造影劑及其相關造影劑的改進的制作方法

專利名稱：造影劑及其相關造影劑的改進的制作方法
技術領域：
本發明涉及超聲成像，更具體而言涉及肝臟的超聲成像方法和該方法中所用的造影劑，其在這種方法中具有延長在肝臟中停留時間的優點。
癌癥如肝細胞瘤和擴散到肝臟的轉移瘤是工業化社會的主要死亡原因，因此需要不斷改進腫瘤的檢查方法。肝臟檢查可通過例如注射一種脂質體包裹的碘化X-射線造影劑之后用X-射線成像來進行。如WO-A-8809165中描述，該脂質體通過與網狀內皮系統相互作用固著于肝臟和脾臟中，使這些器官可被X-射線檢查；一般腫瘤組織與正常組織有不同的血管分布和/或具有比正常組織少的吸收位點，因此形成反差改變了的區域而被檢測。
如WO-A-8809165中描述，肝臟的X射線檢查通常需要存在于組織中的碘化X射線造影劑的濃度為2-2.5毫克碘/克組織，即按成年人肝臟重約1.5kg算，總量約是3.5g碘。通常40％的脂質體被肝臟攝入，因此，造影劑的注射液需含有約9克碘才能達到這個水平。這樣使伴隨注射入體內的脂質高達9克，可能導致不期望的副作用。
肝臟超聲檢查具有很多潛在的優勢，因為超聲掃描儀與X-射線和計算機體層攝影(CT)掃描儀相比價錢大大降低，避免了使用電離輻射(潛在的提高病人和醫務工作者的安全性)，減少所需造影劑的劑量。最后一點，眾所周知，因為微泡的低密度和易壓縮性，包含氣體和/或易揮發性液體的微泡的分散液是高效的超聲反向散射劑；如果使之適當穩定，可獲得高效的超聲造影，例如，在血管系統和組織微血管，經常使用有利的低劑量。然而，當這些造影劑主要通過網狀內皮系統如在肝臟、脾臟和淋巴結等器官中攝取而從血管中消除時，用于這些器官的現有成像方法在它們的申請中十分有限。
US-A-5425366中公開雖然多種微粒超聲造影劑，如含氣體的高分子微囊，能被肝臟吸收，但用常規的B型技術不能有效成像。這是因為由于造影劑累積性反射而使發射的超聲信號在肝臟組織中只有很低的穿透深度，形成均勻的陰影，同樣可能是由于與微粒結構物質相互作用而使發射的超聲信號衰減的結果，導致例如信號被吸收和轉化為熱能。
在US-A-5425366中認為雖然保留在器官如肝臟中的這些微粒造影劑基本上是靜止不動的，但用彩色多普勒技術可使之顯現。這是因為彩色多普勒檢查的高輻射能使微粒爆烈，產生稱為“聲頻激發的聲波發射”的多普勒敏感信號，盡管看起來象是探測器把微粒子的消失看作是高速位移并產生相應的信號。也可解釋為在檢查過程中，微粒被發射的超聲信號逐漸破壞而使信號易于穿透進入組織的深處。
這個技術的一個缺點是象上述的高分子包裹的造影劑產生很高的衰減。這可能是包裹材料的相對剛性造成的，妨礙在整個肝臟中產生相同水平的信號。掃描時間因此必然延長，獲得的信息也難以解釋。因此該技術不適用于超聲體層掃描。還有一個缺點是使用彩多普勒儀器裝備檢測由基本靜止不動的微粒引起的很不規則信號，不可避免造成信息丟失和成像質量下降。因而該設備記錄的是速度而不是信號密度，使得關于密度的信息丟失或被歪曲，如通過使用高通量濾波器來排除由于慢速位移的組織而引起的信號。
此外，因為上面提到的微粒化超聲造影劑如US-A-5425366中描述的高分子包裹的微囊的高衰減，反向散射與衰減的比例必然比較低。這不可避免的限制了身體其它部位的超聲成像效果，如，希望與肝臟的圖象結合起來研究的血管系統。
因此，需要一個應用可使通過各種成像技術，如包括傳統的B型和諧波成像技術都能得到有效的肝臟造影的造影劑的超聲成像方法。
