神經肽y激動劑的制作方法

專利名稱：神經肽y激動劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及在調節神經元釋放生理活性物質的特異性神經肽酪氨酸(NPY)受體處模擬NPY某些生物活性的肽。這些受體通常位于神經效應器接點處的神經元上，并在一些組織和物種中分類為NPY Y2受體亞型。另外，本發明還涉及包括這些肽作為活性組分的藥物組合物以及包括給藥這些組合物的治療方法。
神經元接點前NPY受體的活化通常抑制神經活性，降低神經遞質在對神經沖動之反應以及對起釋放神經遞質作用的局部因子之反應中神經遞質的釋放(Wahlestedt等人，1986)。
含NPY之神經元存在于各物種包括人的鼻粘膜中，通常與腺泡(glandular acini)和血管有關(Baraniuk等人，1990；Grunditz等人，1994)。對狗鼻粘膜副交感神經(翼管神經)的刺激可增加該區域的血流，該作用的主要部分是阿托品耐受性的。靜脈內給藥NPY由于副交感神經的刺激降低血管舒張，NPY Y1-選擇性激動劑[Leu31，Pro34]不能模擬該作用，但是給藥NPY Y2-受體激動劑N-乙酰[Leu28，Leu31]NPY(24-36)則可模擬該作用(Lacroix等人，1994)。這與接點前NPY Y2樣受體介導的抑制神經遞質由副交感神經釋放是一致的。
接點前或神經肽YY2受體分類是基于肽YY(13-36)的作用，但是在許多系統中，該分子以及神經肽Y(13-36)確實具有加壓活性(Rioux等人，1986；Lundberg等人，1988；Potter等人，1989)。有人對該現象進行了解釋，指出在一些血管床中在接點后膜上有兩種神經肽Y受體類型(神經肽YY1和神經肽YY2)(Schwartz等人，1989)。但是，這些分子缺乏選擇性可能是由于對Y1受體之部分激動劑活性的保留，這使得它們引起功能降低的反應。我們已事先描述了神經肽Yj的13-36類似物——(Leu17，Glu19，Ala21，Ala22，Glu23，Leu28，Leu31)神經肽Y-(13-36)(ANA神經肽Y-(13-36))，其在體內研究中表現出與整個神經肽Y分子等同的接點前活性(Potter等人，1989)。但是，該類似物仍保留明顯的加壓活性，或者神經肽YY1受體介導的相互作用。
我們已事先描述了在抑制心迷走神經作用方面模擬神經肽Y之作用但沒有加壓作用的神經肽Y類似物。用一個類似物——N-乙酰[Leu26，Leu31]神經肽Y-(24-36)進行了結合研究，其結果是一致的，該研究表明與在人成神經細胞瘤細胞系SMS-KAN上表達的神經肽YY2受體亞型具有明顯的親和性，但是對在人細胞系SK-N-MC上表達的神經肽YY1受體類型沒有親和性(Potter等人，1994)。另外，該類似物不刺激在成纖維細胞中表達之人神經肽YY1受體誘發胞液鈣的增加，但是該受體應答完整的神經肽Y。
因此，在本發明的第一方面中，其包括具有以下式的神經肽Y受體的配體
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15其中X1是H、R1-CO或者一個或兩個天然氨基酸，X2是Leu、Ile、Val、Nle、Sar、Gly、Ala、Aib、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-Ala或D-Nle；X3是Arg、Lys、Orn、Ala、Dbu、或His；X4是His、Lys、Arg、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X5是Tyr、Phe、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X6是Leu、Ile、Val、Ala、Arg或Nle；X7是Asn、Ala或Gln；X8是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X9是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X10是Thr、Ala或Ser；X11是Arg、Lys或Orn；X12是Gln、Pro或Asn；X13是Arg、Lys或OrnX14是Tyr、Phe、His、Trp、D-Tyr、D-Phe、D-His或D-Trp；X15是OH、NH2、NHR2、NR3R4或者一個或兩個其端氨基酸是正常或酰胺形式的天然氨基酸，其中R1、R2、R3和R4獨立地是直鏈、分枝或脂環結構的烷基；而且X2-X10中至少一個是Ala。
