電壓門控鈣通道拮抗劑和方法

專利名稱：電壓門控鈣通道拮抗劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新型的肽化合物，該化合物專一性地阻斷E類電壓門控鈣通道，并涉及阻斷該通道的方法。本發(fā)明還涉及使用所述化合物例如治療驚厥性疾病的治療方法。
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背景技術(shù)：
電壓門控鈣通道存在于神經(jīng)元、及心肌、平滑肌和骨骼肌、以及其它可興奮細胞中。已知這些通道參與膜興奮性、肌肉收縮以及細胞分泌，如細胞排粒(exocytotic)突觸傳遞。在神經(jīng)元細胞中，根據(jù)其電生理以及生化和藥理學(xué)性質(zhì)來分類電壓門控鈣通道。最近，基于通道的分子生物學(xué)進行了進一步分類。
鈣通道通常根據(jù)它們的電生理學(xué)性質(zhì)分類為低電壓活化(LVA)或高電壓活化(HVA)通道。目前已知HVA通道包括至少三組通道，即L-、N-和P/Q-型通道。這些通道相互之間是在它們的藥理學(xué)和配體結(jié)合性質(zhì)的基礎(chǔ)上通過電生理學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)來區(qū)別的。因此，二氫吡啶、二苯基烷基胺和哌啶與L-型鈣通道的α1亞基結(jié)合，阻斷神經(jīng)元組織中的部分HVA鈣電流，所述電流稱為L-型鈣電流。N-型鈣通道對ω-conopeptides敏感，但是對二氫吡啶化合物如尼莫地平和硝苯地平相對不敏感。另一方面，P/Q-型通道對二氫吡啶不敏感，但是對漏斗網(wǎng)(funnel web)蜘蛛毒素AgaⅢA敏感。
類似于L-、N-、P-和Q-型通道，R-型鈣通道被大的膜去極化活化，并因此歸類為高電壓活化(HVA)通道。R-型通道對二氫吡啶和ω-conopeptides不敏感，但是與P/Q、L和N-型通道類似，對漏斗網(wǎng)蜘蛛毒素Aga ⅣA敏感。免疫細胞化學(xué)染色研究表明，這些通道遍布在腦中，特別是在深中線結(jié)構(gòu)(有尾殼(caudate-putamen)、丘腦、下丘腦、扁桃體(amygdala)、小腦)中以及前中腦和腦干核中。有人認為該通道主要存在于神經(jīng)元細胞體和樹突中，并在此對細胞電活性發(fā)生作用。還有證據(jù)表明R-型通道可能位于突觸前神經(jīng)末端上。
包括神經(jīng)元電壓敏感性鈣通道的分子復(fù)合物是由中心α1亞基、α2/6亞基、β亞基和95KD亞基組成的。分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少5類編碼α1亞基的mRNA，并編號為A、B、C、D和E。它們相對于電生理學(xué)研究中定義的P/Q-型(α1A)、N-型(α1B)、L-型(α1c、α1D)、和R-型(α1E)電壓門控通道(Snutch等人1990,Soong等人1993,Tsien等人1991；Biel等人1990,Mikami等人1989,Perez-Reyes等人1989,Tanabe等人，Williams等人1992；Fujita等人1993,Mori等人1991,Sather等人1993,Stea等人1994,Forti等人1994,Randall和Tsien 1994)。E類電壓門控鈣通道包括其電生理學(xué)表征為R-型的電流和G2電流的電流。
尚未知曉對于E類或R-型神經(jīng)元鈣通道為專一性或選擇性的配體。雖然蜘蛛肽ω-Aga ⅢA拮抗該通道(Palma等人1995),但該肽亦可強效阻斷N-、P/Q-和L-型鈣電流(Cohen等人1993,Ertel等人1994),并因此缺乏專一性。因此，該通道缺乏專一性配體阻礙了其在神經(jīng)元功能中作用的闡明。表1概述了在此所述電壓門控鈣通道的各種亞型的拮抗劑。
表1
由于神經(jīng)元功能中專一性鈣通道的重要性，其可用于鑒別專一性阻斷E類鈣通道的藥物。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了可選擇性阻斷該通道的新一類肽。此類化合物在此是以新型的HG肽為例的，該肽得自于原始從H.Gigas分離的肽。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一類新型的肽，該肽可選擇性地阻斷E類鈣通道。更具體而言，此等肽通常稱為E類電壓門控鈣通道阻斷肽，其能夠在濃度為約10-50、更優(yōu)選不超過10-20倍于阻斷該通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的濃度時阻斷E類電壓敏感性鈣通道。在其它實施方案中，該肽的進一步特征是在其摩爾濃度約10倍于半最大阻斷E類電壓門控鈣通道所需要的濃度時，其不能至少50％阻斷在此所述的L-型、T-型、P/Q型或N-型鈣通道。
在優(yōu)選實施方案中，所述肽的形式為V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P；SEQ ID NO:19是CRYMFGGC；X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，以及X15是F或D或缺失。
在另一個優(yōu)選實施方案中，肽的形式為SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，X1選自Ⅴ類，X2選自Ⅱ類，X3選自Ⅳ或Ⅴ類，X4選自Ⅲ類，X5選自Ⅲ類或Ⅳ類或缺失，X6選自Ⅳ或Ⅴ類，X7選自Ⅱ或Ⅳ類，X8選自Ⅱ或Ⅴ類，X9選自Ⅵ類，X10選自Ⅱ或Ⅲ類，以及X11選自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。在進-步優(yōu)選的實施方案中，在上述復(fù)合肽的可變位置上有以下取代基X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，以及X11=L、F或G；SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC，以及SEQ ID NO:18是YCAWD。在又一個優(yōu)選實施方案中，所述肽是SEQ ID NO:1(HG-1)、SEQ ID NO:8(HG-8)、SEQ ID NO:13(R9)、SEQ ID NO:14(R11)和SEQ ID NO:15(SNX-629)中的任何一個。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離多核苷酸，該核苷酸包括編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、以及SEQ ID NO:15所限定之序列的肽。在另一個實施方案中，所述多核苷酸選自具有SEQ IDNO:23-SEQ ID NO:43所限定之序列的核苷酸。
在進一步的實施方案中，所述分離多核苷酸包括編碼具有V1-SEQID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15序列之肽的核苷酸序列，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
在又一個實施方案中，所述分離多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:16-X1FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD序列的肽，其中X1選自Ⅴ類，X2選自Ⅱ類，X3選自Ⅳ或Ⅴ類，X4選自Ⅲ類，X5選自Ⅲ類或Ⅳ類或缺失，X6選自Ⅳ或Ⅴ類，X7選自Ⅱ或Ⅳ類，X8選自Ⅱ或Ⅴ類，X9選自Ⅵ類，X10選自Ⅱ或Ⅲ類，而X11選自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。
在相關(guān)方面中，本發(fā)明包括抑制患者癲癇發(fā)作的方法。該方法包括向患者給藥藥物學(xué)有效劑量的HG肽，該肽能夠在其濃度最多約10-50倍于阻斷E類電壓門控鈣通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的濃度時阻斷所述通道。
在相關(guān)方面中，用于抗驚厥治療方法中的肽的進一步特征是在其濃度最多約10倍于半最大阻斷所述E類電壓門控鈣通道所需之濃度時不能至少50％阻斷L-型、T-型、A類(P/Q-型)或B類(N-型)鈣通道。用于該方法的優(yōu)選肽具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
在進一步相關(guān)方面中，本發(fā)明包括抑制神經(jīng)垂體激素如催產(chǎn)素釋放至循環(huán)系統(tǒng)中的方法?？墒褂迷摲椒▉矸乐估缭绠a(chǎn)或者抑制射乳反應(yīng)。所述方法包括給藥在合適藥物賦形劑中的E類通道阻斷HG肽。除可阻斷E類通道的HG肽外，如在此所述，該治療法還可包括給藥L-型鈣通道阻斷劑、N-型鈣通道阻斷劑或P/Q-型鈣通道阻斷劑。在本說明書中，有效的治療方案是可以消除早產(chǎn)的方法。此等方案還可用于抑制泌乳女性的射乳反應(yīng)。
本發(fā)明還包括選擇用于上述治療方法(抑制催乳激素釋放、抗驚厥活性)之化合物的方法。該方法包括測試能夠在神經(jīng)元組織中選擇性阻斷E類鈣通道的化合物，然后選擇在其濃度不超過10-50倍于有效阻斷所述E類鈣通道中鈣電流的HG-1肽之濃度時阻斷所述電流的化合物。
在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明包括選擇用于治療如癲癇或催產(chǎn)素過度分泌的疾病的化合物的方法，在所述方法中顯示出E類鈣通道被阻斷。選擇方法包括在測定E類通道活性的試驗系統(tǒng)中測試化合物，然后選擇在其濃度不超過50倍于有效阻斷所述通道的HG-1肽之濃度時阻斷所述通道中鈣電流的化合物。示例性的篩選試驗是在此所述的神經(jīng)垂體末端的全細胞膜片鉗。再者，選擇方法可使用另外的篩選法，如N-、L-、或P/Q-型鈣通道試驗，以確保所選擇化合物對E類通道的選擇性。
在另一個方面中，本發(fā)明包括制備E類電壓門控鈣通道阻斷肽的重組方法。具體而言，為用于該方法中，本發(fā)明包括具有序列SEQ IDNO:23-SEQ ID NO:43的核苷酸片段。
通過參考附圖閱讀本發(fā)明的以下詳細描述，本發(fā)明的上述和其他目的以及特征將變得更明顯。
附圖簡述

圖1(A-C)顯示Hysterocrates gigas的粗毒液的洗脫(A)、A圖峰值的重新色譜分離(B)、和B圖峰值的重新色譜分離(C)的HPLC圖譜，其中各圖的箭頭表示HG-1峰；圖2A顯示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:2)、HG-3(SEQ ID NO:3)、HG-4(SEQ ID NO:4)、HG-5(SEQ IDNO:5)、R1(SEQ ID NO:11)、R2(SEQ ID NO:12)、R9(SEQ IDNO:13)、和R11(SEQ ID NO:14)之氨基酸序列的對比，這些序列對比顯示出保守區(qū)和半胱氨酸殘基(黑體字)；圖2B顯示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:3)、HG-6(SEQ ID NO:6)、HG-7(SEQ ID NO:7)和HG-8(SEQ IDNO:8)的序列對比，以顯示出保守區(qū)；圖2C顯示肽HG-1(SEQ ID NO:3)、HG-2(SEQ ID NO:4)、HG-8(SEQ ID NO:21)和HG-4(SEQ ID NO:22)的序列對比，以顯示保守區(qū)；圖2D顯示HG-1、HG-10(SEQ ID NO:10)、HG-2、HG-6、HG-7、HG-9(SEQ ID NO:9)、HG-8和HG-14的序列對比，以顯示保守區(qū)；圖2E顯示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:2)和HG-3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列對比，該序列對比顯示了保守區(qū)和V1-V4可變區(qū)(黑體字)；
