專利名稱:免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌法的制作方法
本發明與免疫球蛋白的溶液加熱有關，加熱的目的在于減少或消除這些物質在臨床使用時的病毒傳染的危險和減少可能伴發的引起臨床付反應的酶污染，同時又沒有附隨物質對免疫球蛋白的結構和功能有害影響。
商業免疫球蛋白制劑主要包含免疫球蛋白G(IgG)分子，廣泛地用于無γ球蛋白癥和低γ球蛋白癥、抗病原生物體的被動免疫法，予防Rh過敏癥和處置象突發性血小板減少性紫癜(ITP)的自體免疫疾病的替代療法。給藥的主要途徑是通過靜脈或肌肉注射。然而，已有報導說通過靜脈注射大劑量的免疫球蛋白會傳染NonA NonB(NANB)肝炎和可能的其他病毒傳染病。
免疫球蛋白通常是利用科恩(Cohn)冷酒精法(見美國專利No2390074)，用離子交換色譜法或其他已公開的方法從血漿或胎盤血分離，這些方法所依據的是所含蛋白質的物理、化學或免疫的性質。
幾種操作方法正用于由于粗心而污染了抗血友病因子A(Factor VIII)的濃縮物以及其他用人體血漿混合物制造的蛋白質制劑的病毒失活，例如免疫球蛋白溶液。使用“蒸汽”、“干燥加熱”或“化學”處理，例如用β-丙酰基內酯(BPL)和紫外照射或者膽酸酯/三硝基丁基磷酸酶(TNBP)等方法都已經嘗試過。在低溫干燥狀態(或干加熱處理)在60℃加熱72小時的抗血友病因子A的濃縮物曾把NANB肝炎傳染給13個患有血友病的接受者當中的11個(見Colombo M.等，Lancet 1985;21-4)。在20個接受在潮濕狀態和部分蒸汽壓力下加熱過的濃縮物的病人中，沒有出現NANB肝炎，而出現了3例B型肝炎(見Schimpf K.等New England J.of Medicine，316，918〔1987〕)。然而這些方法都不能免除肝炎的傳染。使用BPL/紫外線輻射，在消除病毒傳染的同時，可能導致蛋白質分子的化學改性和形成可能引起臨床反應的新抗原。
實驗室研究表明，膽酸酶/TNBP在消除來自聚集產物的類脂包被的病毒方面是非常有效的。一個涉及七個事先沒有接觸過血漿制品的病人的有限的臨床研究表明沒有發生肝炎傳染(見Horowitz，M.S.等，Thrombosis and Hemostasis，58(1)P.371〔1987〕)。然而，這個方法只能應用于破壞類脂包被的病毒，很遺憾，而后要除去在這個方法中所應用的化學物質卻是困難的。
眾所周知，巴氏滅菌法，即對溶液加熱，對于病毒和其他生物體的失活是很有效的。把巴氏滅菌法應用于牛奶，通常是71.7℃進行15秒鐘(見Pelczar M.J.等，Microbiology，4th Ed.，McGraw-Hill，1977，PP.833-835)。這種處理表明它使結核絲桿菌有效地失活，該菌大概是現今抵抗力最大的病原體了。用巴氏滅菌過的普通血清白蛋白，在超過35年的期間內，還不曾聽說過有傳染任何血清肝炎或其他病毒的病例(見Edsall，J.T.，Vox Sang.46338-340〔1984〕)。抗血友病因子A(Factor VIII)濃縮物的巴氏滅菌法，在存在象糖和氨基酸這樣穩定劑的情況下，大大地減少了肝炎的傳染(見Schimpf，K.等，同上)。抗凝血酶Ⅲ-另一種血漿制品在有0.5M檸檬酸存在的情況下的巴氏滅菌法，多年來一直是一種必要的操作，自從它應用以來，沒有報導過有肝炎傳播的情況。
因此，免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌法使病毒失活的可能性會是引人注目的。然而，人們知道IgG的分子在溶液中加熱時會聚集(見Rosenqvist，E.等，Molecular Immunology，24，No.5，PP.495-501〔1987〕)。事實上，在63℃下將IgG溶液加熱15分鐘是一種生產可溶性IgG聚集體(aggregates)的廣泛使用的方法。這種聚集體具有類似于抗原抗體復合體的性質，也就是說它們將補體固定，結合在巨噬細胞上，引起阿圖斯(Arthus)反應(見Christian，C.L.，J.Immunology 84，112-121)。利用聚集的IgC分子Fc段活化補體系統導致了許多生產一種用于靜脈注射的可溶的IgG的嘗試，或者可以通過改善IgG與血漿的分離步驟，或者通過改性或切除Fc段(見McClelland D.B.L.，Yap P.L.，Clinics in Haematology 13，No.1 Feb.1984)。