以上縮寫為Sar肌氨酸或N-甲基甘氨酸；Aib氨基異丁酸；Orn鳥氨酸；Dbu二氨基丁酸。
在一個優選實施方案中，X2、X4、X5、X8和X9中至少兩個是Ala。在一個特別優選的實施方案中，X2和X5是Ala。
在一個特別優選的實施方案中，R1是選自甲基、乙基、正丁基、叔丁基、環己基或具有10個或更少碳原子的其他烷基的烷基。
在進一步優選的實施方案中，R2、R3和R4是獨立地選自甲基、乙基、異丙基、正丁基、環己基或具有10個或更少碳原子的其他烷基的烷基。
在本發明進一步優選的實施方案中，所述配體是Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Ala-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Ala-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Leu-Tyr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Aib-Leu-Asn-Ala-Aib-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Lys-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Lys-Gln-Lys-Phe-NH2；或丁酰基-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-DTyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Gln-Ile-Leu-Ser-Arg-Asn-Arg-Tyr-NH2。
在本發明的優選實施方案中，神經肽Y受體是神經肽YY2樣受體。術語“神經肽YY2樣受體”是指具有與人神經肽YY2受體共同藥理學特性的受體。此等受體可調節神經遞質如乙酰膽堿和去甲腎上腺素的釋放，并可調節效應子從傳感神經的釋放。一些NPY受體亞型如Y5可被在NPYY2受體處高效力但在NPYY1處低效力的配體活化(Gerald等人，1996)，并因而是Y2樣的。在最優選的實施方案中，所述受體是神經肽YY2受體。
本發明的配體可為多聚體的形式，例如他們可以是二聚或三聚體的形式。
本發明領域中的普通技術人員可以理解的是，在不嚴重損壞肽的生物活性的情況下，還可對本發明的肽進行各種的修飾。這可通過各種改變來實現，如在肽序列中所述改變不實質上降低肽的生物活性的保守性或非保守性的插入或取代。
在此所認為的修飾可包括但不限于對側鏈的修飾、在肽合成期間加入非天然氨基酸和/或他們的衍生物以及使用交聯劑和其他可在肽上產生構象限制的方法。
本發明范圍內的側鏈修飾的例子包括通過與醛反應、然后用NaBH4還原由還原性烷基化來修飾氨基；用N-甲基乙酰胺的酰胺化；用乙酸酐的乙酰化；用氰酸鹽對氨基進行氨甲基酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進行三硝基芐基化；用琥珀酸酐和鄰苯二甲酸酐使氨基酰化；以及用吡多醛-5′-磷酸酯、然后用NaBH4還原使賴氨酸吡多醛化。
精氨酸基的胍基可如下進行修飾用如2，3-二丁酮、苯基乙二醛和乙二醛等試劑形成雜環縮合產物。
羧基可如下進行修飾通過形成O-酰基異脲進行碳二亞胺活化，然后進行衍生化，如形成相應的酰胺。