圖2F顯示HG-1、R9、R11、HG-10和SNX-629(HG-1(7-41)；SEQ ID NO:15)的對比；圖3顯示HG-1序列與grammatoxin S1A(Lampe等人1993)和hanatoxin肽的對比，對比出以黑體字顯示的半胱氨酸殘基；圖4A-4G顯示HG-1(SEQ ID NO:23(前導(dǎo)區(qū))、SEQ ID NO:24(編碼)和SEQ ID NO:25(整個序列))、HG-2(SEQ ID NO:26(前導(dǎo)區(qū))、SEQ ID NO:27(編碼)和SEQ ID NO:28(整個序列))、HG-3(SEQ ID NO:29(前導(dǎo)區(qū))、SEQ ID NO:30(編碼)和SEQ IDNO:31(整個序列))、HG-4(SEQ ID NO:32(前導(dǎo)區(qū))、SEQID NO:33(編碼)和SEQ ID NO:34(整個序列))、HG-4′(SEQ ID NO:35(前導(dǎo)區(qū))、SEQ ID NO:36(編碼)和SEQ ID NO:37(整個序列))、HG-6(SEQ ID NO:38(前導(dǎo)區(qū))、SEQ ID NO:39(編碼)和SEQ IDNO:40(整個序列))、和HG-9(SEQ IDNO:41(前導(dǎo)區(qū))、SEQ IDNO:42(編碼)和SEQ ID NO:43(整個序列))的編碼序列，其中，在各序列中，前導(dǎo)序列的開始都以一直線和字母“L”表示，成熟肽編碼區(qū)以一直線和箭頭表示，而編碼區(qū)的結(jié)束以第三個直線表示；圖5顯示在有或沒有33nM HG-1存在時全細胞膜片鉗(192C細胞)中鈣電流的波形曲線；圖6顯示各種HG-1濃度對穩(wěn)定表達E類(192C)和B類(S-3)型α-1亞基之細胞中峰值內(nèi)鈣電流的影響以及AgaⅢA對表達E類α-1亞基的192C細胞的影響；圖7顯示尼卡地平、ω-conotoxin MⅦA(SNX-111)、ω-conotoxin MⅦC(SNX-230)和HG-1(SNX-482)對神經(jīng)垂體末端中鈣電流(載于鋇)的影響；圖8(A-C)顯示各種化合物對鉀去極化后內(nèi)鈣濃度的濃度一作用曲線，其是以經(jīng)鈣敏感染料INDO-1處理的細胞的熒光比來測定的(A)在表達E類通道的192C細胞上，HG-1和Aga-ⅢA的作用；(B)在具有L-型和T-型兩種鈣通道的GH3細胞上，HG-1、Aga-ⅢA和尼群地平的作用，其中啟動顯示在有或沒有5μM尼群地平時在經(jīng)受鉀去極化的細胞中INDO-1熒光的典型時間長度；(C)在IMR-32成神經(jīng)細胞瘤細胞上，該細胞主要具有N-型鈣通道，HG-1、Aga-ⅢA和SNX-194(met-12至norleu-12-SNX-111)的作用；圖9A和9B顯示各種劑量的SNX-482(HG-1)對經(jīng)受聽原性刺激的DBA/2鼠中驚厥行為的作用；圖10顯示在有或沒有HG-1肽SNX-482存在時對電刺激產(chǎn)生的驚厥的累積劑量-反應(yīng)曲線；圖11A和11B顯示各種劑量的SNX-629對經(jīng)受聽原性刺激的DBA/2鼠中驚厥行為的作用；和圖12顯示0、1或5μg SNX-629對電刺激驚厥的累積劑量-反應(yīng)曲線。
發(fā)明詳細描述定義在此所用術(shù)語“多核苷酸”是指具有支持能夠氫鍵結(jié)合于典型多核苷酸之堿基的骨架的聚合物分子，其中聚合物骨架中的堿基能使所述氫鍵為聚合物分子和典型多核苷酸(如單鏈DNA)之間序列特異性的。所述堿基通常為肌苷、腺苷、鳥苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。聚合物分子包括雙和單鏈RNA和DNA、它們的改性骨架，例如甲基磷酸酯鍵。
術(shù)語“載體”是指能夠同化新型核酸、并在合適宿主中傳播新序列的核苷酸序列。所述載體包括但不限于重組質(zhì)粒和病毒。包括本發(fā)明之核酸的載體(如質(zhì)?；蛑亟M病毒)可處在負載體中，例如與蛋白質(zhì)復(fù)合的質(zhì)粒、與磷脂基核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或者其他非病毒載體系統(tǒng)復(fù)合的質(zhì)粒。在此所用術(shù)語“多肽”是指由通過肽鍵鍵合在一起的單鏈氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。術(shù)語“蛋白質(zhì)”與術(shù)語“多肽”同意，或者另外指兩個或更多的多肽的復(fù)合物。
在此所用術(shù)語“基本同源”或者“基本相同”以及類似的說法是指一個氨基酸序列與另外一個氨基酸序列或者一個多核苷酸序列與另外一個多核苷酸序列，當將這些序列以最合適的序列對比進行比較時，至少有70％、更優(yōu)選80％或更大是一致的。對于核苷酸序列，該術(shù)語還意味著未確定的核苷酸序列能夠在特異性多核苷酸序列之雜交探針的篩選試驗中被檢測出。Ⅰ、E類電壓門控鈣通道阻斷肽此部分描述本發(fā)明的新一類肽，集中在它們的結(jié)構(gòu)特性上。E類電壓門控鈣通道阻斷肽也被稱為HG肽或者HG-1衍生物或類似物，在其結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對它們進行限定，并如以下第Ⅱ部分所述進一步在其體外鈣通道阻斷特異性的基礎(chǔ)上對它們進行限定。A、E類電壓門控鈣通道阻斷肽的分離HG肽可根據(jù)許多使用現(xiàn)有標準技術(shù)的方法來鑒定和分離。原則上，此類方法包括天然物質(zhì)的生化學(xué)純化、核苷酸編碼序列的分離和/或鑒定、以及特征分子的合成或重組制造。在以下實施例中，“天然物質(zhì)”是具體舞蛛種類的毒液腺，可以理解的是在此所述的分離和/或鑒定技術(shù)通常可適用于舞蛛以及其他蜘蛛和生物。以下實施例將描述這些方法。
1、Hysterocrates gigas毒液之HG-1的純化。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對E類鈣通道有選擇性的肽可在Old World和New World舞珠如H.Gigas中鑒定并分離。這些肽在中性pH下是相對酸性的，并是相對疏水性的。因此，它們通常通過利用這些性質(zhì)的方法來分離。這些方法通常已由Newcomb等人(1989)描述。
實施例1提供了能夠用于從H.gigas毒液中純化HG-1的示例性方法。簡而言之，根據(jù)標準“乳化(milking)”技術(shù)收集蜘蛛毒液，然后閃冷至使用。將溶化的樣品放入HPLC柱中，其細節(jié)見實施例1。根據(jù)標準技術(shù)，通過220nm處的吸光度和內(nèi)源性熒光檢測洗脫。在125分鐘內(nèi)1ml/min的0-100％線性梯度的甲醇12mM磷酸鈉(pH6.2)溶液可使毒液組分產(chǎn)生良好的分離。
圖1A顯示了HPLC柱洗脫產(chǎn)生的吸光度(A220；上曲線)和熒光(下曲線)，在該HPLC柱上裝有粗H.gigas毒液，其細節(jié)見實施例1。箭頭代表HG-1活性的峰值，其是用在192C細胞(用E類通道穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細胞)上進行的電生理學(xué)測定來估測的，具體見實施例6。圖1B顯示了使用0.1％TFA緩沖水溶液對圖A的峰重新進行色譜分析得到的洗脫曲線，而圖1C是使用0.05％HFBA緩沖水溶液對圖B的峰重新進行色譜分析得到的洗脫曲線。
那些不存在于活性且包含HG-1之組分(glu和ile)中的氨基酸的Edman降解以及氨基酸分析表明，TFA純化的物質(zhì)(圖B中的活性峰)為95-99％純(其中該峰的早期洗脫部分具有更高的純度)。由該分離中得到的活性物質(zhì)通過使用0.05％七氟丁酸(HFBA)緩沖水溶液(0-65％甲醇5分鐘，然后65-85％50分鐘，圖1C)重新進行色譜分離。Edman降解和氨基酸分析后，該物質(zhì)為99％或更高的純度。
使用上述方法，H.gigas的毒液可重復(fù)地產(chǎn)生在70-80％甲醇中洗脫并拮抗E類鈣電流的物質(zhì)。使用0.1％TFA、然后是0.05％HFBA緩沖水溶液，在酸性pH下通過反向色譜得到進一步的純化。1ml樣品的生物測定表明，E類鈣拮抗劑與在這些溶劑系統(tǒng)(箭頭，圖1B和1C)上的主要材料共同進行色譜分析；如所測定的那樣，兩者通過全細胞膜片鉗以及去極化引起內(nèi)鈣濃度的變化。
2、HG-1結(jié)構(gòu)的確定。經(jīng)純化的HG-1肽進行基體輔助激光解吸質(zhì)譜分析。根據(jù)該過程，HG-1測得的大約分子量為4500，但內(nèi)源性熒光的存在表明其中有色氨酸。根據(jù)這些結(jié)果和氨基酸分析的結(jié)果(實施例3)，確定氨基酸組成如下表2所示。在該表中，氨基酸用常規(guī)的3字母標號表示，如果分析中沒有拆分兩個對映體(his)，或者在氨基酸分析中沒有檢測到(pro和cys)，則以DL表示。
表2HG-1的氨基酸組成
0.5nmol全長度烷基化肽的Edman降解在35位產(chǎn)生序列信息，這表明存在6個半胱氨酸殘基和1個脯氨酸殘基。用胰蛋白酶在23位切割2nmol的烷基化肽，而且羧基端片段的序列在39位上產(chǎn)生HG-1的序列，但是在40和41位處得到的Ser和Asp產(chǎn)率低(約1pmol)。通過測序胰蛋白酶片段的其余部分，證實了該序列的氨基端部分，其表明除HG-1的氨基酸41外沒有其他的序列。用羧肽酶A進行消化，證實了羧基端的Ser-Asp序列。羧肽酶A和Y都釋放游離羧基形式的Asp。在已確定手性的氨基酸(所有除gly、pro、cys和his外)中，僅檢測出L對映體。HG-1序列預(yù)測肽的分子量為4495.10道爾頓。該分子量與使用電噴射質(zhì)譜測定的(4494.86±0.11道爾頓)相一致。
HG-1的氨基酸序列見圖2所示，編號為SEQ ID NO:1。
3、HG肽之核苷酸編碼序列的分離。根據(jù)圖2所示的HG肽序列，為分離和確定編碼所示的HG肽以及其他HG肽的核苷酸的編碼序列，設(shè)計并合成寡核苷酸引物。分離此等序列的一種有用方法是cDNA終端的PCR快速擴增(PCR-RACE)反應(yīng)(Frohman等人1988,Frohman1990)，其具體見實施例10。
以HG-1為例，根據(jù)HG-1的N-端序列(如GVDKAGC)并使用降低簡并性的昆蟲密碼子選擇，設(shè)計并制備3′寡核苷酸引物。從3-5個蜘蛛的產(chǎn)毒細胞中分離Poly-A mRNA，然后使用實施例10中描述的方法制備cDNA。該cDNA進行TdT加尾，并用作底物，對于PCR用作3′引物，基于HG-1之N-端序列的簡并寡核苷酸引物。用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，在該分析的基礎(chǔ)上，制備5′簡并引物，并用于得到在編碼區(qū)(如編碼肽的N端部分的編碼區(qū)上游)的5′端的非編碼區(qū)。該方法可有利于從小量的起始物得到完全的編碼區(qū)。分離片段的序列根據(jù)本領(lǐng)域已知的標準方法進行確定。示例性的核苷酸序列示于圖4A-4G中。如圖中所示，前導(dǎo)序列后是成熟肽編碼區(qū)。
所得DNA編碼片段可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來合成，插入合適的載體中，然后用于構(gòu)建產(chǎn)肽細胞，包括但不限于酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞和細菌細胞。
4、E類電壓門控鈣通道阻斷肽的合成。HG肽和HG-1肽衍生物可用化學(xué)方法來制備或者如下所述使用本領(lǐng)域已知的方法進行重組表達。
