專利名稱：肝素或硫酸乙酰肝素與脫乙酰殼多糖結合用于預防或治療由皰疹病毒引起的感染的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于制備可用于預防或治療由皰疹病毒引起的感染的藥物的特定硫酸化的多陰離子的葡糖氨基聚糖(glucoseaminoglycans)的用途。發明背景皰疹(Herpes)是一個通用名稱，它指一個屬的病毒，這些病毒在哺乳動物包括人中引起傳染性疾病。與大多數傳染相反，皰疹病毒常產生潛伏感染，因此它在中樞神經系統的神經根潛伏存在，從而在受到某些未知因素激活的情況下引起活動的疾病。目前還沒有方法來治療這類感染。激活該疾病的因素也幾乎是未知的，但據信緊張、發燒、月經、陽光等都可以引起病毒的激活。從實踐觀點來看，皰疹病毒一般引起作為主要癥狀的皮疹。
已知有兩種主要類型的單純皰疹病毒，引起口部皰疹的HSV-1，和引起生殖器皰疹的HSV-2。在約10％的群體中，這些疾病引起反復的皮膚病痛及粘膜損傷。該病的疼痛和對外貌的影響是大多數患者主要關心的問題，于是消除疼痛及更快速康復是現有技術的主要進展方向。實質上要注意到的是在大多數患者中康復是自然發生的，因此努力的一個主要目標應當是加速康復的過程并提供止痛效果。發明簡述本發明就其主要目的而言是提供一種用于預防或治療由皰疹病毒引起的哺乳動物，包括人的傳染病的新技術。
本發明的另一個目的是提供用于制備用于該治療或預防的活性成分的新組合。
本發明的再一個目的是提供一種治療由皰疹病毒在哺乳動物，包括人中引起的感染的方法。
從本發明下述的公開中這些和其它目的將會清楚起來，本發明提供的新技術在于使用肝素或硫酸乙酰肝素與脫乙酰殼多糖結合以制備用于預防或治療由皰疹病毒在哺乳動物，包括人中引起的傳染病的藥物。
在這種應用中，優選根據肝素和脫乙酰殼多糖的結合來制備所說的藥物。
肝素和硫酸乙酰肝素都是市場上可從許多生產商買到的。只要其能保持生物活性基本不被改變，那么這些成分的部分水解形式也是可以使用的。
用于預防或治療由皰疹病毒引起的傳染病的藥物可以是各種物理形式的，例如粉末、軟膏、糊劑、凝膠、懸浮液或溶液。所用的形式當然應當適應于所要治療的疾病的性質。
本藥劑中的一個主要成分是由β-D-氨基葡糖本體構成的線性1,4結合的多糖，即多糖脫乙酰殼多糖。脫乙酰殼多糖由幾丁質N-脫乙酰化制備而來，幾丁質是形成具外骨骼昆蟲和貝殼的外殼的多聚物。市場上的幾丁質是從組成漁業廢物的蟹和蝦殼回收而來。通過調節幾丁質的堿處理可制備乙酰化程度各不相同的脫乙酰殼多糖。當以堿，例如氫氧化鈉處理時，發生了N-脫乙酰作用，其中乙酰氨基被轉換成氨基，于是就形成了脫乙酰殼多糖。
根據N-乙酰化程度、分子量及均一性，決定脫乙酰殼多糖的物理性質影響其應用的。脫乙酰殼多糖是可生物降解的，它可被來源于消化系統的幾丁質酶及體液中的溶菌酶降解。
在本發明中優選使用N-乙酰化程度至多約為90％的脫乙酰殼多糖，更優選至多為50％。尤其優選N-乙酰化程度小于25％。
本發明中涉及的藥物的兩個主要成分，肝素或硫酸乙酰肝素及脫乙酰殼多糖適于與可藥用的常規載體或賦形劑一起結合使用。更一般地優選該基質是液體基質，同時載體或賦形劑可含有增加粘度的多糖，該多糖可選自半纖維素，例如阿拉伯糖基木聚糖及葡甘露聚糖、植物膠，例如瓜耳膠、locust bean膠，纖維素及其衍生物，例如甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧基甲基纖維素、淀粉及淀粉衍生物，例如羥基乙基淀粉或交聯淀粉、微生物多聚糖，例如xanthan膠、curdlan、支鏈淀粉、葡聚糖。還有藻多糖(algi polysaccharides)，例如瓊脂糖、角叉膠、藻酸都可用來作為載體或賦形劑的成分。