本發明基于如下發現含由可調理的雙親性物質來穩定的氣體微泡造影劑在肝臟和脾臟中具有延長的反差產生保留時間。雖然這些用雙親性物質穩定的微泡會被肝臟和脾臟的巨噬細胞吞噬，雖然實際上如下文中詳細描述的所挑選的雙親性物質易于被肝臟攝取，如被網狀內皮系統的枯否氏細胞攝取，但令人十分驚奇的是它們產生反差的效果依然會持續下去，例如持續幾個小時，因為一般會認為造影劑迅速被破壞，產生回聲性隨吞噬而消失。
本發明的一方面提供了一個超聲成像的方法，其包含給人或人類以外的動物對象施用一種反差增強劑量的造影劑，該造影劑包括由可調理的雙親性物質穩定的生物相容性氣體微泡，允許至少一部分所述微泡被受檢者的肝臟吸收并產生至少一部分肝臟的超聲影像。
本發明進一步包含上述的造影劑在肝臟超聲成像中的用途，以及成像劑產品中由可調理的雙親性物質穩定的生物相容性氣體微泡在制造用于人和人類以外的動物對象的肝臟超聲成像的成像中的用途。
可調理的雙親性物質如果需要可以是氟化的，可從例如可調理的雙親性脂類、可調理的雙親性蛋白質和可調理的雙親性天然和合成的高分子中挑選。
可調理的雙親性脂類物質可包括例如一種或多種成膜脂，用于此處的這個詞是表示在水溶液介質中能形成液晶或膠態雙分子層的雙親性脂；此雙親性脂在氣水界面也可以形成單分子層或單一的雙分子層，如在Langmuir-Blodet膜中。因而這個詞包括諸如在生物膜中發現的脂類，其特征在于水溶性低，在水溶液介質中甚至在很低的濃度下能形成液晶或膠態雙分子層，其在水溶液中基本上具有減小表面張力的傾向，例如幾乎減小到零。該脂會形成包裹如本發明所用的造影劑中氣體微泡的單分子層、雙分子層或多分子層。
該成膜脂的實例包括脂肽、親脂性的衍生碳水化合物，如帶一個或多個脂肪酰基團、脂肪酸的單或雙甘油酯、神經鞘脂、糖脂、甘油脂和更優選的，磷脂，如磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、心脂和其相應的溶解類似物(即單乙酰，更優選的如1-乙酰)。
如本發明所用的造影劑中的可調理的雙親性物質可包括，例如，一種或多種成膜脂，和任選的添加劑，添加劑用于改良諸如穩定性、分散性、聚合傾向、生物活性、柔韌性和極性等特性。代表性的添加劑包括非成膜脂，例如甾醇類如膽固醇。
最好是至少有部分，例如至少5％，如至少20％，更優選的是至少50％的成膜脂類物質由在制備和/或使用條件下各自帶凈總負電荷的分子組成。這樣，帶電的脂膜之間的電子排斥促進堅固的和穩定的包裹著氣體微泡的脂質單分子層膜的形成；這樣的薄膜的彈性和可變形性大大地提高了涉及由一種或多種脂雙分子層包裹的氣體系統的造影劑的產生回聲性。此外，這樣的單分子層系統與雙分子層系統相似基本上減弱了衰減，使發射的超聲信號具有更高的穿透深度，因此，易于在肝臟的更深處成像。
帶負電的成膜脂物質也促進枯否氏細胞識別造影劑，因此增加肝臟的攝取，靜脈注射包含這樣的脂物質后的大鼠的肝臟電子顯微檢查可進一步證實這一點。
帶負電荷的成膜脂包括帶負電的磷脂，如自然產生的磷脂(如，從大豆或蛋黃中得到的)，半合成的磷脂(如，部分或完全氫化的)，和合成的磷脂酰絲氨酸、磷脂酯甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和心磷脂；這些磷脂的脂肪酰基團通常都包含約14-22個碳原子，例如棕櫚酰和硬脂酰基團。
特別優選使用包括磷脂酰絲氨酸的造影劑，因為枯否氏細胞和脾巨噬細胞是通過其表面高濃度的磷脂酰絲氨酸的存在來識別衰老的紅細胞和血小板的。它們因此相應的識別和吞噬在肝臟和脾臟中的含有磷脂酰絲氨酸的造影劑。