a、固相合成。根據(jù)本發(fā)明的肽可使用自動肽合成儀根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用固相合成法來合成。制備結(jié)晶形式的N-α-保護的(F-moc)氨基酸酐，然后使用側(cè)鏈保護基在N-端連續(xù)增加氨基酸。所述合成法是基于常規(guī)方法，需考慮HG-1肽是酸性易變的。從樹脂上將肽斷裂，然后在氧化和還原谷胱甘肽(1:2)存在下于pH9.5作進一步的處理(氧化)，以形成適當構(gòu)型的鏈內(nèi)二硫鍵。氧化步驟的進展通過C18柱的分析用HPLC來監(jiān)測。使用制備性HPLC系統(tǒng)(Septech環(huán)形膨脹柱，Septech,Wakefield,RI)來實現(xiàn)肽的制備性純化。
通過凝膠過濾由初始分離來分離肽，以除去肽二聚物和更高的聚合物，還可除去在氧化反應(yīng)中使用的非所希望的鹽如鹽酸胍。經(jīng)部分純化的肽通過制備性HPLC色譜作進一步的純化，然后用氨基酸組成分析來證實肽的純度。
相應(yīng)于HG-1的合成肽編號為SNX-482(SEQ ID NO:1)。相應(yīng)于HG-1(8-41)的合成肽編號為SNX-629(SEQ ID NO:15)。
b、E類電壓門控鈣通道阻斷肽的重組表達?？稍诩毦?、酵母或優(yōu)選的昆蟲細胞中根據(jù)本領(lǐng)域已知的重組法制備肽。根據(jù)一種常規(guī)的方法，從蜘蛛如H.gigas的產(chǎn)毒細胞中得到細胞DNA，然后如以上部分2的下半部分所述分離HG-1或HG-1類似物的編碼區(qū)。
或者，使用HG-1的氨基酸編碼序列來產(chǎn)生相應(yīng)的DNA編碼序列，其中密碼子選擇適用于在所選擇細胞(如細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞)中的表達。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，通過順序添加寡核苷酸來合成構(gòu)建DNA編碼序列。使用常規(guī)的限制消化和連接酶將克隆寡核苷酸并合入單個多核苷酸中。
在表達重組HG-1時，該合成編碼序列可放入任何眾多的細菌表達載體中例如λgtll(Promega,Madison WI)、pGEX(Smith等人，1985)、pGEMEX(Promega)、和pBS(Stratagene,La JollaCA)載體。其他包含合適啟動子如T7 RNA聚合酶啟動子和tac啟動子的細菌表達載體也可使用。在昆蟲細胞(Spodoptera frugiperda)中表達時，將編碼序列插入合適的桿狀病毒載體中，此等病毒載體可從Invitrogen(SanDiego,CA)得到。其他合適表達系統(tǒng)包括但不限于哺乳動物細胞(Clontech,Palo Alto,CA；Gibco-BRL,Gaithersburg MD)和植物細胞。
重組多肽可表達成融合蛋白或天然蛋白。許多特征都可人工改造進表達載體中，如促進表達序列分泌至培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列。重組制造的多肽通常可從溶解細胞或培養(yǎng)基中分離?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法進行純化，這包括但不限于分級鹽析、離子交換色譜及親和色譜法。如以下B部分所述，可采用免疫親和色譜法，其使用基于HG-1產(chǎn)生的抗體，特別是肽的保守區(qū)。
B、E類電壓門控鈣通道阻斷肽的結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明發(fā)現(xiàn)HG肽具有使它們特別適合用作E類電壓門控鈣通道之選擇性拮抗劑(阻斷劑)的藥理學(xué)特征。此部分描述術(shù)語“E類電壓門控鈣通道阻斷肽”、“HG肽和”以及“HG-1衍生物或類似物”所包括的范圍。本發(fā)明說明書中所用的術(shù)語“拮抗劑”在以下部分Ⅱ中描述和闡明。
E類電壓門控鈣通道阻斷肽以如圖2A所示的HG-1(SEQ ID NO:1)為例。如以下所述，結(jié)合與不具有所希望之藥理學(xué)特征的相關(guān)結(jié)構(gòu)對比，復(fù)合HG肽可通過對比以圖2A-2F中編號為SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15的各種結(jié)構(gòu)形成，并形成HG肽結(jié)構(gòu)限制的基礎(chǔ)。
圖3顯示了HG-1序列與其他具有相同或類似半胱氨酸殘基模式(C-C-CC-C-C)的蜘蛛鈣和鉀拮抗劑肽的對比。如圖所示，HG-1的初級序列顯示出與grammatoxm S1A(Lampe等人1993)和hanatoxin(Swartz和MacKinnon1995)肽具有某些同源性，這兩種物質(zhì)都是從舞蛛Grammostola spatulata中分離的。grammotoxin S1A是N-和P/Q-型鈣通道的非選擇性阻斷劑，對L鈣通道亞型則不是(Lampe等人1993；Piser等人1995)。hanatoxin是鉀通道拮抗劑(Swartz和MacKinnon 1995)。需注意的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，上述肽都沒有表現(xiàn)出E類鈣通道拮抗劑的活性。
從以上所述可以推論出，HG-1的半胱氨酸殘基模式以及相關(guān)的肽對于E類鈣通道選擇性是必須但不是必要的。這些肽的結(jié)構(gòu)因此代表未在所述“HG肽”之定義范圍內(nèi)的肽序列，因而只是在本發(fā)明范圍內(nèi)提供“陰性選擇”的指導(dǎo)。
例如圖2E顯示了HG-1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列與HG-2(SEQ ID NO:2)和HG-3(SEQ ID NO:3)推導(dǎo)氨基酸序列的對比。通過疊加半胱氨酸殘基進行HG-1和HG-2的序列對比，在7、14、20、21、26和34位處發(fā)現(xiàn)6個半胱氨酸。為進行該序列對比，在圖中以波折號表示的位置處引入空格。在以下的分析中，這些空格如圖2E所示仍保留編號，即使它們代表活性HG-1肽的各基團中的氨基酸缺失。“活性”是指肽化合物在阻斷E類電壓門控鈣通道的效力上比HG-1低最多1.5個對數(shù)單位(約30倍)、優(yōu)選最多1個對數(shù)單位(10倍)。
使用對比序列作為引導(dǎo)，可通過使用以下限制因素形成HG-1肽類似物或衍生物1、如圖2E中針對HG-2、HG-2和HG-3所示，肽包括在7、14、20、21、26和34位上的Cys殘基。
2、肽在中性pH時為酸性的，而且通常是疏水性的。限制因素1和2保留了E類電壓門控鈣通道阻斷肽在生理化學(xué)特性方面的基礎(chǔ)構(gòu)象以及該類化合物特性之二硫鍵模式。結(jié)合該限制因素1和2，考慮以下限制因素3和4，形成如圖2A-2D所示的示例性肽的保守衍生物，然后考慮以上限制因素1和2以及以下限制因素3和5，形成更普通的HG肽。
3、保留在肽HG-1、HG-2和HG-3(圖2E)之間相同或者在肽HG-1、R9、R11、HG-8和SNX-629(圖2F)之間相同的氨基酸位。因此，例如，除上述Cys殘基外，對于HG-1/HG-2/HG-3復(fù)合肽，保留相應(yīng)于1-9位的氨基酸(SEQ ID NO:16)。
4、進一步參考HG-1/HG-2/HG-3復(fù)合肽，在形成保守HG-1肽衍生物時，允許在11個非保守殘基(10、15-17、27-32和38位)處發(fā)生的氨基酸變異，以在母肽HG-1、HG-2和HG-3中的氨基酸取代之間改變。也就是說，將上述保守位定位于X1-X11時，該組化合物包括具有以下形式的肽結(jié)構(gòu)SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，如圖2B所示，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L、X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，而X11=L、F或G,SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC,而SEQ ID NO:18是YCAWD。
5、考慮在標準取代類(根據(jù)常規(guī)側(cè)鏈性質(zhì)和在天然同源蛋白質(zhì)中取代的最高頻率分為6類，后者是例如根據(jù)標準Dayhoff頻率交換基體(Dayhoff)來確定的)基礎(chǔ)上的取代，進一步形成衍生物。這些類是Ⅰ類Cys；Ⅱ類Ser、Thr、Pro、4Hyp、Ala和Gly，代表小的脂族側(cè)鏈和OH-基團側(cè)鏈；Ⅲ類Asn、Asp、Glu和Gln，代表能夠形成氫鍵的中性和負電荷側(cè)鏈；Ⅳ類His、Arg、和Lys，代表堿性極性側(cè)鏈；Ⅴ類Ile、Val、和Leu，代表分枝脂族側(cè)鏈，以及Met；和Ⅵ類Phe、Tyr、和Trp，代表芳香側(cè)鏈。另外，各組可包括相關(guān)氨基酸類似物，如在Ⅳ類中的鳥氨酸、高精氨酸、N-甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸或三甲基賴氨酸，以及在Ⅵ類中的環(huán)己基丙氨酸或鹵化酪氨酸。而且，分類可包括L和D立體異構(gòu)體，但是L-氨基酸對于取代是優(yōu)選的。根據(jù)上述分類，在序列SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD中各位置上的取代可從以下分類中選擇X1=Ⅴ類，X2=Ⅱ類，X3=Ⅳ或Ⅴ類，X4=Ⅲ類，X5=Ⅲ類或Ⅳ類或缺失，X6=Ⅳ或Ⅴ類，X7=Ⅱ或Ⅳ類，X8=Ⅱ或Ⅴ類，X9=Ⅵ類，X10=Ⅱ或Ⅲ類，而X11=Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。
進一步的例子是，也是形成部分本發(fā)明，圖2F顯示所選擇的序列HG-1、R9、R11、HG-8、HG-10和SNX-629的序列對比。如上所述合并這些序列形成具有以下形式的復(fù)合序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中，V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。該序列可進一步泛化，以在X1-X15位上包括上述的Dayhoff類取代。
在更普通的意義上，進一步希望的是E類阻斷肽可通過由上述合適取代類產(chǎn)生氨基酸取代來形成。另外，還希望的是肽的C-和/或N端延伸是可接受的，只要上述半胱氨酸殘基之間的空間關(guān)系保持不變即可。上述氨基酸取代規(guī)則的目的是作為E類電壓敏感鈣通道阻斷肽范圍內(nèi)允許氨基酸取代的一個指導(dǎo)。如果進行氨基酸取代或改性，則要進一步如部分Ⅱ所述根據(jù)選擇性阻斷E類鈣通道的能力篩選肽。
也可根據(jù)本發(fā)明以及部分Ⅱ中所述的化合物測試法來鑒定具有E類通道阻斷活性的鈣通道拮抗劑化合物。在篩選方法中，篩選測試肽之選擇性抑制E類鈣通道的能力。如果化合物(ⅰ)在其濃度不超過10-50倍于阻斷E類電壓門控鈣通道所需之HG-1濃度時，相同程度地有效阻斷該通道的鈣電導(dǎo)率；以及(ⅱ)在其濃度為約10倍于半最大阻斷E類電壓門控鈣通道所需之摩爾濃度時，不能至少50％阻斷L-型、T-型、P/Q型鈣通道，則根據(jù)本發(fā)明測試化合物可選擇用于阻斷E類通道。
優(yōu)選的篩選方法見部分Ⅱ，其細節(jié)見實施例5-9。Ⅱ、E類電壓門控鈣通道的藥理學(xué)特性此部分描述E類電壓門控鈣通道阻斷肽的藥理學(xué)特性。該藥理學(xué)特性能夠?qū)x擇根據(jù)本發(fā)明的肽，更具體而言是選擇用于治療部分Ⅲ所述病癥的肽提供指導(dǎo)。