色氨酸基可如下進行修飾用N-溴代琥珀酰亞胺進行氧化或者用2-羥基-5-bitrobenzyl溴或硫苯基(sulphenyl)鹵化物對吲哚進行烷基化。另一方面，酪氨酸可通過用四硝基甲烷進行硝基化形成3-硝基酪氨酸衍生物來改變。
組氨酸基的咪唑環的修飾可如下進行用碘代乙酸衍生物進行烷基化或者用二乙基焦碳酸酯(pyrocarbonate)進行N-乙酯基化。
在肽合成期間加入非天然氨基酸和衍生物的方法包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構體。
作為進一步的例子，可在本發明中用其他具有疏水性側鏈的非天然氨基酸替代X14上的殘基，如Cha(β-環己基-L-丙氨酸)、Nal(β-(2-萘基)-丙氨酸)、Phg(L-苯基甘氨酸)、Tic(L-1，2，3，4-四氫異喹啉3-羧酸)、Thi(β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸)、或他們的D-異構體，但不實質上改變生物活性。
也可在本發明的肽上添加各種基團，以增加有利的性質如增加效力或者延長體內半衰期，而不實質上降低肽的生物活性。對本發明肽進行的此等修飾不導致生物活性的降低，這些修飾也被認為是在本發明的范圍之內。
本發明的配體可用于治療以下病癥——與炎癥有關的病癥(如鼻腔炎癥、鼻炎包括過敏性和血管舒張性的、哮喘、關節炎)；——與神經原炎癥有關的病癥(如偏頭痛、頭痛、眼的炎癥、鼻炎等)；——鼻炎-血管舒張性鼻炎；——呼吸疾病(如肺充血、哮喘、上呼吸道炎癥)；——睡眠紊亂；——與交感神經活性增強有關的病癥；——與性功能障礙和生殖疾病有關的病癥；——與心臟、血管或者腎系統有關的疾病(如血管痙攣、心衰竭、休克、心肥大、血壓升高、心絞痛、心肌梗塞、突然心死亡、心率失常、周圍血管疾病、腎衰竭等)；——與交感神經活性增強有關的病癥(如冠狀動脈手術以及胃腸道的手術期間或之后)；——腦疾病以及與疼痛或傷害性知覺有關的疾病；——與中樞神經系統有關的疾病(如腦梗塞、神經變性、癲癇、中風、腦血管痙攣、抑郁、焦慮或癡呆)；——與非正常胃腸道運動和分泌有關的疾病(節段性回腸炎)；——影響泌尿生殖系統的疾病和病癥(如尿失禁)；——非正常飲食攝入疾病(如肥胖、厭食、食欲過盛)。
在第二方面中，本發明包括用于緩解鼻腔充血或者治療易于引發急性腎衰竭的血管收縮癥、抗高血壓、心血管疾病、與肺充血有關的病癥、炎癥、神經原性炎癥、睡眠紊亂、與交感神經活性增強有關的病癥、與中樞神經系統有關的疾病、與疼痛或傷害性知覺有關的病癥、與胃腸道運動和分泌有關的疾病、肥胖、或阿爾茨海默氏病、或者作為抗精神病藥的組合物，該組合物包括本發明第一方面的肽以及藥物學載體。
本發明的第三方面包括用于在患者中緩解鼻腔充血、減輕心迷走神經作用、治療易于引發急性腎衰竭的血管收縮癥、高血壓、心血管疾病、與肺充血有關的病癥、炎癥、神經原性炎癥、睡眠紊亂、與交感神經活性增強有關的病癥、與中樞神經系統有關的疾病、與疼痛或傷害性知覺有關的病癥、與胃腸道運動和分泌有關的疾病、肥胖、或阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括向患者給藥有效劑量的本發明第二方面的組合物。
在本發明的第三方面中，優選的是患者患有鼻腔充血、肺充血或者易于引發急性腎衰竭的血管收縮癥。在進一步優選的實施方案中，將該組合物以噴霧劑給藥。
活性化合物可以常規方式給藥，例如口服、靜脈內(水溶性的)、肌肉內、皮下、鼻腔內、皮內或者栓劑或植入(如使用緩釋分子)。也可吸入(干粉或在溶液中)至肺中。取決于給藥途徑，活性成分需要包衣在合適材料中，以保護所述成分避免酶、酸以及其他可使該成分失活的自然條件的作用。例如，肽的低親脂性可使他們在胃腸道中被能夠斷裂肽鍵的酶或者在胃中被酸解破壞。為以經胃腸道給藥，他們可進行包衣，或者與防止他們失活的物質一起給藥。例如，肽可在溶劑中、脂質體中、或者與酶抑制劑一起給藥。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟代磷酸酯(DFP)以及抑肽酶。脂質體包括油包水型乳劑以及常規的脂質體。