成膜脂或其它的可調理的雙親性物質可選擇基本不透過造影劑中的氣體的物質，至少在血流運送造影劑到肝臟的過程中不透氣。這可通過例如應用在脂和脂膜中具有較低擴散速率的氣體來實現。這些氣體的實例包括鹵化硫類，如六氟化硫或十氟化二硫；氟化烴類如全氟化烴；氟代(如全氟代)酮如全氟丙酮；和氟代(如全氟代)醚如全氟乙醚。代表性的全氟化烴類可例如含有多至七個碳原子，包括全氟烷如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷類(如全氟正丁烷以及與其它異構體諸如全氟異丁烷的任意混合物)、全氟戊烷類、全氟己烷類和全氟庚烷類；全氟烯如全氟丙烯、全氟丁烯類(如全氟2-丁烯)和全氟丁二烯；全氟炔類如全氟2-丁炔；全氟環烷類如全氟環丁烷、全氟甲基環丁烷、全氟二甲基環丁烷、全氟三甲基環丁烷、全氟環戊烷、全氟甲基環戊烷、全氟二甲基環戊烷、全氟環己烷、全氟甲基環己烷和全氟環庚烷；和前述物質的任意混合物，包括與多種可透膜氣體如空氣、氮氣、二氧化碳和氧氣等的混合物，如包含多達90％的上述多種透膜氣體的混合物。
包含由一種或多種磷脂酰絲氨酸包裹的全氟烷如全氟丁烷的微泡的造影劑的用途是本發明在這方面的一個十分優選的實施方案。
另外，可選擇對諸如空氣、氮氣、二氧化碳、氧氣等氣體具有相對較低透過率的成膜脂或其它可調理的雙親性物質。因此例如氟代的成膜脂物質如脂肪酰基團被氟代，優選的是全氟代可用于包裹大范圍的如本發明所用的造影劑中的生物相容性氣體，(生物相容性氣體包括在37℃的正常人體溫下基本上或完全是氣態的或蒸氣形式的物質，包括混合物)。這樣的氣體實例包括空氣、氮氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、氧化氮、惰性氣體(如氦氣、氬氣、氙氣或氪)、任選的鹵代硅烷(如四甲基硅烷)、任選的鹵代低分子量的烴(如包含多達七個碳原子的烴，如諸如甲烷、乙烷、丙烷類、丁烷類或戊烷類的烷烴，諸如環丁烷或環戊烷的環烷烴，諸如丙烯或丁烯的烯烴，諸如乙炔的炔烴；醚類；酮類；酯類；和以上任意物質的鹵代形式，包括諸如以上列出的全氟化烴類物質)、鹵化硫類(如，六氟化硫或十氟化二硫)和以上任意化合物的混合物。
可以認識到，當造影劑被肝臟捕獲和/或攝取后，如在表面被捕獲(如與受體的特異性相互作用)和通過已知的內化過程被細胞吸收后，脂和類似的膜不需要一定保持不透過性和/或穩定氣體微泡。因此，在被捕獲或攝取之后，回聲的產生可來自于被原來的成膜脂或其它可調理的雙親性物質穩定的氣體微泡、部分雙親性物質被內源性磷脂取代的微泡、從造影劑中釋放出的游離的氣體微泡(如果不被溶解或被肝臟除去)或者上述的任意組合。可進一步認識到的是，如果比正常血液中氣體如氧、二氧化碳和氮氣具有更低水溶性的氣體可增加氣體微泡的穩定性。
本發明所用的造影劑微泡的合適的平均尺寸為0.1-10μm，如1-7μm，因此，靜脈注射后可自由的通過肺最后被諸如肝臟和脾臟攝取。這些微泡仍然有足夠的大小而呈現基本的產生回聲性。(體積大小依賴性)。這種能提高肝臟成像的尺寸的微泡的用途可與諸如WO-A-9109629中所暗示的現有技術形成對照，為了保證通過毛細小孔進入肝臟，現有技術造影劑的尺寸必須在30-100nm左右，而氣體微泡在這個尺寸范圍呈現比以上提到的優選的尺寸范圍低得多的產生回聲性。
如果需要的話，可以在注射造影劑之前、期間或之后施用一種能促進肝臟中血流的物質如胰高血糖素，和/或一種能通過刺激吞噬作用而提高肝臟攝取的物質如抗體、抗體碎片或纖連蛋白。
本發明所用的優選的含磷脂的造影劑的給藥劑量范圍是按體重所注射磷脂的量為0.1-10μg/kg，如1-5μg/kg。可想象到使用如此低劑量磷脂的最大的優點是減小了可能的毒副反應。