在載體或賦形劑中優選使用的多糖是纖維素衍生物，例如甲基纖維素。
對所希望的藥物來說，優選增稠的多糖與所說脫乙酰殼多糖的總重量不超過藥物總重量的10％。
藥物的優選物理形式是凝膠形式的，并且在這樣凝膠形式的藥物中，所說的多糖和脫乙酰殼多糖的結合量根據藥物總體重量來說優選在0.5到約5％的范圍內。
藥物中所說的肝素和硫酸乙酰肝素優選占重量的約0,1到2％。
本發明還提供了一種方法，用于預防或治療在哺乳動物，包括人中由皰疹病毒引起的傳染病。該方法包括將活性量的含有肝素或硫酸乙酰肝素與脫乙酰殼多糖聯用的藥物施用于需要治療的部位。實施例本發明將在下面的公開中與非限定性實施例一起進行描述。如果不另加說明，那么所說實施例中的部分與百分比都指的是重量。該說明是結合附圖
進行的，其中對用于說明藥物全部以及缺少一到兩種成分的組合物5種不同組合物，以HSV-1噬斑效應對該5種不同組合物的連續樣品稀釋度進行了作圖。實施例1-全藥(Complete medicanent)制備將具有N-脫乙酰化程度為16％的脫乙酰殼多糖的鹽酸鹽(PronovaBiopolymers,Dramen,Norway)溶于無菌過濾的蒸餾水中以形成3％的脫乙酰殼多糖溶液。
制備含濃度為4克/升的含甲基纖維素的天然肝素的0.6％溶液。
將兩種溶液進行高壓滅菌并在無菌條件下以等量混合。以抗真菌的量加入山梨酸作為防腐劑。實施例2以類似方法制備實施例1的組合物，但除去山梨酸。實施例3以類似方法制備實施例1的組合物，但排除了山梨酸與肝素。實施例4以類似方法制備實施例1的組合物，但這次排除了山梨酸與脫乙酰殼多糖。實施例5
以類似方法制備實施例1的組合物，但這次除了山梨酸和肝素，還排除了脫乙酰殼多糖。實施例6-實驗方法實驗中所用的稀釋劑是等滲NaCl(0.136摩爾/升)及伊格爾氏極限必需培養基(EMEM)。所用的病毒是HSV-1，菌株KOS321。
在24孔板上稀釋樣品。將1毫升的樣品與1毫升的等滲NaCl混合，然后在等滲NaCl中進行連續二倍的稀釋直至1∶32。每行中的最后一孔只含有等滲NaCl。以EMEM替代等滲NaCl也形成了同樣的溶液。
具體步驟1．將100PEU的HSV-1的100微升等滲NaCl溶液加到連續稀釋的樣品中。
2．在室溫下溫育10分鐘。
3．以2毫升的等滲NaCl或EMEM將細胞(綠猴腎細胞(Green monkeykidney cells)(GMK AH1)，鋪滿的單層，3天齡，6孔板)洗滌一次。
4．在細胞上加入1毫升的病毒樣品混合物。
5．室溫下溫育1小時。
6．以2毫升的EMEM洗滌細胞兩次。
7．加入3毫升的標準甲基纖維素溶液。
8．在37℃下二氧化碳恒溫箱中溫育3天。
9．以結晶紫(Crystal violet)溶液染色細胞并計數病毒噬菌斑。結果附圖以HSV-1噬菌斑對樣品稀釋度(Sample dilution)(負的log2)作圖方式表示。可從圖中所描述的結果看出來1∶2和1∶4的稀釋物導致的被各種制劑的抑制可能是由于甲基纖維素的存在而引起的。在1∶16和1∶32的稀釋物中只有含肝素的制劑是有活性的。到1∶32的稀釋后，含有肝素和脫乙酰殼多糖的制劑保留了抑制活性。
毒性試驗表明所有組合物都是對GMK細胞無毒性的。實施例7-臨床試驗以凝膠形式，用根據上述實施例1組合物進行下述的臨床試驗。所有測試都用于治療或預防由HSV-1病毒引起的口唇感染。