在部分Ⅰ中，已確定HG肽和HG-1衍生物肽與某些結(jié)構(gòu)標準相符。另外，本發(fā)明認為如在重組細胞中構(gòu)建或者從天然物質(zhì)中分離，如以下所述，有用的肽應(yīng)能夠選擇性地阻斷E類電壓門控鈣通道。A、E類電壓門控鈣通道的阻斷E類鈣電流可根據(jù)本領(lǐng)域評估鈣在可興奮膜兩側(cè)移動的許多方法來測定，如去極化誘導(dǎo)鈣流入細胞、或者全細胞或端膜片(電生理技術(shù)，見實施例6)。通常來說，E類拮抗劑HG肽拮抗這些電流，優(yōu)選是其濃度最大為10-50倍于HG-1對其他電流產(chǎn)生作用的摩爾濃度。
為確定具體的測試化合物對E類通道是否為選擇性的，可在幾種細胞類型中測定鈣通道活性，所選的細胞具有相對均一的電壓敏感離子通道前垂體細胞系--GH3，具有L-型和T-型兩種鈣電流；IMR-32成神經(jīng)細胞瘤細胞系，據(jù)報道包含明顯比例的N-型鈣電流(Carbone等人1990)；192C細胞系，如在此所述被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染表達E類通道；以及由后垂體得到的神經(jīng)垂體末端制劑，其表達以前的“耐藥性”鈣電流，該電流在支持本發(fā)明的試驗中被認為是E類通道。另外，在IMR-32細胞中測量鈉和鉀通道活性，然后如以下所述在Xenopus卵母細胞中瞬時表達所選的通道(A類鈣和鉀通道)用其它通道活性測量。
1、電生理學(xué)測量。使用全細胞膜片鉗記錄鈣電流，由此常規(guī)地測量鈣通道活性。為此可使用具有E類通道的一種或更多種制劑。在一種制劑中，神經(jīng)垂體末端制劑，細節(jié)見實施例6B及如下所述，使用藥理學(xué)雞尾酒阻斷其他類型的鈣通道(如P/Q型和L-型通道)以及制劑中的鈉通道。殘留的高電壓活化電流是HG-1敏感性的，并因此定義為E類通道。該制劑適合于實施例6B所述的標準膜片鉗法。
另外，可通過在細胞中添加E類通道的各種亞基的編碼序列，在哺乳動物細胞中穩(wěn)定地共同表達該通道。例如，如果人α1E(WO95/04144)、鼠α2(第5,407,820號美國專利)和β鈣通道亞基的編碼序列共同轉(zhuǎn)染在細胞中，這些亞基可形成在E類通道內(nèi)。再者，根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法，人α1E亞基可與其他來源的α2和β亞基相互組合，形成用于測試的電生理學(xué)功能通道。
a、全細胞試驗。圖4顯示了在有或沒有33nM HG-1存在時、由192C細胞(被α-1E亞基穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細胞，Home等人，1995)的全細胞膜片鉗測定鈣電流的波形。根據(jù)實施例6A所述的方法，由-90mV的保持電勢至0mV的脈沖引發(fā)電流。電流衰變的分析表明在有或沒有33nM HG-1存在下(減去400mSec時測定的預(yù)穩(wěn)態(tài)電流值后的動力學(xué)分析)在192C細胞中引發(fā)了鈣電流的單指數(shù)衰變(速率常數(shù)=12.5sec-1)。
為確定濃度-作用參數(shù)，在不同的HG-1濃度下得到記錄，其中如上所述，在內(nèi)電流的峰值時評估肽作用。圖6顯示各種濃度的HG-1和AgaⅢA對192C細胞中峰值內(nèi)鈣電流的作用。圖6還顯示了各種濃度的HG-1對S-3細胞穩(wěn)定表達B類α-1型亞基(S-3)的作用，其中各數(shù)據(jù)點代表各濃度下3-5個獨立測量的平均值和標準偏差，一個細胞在1或2個濃度下使用。
如圖所示，HG-1阻斷192C細胞中表達的E類電流，其IC50為25nM，而對B類電流估計為約800nM。這些值與以下所述用INDO-1去極化引發(fā)之通道試驗中所得的表觀IC50值相符合。Aga-ⅢA阻斷192C細胞中的E類電流，其IC50為4nM。該值也與以下的INDO-1試驗一致。
HG-1對E類電流的選擇性可進一步在Xenopus卵母細胞中證實，其中所述卵母細胞用于表達A類α-1亞基。Aga ⅢA和鎘測定對P/Q鈣通道的作用。在這些試驗中，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，為技術(shù)原因測定在鈣通道中通過的鋇電流(4mM鋇，無添加鈣，在培養(yǎng)基中)。在高至280nM的濃度時，HG-1對電流沒有作用。相反地，60nM Aga-ⅢA部分阻斷、而鎘完全阻斷該電流。
b、神經(jīng)垂體末端試驗。在其他支持本發(fā)明的試驗中，已發(fā)現(xiàn)E類阻斷HG肽阻斷多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌組織中的電壓門控鈣通道，而以前發(fā)現(xiàn)這些通道對其他已知鈣通道阻斷劑的雞尾酒是耐受性的。實施例6B提供了在神經(jīng)垂體末端中化合物制劑及其電生理學(xué)測試的細節(jié)。近來表明這些末端釋放某些肽激素(催產(chǎn)素、加壓素)，其方式可用在神經(jīng)元中鑒定的各種鈣通道差別調(diào)節(jié)(Wang)。因此，企圖使電生理學(xué)參數(shù)和肽釋放相關(guān)的研究已揭示出，可按照與組合L-型、N-型和P/Q型鈣通道的調(diào)節(jié)相一致的方式抑制加壓素(AVP)釋放；相反地，在有上述通道類型之藥理學(xué)阻斷劑存在時，仍持續(xù)殘留的經(jīng)刺激的催產(chǎn)素釋放(Wang)。
在相同的神經(jīng)垂體末端制劑中，如圖7所示，2.5μm尼卡地平用于阻斷神經(jīng)末端的L-型電流。添加高濃度的N-和P/Q-型阻斷劑SNX-111(3μm)和SNX-230(144nM)組合可部分但不是全部阻斷殘留電流。進一步添加40nM的HG-1肽(SNX-482)可導(dǎo)致殘留電流的完全阻斷。
根據(jù)本發(fā)明，可使用類似方法來測試其他E類阻斷肽的效力。
2、去極化引發(fā)鈣流入。電壓敏感鈣通道活性也可在可興奮細胞中通過測量應(yīng)答去極化作用如電刺激、刺激性神經(jīng)遞質(zhì)或者高濃度的細胞外鉀產(chǎn)生的鈣流入來測定。因此，一個化合物阻斷去極化刺激鈣流入的能力是其通道阻斷活性的表示。
如果所用制劑具有單通道類型或者主要是單通道類型，該技術(shù)對于測定通道特異性是特別有效的。如以下所述，在某些情況下，可用已知的通道拮抗劑阻斷離子由第二通道的流入，這樣，測量是在感興趣的主通道進行的。
為監(jiān)測IMR-32細胞中的N-型鈣通道活性，還加入飽和濃度的尼群地平(二羥基吡啶)來阻斷該細胞中的L-型鈣通道。同樣，GH-3細胞暴露在飽和濃度的尼群地平中，以僅測量T-型鈣通道活性。
測量三種細胞系中鈣電流的具體方法見實施例5。簡而言之，根據(jù)常規(guī)方法在細胞中加入鈣指示劑染料INDO-1乙酰甲基酯(MolecularProbes)。如上所述，在任何第二通道阻斷劑存在下，在細胞中加入測試化合物。然后將細胞暴露在去極化濃度的鉀離子中。在用鉀刺激時，細胞中的胞內(nèi)鈣通常由100-150nM的基線值增加至接近1μm的刺激值。如實施例5所述，從這些數(shù)據(jù)可計算濃度作用曲線。用對L-型電流(尼群地平)、N-型電流(SNX-111=合成ω-conopeptideMⅦA)特異性鈣拮抗劑以及低選擇性鈣拮抗劑(SNX-230=合成ω-conopeptide MⅦC和ω-Aga-ⅢA和非洛地平)的獨立試驗證實不同試驗信號的藥理學(xué)特異性。
在全細胞上進行熒光研究，該細胞被遺傳改造以表達鈣通道α1E亞基，如上述的192C細胞；或者，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法此研究在神經(jīng)垂體末端制劑中進行。在遺傳改變細胞中去極化引發(fā)的內(nèi)鈣增加對ω-conopeptides MⅦC和MⅦA是耐受性的，而這兩種物質(zhì)分別阻斷P/Q通道和N-型鈣通道，所述內(nèi)鈣增加對二羥基吡啶(L-通道阻斷劑)尼群地平也是耐受性的。在此等試驗中，如Grynkiewicz等人(1985)所述，400nm和490nm處的INDO-1熒光比隨時間的變化與鈣濃度有關(guān)。
圖8A顯示了上述INDO試驗中得到的濃度作用曲線。數(shù)據(jù)以百分熒光比來表示，該比例提供在對照條件(即沒有通道阻斷劑時鉀刺激細胞中的百分鈣含量)下細胞中存在的鈣。如圖所示，HG-1阻斷鉀刺激的鈣向這些細胞中的流入，其表觀IC50為15nM(圖8A，實心方塊)。
Aga-ⅢA也阻斷去極化引發(fā)的鈣向細胞中的流入(表觀IC50為5nM，圖8A，實心圓)。這些結(jié)果與E類Ca2++通道的藥理學(xué)一致(Palma等人1994)。相反地，如以下所述，HG-1不阻斷鈣向GH-3細胞或IMR細胞中的流入。據(jù)報道，通過全細胞膜片鉗記錄鋇電流，前垂體細胞系--GH3具有L-型和T-型兩種鈣電流(Lievano等人，1994)。與此一致的是，二羥基吡啶尼群地平僅阻斷去極化引發(fā)之內(nèi)鈣增加的持續(xù)組分，而該鈣增加在60秒內(nèi)不失活(表觀IC50為400nM)，而且即使?jié)舛却笥?μM時，也不會完全阻斷內(nèi)鈣的瞬間增加(圖8B和開始)。存留的瞬間內(nèi)鈣增加完全被二羥基吡啶非洛地平阻斷(表觀IC50為600nM)。該二羥基吡啶在4μM和以下濃度時完全阻斷心肌細胞中的L-型鈣通道(Cohen等人1994)。HG-1在500-600 nM濃度時對去極化后40秒時評估的總內(nèi)鈣增加沒有作用，而且對5μM尼群地平(圖8B，開始)存在時內(nèi)鈣峰值(去極化后10秒)也沒有作用，這表明HG-1不抑制L-型或T-型電流。相反地，Aga-ⅢA對這些細胞中去極化引發(fā)的信號產(chǎn)生強效但是部分的阻斷作用(圖8B，表觀IC50=1.5nM，在去極化后60秒評估)，這與其報道的心肌中L-型電流的強效阻斷是一致的(Cohen等人，1994)。
如上所述，IMR-32成神經(jīng)細胞瘤細胞系具有鈣(鋇)電流，該電流對N-通道選擇性ω-conopeptide GVIA是敏感的(Carbone等人，1990)。與觀察到的一致，在這些包括阻斷L-通道活性的尼群地平、SNX-194(N-通道阻斷ω-conopeptide，其是ω-conopeptide MⅦA的met-12至nle-12衍生物)的細胞制劑中，幾乎完全抑制內(nèi)鈣之殘留瞬間去極化引發(fā)的增加，其表觀IC50為1nM(圖8C)。Aga-ⅢA對IMR-32細胞中引發(fā)的內(nèi)鈣濃度增加具有類似的作用(表觀IC50=0.1nM)。HG-1對該電流有小的作用，而且還是在高濃度(IC50＞400nM)時。
根據(jù)實施例7中所述的方法進行測定，當在40nM濃度下灌流時，HG-1對IMR-32成神經(jīng)細胞瘤細胞中的鈉和鉀電流沒有作用。如實施例9中所測定的，HG-1對Xenopus卵母細胞表達系統(tǒng)中單個的克隆鉀通道Kv1.1、Kv1.2和Kv1.4也沒有作用。B、E類鈣通道的選擇性上述A部分中討論的研究還指出了HG肽的第二個重要特征，即它們相對于其他類型的鈣電流阻斷E類鈣電流的選擇性。例如，雖然蜘蛛肽ω-Aga ⅢA拮抗E類鈣通道(Palma等人，1995)，但還不能將其視為選擇性配體，這是因為它可強效地阻斷N和L-型鈣電流(Cohen等人1993,Ertel等人1994)。相反地，如以上研究所證實的，當其濃度為至少10倍于半最大阻斷E類電壓門控鈣通道之濃度，將示例性的HG肽HG-1在N-型、L-型、P/Q型或T-型鈣電流、或者對鈉或鉀通道上測試時，該肽實際上對這些通道沒有作用。C、E類鈣通道拮抗劑的選擇從以上支持本發(fā)明的試驗中可以看出，HG肽(如具有部分ⅠB中所述結(jié)構(gòu)特征和部分Ⅱ中所述藥理學(xué)特征的肽)特異性阻斷E類鈣通道，其證據(jù)是與阻斷由其他已知類鈣通道中通過的電流需要相對較高的濃度(如N-型(IC50約為800nM)、P/Q-型、T-型和L-型)相比，該化合物在相對較低的濃度(IC50為15-25nM)即可阻斷E類通道中的電流。
