濃度。根據一個優選的實施方案，所述非質子極性化合物溶于水性溶液中，就是說該化合物被稀釋在水性溶液中，后者適當時為鹽水或緩沖液。技術人員有足夠的知識使他們能夠選出對靶細胞類型最為合適的水溶液。更具體地說，所述非質子極性化合物是溶解在水中或緩沖液中的，例如20mM的Hepes中，pH值為7.5。非質子極性化合物的體積可以是組合物總體積的0.1-100％，優選的體積為5-50％，最優選的是從15-20％。
本發明進一步涉及一種藥物組合物，該組合物包括上面提到的本發明的組合物并且任選性地含有藥物上可接受的載體或賦型劑。合適的藥物載體的例子是本領域所公知的且包括磷酸緩沖鹽水溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各種類型的濕潤劑，滅菌溶液等等。可用公知的常規方法來制備含有這樣的載體的組合物。這些藥物組合物可以以合適的劑量給受試者用藥。可經不同的方式進行適宜組合物的給藥，例如，靜脈給藥，氣管內給藥，肺內給藥，腹膜內給藥，皮下給藥，肌內給藥，局部或皮內給藥。所用劑量方式應由臨床醫生及其它臨床因素來確定。正如醫藥領域所公知的，對每個患者的用藥劑量取決于很多因素，包括患者的身材，體表面積，年齡，所用藥物的特性，性別，給藥時間及途徑，健康狀況，以及同時使用的其它藥物。一般地，使用本藥物組合物的劑量方案為每日1μg到10mg的藥物活性化合物。如果劑量方案為連續注入，那么應按每分鐘每千克體重的用藥范圍為1μg到10mg的生物活性化合物給藥。可通過定期評估來監測病情進展狀況。用藥劑量會不同，但對靜脈內施用多核苷酸的優選劑量為，例如DNA應是約從106到1016挎貝的DNA分子。本發明的組合物可以局部或系統給藥。通常用腸胃外給藥方式，例如靜脈內給藥；也可將DNA直接向目標位點給藥，例如，用導管向動脈內給藥。而且，在注射前，可將本發明組合物結合于微膠囊或微球體上。人們可以用體內轉基因法，為此已設計出多種設備，如雙氣囊或其它導管，或者用上面描述的通過直接向靶組織注射的方法。另外，可以用離體方法，從體內分離組織中的細胞，然后用上面提到的組合物轉染并再注回。
本發明另一個實施方案中涉及一種含上面提到的任何一種組合物的疫苗。在這一實施方案中，優選的治療活性物質為一種抗原或編碼能夠引起對某種疾病敏感的人或動物對該疾病產生保護性免疫的抗原的多核苷酸。可根據本領域的公知方法制備本發明所述疫苗。例如通過共轉染編碼分泌型細胞因子或趨化因子或膜分子的cDNA，設計Th-1-或Th-2-導向的免疫反應，就能夠提高用于接種的抗原的免疫原性。該疫苗例如可以被或者皮內注射，皮下注射，肌內注射，或者特別是如果用作抗腫瘤免疫接種，注射到腫瘤生長部位或者注射到腫瘤生長部位的淋巴管或淋巴結引流區。
本發明的另一實施方案涉及一種診斷組合物含有上述任一組合物以及可任選的合適的檢測工具。在本實施方案中，優選帶有標記的治療活性物質。有許多本領域普通技術人員知道的不同的標記及標記方法。可用于本發明的標記包括酶，放射性同位素，膠體金屬，熒光化合物，化學發光化合物，以及生物發光化合物。附加的或可另選的情形是，該治療活性物質含有編碼可直接或間接被檢測的蛋白的標記基因，比如β一半乳糖苷酶，綠色熒光蛋白或熒光素酶；另見后面的實施例。本發明的診斷組合物可有利地用于定向，例如，向選定區域發光，以及用于跟蹤受試者體內的實物。另外，可用上面描述的組合物完成病態動物模型，對動物體內的病原體或疾病進程的定位及根蹤方法，以及從推定的治療化合物中篩選出對抑制疾病或病原體有效的化合物的方法。對哺乳動物發出的光的檢測及定位已在現有技術中做了描述，比如97/18841以及文中引用的文獻。