因此，免疫球蛋白在溶液狀態時，如果不要形成聚集的話，就不能加熱這一總的觀點多年來一直是免疫球蛋白化學的一個組成部分。Fernandes，P.M.等(美國專利No4440679)和Hirao，Y.等(Published European Patent Application No.0196761)對下述內容提出專利保護的要求，即免疫球蛋白在溶液狀態可以加熱并保持它的生化性質，但這一方法需要有大量糖或糖醇作為主要的穩定劑(多達50%W/V或更高)。一種附加穩定劑，它可以是一種中性的氨基酸、一種中性的無機鹽、一種有機羧酸或表面活性劑，是由Hirao等在上述歐州專利申請中提出要求專利保護的，以提供附加的穩定性。然而存在大量的作為穩定劑的糖也可能使病毒穩定。蔗糖已用做真空冷凍干燥后立克次氏體和病毒防腐的穩定劑成分(見Bovarnick等，J.Bacteriology 59，509-522，〔1950〕)。Ng P.K.等(見Thrombosis Research 39 439-447〔1985〕)指出在抗血友病因子A溶液巴氏滅菌中，加入蔗糖保護了豬的細小病毒(Porcine Parvovirus)免遭失活。此外，從蛋白質溶液中除去大量的糖和糖醇也是困難的。
本發明允許在不加任何穩定劑的情況下對免疫球蛋白溶液進行巴氏滅菌，使病毒失活，而又不會明顯地改變IgG分子或它們的生理活性。我們已經指出，當免疫球蛋白溶液在低離子強度和中等酸度的PH下加熱時，保持了生物活性并且僅出現極少的聚集(少于5%)，這是在國際衛生組織(WHO)為適用于靜脈注射用的免疫球蛋白制劑所推薦的標準范圍之內的(WHO/BS/83.1396-Annex2)。
在本發明中，IgG稀的水溶液，一般濃度小于5%W/V，最好是小于2%W/V，它的巴氏滅菌是在下述條件下進行的在一個中等的溫度，一般是大約35℃到大約75℃，最好是大約50℃到大約60℃;在中等酸度條件下，PH一般是大約3.5到大約6.5，最好是大約4到大約6;在低離子強度下，一般相當于水溶液，離子強度小于0.05mM NaCl水溶液所具有的離子強度。
根據本發明處理的免疫球蛋白溶液一般具有低蛋白質濃度，通常小于5%W/V，最好小于2%W/V。
為了達到所存在的病毒失活的目的，所必需的加熱時間長度取決于病毒的類型和濃度，以及加熱的溫度。就其典型情況而言，加熱時間至少需10小時。
在使用Sindbis人體免疫缺損-1(Human Immunodefi-ciency-1)和牛痘病毒作為模式的實驗中，表明在pH為4至6、溫度為56℃至60℃的情況下，將IgG稀溶液加熱10小時，其破壞病毒的效果，至少與25%普通血清白蛋白的溶液在這種溫度下的巴氏滅菌效果相同，并且比抗血友病因子A溶液在有以糖和糖醇為穩定劑的巴氏滅菌的效果要好。免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌還產生了這樣一種結果，即減少或消除了某些可能引起臨床反應的酶污染(見Alving，B.M.等Immunohemotherapy，ed.Nydegger，Academic Press〔1981〕)。在體外試驗時，這種酶污染還可以引起非活化的部分凝血激酶時間的縮短和形成血管舒緩素(Kal-likreins)。
與其說本發明不限于用于臨床用現有工業用的方法，包括科恩(Cohn)分級分離制備的免疫球蛋白的巴氏滅菌法，倒不如說免疫球蛋白的制備方法與我們的方法的用途不相干，并且用其他方法由血漿制備的，或者用一般遺傳工程制備的，以及由發酵液體培養基分離出來的免疫球蛋白，也包括從轉移基因(transgenic)動物得到溶液，同樣也能適用于這種巴氏滅菌法。
商業免疫球蛋白屬于一種被稱為多變的類型，是一種針對大量抗原決定基的抗體的混合物。這些免疫球蛋白也被稱為多克隆。本發明的巴氏滅菌法也適用于所謂單克隆抗體，它們是由混合瘤(hybri-doma)細胞制造的，并且不是多變的，但是對于一種特殊的抗原決定基是專門的。