第1個病例通過預防治療早期癥狀及治療晚期感染，重復治療15歲的男孩，以實施例1的組合物的局部施用在24小時之內消除了早期癥狀，并在72小時之內產生了康復效應。
第2個病例對一個48歲的男子進行了早期癥狀的預防治療，結果與上述第一種情況是相同的。
第3個病例已將實施例1的藥物成功地用于了一個9歲女孩的晚期疾病及預防治療。
第4個病例用上述實施例1的組合物對患晚期舌部感染的一名3歲男孩進行了唇部治療，在2天之內使得感染停止，并在4天之內康復。
第5個病例用實施例1所用的凝膠已成功地對一個52歲的男子進行了晚期疾病和早期癥狀的預防治療。
全部上述涉及對病毒細胞生長的抑制和診斷測試的結果，確證了本發明的組合物對由皰疹病毒引起的傳染病所具有的神奇療效。用肝素與脫乙酰殼多糖的結合治療該感染的成功實際上是未預料到的和令人驚奇的。雖然發明不限于任何特定的作用理論或機制，但可能是組合物中所用的基質提供了肝素以活性的形式的緩釋而產生的。可以認為包括脫乙酰殼多糖的基質通過離子鍵與肝素結合，從而在治療條件下存在的酶不會使其失活，這些酶例如有肝素酶(enzyme heparinas)。就肝素對酶降解和失活的敏感性這一點看來，這明顯是難以預料的。
應該注意到上述以例子說明的本發明并不限于所說的具體實施方案，這是由于改進對本領域技術人員而言見相當簡單的。因此，本發明的范圍僅僅通過附加權利要求書來進行限制。
權利要求
1．用肝素或硫酸乙酸肝素與脫乙酰殼多糖結合以制備用來預防或治療由皰疹病毒在哺乳動物包括人中引起的感染的藥物的用途。
2．根據權利要求1的用途，其中的制備基于肝素和脫乙酰殼多糖的結合。
3．根據權利要求1或2的用途，其中脫乙酰殼多糖的N-乙酰化程度至多為約90％，優選至多為50％。
4．根據權利要求3的用途，其中脫乙酰殼多糖的N-乙酰化程度少于約25％。
5．根據上述權利要求任一項的用途，其中的藥物形式為粉末、軟膏、糊劑、凝膠、懸浮液、溶液或膜劑。
7．根據權利要求5或6的用途，其中所說的載體或賦形劑包括增加粘度的多糖。
8．根據權利要求7的用途，其中所說的增加粘度的多糖由纖維素衍生物組成。
9．根據上述權利要求任一項的用途，其中所說的藥物包括液體基質。
10．根據權利要求6到8中任一項的用途，其中所說的增加粘度的多糖與所說脫乙酰殼多糖在所說藥物中的總量來說少于10％重量。
11．根據權利要求10的用途，其中所說的藥物形式為凝膠。
12．根據權利要求11的用途，其中所說的增加粘度的多糖與所說脫乙酰殼多糖在所說藥物中的總重量從約0.5到約5％重量。
13．根據上述權利要求中任一項的用途，其中所說的肝素或硫酸乙酰肝素在藥物中的重量從約0.1到約2％重量。
14．一種用于預防或治療在哺乳動物包括人的由皰疹病毒引起的感染的方法，包括將活性量的含肝素或硫酸乙酰肝素和脫乙酰殼多糖的藥物施加到需要治療的部位上的步驟。
15．根據權利要求14的方法，其中所說的藥物包含肝素及脫乙酰殼多糖。
16．根據權利要求14或15的方法，其中所說的藥物為粉末、軟膏、糊劑、凝膠、懸浮液、溶液或膜劑。
全文摘要
將肝素或硫酸乙酰肝素與脫乙酰殼多糖結合制備用于預防或治療在哺乳動物包括人中由皰疹病毒引起的感染的藥劑的用途；以及一種用于治療由皰疹病毒引起的傳染病的方法。
文檔編號A61K31/722GK1227493SQ97197038
公開日1999年9月1日 申請日期1997年8月1日 優先權日1996年8月6日
發明者奧勒·拉姆, 馬庫斯·巴克, 托馬斯·伯格斯特龍姆 申請人:梅迪卡布公司