本發明還涉及本發明的組合物在體外、離體或體內(特別是體內)轉移至少一種治療活性物質特別是一種多核苷酸到靶細胞內的用途。
這些引入或轉移方法本身是公知的。“轉移”的意思是指治療活性物質被轉移到細胞中，并且在步驟最后定位在所述細胞內或細胞膜內或表面。如果該活性物質是核酸就叫作“轉染”。可用各種合適的方法來鑒定轉染，例如通過測定所述基因的表達或測定表達蛋白質的濃度。
按照本發明，“靶細胞”被認為是原核細胞，酵母細胞以及真核細胞，植物細胞，人或動物細胞，特別是哺乳動物細胞。另外，也應提到癌細胞。在體內，本發明可應用于組織的間質或腔內，比如肺，氣管，皮膚，肌肉，腦，肝，心臟，脾，骨髓，胸腺，膀胱，淋巴，血液，血管，胰，胃，腎，卵巢，睪丸，直腸，周圍或中樞神經系統，眼，淋巴器官，軟骨及內皮。按本發明的有利的選擇，靶細胞為肌細胞，造血干細胞或呼吸道細胞，更具體地說是氣管或肺細胞，有利的是呼吸道上皮細胞。
本發明還涉及一種將治療活性物質轉移到靶細胞中的方法，該方法是將所述細胞同本發明的組合物相接觸。有利的是，這一方法包括一附加步驟，該步驟是在與細胞接觸前加熱該組合物。
根據本發明應當理解，“組合物”指的是其中所含的治療活性物質和極性化合物以某種方式關聯或結合在一起，從而不能認為所述活性物質不含促進劑。例如，在所述活性物質為質粒DNA的特定情況中，申請人證明了在DPSO存在時DNA物理性質有所變化。因此，本領域技術人員可以容易地想象由所述活性物質和所述極性化合物組成的組合物可在體外獲得，也可在體內得到，向靶器官或組織分別注射所述化合物，在第一種化合物仍然存在時接著注射第二種化合物以就地形成權利要求的組合物。這種獨立的給藥方式應當被認為是本發明的等同實施。
正如上文所提到的，根據本發明的組合物可被用作診斷·治療、預防或接種目的的藥物。因為這一緣故，本發明也涉及將本發明組合物用作治療、預防或接種目的的藥物。
特別地，本發明組合物可被用于實施治療方法，該方法是將至少一種治療活性物質，特別是一種多核苷酸轉移到靶細胞中。優選的靶細胞為哺乳動物細胞。特別是，這些哺乳動物細胞是肺細胞、肌細胞或造血干細胞。
可將本發明的組合物通過肌內，氣管內，鼻腔內，腦內，胸膜內，腫瘤內，表皮，靜脈或動脈內的途徑給藥，使用注射器或任何其它類似的工具，包括適用于呼吸道或粘膜的系統，例如吸入，滴入，氣霧化。可提到的給藥方式有通過使用乳劑形式，通過口服方式或技術人員公知的且可用于本發明的任何其他方式。
根據本發明，以及從體內基因治療的角度，所建議的給藥方式可以對病人重復施用多次，并且任一所用化合物不會引起任何明顯的免疫反應。給藥方式可以是單劑量或多劑量，在一定時間間隔內重復給藥一次或多次。給藥途徑及劑量取決于不同因素，例如，接受治療的個體或疾病，以及將要被轉移的多核苷酸。
更特別地，本發明涉及本發明的組合物在制備用于診斷、治療、預防或接種目的的藥物中的應用，該藥物通過基因療法用于人或動物體。第一種可能是，可以直接在體內施用該藥物(例如肌肉給藥，或用氣霧劑對肺給藥，等等)。也可以采取離體的方法，該方法首先從患者體內提取細胞(骨髓干細胞，外周血淋巴細胞，肌細胞等等)，再根據本發明轉染這些細胞，然后再給患者施用這些轉染了的細胞。