因此，本發明是適用于種類繁多的天然的和改性的免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌法，包括γ球蛋白(IgG)溶液;直接從血液中獲得的免疫球蛋白混合物，和主要含有γ球蛋白和少于5%的其他種類的免疫球蛋白，它包括IgA，IgM和IgE;靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)，高免疫球蛋白，例如Rho(D)免疫球蛋白和B型肝炎免疫球蛋白;IgG類單克隆抗體，最好是IgG1亞類;以及IgG類人體骨髓瘤蛋白，最好是IgG1亞類。
本發明用下面的例子加以說明例1本例說明γ球蛋白溶液的巴氏滅菌法。
γ球蛋白溶液是由科恩(Cohn)餾分Ⅱ+Ⅲ制備的，這是根據科恩在J.A.C.S.Vol.68，PP.459到475(1946)上公開的科恩乙醇沉淀法進行的。餾分Ⅱ是用Kistler等在VoX Sanguinis 7，414(1962)所描述的方法得到。餾分Ⅱ被溶解并用過濾使之分離。pH調到4.0±0.3，乙醇和鹽用具有超過濾單元(M.W.C.O100000的微孔盒式系統)分離過濾除去。為了除去鹽，使溶液進一步對蒸餾水在4℃下透析60小時。蛋白質濃度用蒸餾水調到1%W/V，PH值用0.1N鹽酸調到5.0，溶液在60℃加熱10小時。
為了了解各種病毒和細菌抗體的濃度，要分析巴氏滅菌前后樣品。沒有發現任何一種抗體濃度有所降低。當試驗樣品的抗補本活性、前激肽釋放酶激活劑活性(PKA)、分子大小分布(用大小排阻色譜法)和SDS PAGE(測定蛋白質成分)時，沒有看到由于巴氏滅菌的結果而發生有害的影響。產生中不符合要求的PKA的活性實際上由于巴氏滅菌的結果而被消除了。
所得結果總結于下面表Ⅰ中表Ⅰ測定 控制 經過巴氏滅菌抗體分類 1%IVIG 1%IVIG麻疹 1∶32 1∶32流行性腮腺炎 1∶23 1∶23脊髓灰質炎類型Ⅰ 8.1μ/ml 8.1μ/ml脊髓灰質炎類型Ⅱ 9.3μ/ml 9.3μ/ml風疹 1∶182 1∶256流感bx 2.4mcg/ml 2.5mcg/ml(Hemophilus flu.bx)破傷風 1.6I.U./ml 2.4I.U./ml化學的抗補體(mg/CH50) 1.2 1.0PKA(%BOB ＃2) 4.5% 0%(前血管舒緩素激活劑)物理的大小排阻色譜法% 聚集體 ＜1% ＜1%%雙倍體 5.5% 4.4%%單倍體 93.5%-94.5% 94.6%-95.6%S降解 0 0SDS-PAGE在巴氏滅菌后沒有觀察到額外的譜帶。
例2。
本例說明靜脈注射的免疫球蛋白(IVIG)的巴氏滅菌。
一種經過真空冷凍干燥的靜脈注射的免疫球蛋白制劑，由申請人制備，沒有用化學的或酶的方法進行過予先改性的天然IgG組成，用蒸餾水再生，溶液在4℃相對于蒸餾水進行深度透析，以除去葡萄糖和鹽，用蒸餾水將蛋白質濃度降低到1%W/V，用0.1N的鹽酸將pH值調到5.0，溶液的電導為110micros(25℃)。在60℃和10小時完成巴氏滅菌。
進行下述實驗是為了確保巴氏滅菌不會對IgG產生危害。
(ⅰ)測定巴氏滅菌前后免疫球蛋白溶液在210到320nm之間的園振二向色性光譜。這些光譜是利用ORD/CD-15分光偏振計在25℃時測得的，CD兩光譜是相同的。
(ⅱ)利用Cary219Uv/vis分光光度計在240到350nm之間所測得的巴氏滅菌前后兩種溶液的紫外光譜也是相同的。
因此，作為在60℃、PH5.0和10小時條件下對該溶液進行巴氏滅菌的結果，蛋白質的三維結構并沒有出現肉眼看得見的構象變化。
如同用大小排阻色譜法所測得的那樣，聚集體的濃度由小于1%增加到巴氏滅菌后的2%，但仍然大大低于世界衛生組織(WHO)所推薦的適用于靜脈注射的免疫球蛋白溶液的5%的上限。檢測不到降解產物。
然而，巴氏滅菌前后的免疫球蛋白溶液，恢復了等滲性和中性pH值后，仍保持它們的聚集(aggregate)能力，并且當在62.5℃水浴浸泡14分鐘后，兩樣品產生大約20%聚集體(aggregate)。在巴氏滅菌后，檢測不出抗補體的活性和各種抗體的濃度有什么變化。在巴氏滅菌后PKA的濃度進一步減少到“不可檢測”的程度。