因為本發明所用的優選造影劑能迅速在肝臟中被枯否氏細胞吸收，在給病人施用造影劑后5-10分鐘即可進行肝臟成像，更優選的是稍后一點再進行，如直到給藥后30分鐘進行，以使造影劑達到最大吸收。肝臟中延長的造影劑產生回聲的保留時間允許在給藥后幾個小時(如2-8小時)中進行有效的成像。
肝臟的超聲成像，可使用成像頻率范圍為例如約0.1-15MHz，如1-10Mhz進行。
本發明所用的代表性成像技術包括M型成像、B型成像、連續波多普勒成像、脈沖多普勒成像技術如彩色或電力(power)多普勒成像、諧波成像或如上述技術的任意組合。本發明所用的雙親性物質穩定的造影劑微泡的柔韌性使之特別適合于諧波成像技術，該技術是基于例如US-A-5410516所述的非線性效果，諸如高頻諧波(如成像頻率的2、3、4…倍)，低頻諧波(subharmonics)(如成像頻率的1/2、1/3、2/3、3/4……倍)和超頻諧波(ultraharmonics)(如成像頻率的3/2、5/4……倍)；特別優選的使用次級(second)諧波成像。
為了高效率的轉化成諧振超聲能量，諧波成像通常需要將微泡造影劑置于高強度的超聲輻射下。在諸如肝臟等大范圍組織部位超聲強度空間分布很不均勻，這是入射的超聲波束的不均勻性和被組織聲學衰減的結果，所以必須使用非常高的入射強度來獲得足夠強度的從成像組織的遠側部分反射的信號強度，這樣就導致靠近傳感器的組織的反差效果迅速降低，高強度的超聲輻射可加速微泡氣體溶于周圍的組織液中，隨之在照射開始短至一秒鐘的時間內反差效果就喪失。這就不可避免地限制了該技術用于獲得組織區域的全貌。
然而，本發明所用的造影劑的柔韌性，甚至在低的入射超聲強度下也使它們具有高效的諧波能量轉化，使它們在低的超聲強度下能用于肝臟深層定位區域的諧波成像，而不引起靠近傳感器的肝臟區域中微泡被破壞的現象。更一般地說，該造影劑的柔韌性允許它們在不破壞造影劑的低超聲強度下用于各種成像模式，因而推動了如意在確定肝臟中目的區域的多重掃描或不同成像模式的使用。
但是，如果需要，也可使用高強度的超聲，通過檢測微泡消失的方法來檢測反差。該方法的實例包括諸如彩色多普勒(如在US-A-5425366中描述的)或電力多普勒的相敏感技術，和如在US-A-5456257中描述的相不敏感技術。與US-A-5425366中所述的造影劑采用的通常高分子包裹的微泡不同，本造影劑容易被設計成對入射的超聲能量極敏感，如通過在單分子層形式中使用穩定的雙親性物質。因而使用極低強度的超聲能量也能導致微泡的消失，在極低的入射超聲能量強度下形成肝或部分肝臟的高效擬多普勒影像。
因而，可使用的檢測技術包括諸如彩色速率成像的基于非多普勒相關技術和其它基于在時間和頻率范圍內兩次連續脈沖過程低相關的技術，如使用任意混合其它信號的RF信號、振幅去調制的RF信號或用其它技術處理的RF信號。使用非線性技術也可影響真正的或表觀的微泡消失，如分析發射超聲脈沖基本頻率譜帶寬度之外的信號，諸如高頻諧波、低頻諧波或超頻諧波或倍頻波或差頻波，其比如，由發射脈沖和這些諧波產生。
令人驚奇的是，使用本發明所述的造影劑，一般認為涉及微泡破壞的成像技術可反復進行。因而可看出該技術可以可逆地改變該造影劑所用造影劑的聲學特性而不是破壞了微泡，因此，可重復進行掃描。
同樣令人驚奇的是，甚至在肝臟延長的保留時間之后，按本發明所用的造影劑可產生比由血液和組織運動引起的信號寬得多的譜帶的多普勒信號。運用比用于多普勒成像中普通濾波裝置高的濾波器，可使檢測不受人為的干擾運動的影響。同樣可使用高增益的裝置，從而在整個掃描中產生均勻的反差。
本發明所用的造影劑可通過任何合適的方法制備，一種較可取的方法包括如下步驟i)在含有諸如成膜脂等的一種可調理的雙親性物質的水溶液介質中形成氣體微泡分散液。