活性化合物也可非經胃腸道給藥。也可在甘油、聚乙二醇、以及他們的混合物和油中制備分散液。在常規條件下儲藏和使用時，這些制劑包括防止微生物生長的防腐劑。
適用于注射給藥的藥物劑型包括無菌水溶液(是水溶性的)或者分散液和無菌粉末，該粉末可由于立即制備無菌注射溶液和分散液。在所有情況下，所述劑型必須是無菌的，而且是可流動的，其流動程度使得易于注射。其在制造和儲藏的情況下必須是穩定的，而且能夠防止微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或者分散介質，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、聚丙二醇、液體聚乙二醇等)、他們的合適混合物以及植物油。例如使用包衣如卵磷脂、在分散液時保持所需的粒徑、以及使用表面活性劑，由此可保持適當的流動性。可用各種抗菌劑和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、壞血酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在許多情況下，優選包括等滲劑如蔗糖和氯化鈉。在組合物中使用延遲吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠，可延長注射組合物的吸收。
可在活性化合物中摻入所需量的合適溶劑以及其他需要組分，然后過濾滅菌，由此制備無菌注射液。通常情況下，將各種無菌組分摻入在無菌載體中，所述載體包括基本的分散介質和所需的其他組分，由此可制備分散液。在使用粉末或者用粉末制備無菌注射液時，優選的制備方法是真空干燥和凍干法，這些方法可從以前的無菌過濾溶液制得活性組分以及任何其他所需組分的粉末。
為使本發明更易于理解，以下將參考實施例和附圖來描述其優選實施方案。在附圖中

圖1顯示了Ac[Ala24，Ala27，Leu28，Leu31]NPY(24-36)對電刺激腎交感神經誘發的鼠腎血管耐受性增加的作用。材料和方法體內在成年鼠(Wistar)(250-350g)上進行試驗，雄性和雌性都有，用戊巴比妥鈉(Nembutal，Boehringer-Ingelheim；60mg/kg，i.p.)麻醉。對氣管進行插管處理，并使動物進行人工通氣。在股靜脈插管，以給藥肽和進一步劑量的麻醉劑。在左股動脈中插管，以記錄動脈壓。切斷迷走神經，以消除迷走神經介導的對心臟的反射作用，該作用在用神經肽Y升高血壓時會發生。使用獨立的方形波刺激儀(GrassInstruments)，每30秒用6秒連續的超大刺激(2Hz，1ms；7V)刺激右迷走神經的心端。選擇頻率以將脈搏間隔增加100ms，在該變化上產生次最大作用。用針式電極測量心電圖，并在示波器的一個通道上進行監測。啟動ECG，一跳一跳地記錄脈搏間隔(連續心跳之間的間隔)。在鋼筆記錄儀上記錄脈搏間隔和動脈壓。
由所有鼠的數據繪制劑量-反應曲線。因為測試肽的作用時間長，并沒有將所有的肽都給至各鼠。但是，各鼠通常接受神經肽Y和兩個其他肽。
作為接點前活性的指示，測量兩個參數對注射肽后刺激迷走神經引發的脈搏間隔增加的最大百分抑制以及該作用半恢復的時間(T50)。對于加壓作用，其是接點后活性的指示，也測量兩個參數注射肽后峰值加壓反應和血壓增加的持續時間。這些指標給出了肽在接點前和接點后位置處作用的可靠量度，而且以前已被用于為此目的的試驗中(Potter等人，1989；Potter等人，1991)。使用單路ANOVA分析結果。腎血流試驗(體內)的方法在六條重量在18-26kg之間的成年mongrel狗上進行試驗，雄性和雌性狗都有。通過藥團注射戊巴比妥鈉(36mg/kg，靜脈內，Nembutal，Boehringer Ingelheim)使狗麻醉，然后保持輸液(2-3mg/kg/hr)。使動物人工通氣，保持恒定的溫度和血壓，并連續地監測心率。