根據(jù)本發(fā)明，對鈣通道為選擇性的肽符合上述部分Ⅰ中描述的結(jié)構(gòu)限制和上述活性特征。因此，E類通道選擇性阻斷肽是符合部分Ⅰ中所述之基本結(jié)構(gòu)限制的肽其如圖2E所示包括在相應(yīng)于7、14、20、21、26和34位的位置上的Cys殘基，并優(yōu)選具有三個鏈內(nèi)二硫鍵。在一個普通實施方案中，HG肽符合所示的HG-1/HG-2/HG-3或者HG-1/HG-8/R9/R11/SNX-629肽復(fù)合物的普通形式，但可包括在Dayhoff取代基范圍內(nèi)用于鏈中各附加位置的取代。在另一個實施方案中，E類鈣通道阻斷HG肽保留用于在此所述的一個或多個或復(fù)合肽的保守區(qū)，而且變化區(qū)將包括各變化位置所限定的取代。例如，對于HG-1/HG-2/HG-3肽，該肽的形式為SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中變化位置X1-X11如下選自于Dayhoff取代分類中X1=Ⅴ類，X2=Ⅱ類，X3=Ⅳ或Ⅴ類，X4=Ⅲ類，X5=Ⅲ或Ⅳ類或缺失，X6=Ⅳ或Ⅴ類，X7=Ⅱ或Ⅳ類，X8=Ⅱ或Ⅴ類，X9=Ⅵ類，X10=Ⅱ或Ⅲ類，而X11=Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。
在另一個實施方案中，在11個非保守殘基(位置10、15-17、27-32和38)上發(fā)生的氨基酸變異是允許的，以在母肽中的氨基酸取代之間變化。此中，更具體地以HG-1/HG-2/HG-3為例，肽的形式為SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中如圖2E所示，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，而X11=L、F或G,SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ IDNO:17是DDCCPRLGC，而SEQ ID NO:18是YCAWD。前述經(jīng)取代的肽在此定義為“HG-1/HG-2/HG-3復(fù)合肽”。
根據(jù)上述標準選擇的肽如果對E類鈣通道是選擇性的，則可用于本發(fā)明中。該段的部分B描述了可用于測定此選擇性的試驗方案。具體而言，如果化合物能夠在比其阻斷其他已知鈣通道(如N-型、L-型、T-型和P/Q-型通道)或者其他在可電興奮細胞中的重要離子通道(如鈉或鉀通道)的濃度低得多的濃度下阻斷E類通道，則認為該化合物對E類通道是選擇性的?！暗偷枚嗟臐舛取笔侵概c抑制其他離子通道，特別是L-型、N-型和T-型電壓門控鈣通道相比，抑制E類鈣通道的有效摩爾濃度(以IC50計，更優(yōu)選Ki)至少相差10-50倍。
因此，使用HG-1肽(SEQ ID NO:1)為例子，HG-1符合上述Ⅰ段所限定的最保守性的結(jié)構(gòu)限制(即限制因素1-4)。如果用在測試對E類鈣通道的選擇性，根據(jù)兩個獨立的通道阻斷活性測量，該肽阻斷E類通道的IC50在15-25nM范圍內(nèi)。HG-1沒有阻斷L-型、T-型或P/Q型通道的證據(jù)，而且阻斷N-型通道的IC50為＞400-800nM。該化合物也沒有在相對較高濃度下阻斷鉀或鈉通道的證據(jù)。因此，HG-1是選擇性對E類鈣通道阻斷的。
同樣，在支持本發(fā)明的試驗中，還表明截短的HG-1肽SNX-629(SEQ ID NO:15)在其濃度少于約20倍于HG-1在相同試驗(抑制鈣吸收)中的濃度時抑制E類鈣通道；因此，根據(jù)本發(fā)明，SNX-629是有效阻斷E類通道的HG-1衍生物肽的候選者。
作為相反實施例，肽Aga ⅢA也表現(xiàn)為E類通道阻斷劑的活性，其阻斷通道的IC50為0.1nM(電生理學(xué)測量)-15nM(鈣流入)。但是，Aga ⅢA不在如上所述并如圖2和3所示的E類鈣通道阻斷肽的限定結(jié)構(gòu)內(nèi)。而且，該肽不是R-通道選擇性，因為它還阻斷N-型鈣通道，其IC50為約0.1nM。Ⅲ、實用性選擇性拮抗E類鈣通道的HG肽和HG肽衍生物可用于治療許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是那些涉及在腦中線區(qū)(有尾殼、丘腦、下丘腦、扁桃體、小腦)以及在前中腦和腦干的核中非正常信號傳遞的疾病，包括如下所示，投射至垂體中，特別是從下丘腦。鈣從E類鈣通道中的進入還起到細胞內(nèi)信使的作用，這涉及其他離子通道和細胞蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。因此，肽可在細胞和網(wǎng)絡(luò)水平上影響信號傳遞。得益于E類鈣通道阻斷的神經(jīng)疾病可包括但不限于缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷、癲癇、急性和慢性疼痛、以及心理疾病。以下描述本發(fā)明的兩個示例性應(yīng)用。A、抗驚厥活性在支持本發(fā)明的試驗中，按照標準的試驗動物癲癇發(fā)作模型--DBA/2聽原性癲癇發(fā)作模型測試本發(fā)明的HG肽，該模型用于評估化合物抗驚厥活性、在癲癇以及其他腦癲癇發(fā)作疾病中的潛在應(yīng)用。在該模型中的測試步驟的詳細內(nèi)容可見實施例11。簡言之，遺傳性易于癲癇發(fā)作的小鼠--DBA/2小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)當暴露于特殊頻率和強度的聲源時，表現(xiàn)出可重復(fù)的癲癇發(fā)作行為模式。在該模型中已發(fā)現(xiàn)具有各種結(jié)構(gòu)的化合物都是活性的，該模型與溫度無關(guān)。這后一點對于誘導(dǎo)低溫的鈣通道阻斷劑是特別重要的，而低溫在許多動物中又是抗驚厥劑。
圖9A和9B顯示了測試結(jié)果，其中，小鼠(18-21天，約7-10g)在聲刺激前30分鐘通過腦室內(nèi)途徑給藥0.5-5μg HG-1(SNX-482)。在圖9A中顯示了在聲刺激過程中表現(xiàn)四種主要行為之一的百分測試小鼠(N=10/劑量)狂奔、陣攣性癲癇發(fā)作、緊張性癲癇發(fā)作和呼吸停止。圖9B顯示了各種動物的總癲癇發(fā)作分數(shù)，其中，癲癇發(fā)作根據(jù)強度分為0-4級，0=無癲癇發(fā)作活動，1=僅有狂奔，2=狂奔+陣攣性癲癇發(fā)作，3=狂奔+陣攣性癲癇發(fā)作，4=狂奔+陣攣性癲癇發(fā)作+緊張性癲癇發(fā)作+呼吸停止。DBA/2小鼠中抗驚厥作用的ED50約為0.8μg/鼠i.c.v.。圖10顯示在有或沒有SNX-482時對增加電刺激反應(yīng)在小鼠中產(chǎn)生驚厥的累積劑量-反應(yīng)曲線。
同樣，圖11A和11B顯示了研究結(jié)果，在該研究中，DBA/2小鼠在暴露于聲刺激前i.c.v.給藥SNX-629。在此發(fā)現(xiàn)約5μg/鼠的ED50。在前述研究中，數(shù)值通常得自于在此所示的圖，而且基于2-3輪、每輪各10只鼠。圖12顯示了用SNX-629(1或5μg)治療小鼠對電刺激驚厥的作用。B、神經(jīng)內(nèi)分泌治療在支持本發(fā)明的試驗中，并如上所述，已表明在催產(chǎn)素分泌中涉及R-型鈣通道。在孕婦生產(chǎn)過程中以及在泌乳母親的射乳反應(yīng)中涉及催產(chǎn)素。HG肽可用于抑制催產(chǎn)素從垂體中的釋放，由此(ⅰ)防止早產(chǎn)，和/或(ⅱ)在泌乳女性不希望哺育嬰兒或者希望停止哺乳時抑制射乳反應(yīng)。
對于上述方法，所述肽可以任何途徑給藥，使血藥濃度足以阻斷所希望位置處的鈣通道。例如，因為后垂體鄰近一個富毛細血管床(門毛細血管叢)，而所述垂體向該毛細血管床中釋放激素，使藥物靶向該毛細血管床的給藥方法特別有利于抑制催產(chǎn)素由神經(jīng)垂體的釋放。類似地，釋放肽至腦中的給藥方法有利于產(chǎn)生抗驚厥活性。可從在此所述的合適動物模型中外推出適當?shù)膭┝俊?br> 給藥方式包括但不限于例如靜脈內(nèi)給藥、肺部釋放(鼻吸入)、使用透皮藥貼等。這些方法中適用于釋放肽的可接受賦形劑在本領(lǐng)域中是已知的(Banga)。對于肽，口服(胃，或優(yōu)選頰)以及直腸給藥也是可以接受的，而且可與本發(fā)明一起使用。
鼻腔給藥肽的優(yōu)點是避免了肝臟循環(huán)中的首過效應(yīng)，并因而相對較快地使肽發(fā)揮作用，并使消除濃度最小。所述肽可在合適鹽和提供等滲性及穩(wěn)定pH的緩沖劑存在下制成噴霧劑。該方法對于較小的肽通常是最合適的，而且使用某些滲透增強劑如溶血磷脂酰膽堿或非離子洗滌劑可有助于HG肽跨過鼻粘膜的轉(zhuǎn)運。
同樣地，肺部給藥也可避免肝臟首過效應(yīng)。該給藥方式以及在利用該方式時應(yīng)堅持的謹慎措施在本領(lǐng)域中是已知的。通常來說，肽可配制成由一個裝置產(chǎn)生的氣霧劑，所述裝置例如是計量吸入器、噴霧器或干粉吸入器。產(chǎn)生的氣霧劑應(yīng)具有所選擇的質(zhì)量平均氣動直徑(MMAD)，以沉積在肺部，所述直徑是粒徑、形狀和密度的函數(shù)。通常情況下，MMAD為約1-6μm的顆粒對向肺部的釋放是最合適的。如需要也可在制劑中添加滲透增強劑和/或蛋白酶抑制劑。
雖然可通過標準的胃腸道由口服給藥肽，但如果肽的預(yù)期作用點是垂體，則頰或舌下給藥是優(yōu)選的。頰粘膜是覆蓋臉頰內(nèi)部之口腔粘膜的一部分。對于本發(fā)明的肽，使用口腔粘膜粘合劑型，如帶有粘性表面(羥丙基纖維素、carbopol)的片劑，則可在長時間接觸中促進藥物的吸收。除肽酶抑制劑外，滲透增強劑如非離子和離子表面活性劑也可有利于肽通過該途徑的吸收(Banga)。
在選擇給藥方法時，臨床醫(yī)師也可滴加患者反應(yīng)所需量的抑制劑，例如治療早產(chǎn)時，臨床醫(yī)師可監(jiān)視宮縮，并相應(yīng)地改變藥物量。為此目的，靜脈內(nèi)給藥是可接受的，但是也可使用任何的上述方法。優(yōu)選的是，HG肽的給藥量足以產(chǎn)生約1-200nM HG-1肽的濃度(或者相關(guān)HG肽的生理相當量)；但如上所述，實際的給藥量取決于臨床醫(yī)師對患者反應(yīng)的評估、以及其他標準因素如患者體重、循環(huán)狀況等。此等決定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)的。
通常情況下，在治療此等神經(jīng)疾病時，如果所給劑量在作用點產(chǎn)生約10-100nM或更高濃度，則化合物是有效的。根據(jù)待治療患者的重量、作用點、以及化合物的藥代動力學(xué)，產(chǎn)生此等濃度所需的劑量和給藥途徑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。材料和方法A、Hysterocrates gigas毒液通過電場刺激收集雄性品種的毒液，然后閃凍(InvertebrateBiologics,Los Gatos,CA)。B、Agelenopsis aperta毒液從Spider Pharm(Feasterville,PA)得到凍干毒液。然后將該凍干毒液(等于0.5ml初始毒液體積)懸浮于0.5ml 0.1N HCl中后直接施用在Sephadex G-50(Pharmacia,Piscataway,NJ)大小排阻層析柱上。C、細胞系從American Type Culture Collection(ATCC Accession No.CRL 1573,Rockville,MD)得到人成神經(jīng)細胞瘤細胞系IMR-32、鼠垂體細胞系GH-3、以及人胚胎腎細胞系293(HEK)，并將它們保存在添加有2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。S3和192C細胞是HEK細胞，如下所述，這兩種細胞可分別穩(wěn)定地表達B類和E類鈣通道。D、HEK293細胞的轉(zhuǎn)染如PCT公開WO95/04144中所述，在pcDNAⅢ中構(gòu)建載有人α-1E(hα-1E)鈣通道亞基之編碼區(qū)的載體，所述專利的內(nèi)容在此引入作為參考。用本領(lǐng)域已知的標準方法(磷酸鈣或脂轉(zhuǎn)染胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)轉(zhuǎn)染HEK細胞，以形成表達E類電壓敏感鈣通道的192C細胞。