在體外，通過化驗來評價巴氏滅菌前后免疫球蛋白溶液的生物活性，這種化驗包括免疫球蛋白與補體(C1)的第一組分的結合，以及測量與Fc-受體-支撐(bearing)前單核細胞的細胞線(cellline)U937競爭性結果。已經證明在U937細胞線中Fc受體的性質在親合力和多肽的鏈結構方面與正常人體單核細胞和巨噬細胞是類似的(見Anderson，C.L.，J.Exp.Med 156 1794-1806〔1982〕)。在兩個樣品中的C1結合表示分別在6.5μM和5μM具有50%抑制的普通活性。相同的樣品，在等滲、62.5℃條件下加熱聚集14分鐘后，表明C1結合在0.0013μM和0.0035μM有50%的抑制，在與C1的結合上，增量大于100倍。
對于用非巴氏滅菌和巴氏滅菌的樣品來說在與U937Fc受體有競爭性的結合上要達到50%的抑制所需要的蛋白質的濃度是15nM和16nM。對于具有整體的Fc功能的免疫球蛋白制劑來講，這和Law等所報導的20nM的值是一致的(Molecular Immu-nology，23，331-338〔1986〕)。Gamimmune(Cutter Labs的商標)，一種還原性和烷基化的免疫球蛋白制劑，據報導，要達到同樣的效果需要兩倍多。
因此，巴氏滅菌不會使IgG對C1的結合能力有明顯的增加，并且不影響它與單核細胞和巨噬細胞的相互作用。同時，將在體外的實驗同在體內完成的實驗相互關連是困難的，這些觀察結果表明，在巴氏滅菌前后的免疫球蛋白制劑之間，在調理素的功能(通過在Fc和正常人體單核細胞以及巨噬細胞之間的相互作用)和恢復從屬于抗原結合的補體系統能力方面，沒有發現有明顯的差別。
例3本例說明Bho(D)免疫球蛋白的巴氏滅菌。
將用科恩(Cohn)乙醇分級分離法制備的和用DEAE Sephadex A50(Pharmacia Sweden)處理過的Rho(D)免疫球蛋白粉末(112g)用706ml蒸餾水溶解，溶液通過膜濾器過濾使之澄清，并通過一個SephadexC25柱(100cm×10cm)使之脫鹽。收集容隙體積所含蛋白質并將濃度稀釋為大約0.5%W/V。
用4ml1.0N鹽酸將pH調到4.9，將稀釋的溶液倒入500ml玻璃瓶中，密封并在60℃水浴中巴氏滅菌11小時。沒有檢測到抗體-D的效力降低。在巴氏滅菌前后的樣品中聚集體的濃度低于1%。沒有檢測到PKA活性，并且在巴氏滅菌后抗補體的活性沒有改變。所得結果總結于下面表Ⅱ中表Ⅱ試驗 前 后蛋白質濃度 0.5% 0.5%Anti-D濃度(mcg/ml) 45 45PKA濃度(%BOB ＃2) 1% 0.0%抗補體活性(mg/CH50) 0.15 0.15大小排阻色譜法(Pharmacia Superose 12 HR10/30)聚集體濃度 ＜1% ＜1%單倍體+雙倍體 ＞99% ＞99%降解產物 0 0
例4本例說明用巴氏滅菌使免疫球蛋白溶液中Sindbis和人體免疫缺陷病毒-1(HIV-1)失活。
(a)比較免疫球蛋白溶液中(pH4.0和脫鹽)和含有50%蔗糖、1M甘氨酸(pH7.0)抗血友病因子A溶液中的病毒失活。是使用Sindbis病毒進行的。將Sindbis病毒種菌加到1%免疫球蛋白溶液中(脫鹽和pH4.0)。將該溶液在水浴中加熱到56℃。為了檢驗病毒傳染性，分別在0.25、0.5、1.0、2.0和3.0小時取出樣品，并立即加入4.5%碳酸鈉溶液(pH8.0)加以中和。
同樣，用同樣的Sindbis病毒種菌加到含有50%蔗糖、1M甘氨酸的抗血友病因子A溶液中(pH7.0)，并在水浴中加熱到60℃。分別在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0小時取出并加以檢驗。
所得殘余病毒傳染性的結果，用組織培養傳染性劑量(TCID50)的以10為底對數來表示，總結于下面表Ⅲa中表Ⅲa樣品處理時間 Log10TCID50滴接種的IgG溶液 定度(Spiked IgG Soln) pH 7.0/4℃ 0小時 5.1(等滲的)接種的IgG溶液 pH 7.0/4℃ 0小時 4.5(脫鹽的)″ pH4.0/56℃ 0.25小時 ＜0.5″ pH4.0/56℃ 0.5小時 NVD