最后，本發明涉及到用前面定義的組合物轉染過的細胞，特別是原核細胞，或酵母細胞或真核細胞，特別是動物細胞，特別是哺乳動物細胞，更特別的是癌細胞。根據本發明的優選實施方案，所述細胞是呼吸道細胞，更具體地說是氣管細胞或肺細胞，有利的是呼吸道上皮細胞。就呼吸道用藥而言，預先施用支氣管舒張化合物(例如茶堿)是有利的。申請人證明，在把含有DPSO的組合物溫育前30分鐘，給小鼠口服0.3mg的茶堿(Dilatrane)，同沒有用這一預處理的小鼠相比，可使表達水平略有提高。
本發明的說明書和實施例公開并說清并包含了各實施方案。與本發明所用的任何方法、用途及化合物有關的文獻可從公共圖書館中，或用例如電子設備得到。例如，可使用國際互聯網上的公共數據庫“Medline”，例如，在網址http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。另外的數據庫及網址，比如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/research___tools.html,http://www.tigr.org/，對本領域技術人員是公知的并且可通過例如網址http://www.lycos.com獲得這方面的信息。在Berks著的TIBTECH 12(1994)，352-364中給出了生物技術領域的專利信息概述及對用于追溯檢索和更新信息的相關專利信息源的調查。
本發明的組合物、應用、方法可用于治療各種疾病，這些疾病的治療和/或診斷涉及或取決于治療物質在細胞中的轉移。盡管對動物的治療也包括在本文描述的方法和應用中，但最理想的是將本發明的藥物組合物、方法及應用用于人。
下面的實施例1到7參照

圖1-5說明了本發明。
圖1質粒pTG 11033的圖譜圖2注射組合物后，肺中編碼熒光素酶基因的表達水平(RLU/mg蛋白)。該組合物由溶于pH值為7.5的20mM Hepes緩沖液中的50μgDNA及15％(v/v)DESO或DPSO組成圖3注射組合物后肺中編碼熒光素酶基因的表達水平(RLU/mg蛋白質)。所述組合物含有溶于pH值為7.5的20mM Hepes緩沖液中的50μg DNA和適當的情況下的10或15％(v/v)的不同的極性化合物。所示數值是由用同一組合物注射小鼠后每一觀察結果的平均值計算出來的。
圖4注射組合物后肺中編碼熒光素酶基因的表達水平(RLU/mg蛋白)。所述組合物含有溶于pH值為7.5的20mM Hepes緩沖液中的50mg DNA和在適當的情況下的10或15％(v/v)的TMU或DPSO。所示數值是由用同一組合物注射n只小鼠后所觀察每一結果的平均值計算出來的。SEM平均標準誤差(見Burke，科學數據處理(Scientific data management)9(1997),32-38)。
圖5質粒DNA解鏈曲線+/-DPSO。將pH值為7.5的20mMHEPES中的50μg/ml質粒DNA(pTG 11033)，或分別含有5％,10％,15％或20％DPSO的pH值為7.5的20mM HEPES中的50μg/ml的質粒DNA加熱(4℃/min)。記錄吸光度并對35℃時的起始吸光度歸一化。
從下面的說明性實施例，我們可以更好地理解本發明及其許多優點。
實施例1制備所含極性化合物為DESO或DPSO的組合物所選擇的多核苷酸，即質粒pTG 11033(圖1)，包括在CMV啟動子控制下的編碼熒光素酶的基因，HMG基因的內含子1以及SV40polyA終止信號。用乙醇沉淀250μl 1mg/ml的純化質粒(用氯化銫梯度離心所純化的)溶液中的質粒DNA。離心后，用70％乙醇洗滌并干澡，將核酸沉淀溶解于給定體積的DESO或DPSO以及20mM pH值為7.5的Hepes緩沖液中，以制備下面表Ⅰ所示的組合物