類似地，如Ellinor等人(1994)所述，由人α-1B鈣亞基轉(zhuǎn)染HEK細胞，由此形成S3細胞。E、細胞培養(yǎng)方法S3和192C細胞保存在DMEM中，該培養(yǎng)基添加有10％胎牛血清(FBS)、0.4mg/ml潮霉素B和0.6mg/ml遺傳霉素G418(以上兩種都得自于Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)，然后在鋪板于載玻片上后2天使用。
在電生理學(xué)研究中，IMR-32細胞在添加有10％FBS的Dulbecco最小基本培養(yǎng)基(DMEM,Gibco-BRL)中培養(yǎng)，然后在無分化的情況下使用。對于內(nèi)鈣濃度的測定，在帶有Earle鹽并添加10％FBS、2mM谷氨酰胺和抗生素/抗有絲分裂混合物(Gibco-BRL)的Eagle最小基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。通過添加1mM二丁酰cAMP和2.5μM5-溴脫氧尿苷(都得自于Sigma,St.Louis,MO)使上述細胞分化，然后在分化后7-15天使用。
GH-3細胞在添加有15％馬血清、2.5％FBS和抗生素/抗有絲分裂混合物的Ham F-10培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
實施例1HG-1的純化在Gilson HPLC上用Newcomb等人(1989)描述的常規(guī)方法從Hysterocrates gigas中分離HG-1。使毒液(20-150μl)溶化，然后立即施用在填充有5μm顆粒的4.5×250mm“大孔”十八烷基二氧化硅柱(Vydac)中。用Gilson Holochrome檢測儀通過220nm下的吸光度、以及用Hewlett-Packard 1046A型熒光檢測儀(激發(fā)260nm，發(fā)射340nm,280nm發(fā)射截止過濾器)通過內(nèi)源性熒光監(jiān)測洗脫。用0-100％甲醇之12mM磷酸鈉(pH6.2)溶液的線性梯度在125分鐘的時間內(nèi)以1ml/min進行洗脫(在重新使用前，所述柱用0.1％THF-甲醇的梯度洗滌，以除去未用pH6.2緩沖液洗脫的組分)。
通過以下實施例8中描述的膜片鉗電生理學(xué)方法將拮抗E類鈣通道的組分定位在1ml餾分中，然后在真空離心中從活性餾分(包含HG-1)中除去甲醇。使用0-25％甲醇之0.1％三氟乙酸(TFA)溶液線性梯度5分鐘、然后25-80％甲醇梯度50分鐘進行進一步的分級分離。
不存在于HG-1中的那些氨基酸(glu和ile)的Edman降解、以及氨基酸分析表明，TFA純化物質(zhì)為95-99％純(峰值的早期洗脫部分具有更高的純度)。為證實HG-1的活性，使用0.05％七氟丁酸(HFBA)(0-65％甲醇5分鐘，然后65-85％50分鐘)緩沖劑水溶液對上述分離中得到的活性物質(zhì)重新進行色譜分離。以Edman降解和氨基酸分析估算，該材料的純度為99％或更高。
實施例2ω-Aga-ⅢA的純化A.aperta毒液在Sephadex G-50上進行大小排阻色譜分離，然后進行兩步反相色譜分離(與實施例1中所述的Vydac柱相同)，由此分離ω-Aga-ⅢA(Venema等人，1992)；首先使用2 mM磷酸鉀pH2.8-乙腈的梯度，然后使用0.1％TFA-乙腈的梯度(兩個梯度為0.75％乙腈每分鐘)。特征ω-Aga-ⅢA由Dr.Mike Adams(University ofCalifomia,Riverside)提供，并用作監(jiān)測肽洗脫位置的標準物。使用天然肽經(jīng)過20-30個循環(huán)的Edman降解來證實主要包含Aga-ⅢA序列(通常＞95％)的餾分，使用以電噴射法的質(zhì)譜分析來說明樣品由Aga-ⅢA組成(與Ertel等人，1993描述的實施方案相反)。如果情況不是如此，使用0.05％HFBA-甲醇的梯度(1.675％甲醇每分鐘)進一步純化Aga-ⅢA，得到純度為99％或更高的制劑。
實施例3結(jié)構(gòu)和序列測定A、氨基酸分析在氨基酸分析前，經(jīng)純化的肽樣品進行酸解或者酶降解。于110℃下使樣品(50-70pmol經(jīng)純化的HG-1每小瓶)在TEFLON塞住的自動進樣器小瓶中的6N HCl中進行酸解20和48小時。通過與標準物(100pmol各L-氨基酸)的對比測定酸解物的氨基酸含量，所述標準物也進行酸解。
用N-乙?；?L-半胱氨酸和o-鄰苯二甲醛(OPA)(Bruckner等人，1989)然后是反相色譜和熒光檢測分析，由此進行組成和C-端分析。經(jīng)稀釋的水解物放置在自動進樣器小瓶中的40μl二甲基甲酰胺∶水1∶9中，然后使Gilson231-401自動進樣器按程序添加25μl的1mg/ml OPA和50μl的1mg/ml硫醇，這兩種物質(zhì)都在0.5M硼酸鉀pH10中?；旌?約1分鐘)后，將衍生物注射至4.5×250mmPhenomonex Primesphere“HC”十八烷基二氧化硅柱(5μm顆粒；Torrance,CA)上，該柱用15mM磷酸鈉pH6.2補償，然后用至65％甲醇的梯度洗脫87分鐘。用Hewlett-Packard 1046A型熒光檢測儀進行檢測，該檢測儀設(shè)定為340nm激發(fā)和408nm發(fā)射(408nm發(fā)射截止過濾器)。該系統(tǒng)拆分所有主要氨基酸的D和L對映體，但組氨酸除外(脯氨酸和半胱氨酸未檢測到)。
通過與L-氨基酸標準物進行對比，確定氨基酸的比例，所述標準物也經(jīng)受相同的水解處理(在6N HCl中于110℃下進行20或48小時)。與L和DL標準物進行對比，由此確定手性，在20小時的水解物中外消旋化低于5％。表1中所示的分析代表了50-70pmol的TFA(兩個系統(tǒng))和HFBA(三個系統(tǒng))純化物質(zhì)的10個獨立水解物。未列出的氨基酸(glu和ile)在組合物中的量為0.05或更低。Met和Trp的手性由天然和烷基化肽的羧肽酶消化分析來確定。色氨酸的量根據(jù)羧肽酶Y消化天然HG-1所達到的蘇氨酸比例來確定。B、肽的酶消化干燥天然和烷基化HG-1(250-500pmol)，然后用在100μl0.1M磷酸鈉pH6.2中的0.3μg羧肽酶Y(Pierce,Rockford,IL)消化。在各個時間點取出等分樣品(10μl)，并用氨基酸分析來證實HG-1中有單個的色氨酸殘基存在，還證實存在的氨基酸是L-對映體。因為羧肽酶Y消化不在HG-1的羧基端產(chǎn)生清楚的序列信息，所以在與羧肽酶Y相同的消化條件下用瓊脂糖結(jié)合的羧肽酶Y(Sigma)重復(fù)進行天然HG-1的消化。
為證實Edman降解對酶處理樣品的結(jié)果，干燥1-2nmol的HG-1，然后用在50μl0.1M磷酸鉀pH7.4中的1μg胰蛋白酶(Pierce或Worthington,Freehold,NJ)進行消化(37℃下4小時)。如上所述，使用0-100％梯度的甲醇0.1％TFA溶液在1小時中拆分組分。C、肽還原和烷基化HG-1(2或4nmol的TFA-純化物質(zhì))干燥，然后根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用4-乙烯基吡啶衍生化(例如見Tarr等人，1983；Hawke和Yuank,1987)。D、Edman降解用具有120A型分析系統(tǒng)的應(yīng)用生物系統(tǒng)477A型測序儀(AppliedBiosystems Model 477A Sequenator)(Perkin-Elmer,Foster City,CA)，并使用制造商推薦的化學(xué)和鑒定程序，在烷基化完整的或經(jīng)消化的肽上進行Edman降解。E、肽的質(zhì)譜分析用Finnigan MAT900Q向前幾何雜交質(zhì)譜儀(forward geometryhybrid mass spectrometer)進行正離子電噴射離子化-質(zhì)譜(ESI-MS)分析。質(zhì)譜獲得全加速電勢(5kV)和10s/十年的掃描速率。所用的電噴射離子化界面是基于加熱玻璃毛細管入口。在80∶15∶5乙腈/水/乙酸(v/v/v)中制備樣品溶液，然后從ESI源以1μl/min的流速灌入。分析用1nmol TFA純化的HG-1。
在以線性模式下運行的PerSeptive Vestec Laser Tec Research飛行時間質(zhì)譜儀上獲得基體輔助激光解吸/離子化(MALDI)質(zhì)譜。在解吸過程中使用氮激光輻射(337nm)。在樣品靶上放置1μl HG-1(1-10pmol/μl，在0.1％TFA中)的水溶液和1μl合適基體溶液[c.5mg/ml3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸)或α-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)在1∶2乙腈/0.1％TFA(含水)(v/v)中]，由此以標準方式制備樣品。樣品/基體溶液在分析前于室溫下空氣干燥。
實施例4生物測定樣品的制備體外測定中所用的樣品中HG-1和Aga-ⅢA濃度由氨基酸分析來確定。通常情況下，最終餾分包含最終濃度為約10-30μM的經(jīng)純化肽。在于各種測定緩沖劑中稀釋100倍或者更多倍之前，于-80℃下儲存餾分。如果測定更高濃度的肽，可將HPLC餾分的等分樣品(約100μl)在真空離心中放置10-15分鐘，由此從樣品中除去甲醇。
實施例5細胞和神經(jīng)制劑中鈣流入的測定細胞中內(nèi)鈣濃度的INDO-1測定如材料和方法部分中所述，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和保存細胞。通過于30℃下在包含1％BSA的測定緩沖液(10Mm HEPES pH7.4，在Hanks平衡鹽溶液中，沒有碳酸氫鹽或苯酚紅)中與0.5mM EDTA溫育并添加5μM INDO-1乙酰甲酯(Molecular Probes,Eugene,OR)60分鐘，使細胞解吸。有負載的細胞洗滌兩次，然后重新懸浮在包含0.5％BSA的測定緩沖液中(107細胞/ml)，并儲存在冰上至使用(＜3小時)。在6ml 0.5％BSA之包含約3×106負載細胞的緩沖液溶液中添加各種濃度的測試化合物或載體對照。另外，在IMR-32細胞還添加5μM的尼群地平，以阻斷L-型鈣通道，而且在192C細胞中添加30-45μM的真菌霉素，以降低測試膜電勢并使添加的細胞外鉀快速去極化。樣品在30℃下溫育10分鐘，然后等分放入三個一次性比色杯中。用Photon Technology Intemational的RF-F3004型分光熒光計于30℃下進行熒光測量，重復(fù)3次，所述分光熒光計的激發(fā)在350nm，雙發(fā)射單色計設(shè)定在400nm和490nm。得到20秒的基礎(chǔ)發(fā)射信號，然后用計算機控制泵在攪拌的比色杯中于1.86ml溫育混合物中添加180μl的刺激溶液(1M氯化鉀和68mM氯化鈣)。去極化后30-50秒獲得發(fā)射信號。
如Grynkiewicz等人(1985)對INDO-1所述，將基礎(chǔ)和峰值發(fā)射比(400nm/490nm)轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)鈣濃度(根據(jù)式[Ca++]i=Kd*((R-Rmin)/(Rmax-R))*Sf，其中R是測定的400nm/490nm比，其余的術(shù)語是描述INDO-1的光譜性質(zhì)及其與游離鈣相互作用的常數(shù))。Rmin、Rmax和Sf值在Premack等人(1995)所述的2點校正中確定。
對于192C和IMR-32細胞，計算內(nèi)鈣升高峰值處的鈣濃度(加鉀后約10秒)，而GH-3細胞的值在有5μM尼群地平存在時在峰值應(yīng)答處(T-電流)或者在不添加二羥基吡啶時在加鉀后40秒(L-和T-電流的組合)測定。內(nèi)鈣增加通常從基線的100-150nM至接近于1μM的刺激值。從添加試劑的內(nèi)鈣升高與沒有測試化合物時所觀察到的數(shù)值的比例計算濃度-作用曲線。使用最小二乘法將這些數(shù)據(jù)擬合為一個4參數(shù)邏輯函數(shù)，以確定IC50值。