″ pH4.0/56℃ 1.0小時 ＜0″ pH4.0/56℃ 2.0小時 NVD″ pH4.0/56℃ 3.0小時 NVD接種的25%NSA溶液 pH7.0/60℃ 0小時 5.3(Spiked25%NSA Soln)″ pH7.0/60℃ 0.25小時 1.7″ pH7.0/60℃ 0.5小時 0.7″ pH7.0/60℃ 1.0小時 NVD″ pH7.0/60℃ 2.0小時 NVD接種的抗血友病因子A溶液 pH7.0/60℃ 0小時 5.1(Spiked Factor ⅧSoln)(50%蔗糖，1M甘氨酸)″ pH7.0/60℃ 0.5小時 2.9″ pH7.0/60℃ 1.0小時 2.3″ pH7.0/60℃ 2.0小時 ＜0″ pH7.0/60℃ 4.0小時 NVD″ pH7.0/60℃ 8.0小時 NVD注NVD等于未檢出病毒。
對于pH4.0的脫鹽免疫球蛋白溶液在56℃加熱僅0.25小時就得到最低減少4.5log10TCID50量。在2小時和3小時后，沒有檢測到病毒活性。在25%普通的血清白蛋白(NSA)溶液中，經過在60℃下的加熱后，也獲得了類似的Sindbis病毒失活率。對于加穩定劑的抗血友病因子A(FactorⅧ)溶液，通過在60℃加熱1小時后log10TCID50僅減少2.3。在60℃加熱4小時后，達到了檢測不出病毒的效果。
(b)重復進行關于人體免疫缺陷病毒-1(HTV-1)在25%NSA溶液中懸浮液的類似實驗。已經發現在25%NSA溶液中HIV的失活速率大大快于Sindbis病毒(見下面表Ⅲb)。在60℃下經過8分鐘后消除了全部8.5log10TCID50。由于在56℃的免疫球蛋白溶液中和在60℃的25%NSA溶液中Sind-bis病毒的失活速率比較低，那么有理由假定，如果免疫球蛋白溶液中存在HIV病毒的話，在60℃溫度下經過10小時巴氏滅菌后，HIV病毒的傳染性將明顯地降低。所得結果在下面表Ⅲb給出。
表Ⅲb樣品殘余HIV處理時間 log10TCID50/mlHIV接種25%NSA 60℃ 0分鐘 8.4(HIV Spiked 25%NSA)″ 60℃ 4分鐘 ＜0″ 60℃ 8分鐘 NVD″ 60℃ 60分鐘 NVD注NVD即未檢出病毒。
例5本例說明用巴氏滅菌使牛痘病毒失活。
牛痘病毒的菌種加入到1%的脫鹽免疫球蛋白溶液中，該溶液的pH值為5.4，巴氏滅菌在60℃下進行2小時。是用同樣的病毒菌種接種1%的脫鹽免疫球蛋白溶液，并在37℃下培養2小時，獲得一種正的樣品控制。殘余的病毒傳染性在已受孕的雞蛋中用滴定法測定，并用每毫升log10PFV(POCK forming units)來表示。
所得結果總結于下面表Ⅳ中。
表Ⅳ樣品處理時間 log10PFU/ml1%IgG中的牛痘病毒 pH6.8/37℃ 2小時 5.9(脫鹽)″ pH5.4/60℃ 2小時 NVD在McIlvaine中牛痘病毒 pH7.6/37℃ 2小時 6.3緩沖液″ pH7.6/37℃ 24小時 6.3注NVD即未檢測出病毒。
全部病毒的傳染性(log10PFU/ml6.3)在60℃溫度下2小時內被破壞。這種失活并不是由于存在任何可能存在的抗牛痘病毒活性，而這種抗牛痘活性可能存在于開始的免疫球蛋白溶液中。一種類似的接種(Spiked)的IgG溶液的病毒傳染性不受37℃、2小時培養過程的影響。同樣的牛痘病毒菌種在用McIlVaine緩沖液稀釋時，發現在37℃下，在超過24小時的時間內是穩定的。Hilfenhaus等在Vox Sanguinis，50，208，〔1986〕中報導過在含54%的蔗糖和1.8M甘氨酸的抗血友病因子A(Fac-torⅧ)的溶液中進行10小時巴氏滅菌后牛痘病毒傳染性減少6.2log10ID50/ml。然而，在熱處理前，樣品中全部牛痘病毒(6.7log10ID50/ml)在熱處理結束時完全失活是不能達到的。
因此，在60℃下脫鹽免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌比含有50%蔗糖和1.0至2.0M的甘氨酸的穩定的抗血友病因子A溶液巴氏滅菌，就使牛痘病毒的失活來說，更為有效。
例6本例說明單克隆抗體的巴氏滅菌。