腹膜后暴露左腎，并使用超聲流動探測儀(Transonic System Inc.，N.Y.)連續地監測動脈血流(Pemow & Lundberg，1989a)。分離、切斷通向腎的節后神經，并放置在用于刺激的雙極鉑電極上(1-10Hz，5-10V，1-5msec)。已表明去甲腎上腺素和神經肽Y共存于腎中，并且在刺激腎神經時一起釋放(Pemow & Lundberg，1989b)。
在一定范圍的頻率(1-10Hz)中刺激腎神經30秒，然后繪制頻率—反應曲線。在流動峰值變化時測量反應。在團塊給藥NPY Y2受體激動劑(40mol/kg)前和后檢查這些頻率—反應關系。以血管耐受性報告反應。結合試驗(體外)的方法細胞培養從ATCC得到表達人Y1受體的SK-N-MC細胞和表達人Y2受體的SMS-MSN細胞。他們在1∶1 DMEM∶Ham F12培養基(ICN)中培養，所述培養基中包含10％胎牛血清、0.1％非必須氨基酸、0.2mM谷氨酰胺、和0.056％碳酸氫鈉。刮取融合細胞，將沉淀物儲藏在-80℃下。在使用當天將細胞融化，在結合緩沖鹽水中洗滌一次，由22ga針中通過數次，然后使用bicinchoninic酸(BCA kit，Pierce)測定蛋白質含量。調節細胞體積，使蛋白質濃度為200-400μg/ml(SMS-MSN細胞)或者400-800μg/ml(SK-N-MC細胞)，然后添加BSA和蛋白酶抑制劑。受體結合測定在Multiscreen FC板(Millipore)中進行受體結合測定(Gregor等人，1996)，在4℃下用0.5％PVP/0.1％Tween-20過夜預包衣(Scott等人，1995)，以防止非特異性結合。僅在使用前過濾板，并用50mMTris-HCl pH7.4/0.1％BSA洗滌兩次。將總體積為200μl的30pMNPY(Amersham)、競爭劑(10pM-1μM)和細胞(10μg SMS-MSN或者20-40μg SK-N-MC)在室溫下培養于結合緩沖液中2.5小時，該緩沖液包括50mM Tris-HCl pH7.4、115mM NaCl、15mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4、1.25mM KH2PO4、25mM NaHCO3、10mM葡萄糖、0.1％BAS、4mg/ml桿菌肽、和0.5mM PMSF(Tschopl等人，1993)。過濾終止結合。過濾器用2℃下200μl體積的50mM Tris-HClpH7.4/0.1％BSA通過快速過濾洗滌過濾器兩次，然后在LKBγ計數器中計數。使用單點擬合函數通過非線性回歸分析特異性結合(GraphadPrism)。在1μM競爭劑存在下進行結合，由此定義非特異性結合。肽合成和純化用標準的Boc或者Fmoc固相化學合成肽酰胺。
使用聚苯乙烯基MBHA樹脂進行Boc合成。使用甲醇中的乙酸酐在合成結束時進行乙酰化。用包含氟化氫的苯酚(1.3g-10ml)作為清除劑斷裂肽，然后抽提至含水相(30％乙腈水溶液v/v)。用醚洗滌清除劑，然后凍干粗抽提物水溶液，得到粗肽。在斷裂過程中除去各氨基酸的側鏈保護基。用離子交換和反相HPLC(高壓液相色譜)純制肽至95％。
使用tentagel SRAM樹脂進行Fmoc合成。使用AcONSu(乙酸的N-琥珀酰亞胺基酯)在最后一輪進行乙酰化。用包含95％TFA的硫代肌醇和p-甲酚作為清除劑來斷裂肽，并抽提至包含30％乙腈的含水相中。用醚洗滌清除劑，然后凍干粗抽提物水溶液，得到粗肽，用離子交換和反相HPLC純制該粗肽至95％。用電噴射質譜分析肽的氨基酸組成以及正確的分子離子。用分析性HPLC和CE(毛細管電泳)估測純度。所有帶正電荷的肽以乙酸鹽的形式存在，而所有樣品中的肽含量使用Picotag氨基酸分析法在Pierce標準的基礎上確定。結果和討論根據氨基酸24-36所包括之區域中的神經肽Y的氨基酸序列，已合成了新型肽并測試了體內活性。
在鼠體內測試的所有分子中，只有NPY劑量依賴性地明顯升高血壓。在測試劑量中其他化合物中沒有一個明顯改變血壓。這說明缺乏對與升高血壓有關的神經肽Y受體——Y1受體亞型的直接作用。