用對L-型電流(尼群地平)、N-型電流(SNX-111=合成ω-conopeptide MⅦA)特異性的鈣拮抗劑、以及選擇性差的拮抗劑(SNX-230=合成MⅦC、ω-Aga-ⅢA和非洛地平)進行獨立的試驗，以證實不同試驗信號的藥理學(xué)特異性。
實施例6電生理學(xué)測量A、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的全細胞膜片鉗在全細胞中根據(jù)膜片鉗法測量電流(Hamill等人，1981)。電阻范圍是2-6MΩ。用與PCLMP6軟件(AxonInstrument)接口的Axopatch1C或Axopatch 200A(Axon Instruments,Foster City,CA)進行記錄，以獲得數(shù)據(jù)并進行分析。
使用由100四乙基氯化銨、52氯化膽堿、15氯化鈉、2氯化鈣、0.8氯化鎂、10HEPES和7葡萄糖(單位為mM)組成的外浴溶液記錄鈣電流；所述溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，且325mOsM。在包含肽的溶液中添加作為載體的細胞色素C，其濃度為0.1mg/ml。內(nèi)移液管溶液由140甲磺酸銫、5 EGTA、10 HEPES和4腺苷三磷酸鎂組成，并用氫氧化銫調(diào)節(jié)pH至7.2，且310mOsM。由-90mV的保持電勢至0mV改變電壓，階躍脈沖為每15sec.持續(xù)30msec.，由此引發(fā)電流，并測試肽對該電流的作用。在5KHz取樣數(shù)據(jù)并在1KHz過濾。在測量由22mV超極化脈沖(“P/4”方案)引發(fā)的電流后，減去漏電流和電容電流。
通常情況下，HG-1結(jié)果是以對不使用串聯(lián)電阻補償電路而得到的電流振幅峰值的作用來表示的。在80％串聯(lián)電阻補償下進行的另外試驗(見結(jié)果)表明，HG-1對電路隨時間的衰變過程沒有作用在誤差之內(nèi)，抑制值在有或沒有串聯(lián)電阻補償時都是相同的，而且與電壓步驟后不同時間處測量的肽作用相同。對于濃度-作用研究，通過流動或灌注的浴交換給藥肽溶液。灌注溶液的交換通過溶液的灌注來證實，其中改變外鉀濃度以及對于膜電勢作用的測定。B、E類通道在神經(jīng)垂體末端中的電生理學(xué)用二氧化碳使雄性鼠鎮(zhèn)靜，然后去頭殺死。然后切下神經(jīng)垂體，并在包含270mM蔗糖、10mM HEPES緩沖液、0.01mM EDTA鉀且pH為7的溶液中均化。在膜片鉗記錄后，使用逆顯微鏡或通過免疫印跡來鑒定分離神經(jīng)垂體的神經(jīng)末端。所述末端用Normal Locke鹽水溶液(140mM氯化鈉、5mM氯化鉀、5mM碳酸鈉、2.2mM氯化鈣、1mM氯化鎂、10mM葡萄糖、10mM HEPES、0.1％牛血清白蛋白，pH7.2)灌注。在記錄前，所述末端(直徑通常為5-8μm)用包含以下物質(zhì)的5mM Ba2+-LS灌注145mM氯化鈉、5mM氯化鋇、1mM氯化鎂、10mM HEPES、15mM葡萄糖、0.02％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和1μm河豚毒素(TTX),pH7.3。為得到有孔的“全末端”膜片記錄(Rae等人，1995；Hamil等人，1981)，在包含135mM谷氨酸銫、10mM HEPES、5mM葡萄糖、2mM氯化鈣、1mM氯化鎂和20mM三乙胺(TEA)且pH為7.3的移液管溶液中放入新制的兩性霉素B(240μg/ml)溶液。
記錄時僅使用具有3-5 MΩ存取電阻(access resistance)的穿孔末端，以避免停止(run-down)。被去極化激活的Ba2+電流(IBa)為-80至+10mM，并證實瞬間和持續(xù)組分在該情況下沒有任何停止地保持超過1小時。IBa在3 kHz處過濾并在10 kHz處取樣。pCLAMP(AxonInstrument)是用于獲得數(shù)據(jù)和進行分析。
實施例7IMR-320細胞中鈉和鉀電流的測定如上所述(Newcomb等人，1995)，使用實施例6中描述的全細胞膜片技術(shù)測定IMR-32細胞中的鈉和鉀電流，但進行以下改動外浴由與以下物質(zhì)組成(單位為mM)140氯化鈉、5氯化鉀、10HEPES、2氯化鈣、1氯化鎂、以及12葡萄糖，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4，且有305mOSm。內(nèi)移液管溶液由以下物質(zhì)組成(單位為mM)15氯化鈉、125甲磺酸鉀、10HEPES、11EGTA、1氯化鈣、2氯化鎂和59葡萄糖，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至7.4，且有295mOSm。在肽應(yīng)用時，將細胞放置在流動腔中(0.5-1ml/min)。HG-1加在鹽水中，而0.1mg/ml細胞色素C由小管直接放置與細胞相鄰。
實施例8Xenopus卵母細胞中A類鈣通道中電流的測量根據(jù)標準方法(Goldin,1992)，在Xenopus卵母細胞中表達Mori等人(1991)描述的α-1亞基的cRNA。在表達時，α-1亞基的cRNA與兔α2和δ(Ellis等人，1988)以及人β(Williams等人，1992)亞基的cRNA一起以等摩爾比注射。每卵母細胞注射約50nl，總cRNA濃度為0.8μg/μl。
使用包含4mM氯化鋇、38mM氯化鉀、36mM四乙基氯化銨、5mM4-氨基吡啶、0.4mM氮氟滅酸、5mM HEPES(pH7.5)、和0.1mg/ml牛血清白蛋白的溶液，由兩個電極的電壓鉗記錄電流。使用與PCLAMP軟件(Axon Instruments，F(xiàn)osterCity,CA)接口的OC-725B電壓鉗(WarnerInstruments)放大器，在5kHz對數(shù)據(jù)取樣，并在1kHz處過濾，以獲得數(shù)據(jù)并進行分析。使用P/4方案，在線減去漏電流和電容電流。使用由-80mV保持電勢至0mV的電壓脈沖，以每10s引發(fā)電流。
實施例9Xenopus卵母細胞中鉀通道電流的測量以mKv1.1、0.2μg/μl，hKv1.2、0.3ng/μl，和hKv1.4、0.02μg/μl的濃度在卵母細胞中注射入Tempel等人(1988)(MKv1.1)和Ramaswami等人(1990)(hKv1.2、hKv1.4)描述的由鉀通道α亞基cDNA得到的cRNA。
用于記錄鉀電流的外溶液是115mM氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1.8mM氯化鈣、10mM HEPES pH7.2、0.1mg/ml牛血清白蛋白。所有其它步驟皆與實施例8所述的鈣通道相同，但測試脈沖為每5sec.由-70mV的保持電勢至+50mV。
實施例10聚合酶鏈反應(yīng)的HG-2編碼序列的分離根據(jù)標準方法，以圖2B中所示的HG-1的N-端6氨基序列為基礎(chǔ)，并使用D.Melanogaster的密碼子選擇，合成序列特異性簡并引物?；蛱禺愋院塑账崾荊GC/T GTC/G GAT/C AAG GCC/T GGC/TTGC。使用5′引物的初期PCR試驗的結(jié)果，得到3′引物。
除非另有說明，在此實施例中所述的所有緩沖液和試劑都如從Gibco-BRL(目錄號18373-019)購得的cDNA端快速擴增用3′RACE系統(tǒng)試劑盒(3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endskit)中所描述和/或提供的。A、Hysterocrates gigas中總RNA的分離將從3只Hysterocrates gigas蜘蛛中得到毒液囊在8ml TRIzolTM溶液中均化，然后在轉(zhuǎn)移1ml等分樣品至Eppendorf試管中前，在室溫下溫育5分鐘。在各1ml樣品中添加0.2ml氯仿。劇烈搖晃樣品15秒，然后在4℃下10-12000×g離心15分鐘前，溫育2-3分鐘。將所得的含水相轉(zhuǎn)移至新試管中，根據(jù)制造商(BRL)所提供的比例，在每ml Trizol中加入2-丙醇。混合物在室溫下溫育10分鐘，然后在不超過12000×g下離心10分鐘。除去上清液，然后將RNA沉淀重新懸浮于75％乙醇(每1ml TRIzol溶液至少添加1ml 75％乙醇)中。在Vortex混合器中混合樣品，然后在不超過7500×g、4℃下離心5分鐘。將RNA空氣干燥，然后溶解在100μl經(jīng)DEPC處理的水中。B、總RNA中poly-A mRAN的純化(Qiagen的OLIGOTEX旋動(spin)柱方案)通過常規(guī)方法確定RNA樣品中的總RNA量。如果該量低于250μg，將總RNA溶解在250μl DEPC水中。然后在RNA中添加預(yù)熱至37℃之250μl 2×結(jié)合緩沖液和15μl OLIGOTEX懸浮液。輕柔地拍打試管底部，由此使試管混合，然后在65℃下溫育3分鐘，以破壞二級結(jié)構(gòu)。然后將試管繼續(xù)在室溫下溫育10分鐘，接著在最大轉(zhuǎn)速(約12000×g)下離心2分鐘。抽出上清液，并使沉淀物重新懸浮在400μl洗滌緩沖液中。所得懸浮液加至Qiagen OLIGOTEX旋動柱的頂部。該柱在最大轉(zhuǎn)速下離心30秒，然后棄去流出部分。將旋動柱轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶試管中，并重復(fù)加料和離心步驟。然后根據(jù)制造商的說明書，用100μl的預(yù)熱(70℃)洗脫緩沖液洗脫柱兩次。C、由poly-A mRNA合成第一鏈cDNA所用方法是3′RACE試劑盒Gibco-BRL中提供的標準方案。上述B部分中最多至50ng的poly(A)-選擇RNA與DEPC處理水合并，在0.5ml微量離心管中使最終體積為11μl。在該試管中加入1μl的10μM銜接引物溶液(3′RACE試劑盒)?；旌显撾x心管，然后通過簡單離心收集反應(yīng)物。將混合物加熱至70℃10分鐘，接著在冰上冷卻冷凍至少1分鐘。通過簡單離心收集離子管中的內(nèi)容物，并添加如下組分10×PCR緩沖液2μl25mM氯化鎂2μl10mM dNTP mix 1μl0.1M DTT 2μl輕柔地混合離心管，通過簡單離心收集反應(yīng)物。然后使混合物平衡至42℃-5分鐘。接著加入1μl SuperScript Ⅱ RT(逆轉(zhuǎn)錄酶)，并在42℃下溫育15分鐘。在70℃下溫育15分鐘，由此終止反應(yīng)，然后在冰上冷卻冷凍。通過簡單離心收集反應(yīng)物，并在離心管中加入1μl的RNA酶H，混合所述試管，溫育20分鐘。D、3′RACE PCR在0.5ml微量離心管中加入以下物質(zhì)10×PCR緩沖液(GIBCO試劑盒)5μl25mM氯化鎂3μl蒸餾水36.5μl10mM dNTP mix 1μlSGP1*10μM 1μlUAP#10μM 1μlTaq DNA聚合酶(5units/μl)0.5μl在離心管中加入2μl cDNA合成反應(yīng)物，然后輕柔混合。在反應(yīng)混合物上層覆75μl礦物油，然后通過簡單離心收集。反應(yīng)混合物在94℃下溫育3分鐘。進行35個循環(huán)的PCR，其使用以下方案變性94℃,45秒退火55℃,45秒延伸72℃,1分30秒混合物在72℃下另外溫育10分鐘，然后保持在4℃下。用瓊脂糖凝膠電泳分析10μl擴增產(chǎn)物，其余的保藏在-20℃下直至使用。E、cDNA的5′RACE玻璃MAX分離旋動柱純化對于每個待純化樣品，將100μl無菌蒸餾水平衡至65℃，然后將結(jié)合溶液平衡至室溫。將120μl結(jié)合溶液(6M碘化鈉)加至第一鏈反應(yīng)(4.5體積結(jié)合溶液每體積DNA溶液)中。cDNA/NaI溶液轉(zhuǎn)移至玻璃MAX旋動柱中，然后在最大轉(zhuǎn)速下離心20秒。從試管中取出柱插入物，然后將流出物轉(zhuǎn)移至微量離心管中。將柱插入物重新放入試管中，在該旋動柱中加入0.4ml冷卻的1×洗滌緩沖液。然后在最大轉(zhuǎn)速下離心柱20秒，棄去流出物。另外重復(fù)兩次該洗滌步驟，用400μl上述冷卻的70％乙醇再洗滌兩次。在從離心管中除去最終的70％乙醇后，在最大轉(zhuǎn)速下離心試管1分鐘。將旋動柱插入物轉(zhuǎn)移至新的樣品回收管中，然后在該旋動柱中加入50μl無菌蒸餾水(已預(yù)熱至65℃)，接著在最大轉(zhuǎn)速下離心20秒，以洗脫cDNA。F、cDNA的TdT加尾5×加尾緩沖液包含以下組分DEPC處理的水55μl10×反應(yīng)緩沖液25μl25mM氯化鎂20μl5×緩沖液包括以下最終組分50mM Tris-HCl(pH8.4)