ii)凍干如上所得的雙親性物質穩定的氣體分散液，制得干品；和iii)在一種注射用的載體溶液中重構所述的干品。
步驟(i)可通過在有所選氣體存在下使用任何合適的乳濁液制備技術來處理含雙親性物質的水溶液介質而實現，例如超聲處理、振搖、高壓勻漿、高速搖拌或高剪切混合，如用一種轉子-定子勻漿器。如果需要，該水溶液介質中可包含作為粘度增強劑和/或雙親性物質的助溶劑的添加劑，比如醇類或多羥基化合物，諸如甘油和/或丙二醇。
在乳化步驟中所用的氣體不必是最終產品中所需的氣體。因為大部分氣體內容物可在以后的凍干步驟中除去，剩余的氣體也在干品的抽真空過程中除去。然后，應用一個大氣壓或超壓的目的終產品氣體。所選用的乳化氣體只用于優化乳化過程中的參數，而不考慮目標終產品。在氟化硫如六氟化硫或氟代的低分子量烴氣體如全氟代烷或全氟代環烷烴(優選含有4或5個碳原子的烴)存在的條件下乳化，有利于獲得均一的窄的微泡尺寸分布范圍的最終產品。
在周圍溫度如約25±10℃時乳化很容易實現。開始時須加熱水溶液介質，以促進水合作用和雙親性物質的分散，然后在乳化之前使之與周圍的溫度達到平衡。
在進行步驟(ii)凍干之前，把按步驟(i)制備的分散液進行一次或多次洗滌步驟是有利的，用以分離和除去諸如粘度增強劑和助溶劑的添加劑，以及諸如不含氣體的膠態粒子和過小和/或過大的微泡等的不需要的物質。該洗滌可由原本已知的方法來實現，可用諸如懸浮和離心的技術來分離微泡。照此方法，制備按體積大小分開的微泡的分散液，其中至少90％微泡的大小在2μm范圍以內，如體積平均直徑在2-5μm范圍之內。
在一種或多種冷凍防護劑和/或阻溶劑和/或疏松劑(bulking agent)存在下進行步驟(ii)是有益的，并且在洗滌步驟之后，凍干之前加入這種試劑。具有冷凍防護作用和/或阻溶作用的試劑大部分列表于Acta Pharm.Technol 34(3)，129-139(1988)，此處引用其內容以作參考。這些試劑的實例包括醇類(如脂肪醇類比如叔丁醇)，多羥基化合物如甘油，氨基酸類如甘氨酸，碳水化合物(例如諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡萄糖、乳糖和環糊精的糖，或諸如葡聚糖的多糖)和聚乙二醇類，優選使用具有好的生理耐受性的糖如蔗糖(如使用保持產物等滲或稍高滲的量)。
氣體分散液的凍干是例如先將其凍結，然后用已自知的方式凍干被凍結的氣體分散液。該凍結的氣體分散液可在冷凍條件下保存，需要的時候解凍，如通過簡單的溫熱和/或加入載體溶液，得到用于如本發明所述的造影劑的微泡分散液。
因為干品在使用之前一般要按上述步驟(iii)所述重構，氣體分散液在凍干之前最好裝入可密封的小瓶中，以使每瓶含有合適劑量如一個劑量單位的干品，用于重新組合成可注射的形式。在獨立小瓶中而不是大量的凍干所述氣體分散液，就可避免分裝具有脆弱的蜂窩狀結構的凍干產品，且至少避免了該結構的部分破壞。凍干之后進一步選擇性抽空氣體，且在瓶中引入最后制成的造影劑微泡中所需的氣體之后，用合適的蓋子密封小瓶。
通常，步驟(ii)之后所得的干品或冷凍的氣體分散液，經過例如所需的和/或期望的氣體的補充或交換之后，可通過加入合適的注射用的載體溶液諸如注射用無菌無熱原的水或鹽水進行重構。裝干品的小瓶是用隔膜密封，用注射器通過隔膜注入載體溶液。重構后輕輕振搖或混合產品是有益的；只需要輕輕的手搖使該可重復生產的產品具有均勻的微泡尺寸。
另一個制備本發明所用造影劑的方法包括讓氣體與可調理的雙親性物質粉末接觸，然后將該粉末狀的兩親物質與水溶液載體混合形成充滿氣體的微泡的懸浮液，使微泡形成層后，分離該層并洗滌被分離的微泡(例如US-A-5445813中所述)。還有一個可用的方法包括氣體存在下振搖含可調理的雙親性物質的溶液(如WO-A-9428780中所述)。