實施例2用氣管內注射的給藥方式施用該組合物通過腹膜內注射(生理鹽水，IMALGENE 1000，甲苯噻嗪/ROMPUN)麻醉8周齡雌鼠(B6/SJLF1,Iffa Credo)。用70％的酒精消毒皮膚后，切開切口使氣管暴露出來，用注射器向氣管內注射50μl實施例1中的組合物。每種組合物至少給三只不同小鼠注射。將表達水平與那些用不加任何極性化合物，溶于50μl 20mM pH為7.5的Hepes中的50μg DNA注射后所得結果進行比較。本方法中還包括未經注射的小鼠作為對照。
實施例3測量被注射小鼠組織中的熒光素酶的活性。
注射兩天后殺死小鼠。分別處理肺及氣管。將組織在液氮中冷凍并在-80℃下貯藏。為了測量熒光素酶的活性，將組織放在置于干冰中的研缽中進行機械研磨。向從肺或氣管中得到的組織碎片中分別加入500μl或200μl的裂解緩沖液(Promega)，所得溶液經三步冷凍/解凍處理。離心除細胞碎片并根據供應商(Promega)的說明，通過加入100μl的試劑測量20μl上清液的發光來測量熒光素酶的活性(RLU/min，每分鐘相對光單位)。在商業上可得的熒光素酶(Promega)所建立的標準尺度的幫助下，將所測量的熒光素酶的活性同蛋白質的量的關系標準化。用bicinchoninic酸(BCA)比色法(Smith,Anal.Biochem.150(1985),76-85)對上清液等分試樣比色從而確定蛋白質總量。這樣就能用RLU每毫克蛋白(從組織中提取的蛋白質)來表示熒光素酶的活性。對于給定的組合物，所研究的活性相當于從三個被注射過的小鼠中得到的平均值。
實施例4所得結果圖2和圖4圖示了從肺獲得的提取物所得的結果。這些結果證明當僅僅用多核苷酸(50μg)注射肺組織時，觀察不到熒光素酶基因的表達，而注射組合物中加入DPSO可促進表達。
這些結果還證明在將所述組合物注入氣管后，DPSO自身是一種有效促進多核苷酸轉染進入細胞之能力的化合物，因為同僅注射多核苷酸相比，表達量有明顯的升高。
實施例5被試驗的其它非質子極性化合物以相同的方式，我們證明根據了本發明可用其他非質子極性化合物。為此，根據在實施例1和4中所描述的方法制備了各種組合物。具體地說，這些組合物包括50μg的質粒pTG 11033/50μl和可變百分比(10％/15％)的下組的物質DPSO，環丁亞砜(TEMSO)，(見Johnson和Keiser,1973，有機合成論文集(Organic SynthesisColl.)5(1973),791),DMSO，四甲基脲或環丁砜，然后根據前面實施例2中描述的方法，將所得組合物給8到12周齡的小鼠(C57BL/6,Iffo Credo)注射。
所得結果(圖3和圖4)證明了可用各種不同的非質子極性化合物實施本發明。發現在相同的條件下，尤其就濃度而言，同僅注射多核苷酸相比，向氣管內注射試驗組合物(該組合物含多核苷酸和象上面所列的非質子極性化合物的一種)可顯著提高肺細胞轉染。
用含有DPSO或TMU的組合物觀測到了最佳結果。對于每種這些極性化合物，都證明了在測試的DNA量(50μg)下，可以通過提高所述極性化合物的百分含量來提高所測的編碼熒光素酶基因的表達水平(圖4)。
實施例7質粒DNA解鏈曲線的記錄質粒DNA解鏈曲線是在恒溫的紫外/可見CARY/VARIAN分光光度計記錄下來的(軟件版本3.04)，用兩個石英比色環(L=1cm)及Teflon終塞子。樣品總體積1ml(50μg/ml質粒DNA(pTG11033)溶于pH7.5的20mM HEPES中，其中含有不同百分比(0,5,10,20/％)的二正丙基-亞砜(DPSO)。溫度梯度為40℃/分鐘且實驗在260nm、35℃到100℃下進行(范圍0.9-1.2OD；50μg～1OD)。DNA解鏈曲線(圖5)表明，單獨的DNA(“裸”DNA)與有DPSO(“溶劑復合物”)存在下的DNA的表現不同在有亞砜化合物存在時吸光度的變化減小并發生在較高溫度下。這種情況可被解釋為DPSO對DNA的穩定作用(即需要更高的溫度使DNA雙鏈解鏈)。
實施例8脂溶劑復合物的氣霧劑化將載體送入呼吸道上皮的最終的形式是氣霧劑的形式。但是如果僅用DNA，那么DNA會在氣霧化的過程中迅速降解。可以通過將DNA復合為脂復合物來避免發生這種情況(將DNA同象在專利申請n0FR97/15805中描述過的那些陽離子兩親性物例如pTG90復合)。預先已經觀察到單獨的脂復合物在肺中不引起表達或僅引起低水平的表達。按照本發明，試驗了將溶劑復合物(本發明的復合物)和脂類復合物的有利的特性結合起來。為此，制備了脂溶劑復合物(DNA同陽離子脂類和DPSO)；使之氣霧化，收集在冷阱槽中，然后注射到小鼠氣管內。僅向氣管內注射脂復合物和pTG 90/DOPE并不引起熒光素酶的表達，但是在有DPSO存在時，pTG 90/DOPE脂溶劑復合物會導致熒光素酶的表達。一般來說，氣霧化后，脂溶劑復合物試驗的表達量會降低，但是對于pTG/DOPE/DPSO脂溶劑復合物，仍可觀測到到氣霧化前相同復合物86％的活性。
實施例9二亞砜的合成
9.1甲基-二-甲基亞砜(雙(甲基亞磺酰基)甲烷BiMsuM)(=CH3-SO-CH2-SO-CH3)。
在室溫下將10.5ml的CH3SOCH2SCH3(12.5g,100毫摩爾；Aldrich 17.795)稀釋于125ml甲醇中。攪拌后將該溶液貯藏于0℃下。在90分鐘內滴加21.4克NaIO4(100毫摩爾)熔于280ml水中的溶液。用薄層層析(TLC，溶劑CH2Cl2/CH3OH 95/5，用I2,KMnO4檢測，CH3SOCH2SCH3，Rf=0.9；CH3SOCH2SOCH3,Rf=0.33)來控制反應進程。用Celite過濾反應混合物，用300ml水，200mlCH2Cl2，最后用200ml甲醇進行洗滌。
將富集的有機級分匯集，用Na2SO4干燥并蒸發。
純化所得產品并將含有兩個對映體的級分過柱三次，用550mlCH2Cl2250ml CH2Cl2/CH3OH 97/3,1000ml CH2Cl2/CH3OH 95/5，以及1000ml CH2Cl2/CH3OH 90/10在硅膠柱(ID4cm，100g二氧化硅于CH2Cl2中)中洗脫。BiMSuM的兩種對映體洗脫于級分95/5中。用高效液相色譜法對級分進行分析(NH2-柱，該柱可分離兩對映體)。將一種或另一種對映體的富集級分匯合起來并蒸發。用NH2-高效液相色譜法和1H核磁共振(200MH2,CDCl3)進行分析。
對映體純度R,S-BiMSuM/R,R-BiMSuM 87/13:4.5g對映體純度R,S-BiMSuM/R,R-BiMSuM 05/95:0.6g9.2甲基-二-乙基亞砜(雙(乙亞磺酰基)甲烷，BiESuM)(=CH3CH2-SO-CH2-SO-CH2CH3)在室溫下將4ml CH3CH2-SO-CH2-S-CH2CH3(4.45g，29毫摩爾，FluKa 02845)稀釋于25ml甲醇中。攪拌后將溶液保存在0℃下。滴加7g NaIO4(33毫摩爾)溶于50ml水中的溶液。在攪拌下，將該反應混合物在0℃下保存5小時。用薄層層析(TLC，溶劑CH2Cl2/CH3OH 90/10，用I2,KMnO4檢測；CH3CH2SOCH2SCH2CH3,Rf=0.95；CH3CH2SOCH2SOCH2CH3,Rf=0.7)控制反應進程。用Celife過濾反應混合物，用300ml水，200mlCH2Cl2，然后用200ml甲醇洗滌。用CH2Cl2，然后用乙酸乙酯將液相抽提3次。將有機級分匯集，用Na2SO4干燥并蒸發。