125mM氯化鉀5mM氯化鎂將以下組分添加至0.5ml微量離心管中DEPC處理的水6.5μ15×加尾緩沖液5.0μl2mM dCTP 2.5μlcDNA樣品10μl將離心管在94℃下溫育1-2分鐘，然后在冰上冷卻冷凍。通過簡單的離心收集管中的內(nèi)容物，然后放置在冰上。加入1μl TdT，然后輕柔混合，在37℃下溫育10分鐘。反應(yīng)物的最終組成為10mM Tris-HCl(pH8.4)25mM氯化鉀1.0mM氯化鎂100μM dCTP0.4units/μl TdT將TdT混合物加熱至65-70℃10分鐘使之失活。G、dC-加尾之cDNA的PCR擴增在放于冰上的新0.5ml微量離心管中加入以下組分
29μl無菌蒸餾水4μl 10×反應(yīng)緩沖液3μl 25mM氯化鎂1μl 10mM dNTP1μl嵌套GSP2(10μM)1μl錨定引物(10μM)5μl dC-加尾的cDNA(GSP1和GSP2都是根據(jù)HG1的氨基酸序列設(shè)計的簡并引物。GSP1:5′CAUCAUCAUCAUGGYGTSGAYAAGGCTGGYTGC3′GSP2:5′CUACUACUACUAGAARGTSARRTCCCARGC3′)，其中，A、T、G和C代表標準的脫氧核糖核酸，而且Y=C或T,R=A或G，且S=C或G?！癠”代表在C-端的脫氧尿嘧啶。上述UAP和錨定引物是在上述GIBCO-BRL3′RACE試劑盒中提供的通用引物?；旌想x心管中的內(nèi)容物，然后用75μl礦物油層覆。簡單地離心該管以收集管底部的反應(yīng)組分，然后在94℃下溫育5分鐘，并保持在80℃下。在1×反應(yīng)緩沖液中將Taq DNA聚合酶稀釋至0.4units/μl。在各反應(yīng)中添加5μl經(jīng)稀釋的酶?；旌衔镞M行35循環(huán)的PCR擴增反應(yīng)，其使用于上述3′RACE相同的方案。用瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色和適當?shù)姆肿映叽鐦藴史治?0μl擴增樣品。H、在pAMP1載體(GIBCO-BRL)中克隆PCR產(chǎn)物在放置于冰上的0.5ml微量離心管中加入以下組分
2μl PCR產(chǎn)物(10-50ng)2μl pAMP1載體DNA(25ng/μl)15μl1×退火緩沖液1μl尿嘧啶DNA糖基化酶(1U/μl)混合各組分，然后在37℃下溫育30分鐘。溫育后，將反應(yīng)管放置在冰上。退火后，將退火一部分反應(yīng)混合物(1-5μl)用于轉(zhuǎn)化。I、轉(zhuǎn)化將100μl DH5α細胞(感受態(tài)細菌細胞；GIBCO-BRL)放入在冰上的試管中。在該細胞中加入1μl退火產(chǎn)物，然后混合并在冰上培育30分鐘?；旌衔锝又?2℃下進行熱振蕩45秒，并在冰上培育2分鐘。在試管中加入SOB+培養(yǎng)基(0.9ml)，在37℃下?lián)u晃該試管1小時。在不超過4000rpm的轉(zhuǎn)速下于4℃離心試管5分鐘。除去0.9ml上清液，將其余的細胞鋪板在LB板+羧芐青霉素+IPTG+X-gal(作為β-半乳糖苷酶的底物)上。板在37℃下溫育過夜。J、小型DNA的制備制備小型DNA，以證實克隆和正克隆序列的成功。從平板上挑出白色集落。在37℃搖瓶機中，各集落在包含5ml LB培養(yǎng)基的不同試管中過夜溫育，所述培養(yǎng)基中含有羧芐青霉素。然后根據(jù)標準方法制備DNA并測序(如Maniatis等人，1982)。
實施例11抗驚厥活性DBA/2鼠癲癇發(fā)作模型由Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine得到DBA/2小鼠(18-21天齡，約7-10g)，并飼養(yǎng)至少3天，以使它們適應(yīng)實驗室條件。在測試當天時，在暴露于聲刺激前30分鐘，根據(jù)標準方法(Jackson)由i.c.v.向小鼠外腦室中給藥載體或測試化合物(總體積5μl)。注射后，將小鼠單獨飼養(yǎng)在觀察室中，并繼續(xù)觀察30分鐘，以觀察搖晃行為(持續(xù)的全身搖晃)或任何其它不正常的行為。使所述動物暴露在高強度聲刺激(14Hz下100-110dB正弦聲調(diào))中。在暴露于聲中的30秒期間，觀察小鼠是否有陣攣性和緊張性癲癇發(fā)作，而且后肢伸長。
雖然已參考具體的方法和實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)認識到，在不偏離本發(fā)明的情況下還可進行各種的改進。
權(quán)利要求
1.一種在其濃度最多為10-50倍于阻斷E類電壓門控鈣通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的濃度時能夠阻斷所述通道的HG肽。
2.如權(quán)利要求1所述的肽，其進一步的特征是在其濃度最多為10倍于半最大阻斷所述E類電壓門控鈣通道所需要的濃度時，不能至少50％阻斷L-型、T-型、P/Q-型或N-型鈣通道。
3.如權(quán)利要求2所述的肽，其具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P；SEQ ID NO:19是CRYMFGGC；X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，以及X15是F或D或缺失。
4.如權(quán)利要求2所述的肽，其具有以下序列SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，X1選自Ⅴ類，X2選自Ⅱ類，X3選自Ⅳ或Ⅴ類，X4選自Ⅲ類，X5選自Ⅲ類或Ⅳ類或缺失，X6選自Ⅳ或Ⅴ類，X7選自Ⅱ或Ⅳ類，X8選自Ⅱ或Ⅴ類，X9選自Ⅵ類，X10選自Ⅱ或Ⅲ類，以及X11選自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。
5.如權(quán)利要求4所述的肽，其中，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失,X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N,以及X11=L、F或G；SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC，以及SEQ ID NO:18是YCAWD。
6.一種具有選自以下組之序列的肽SEQ ID NO:1(HG-1)、SEQ ID NO:8(HG-8)、SEQ ID NO:13(R9)、SEQID NO:14(R11)和SEQ ID NO:15(SNX-629)。
7.一種具有序列SEQ ID NO:1的肽。
8.一種具有序列SEQ ID NO:15.的肽。
9.一種分離多核苷酸，其包括編碼以下肽的核苷酸序列，所述肽選自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、以及SEQ ID NO:15所限定之序列的肽。
10.如權(quán)利要求9所述的分離多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:43所限定之序列的核苷酸。
11.一種分離多核苷酸，其包括編碼具有V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15序列之肽的核苷酸序列，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
12.一種分離多核苷酸，其包括編碼具有SEQ ID NO:16-X1FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD序列之肽的核苷酸序列，其中X1選自V類，X2選自Ⅱ類，X3選自Ⅳ或Ⅴ類，X4選自Ⅲ類，X5選自Ⅲ類或Ⅳ類或缺失，X6選自Ⅳ或Ⅴ類，X7選自Ⅱ或Ⅳ類，X8選自Ⅱ或Ⅴ類，X9選自Ⅵ類，X10選自Ⅱ或Ⅲ類，而X11選自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ類。
13.一種抑制患者癲癇發(fā)作的方法，其包括向患者給藥藥物學(xué)有效劑量的HG肽，所述肽能夠在其濃度最多約10-50倍于阻斷E類電壓門控鈣通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的濃度時阻斷所述通道。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其進一步的特征是在其濃度最多約10倍于半最大阻斷所述E類電壓門控鈣通道所需之濃度時不能至少50％阻斷L-型、T-型、A類(P/Q-型)或B類(N-型)鈣通道。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述肽具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述肽具有選自SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:15之序列的序列。
17.一種抑制催產(chǎn)素在宿主中釋放的方法，其包括向宿主給藥藥物學(xué)有效劑量的HG肽，所述肽能夠在其濃度最多約10-50倍于阻斷E類電壓門控鈣通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的濃度時阻斷所述通道。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其進一步包括向宿主給藥選自L-型鈣通道阻斷劑、N-型鈣通道阻斷劑和P/Q型鈣通道阻斷劑的化合物。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述催產(chǎn)素釋放的抑制可有效地消除孕婦早產(chǎn)。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述催產(chǎn)素釋放的抑制可有效地抑制人宿主中的射乳反應(yīng)。
21.一種選擇用于阻斷催產(chǎn)素由后垂體中釋放之化合物的方法，其包括測試能夠在神經(jīng)元組織中選擇性阻斷E類鈣通道的化合物，然后選擇在其濃度不超過約10-50倍于有效阻斷所述E類鈣通道中鈣電流的HG-1肽之濃度時阻斷所述電流的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類新型的肽化合物,該化合物可選擇性地阻斷E類電壓門控鈣通道。該類型肽以HG肽如HG－1為例,其是從舞蛛Hysterocrates gigas的產(chǎn)毒細胞中分離出來的。本發(fā)明還涉及使用所述肽阻斷E類通道的方法。HG肽例如可用于抑制催產(chǎn)素的釋放并用于驚厥性疾病的治療。
文檔編號A61P15/06GK1226929SQ97196988
公開日1999年8月25日 申請日期1997年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月2日
發(fā)明者羅伯特·紐科姆, 安德魯·L·帕爾瑪, 巴拉日·G·索克, 卡塔琳·塔爾齊－霍爾諾奇, 威廉·F·霍普金斯, 魯斯·L·孔, 喬治·P·米利亞尼奇, 羅賓·迪恩, 拉斯洛·納達什迪, 拉斯洛·烏爾格, 斯蒂芬·斯科特·鮑爾索克 申請人:伊蘭制藥公司