由于迷走神經的電刺激，給藥表1中所列的所有化合物都劑量依賴性地抑制心率降低。明顯的是，在Ac[Leu28，Leu31]NPY(24-36)中于24-31的任何位置上的Ala取代都導致作為迷走神經刺激心率之作用的抑制劑的效力增強(EC50下降)。該迷走神經刺激作用的抑制表明由交感神經使心臟受神經支配的乙酰膽堿釋放降低，并歸因于對NPYY2受體的刺激(Potterr等人，1994)。在24-31位的Ala取代都與NPYY2受體的高親合性以及對NPYY1受體的低親合性有關(表1)。出乎意料之外的是，在抑制迷走神經介導之心率降低的體內活性與Y2受體的親合性之間沒有直接的相關關系，而這可說明一些化合物的體內穩定性增加。在Ac[L28，L31]NPY24-36之8-13氨基酸殘基的任何一個位置上的Ala取代可增加生物活性，這是非常令人意外的。更令人驚奇的發現是，產生如Ac[A24，A27，L28，L31]NPY24-36、Ac[A26，A27，L28，L31]NPY24-36以及Ac[A24，26，27，30，31，L28，L31]NPY24-36之化合物的多個Ala取代也可增強Y2受體處的體內活性。13的5個殘基可被Ala替代，這意味著在這些位置(24，26，27，30，31)上相對較長的側鏈對保持NPY Y2受體的效力或親合性并不是必須的。這是令人驚奇的，因為替代的氨基酸殘基在結構和性質上是不同的，兩個是芳香性(His，Tyr)，一個帶有羧酰胺側鏈，其余的除Ala外帶有3個碳原子的脂族側鏈。而且，多Ala取代化合物NPYY2受體處的親合性與Ac[L28，L31]NPY24-36的類似或者比它更好，雖然Leu24或His26僅被Ala取代導致親合性明顯降低。此等活性的保持或增強是不可預測的。估測了包含多Ala的化合物Ac[A24，A27，L28，L31]NPY24-36抑制由腎神經刺激引發的腎血管耐受性增加的能力。40nmol劑量的該化合物對循環沒有直接的作用(表1)，幾乎完全抑制神經刺激的作用(圖1)，這證明抑制了神經遞質從受刺激神經中的釋放。該化合物對NPYY2受體具有高親合性，因為雖然受體介導的抑制神經遞質從腎神經中釋放的作用尚未被鑒定，但他們的特征是Y2樣的。表1一系列肽的體內活性(麻醉鼠在脈搏間隔(P1在Y2樣受體處的活性)和血壓(BP在Y1受體處的活性)上的變化)以及體外對Y1和Y2受體的親合性
+對10nmole劑量無反應。
體內觀察表明，這些化合物具有抑制神經遞質從交感神經和副交感神經中釋放的普通能力，而且希望該化合物在需要抑制任何類型的神經遞質的情況中都有能力。希望抑制神經遞質的情況的例子包括如鼻腔充血、肺充血和神經原性炎癥的病癥。
本領域的技術人員應認識到，在不偏離已描述之本發明的實質和范圍的情況下，還可對本發明進行各種的改進和/或變化。因此，本發明的實施方案僅是示例性的，而不是限制性的。
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權利要求
1.一種具有以下式的神經肽Y受體的配體X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15其中X1是H、R1-CO或者一個或兩個天然氨基酸，X2是Leu、Ile、Val、Nle、Sar、Gly、Ala、Aib、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-Ala或D-Nle；X3是Arg、Lys、Orn、Ala、Dbu、或His；X4是His、Lys、Arg、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X5是Tyr、Phe、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X6是Leu、Ile、Val、Ala、Arg或Nle；X7是Asn、Ala或Gln；X8是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X9是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X10是Thr、Ala或Ser；X11是Arg、Lys或Orn；X12是Gln、Pro或Asn；X13是Arg、Lys或Orn；X14是Tyr、Phe、His、Trp、D-Tyr、D-Phe、D-His或D-Trp；X15是OH、NH2、NHR2、NR3R4或者一個或兩個其端氨基酸是正常或酰胺形式的天然氨基酸，其中R1、R2、R3和R4獨立地是直鏈、分枝或脂環結構的烷基；而且X2-X10中至少一個是Ala。