以下非限制性實施例用于說明本發明圖的簡要說明在附圖中

圖1A是生理鹽水處理的對照大鼠肝臟樣本的電子顯微照片，按實施例7所述方法制得。
圖1B是圖1A中標記部分的放大照片。
圖1C是造影劑處理的大鼠肝臟樣本的電子顯微照片，按實施例7所述制得；且圖1D是圖1C中標記部分的放大照片。
A-造影劑的制備實施例1a)通過振蕩制備全氟代丁烷微泡的分散液將25.3mg氫化的卵磷脂酰絲氨酸加入12.5ml含5.4％(w/w)的丙二醇與甘油(3∶10w/w)混合物的水中。通過加熱此磷脂材料至70℃水合約30分鐘，然后冷卻至室溫。取11ml所得的分散液分裝于十一個2ml的小瓶中，每瓶1ml，向每瓶的液上空間充入全氟正丁烷氣體。蓋嚴瓶蓋用Espe CapMix(牙科材料混合器)振蕩45分鐘。所得的微泡分散液合并入四個大些的小瓶中，2000轉/分離心5分鐘，得到一層微泡漂浮層和位于其下的混濁的下漂層。用注射器吸去下漂層，并用等量中性pH的水取而代之。重復進行清洗步驟，下漂層用10％(w/w)蔗糖取而代之。將所得的分散液分成每份2ml，裝入專為凍干設計的10ml的平底小瓶中，于-47℃冷凍，然后凍干約48小時，得到白色蓬松的固體物質。將小瓶轉移到真空容器中，用真空泵抽去空氣，并換成全氟正丁烷氣體。使用前加入水并輕輕用手振搖小瓶幾秒鐘，得到可用作超聲造影劑的微泡分散液。b)用轉子定子混合制備全氟代丁烷微泡分散液將500.4mg氫化的卵磷脂酰絲氨酸加入100ml含5.4％(w/w)的丙二醇與甘油(3∶10w/w)混合物的水中。振搖該混合物并將其加熱至80℃五分鐘，冷卻至室溫，使用前再振搖一次并靜置過夜。
將50ml所制的溶液轉移入一個帶錐形頸的圓底燒瓶中，燒瓶安上一個玻璃套，其內部可控溫外部連接于維持在25℃的水浴。在溶液中引入轉子定子混合軸，為防止氣體泄漏，瓶頸與混合軸之間空間用特制的金屬塞子密封，塞子上帶有氣體進/出接口用以調節氣體內容和控制壓力。將氣體出口連于真空泵，溶液脫氣一分鐘。通過氣體進口注入一個大氣壓的全氟正丁烷氣體。
溶液于23000轉/分勻漿10分鐘，調節轉子定子混合軸使所有開口稍稍高出液面。如此得到白色乳油狀分散液，將其轉移至可密封的容器中，沖入全氟正丁烷。然后將分散液轉入一個分液漏斗中，于12000轉/分離心30分鐘，得到上層是乳油狀微泡層以及混濁的下漂層。去除下漂層以水代之，于12000轉/分離心15分鐘，重復兩次。最后一次離心之后，上清液用10％(w/w)蔗糖取而代之。將所得的分散液分成每份2ml，裝入10ml的專為凍干設計的平底小瓶中，冷凍至-47℃，然后凍干約48小時，得到白色蓬松的固體物質。將小瓶轉移至真空容器中，用真空泵抽去空氣，并換成全氟正丁烷氣體。使用前加水并輕輕用手振搖小瓶幾秒鐘，得到可用作超聲造影劑的微泡分散液。c)通過超聲處理制備全氟代丁烷微泡分散液將500.4mg氫化的卵磷脂酰絲氨酸加入100ml含5.4％(w/w)的丙二醇與甘油(3∶10w/w)混合物的水中。振搖該混合物并加熱至80℃五分鐘，冷卻至室溫，使用前再振搖一次并靜置過夜。
溶液用泵送入并通過一個4ml的超聲處理器的流通池，經過20KHz振幅為90μm的超聲波處理。超聲處理器的角狀發射器直徑1.3cm，流通池內徑2.1cm，發射器與流通池底的距離1cm。脂溶液與全氟正丁烷以1∶2(v/v)的比例在進入超聲池之前混合。(20ml/分鐘脂溶液和40ml/分鐘全氟正丁烷)。溫度保持在33℃。得到了白色乳油狀分散液，將其裝入容器中并沖入全氟正丁烷。表征微泡的體積分布和體積濃度是用一種Coulter Counter Mark II儀器測定的，儀器裝有50μm的小孔，測量范圍是1-30μm。取20μl樣品，在室溫下用200ml空氣飽和的鹽水稀釋，平衡3分鐘然后測定。
測定超聲特性的實驗儀器是根據de Jong，N.和Hoff，L.的方法稍作改進進行的，該法記載于Albunex微球的超聲散射特性(“Ultrasoundscattering properties of Albunex microspheres”)，超聲(Ultrasonic)31(3)175-178(1993)。該儀器測定稀的造影劑懸浮液在2-8MHz頻率范圍內的超聲衰減功效。在測定衰減過程中，給樣品加上120mmHg的過壓，持續90秒鐘，進行壓力穩定性試驗。分析前取2-3μl樣品用55ml IsotonII稀釋并攪拌稀釋的樣品3分鐘。使用3.5MHz測定的衰減以及釋放過壓后在3.5MHz的回復衰減量作為初級響應參數。表1.1根據實施例1(a)-(c)制備的微泡分散液的體外特性數量和重量體積濃度和體積平均直徑。根據上述方法測定的聲學特性。
實施例2通過轉子定子混合、凍干和氣體交換制備各種微泡分散液根據以下步驟分別用空氣、全氟代丁烷、六氟化硫、五氟化三氟甲基硫和四甲基硅取代按實施例1(b)制備的五個樣品中的氣體。
兩個含有按實施例1(b)制取的凍干產品的樣品放入一個具有氣體進口和出口的干燥器中。干燥器連接到一個Buchi 168真空蒸餾器上，其可抽干樣品并注入所選的氣體。樣品于約10mbar抽氣5分鐘，之后引入所選的氣體直到壓力為一個大氣壓，然后仔細地蓋上小瓶。另取兩個樣品重復上述步驟，直至每個所選氣體均被交換。
使用前于每個小瓶中加入2ml蒸餾水，用手輕輕振搖小瓶。所制得的微泡分散液按實施例1所述用體積分布測量進行表征。表2.1根據實施例2制備的磷脂酰絲氨酸穩定的微泡分散液的體外特性數量和重量體積濃度和體積平均直徑
從以上結果可看出，經過氣體交換后體積分布沒有大的變化，證明在凍干和重構過程中預先形成的微泡大小基本保持不變。B-肝臟超聲成像的方法實施例3兔肝成像肌肉注射0.65mg/kg劑量的鹽酸甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮混合物麻醉兔子，按5μg磷脂/kg劑量靜脈注射按實施例1制備的造影劑。超聲傳感器置于肝臟區域上方去毛皮膚上。用B-型成像(5-7MHz)、彩色多普勒成像、次級諧波成像、電力多譜勒成像、諧波與彩色多普勒聯合成像和諧波與電力多普勒聯合成像進行透腹壁研究，指示肝臟中植入的VX2腫瘤的存在，并與經動脈施乙碘油作造影劑的X-射線照像的結果相關。實施例4旱獺肝臟成像用實施例3的步驟檢測旱獺肝中自然生長的腫瘤。所得結果與肝臟解剖學檢查結果相關。實施例5狗肝成像給一只20kg的雜種狗靜脈注射66μl按實施例1(a)制備的1％的微泡分散液，于注射前和注射后十分鐘進行肝臟次級諧波成像，使用ATLHDI-3000掃描儀，配有用于次級諧波成像的發射頻率為2.5MHz的設備以及使用P5-3相陣列扇面掃描傳感器。掃描器功率輸出設在低水平，機械指數(MI)為0.3。傳感器置于肋骨下靠近中線處。注射后獲得的肝臟影像的反差誘導增強作用穩定，盡管持續掃描，反差誘導增強不隨時間而減少。與注射前采集的基準圖象比較，整個肝臟的反差明顯增強，能看見大于10cm的深度。實施例6人肝臟腫瘤的成像給一女性患者靜脈注射10μl 1％的按實施例1(a)制備的微泡分散液。用ATL HDI-3000掃描儀進行的肝臟基頻波B-型成像清楚地表明轉移損傷的周圍血管增生。注射15分鐘后基準掃描中與周圍組織呈現相同回聲，因此開始很難看見的損傷，由于周圍正常肝組織呈現強回聲產生，損傷的清晰度增強，注射后30分鐘效果更加明顯，證明了造影劑在肝臟延長的保留時間之后的持續的和增強反差的效果。實施例7被大鼠肝臟攝取后造影劑的細胞分布通過尾靜脈分別給三只未麻醉的大鼠注射1％的按實施例1(a)制備的微泡分散液(每公斤體重50μl微泡，相當于人類一般造影劑量的幾百倍)。對照大鼠在同樣條件下注射鹽水。注射后將大鼠麻醉。于注射后十分鐘切開腹部與胸壁，給肝臟灌注緩沖液(100mM HEPES，pH7.4)直到顏色變淡，然后用含(2％v/v)戊二醛的同樣緩沖液灌注，直至變硬。切除肝臟并將其切成薄片，然后將組織樣品用環氧樹脂處理，并切成半薄切片(約1μm)以用光學顯微鏡觀察。根據光學顯微鏡觀察結果選取適當的面積，并在此處切下小面積超薄切片，用四氧化鋨染色后進行電子顯微學檢查。
從給予鹽水的對照大鼠樣品的電子顯微照片(見圖1A和圖1B中的放大照片)看出，枯否氏細胞、內皮細胞或實質細胞中沒有空泡形成。而在給予造影劑大鼠的電子顯微照片中可看到一些枯否氏細胞中有內化的微粒或微泡(“P”)(見圖1C和圖1D中的放大照片)。而實質細胞和內皮細胞中沒有上述微粒或微泡。而且，被認為是磷脂類物質(“PL”)的能被深度染色的物質在一些微粒或微泡的邊緣能觀察到。
權利要求
1.一種超聲成像的方法，包括給人或人以外動物對象施用一種反差增強劑量的造影劑，該造影劑包括由可調理的兩親性物質穩定的生物相容性氣體微泡，允許至少部分所述微泡在肝臟中被吸收并產生至少部分肝臟的超聲影像。
2.一種如權利要求1的方法，其中可調理的兩親性物質包括一種成膜脂。
3.一種如權利要求2的方法，其中成膜脂包括一種磷脂。
4.一種如權利要求3的方法，其中成膜脂包括至少50％的一種帶負電荷的磷脂。
5.一種如權利要求4的方法，其中帶負電荷的磷脂包括至少一種磷脂酰絲氨酸。
6.一種如上述所有權利要求中任一項的方法，其中生物相容性氣體包括六氟化硫、十氟化二硫、一種氟代酮、一種氟代醚或一種全氟化烴。
7.一種如權利要求6的方法，其中全氟化烴包括一種全氟代丁烷。
8.一種如權利要求1-5中任一項的方法，其中兩親性物質是氟化的，生物相容性氣體選自空氣、氮氣、二氧化碳、氧氣、氫氣、氧化氮、一種惰性氣體、一種任選的鹵代硅烷、一種任選的鹵代低分子量碳水化合物、一種鹵化硫和上述任意的混合物。
9.一種如上述權利要求中任一項的方法，其中在施用所述造影劑之前、期間或之后要給予一種能促進肝臟中血流的物質和/或一種能通過刺激吞噬作用而增加肝臟攝取的物質。
10.一種如上述所有權利要求中任一項的方法，其中超聲影像是通過次級諧波成像形成的。
11.一種造影劑在肝臟超聲成像中的用途，該造影劑包括由兩親性脂物質穩定的生物相容性氣體微泡。
12.一種由可調理的兩親性物質穩定的生物相容性氣體微泡在顯影劑制造過程中的用途，該顯影劑用于人和人類以外動物對象肝臟的超聲成像。
全文摘要
一種超聲造影劑，包括生物相容性氣體例如鹵化硫或全氟化碳的微泡，由可調理的雙親性物質例如成膜脂如磷脂，尤其是帶負電的磷脂如磷脂酰絲氨酸來穩定，靜脈給藥后在肝臟中可具有延長的反差產生停留時間。
文檔編號A61KGK1227502SQ9719700
公開日1999年9月1日 申請日期1997年8月4日 優先權日1996年8月2日
發明者D·約翰森, J·斯坦森, M·艾里克森, A·托尼斯, S·弗里斯塔德, H·杜格斯塔德, J·克拉文尼斯, P·羅格維德, R·斯庫特維特, J·布拉恩登 申請人:奈科姆成像有限公司