抗淋巴細胞增多癥(lymphocytosis)促進因子(LPF，Pertussis toxin)的鼠科單克隆抗體從小鼠腹水中分離出來。該抗體屬于IgG1亞類，該抗體溶液在G-25柱上脫鹽后，收集空隙容積餾分(The Void Volume fractions)。用0.06M的鹽酸將pH調到5.0。一種正的控制樣品是通過加入0.02M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris hydrochloride)/0.12M氯化鈉、pH6.8的條件下制備的。在巴氏滅菌前后用ELISA測定抗-LPF的活性。在巴氏滅菌后，仍然不可能使在中國侖鼠卵巢(CHO)細胞中百日咳毒素失活。
所得結果總結于下面表Ⅴ中表Ⅴ抗-LPF單克隆(脫鹽)試驗 0小時 10小時/60℃蛋白質濃度 0.1mg/ml 0.1mg/mlpH 5.0 5.0抗-LPF活性 100% 60%在CHO細胞中1320(滴定度) 1320(滴定度)百日咳毒素的失活例7本例說明人體骨髓瘤IgG1、IgG2和IgG3的巴氏滅菌。
血清來自三個確診為多種骨髓瘤的病人。這三種骨髓瘤蛋白質分別屬于IgG1、IgG2和IgG3亞種。IgG用硫酸銨沉淀法和DEAE-纖維素色譜法從全部樣品中分離，如Stevenson，G.T.和Dorrington，K.J.所描述的那樣(見Biochemical Journal 118，703〔1970〕)。
被提純的那些IgG(1.5ml)在4℃下相對于蒸餾水進行深度透析。將經過透析的溶液的蛋白質濃度稀釋為0.26%W/V，并將pH用0.06M鹽酸調到4.8±0.2。樣品在60℃加熱10小時。在IgG1溶液中沒有檢測出產生聚集體(aggregate)，同時在IgG2和IgG3溶液中，經過巴氏滅菌后，發現聚集體的濃度分別為3.3%和2.7%。通過加入0.02M三羧甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris hydrochloride)和0.12M氯化鈉，pH6.8，得到三種蛋白質的正的控制樣品。這些溶液在60℃下加熱10小時。等滲的IgG1溶液不如IgG2或IgG3對于在60℃下加熱聚集敏感。事實上，發現其聚集體濃度小于1%。
等滲IgG2溶液在60℃加熱后會有24%的聚集體，而等滲的IgG3溶液已經100%地轉變為不溶的聚集體。
所得結果總結于下面表Ⅵ中表Ⅵ骨髓瘤樣品 蛋白質濃度 pH 溶液張性 聚集體%% (Tonicity) 0小時/60℃ 10小時/60℃IgG10.22 6.8 等滲的 ＜1% ＜1%IgG20.24 6.8 等滲的 ＜1% 24%IgG30.24 6.8 等滲的 ＜1% 100%IgG10.26 4.9 脫鹽 ＜1% ＜1%IgG20.26 4.8 脫鹽 ＜1% 3%IgG30.26 5.0 脫鹽 ＜1% 3%
如表Ⅵ所示，對于稀的IgG1的蛋白質濃度，無論溶液是等滲的還是脫鹽的，在加熱條件下，都沒有觀察到有聚集現象或只有很少聚集，這一結果可以和高濃度、高溫度下所得結果相比較(見下面表Ⅶ)。
例8本例說明人體骨髓瘤IgG1的巴氏滅菌。
來自具有確診了的多種骨髓瘤病人的經過提純的IgG1，如上述例子所描述。經過提純的蛋白質濃度為18.3mg/ml的IgG1溶液(1ml)在G-25柱(6cm×1cm)上脫鹽。含蛋白質的空隙容積餾份被收集并且用蒸餾水將蛋白質濃度稀釋為0.46%W/V。加入0.06M的鹽酸，將溶液pH調到5.0。通過加入0.02M的三羧甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris hydrochloride)和0.12M的NaCl、pH6.8制備正的控制樣品。樣品在65℃、70℃和75℃加熱10小時，分子大小分布分析的結果總結于下面表Ⅶ中。
這種特殊的脫鹽骨髓瘤IgG在65℃下加熱10小時后不產生聚集體。僅當這種物質在70℃下加熱10小時后出現聚集。這種在前面例子中在60℃加熱時不產生聚集體的等滲的IgG1，在65℃下加熱后，含有18%的聚集體。當在70℃或更高溫度下進行加熱時，出現了膠凝現象。