純化所得產品并將含有兩個對映體的級分用硅膠柱(ID 2cm,38克二氧化硅于CH2Cl2中)過柱三次而富集，洗脫劑為100ml CH2Cl2,200ml CH2Cl2/CH3OH 99/1,200ml CH2Cl2/CH3OH 97/3,200mlCH2CI2/CH3OH 95/05,200ml CH2Cl2/CH3OH 92.5/7.5,200mlCH2Cl2/CH3OH 90/10。BiESuM的對映體被洗脫于級分95/5中。用高效液相色譜(硅膠柱，該柱可分離兩對映體)對級分進行分析。將一種或另一種對映體的富集級分匯集起來并蒸發。用硅膠高效液相色譜和1H核磁共振(200MH2,CDCl3)分析δ3.89(五重峰，2H,-SO-CH2-SO-),3.1(四重峰，4H,-CH2-),1.40(t,6H,-CH3)。
級分1對映體純度R,S-BiESuM/R,R-BiESuM 84/16:1.9g級分2對映體純度R,S-BiESuM/R,R-BiESuM 16/84:0.075g本發明所描述的具體實施方案僅僅是對本發明的具體方面的說明而不是要將本發明限制在這一范圍中，并且任何功能相同的組合物及化合物應在本發明的范圍內。實際上，根據前文的描述及附圖，對本發明做除本文示及所描述之外的各種修改對于本領域技術人員來說是顯而易見的。所述修改也應落入所附權利要求的范圍中。因此，有了對本發明優選實施方案的詳細描述，就應當清楚由所附權利要求限定的本發明不限于上面描述的具體細節，因為在不脫離本發明精神及范圍的情況下，可以對本發明做出許多顯而易見的改變。
權利要求
1．一種組合物，該組合物含有至少一種治療活性物質和至少一種非質子極性化合物的混合物，極性化合物選自如下定義的化合物(a)式Ⅰ
其中R1和R2相同或不同并且為1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基，烷氧基且可被任選性地取代，條件是當R1是1或2個碳原子基團時，R2至少是3個碳原子的基團，R2是1或2個碳原子基團時，R1至少是3個碳原子的基團，R1和R2可能連接形成環狀分子；(b)式Ⅱ
其中R3和R4相同或不同并且為1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基或烷氧基，這些基團可任選性地重復，是線性的或分支的并且可任選性地被取代，R3和R4可能連接形成環狀分子；(c)式Ⅲ
其中R3和R4相同或不同并且為1到8個碳原子的芳基，烷基，環烷基，氟代烷基，鏈烯基或烷氧基，這些基團可任選性地重復，是線性的或分支的并且可任選性地被取代，R5是(CH2)x且在每個[R5-S]n重復單元中是彼此獨立的，其中x=1到50R3和R4可能連接形成環狀分子；或(d)二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，四甲基脲或它們的衍生物。
2．權利要求1所述的組合物，其中所述非質子極性化合物選自二-正丙基亞砜(DPSO)，環丁亞砜(TEMSO)，二甲砜，環丁砜，1-甲基-2吡咯烷酮及它們的衍生物。
3．權利要求1和2所述的組合物，其中所述的治療活性物質是一種多核苷酸。
4．權利要求3所述的組合物，其中所述的多核苷酸是一種不含有任何有助于其進入靶細胞的化合物的多核苷酸。
5．權利要求3所述的組合物，其中所述的多核苷酸是同至少一種病毒多肽聯合的多核苷酸。
6．權利要求3所述的組合物，其中所述的多核苷酸是同至少一種陽離子兩親性物，特別是脂類聯合的多核苷酸。
7．權利要求3所述的組合物，其中所述的多核苷酸是同至少一種陽離子或中性聚合物聯合的多核苷酸。
8．權利要求3到7任一項中所述的組合物，其中所述的多核苷酸是一種反義多核苷酸。
9．權利要求3到7任一項中所述的組合物，其中所述的多核苷酸是一種核酶。
10．權利要求3到7任一項中所述的組合物，其中所述的多核苷酸包括目的基因及使所述目的基因能夠表達的因子。
11．權利要求10所述的組合物，其中所述的多核苷酸編碼多肽的全部或部分。
12．權利要求11所述的組合物，其中所述的多肽顯示治療活性。
13．權利要求11所述的組合物，其中所述的多肽顯示預防活性，特別是致免疫活性。
14．權利要求11所述的組合物，其中所述的多肽是一種酶，激素，細胞因子，膜受體，抗體，調節轉錄、翻譯或復制并且涉及到轉錄穩定性的因子，結構多肽，形成膜通道的多肽，轉運多肽，粘附分子或配體。
15．權利要求1到14任一項中所述的組合物，其中所述的非質子化合物在水性溶液中。
16．權利要求1到15任一項中所述的組合物，其中所述極性化合物的體積相當于該組合物總體積的15-20％。
17．權利要求1到16任一項中所述的組合物，其中非質子極性化合物在水溶液中。
18．一種藥物組合物，該組合物含有權利要求1到17任一項中所述的組合物和任選性的一種藥物上可接受的載體。
19．用于轉移至少一種治療活性物質進入靶細胞內的權利要求18中所述的藥物組合物。
20．權利要求18或19中所述的藥物組合物，其被設計用來通過肌內途徑或通過吸入，氣管內注射，滴入或氣霧劑法來給藥。
21．一種含有權利要求1到17任一項中所述組合物的疫苗。
22．用于基因治療的權利要求18到20任一項中所述的藥物組合物或權利要求21中的疫苗。
23．含有權利要求1到17任一項中所述的組合物的診斷組合物。
24．權利要求1到17任一項中所述的組合物在制備一種在體內或體外將至少一種治療活性物質轉移到靶細胞中的藥物組合物中的用途。
25．權利要求24中所述的用途，其中所述的靶細胞為哺乳動物細胞。
26．權利要求24或25中所述的用途，其中所述的靶細胞為肌細胞。
27．權利要求24或25中所述的用途，其中所述的靶細胞為呼吸道細胞。
28．一種用于體外將治療活性物質轉移到靶細胞中的方法，其中所述的細胞同權利要求1到17之一中的一種組合物接觸。
29．權利要求28中所述的方法，其中包括在將所述組合物同所述細胞相接觸前，加熱所述組合物的附加步驟。
全文摘要
本發明涉及一種用于將至少一種治療活性物質轉移到靶細胞中的組合物,該組合物的特征是含有至少一種治療活性物質以及至少一種極性化合物的混合物,該化合物是從特定非質子極性化合物組成的組中選出的。該治療活性物質優選地為一種多核苷酸,而極性化合物優選地為DPSO,DPSO能夠提高多核苷酸轉染進入細胞內部的能力。根據本發明的組合物可用作診斷、治療、預防或疫苗藥劑并通過基因治療來醫治人或動物。
文檔編號A61K9/12GK1212890SQ9811755
公開日1999年4月7日 申請日期1998年7月1日 優先權日1997年7月1日
發明者R·比紹夫, H·考伯, K·舒格哈特 申請人:特朗斯吉恩有限公司