2.如權利要求1所述的配體，其中，X2、X4、X5、X8和X9中至少兩個是Ala。
3.如權利要求1或2所述的配體，其中，X2和X5是Ala。
4.如權利要求1-3之一所述的配體，其中，R1是選自甲基、乙基、正丁基、叔丁基、環己基或具有10個或更少碳原子的其他烷基的烷基。
5.如權利要求1-4之一所述的配體，其中，R2、R3和R4是獨立地選自甲基、乙基、異丙基、正丁基、環己基或具有10個或更少碳原子的其他烷基的烷基。
6.如權利要求1-5之一所述的配體，其以下式Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Ala-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Ala-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Ag-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Aib-Leu-Asn-Ala-Aib-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Lys-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Lys-Gln-Lys-Phe-NH2；或丁酰基-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-DTyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Gln-Ile-Leu-Ser-Arg-Asn-Arg-Tyr-NH2。
7.如權利要求1-6之一所述的配體，其中，所述神經肽Y受體是神經肽YY2樣受體。
8.如權利要求1-7之一所述的配體，其中，所述神經肽Y受體是神經肽YY2受體。
9.一種用于治療降低神經遞質釋放對其有益的病癥、特別是緩解鼻腔充血或者治療易于引發急性腎衰竭的血管收縮癥、抗高血壓、心血管疾病、與肺充血有關的病癥、炎癥、神經原性炎癥、睡眠紊亂、與交感神經活性增強有關的病癥、與中樞神經系統有關的疾病、與疼痛或傷害性知覺有關的病癥、與胃腸道運動和分泌有關的疾病、肥胖、或阿爾茨海默氏病、或者作為抗精神病藥的組合物，該組合物包括如權利要求1-8之一所述的配體以及藥物學載體。
10.一種用于在患者中緩解鼻腔充血、減輕心迷走神經作用、治療易于引發急性腎衰竭的血管收縮癥、高血壓、心血管疾病、與肺充血有關的病癥、炎癥、神經原性炎癥、睡眠紊亂、與交感神經活性增強有關的病癥、與中樞神經系統有關的疾病、與疼痛或傷害性知覺有關的病癥、與胃腸道運動和分泌有關的疾病、肥胖、或阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括向患者給藥有效劑量的如權利要求1-8之一所述的配體。
11.一種用于緩解患者中鼻腔充血的方法，該方法包括向患者給藥有效劑量的如權利要求1-8之一所述的配體。
12.如權利要求11所述的方法，其中，所述組合物是經鼻腔給藥的。
全文摘要
本發明涉及得自于NPY24－36氨基酸序列的丙氨酸取代的神經肽Y受體配體。該配體可用于例如治療鼻炎、呼吸疾病以及易于導致急性腎衰竭的血管收縮癥。
文檔編號A61P3/04GK1322212SQ97197106
公開日2001年11月14日 申請日期1997年6月5日 優先權日1996年6月5日
發明者埃麗卡·波特 申請人:派普泰克有限公司, Crc生藥研究有限公司