表Ⅶ樣品加熱溫度℃ 蛋白質濃度 pH 溶液張性 聚集體%(%) 0小時 10小時IgG1(65℃) 0.42 6.8 等滲 ＜1% 18%IgG1(70℃) 0.42 6.8 等滲 ＜1% 膠凝IgG1(75℃) 0.42 6.8 等滲 ＜1% 膠凝IgG1(65℃) 0.46 5.0 脫鹽 ＜1% ＜1%IgG1(70℃) 0.46 5.0 脫鹽 ＜1% 75%IgG1(75℃) 0.46 5.0 脫鹽 ＜1% 100%例9本例說明在免疫球蛋白聚集作用上離子強度的影響。
將不同量的氯化鈉加入已經深度透析的0.5%的免疫球蛋白溶液中，用2mM的鹽酸將pH調到5.0。在60℃對每一個樣品進行10小時巴氏滅菌。在巴氏滅菌后，用大小排阻色譜法(Pharmacia FPLC，Superose 12柱)測定聚集體的百分率。
所得結果總結于下面表Ⅷ中表Ⅷ樣品 所加NaCl 25℃導電率 在巴氏滅菌后，相對于不加NaCl樣品聚集體的增加 %1 0.0005mM 40micros 1%2 0.005mM 39micros 0%3 0.05mM 44micros 4%4 0.5mM 73micros 7%5 5.0mM 480micros 22%6 50.0mM 3900micros 膠凝如同從這些結果可以看到的那樣，由于加入了高于0.05mM的NaCl，使得在巴氏滅菌后聚集體形成明顯上升。加入50mM的NaCl導致指示蛋白質變性的溶液的膠凝。
從這些結果可以看出，顯然，在巴氏滅菌前，為避免免疫球蛋白溶液的聚集作用，免疫球蛋白溶液應該具有最小的離子強度。這可以通過許多物理-化學方法，例如透析法、電透析法、膠體過濾法或離子交換法來實現。
例10本例說明pH在免疫球蛋白聚集作用上的影響。
通過加入0.1N鹽酸或者0.5N的氫氧化鈉，將1%的免疫球蛋白溶液樣品的pH分別調到3.0、3.5、4.0、5.0和7.0。然后使予先調到所要求pH的樣品相對于蒸餾水進行深度透析。透析后，將每一免疫球蛋白溶液用0.1N鹽酸再調到先前所要求的pH值。原來pH為5.0、7.0的樣品不需要調節。對于每一樣品在56℃下進行9小時巴氏滅菌。
這些樣品形成聚集體的結果總結于下面的表Ⅸa中表Ⅸa樣品 pH 9小時56℃加熱后聚集%1 1%IgG溶液 3.0 43%2 ″ 3.5 15%3 ″ 4.0 5%4 ″ 5.0 ＜1%5 ″ 7.0 13%
如從表Ⅸa結果所看出的那樣，只有在pH4.0和5.0時所產生的聚集體濃度最小(＜5%)。
在1%的IgG溶液中，在pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5和6.8的情況下進行類似的實驗。溶液在60℃加熱10小時，pH值在4.0至5.5之間時，所獲得的聚集體濃度是可以接受的(＜5%)。
所得結果總結于下面表Ⅸb中表Ⅸb樣品 pH 60℃、10小時加熱后，聚集%11%IgG溶液 4.0 2%2 4.5 ＜1%3 5.0 ＜1%4 5.5 ＜1%5 6.8 34%例11本例說明在免疫球蛋白的聚集作用上蛋白質濃度的影響。
pH為4的免疫球蛋白溶液利用微孔超過濾盒式系統(100，000MWCO)相對于蒸餾水進行深度透析，以除去鹽和乙醇。得到10%W/V濃度的免疫球蛋白溶液。將這種溶液的濃度用蒸餾水稀釋為3%W/V，2%W/V和0.5%W/V。將這些溶液的pH調到4.0，并將它們在56℃下進行9小時巴氏滅菌。
所得結果總結于下面的表Ⅹ中
表Ⅹ樣品 蛋白質濃度 9小時，56℃巴氏滅菌后聚集%經透析過濾的IgG溶液 3.0% 6%″ 2.0% 4%″ 0.5% 2.6%對于3%W/V的免疫球蛋白溶液來說，聚集體的濃度最高。0.5%的溶液聚集體的濃度最低。顯然，對于要求形成最低聚集體巴氏滅菌來講較低的蛋白質濃度是最好的。
例12本例說明乙醇在免疫球蛋白聚集作用中的影響。
一種免疫球蛋白溶液，在pH5下加以深度透析。加入蒸餾水，將蛋白質濃度調到0.2%W/V。加入不同量的乙醇，使其在樣品中的濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10%V/V。在60℃進行10小時巴氏滅菌。
所得結果總結于下面表Ⅺ中表Ⅺ樣品 乙醇濃度%V/V 60℃，10小時巴氏滅菌后聚集體%0.2%IgG溶液 0.0 1.5%″ 0.1 1.0%″ 0.2 1.0%″ 0.5 2.0%″ 1.0 2.6%″ 2.0 4.5%
″ 5.0 20.7%″ 10.0 31.7%表Ⅺ所列聚集體形成數據表明乙醇濃度高于0.5%V/V引起明顯的IgG分子的聚集。
例13本例說明利用酶污染的巴氏滅菌來減少免疫球蛋白溶液的污染物。
可能存在于免疫球蛋白制劑中的酶污染物主要是通過巴氏滅菌來減少。在前激肽釋放酶活化劑(PKA)的活性和未活化的促凝血酶致活酶時間(non-activated Partial Thromboplastin Time)(NAPTT)上的影響總結于下面表Ⅻ中表Ⅻ 結果試驗 樣品 加熱處理(HT) 熱處理前 熱處理后PKA活性 1%VIG pH5/60℃/10小時 4.5% 0%(%BoB＃2)PKA活性 5%Rho(D) pH4/37℃/48小時 28% 3%(%BoB＃2)NAPTT 1%Rho(D) pH5/60℃/10小時 ＜44秒 103秒(控制時間151秒)巴氏滅菌消除了在1%靜脈注射免疫球蛋白溶液中的PKA活性。甚至在pH4、37℃和48小時的處理，顯著地將PKA的濃度從28%減少到3%。1%Rho(D)的NAPTT在巴氏滅菌后顯著地從少于44秒延長到103秒。這表示在制劑中存在的凝血劑活性減少了。
綜上所述，本發明提供了一個新穎的、予料不到的用于免疫球蛋白溶液巴氏滅菌方法。這種巴氏滅菌使各種病毒失活，減少酶活性而不引起聚集或損失生物制劑活性。在本發明范圍內還可以作進一步的改進。
權利要求
1.一種免疫球蛋白水溶液的巴氏滅菌方法，其特征在于在大約35℃到大約75℃的溫度下、在大約3.5到大約6.5的PH值和在低離子強度下對該溶液加熱足夠長的時間，該時間要足以使對該溶液的巴氏滅菌能使該水溶液中所存在的病毒失活，同時又保留免疫球蛋白的生物制劑活性，并不產生高于5%的免疫球蛋白聚集作用。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述離子強度小于0.05mM氯化鈉水溶液所具有的離子強度。
3.根據權利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白溶液的蛋白質濃度小于大約2%W/V。
4.根據權利要求
1至3的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述溫度為大約50℃到大約60℃。
5.根據權利要求
1至4的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述溶液的PH值為大約4至大約6。
6.根據權利要求
1至5的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述溶液的乙醇含量小于5%V/V。
7.根據權利要求
1至6的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白水溶液是γ-球蛋白水溶液。
8.根據權利要求
1至6的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白水溶液是靜脈注射免疫球蛋白或超免疫免疫球蛋白。
9.根據權利要求
1至6的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白水溶液是IgG種或IgG1亞種單克隆抗體。
10.根據權利要求
1至6的任意一項權利要求
所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白水溶液是IgG種或IgG1亞種人體骨髓瘤蛋白質。
專利摘要
病毒失活而又不使IgG分子及其生理活性有明顯改變的免疫球蛋白溶液的巴氏滅菌法，通過在低離子強度下和中等酸度的pH值下將這種溶液加熱到中等高度的溫度來實現，它不需任何穩定劑而且具有極小的聚集作用。
文檔編號A61K38/16GK87101294SQ87101294
公開日1988年7月6日 申請日期1987年11月25日
發明者安東尼·A·馬格年, 華保誠, 保羅·丹尼斯 申請人:康諾特實驗室有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan