用無明顯激素活性的甲狀腺素類似物治療惡性腫瘤的方法

專利名稱：用無明顯激素活性的甲狀腺素類似物治療惡性腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及癌癥治療領(lǐng)域。更具體的是，本發(fā)明涉及無明顯激素活性的甲狀腺素類似物，特別是3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯作為潛在的選擇性和無毒抗腫瘤劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的生長(zhǎng)由于它們獨(dú)特的特性對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)形成了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。這些特性包括不可控制的細(xì)胞繁殖導(dǎo)致惡性組織無規(guī)則地生長(zhǎng)，入侵局部甚至遠(yuǎn)端組織的能力，缺乏變異，缺乏可檢測(cè)的癥狀，最重要的是，缺乏有效的治療和予防方法。
癌癥可在任何年齡段的任何器官中的任何組織中發(fā)生。癌癥的病因?qū)W定義是不清楚的，但是諸如基因感受性、染色體斷裂不規(guī)則、病毒、環(huán)境因素和免疫失調(diào)等機(jī)制都與惡性細(xì)胞生長(zhǎng)和變異有關(guān)。
抗腫瘤化學(xué)療法目前涵蓋數(shù)類藥物，包括烷化劑、嘌呤拮抗劑和抗腫瘤抗生素。烷化劑使細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸烷化以防止細(xì)胞復(fù)制，放入細(xì)胞代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。典型的烷化劑是氮芥、環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥。與烷化劑治療有關(guān)的毒性包括惡心、嘔吐、禿頭、出血性膀胱炎、肺部纖維化和形成急性白血病的危險(xiǎn)增加。
嘌呤、嘧啶和葉酸拮抗劑對(duì)細(xì)胞循環(huán)和相有特異性，為了促進(jìn)抗腫瘤效果，它們要求細(xì)胞處于細(xì)胞復(fù)制階段并在復(fù)制的DNA合成相階段。諸如6-巰基嘌呤或6-硫代胍的嘌呤拮抗劑從頭抑制嘌呤的合成和嘌呤的互相轉(zhuǎn)換。諸如阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶或氟苷等的嘧啶拮抗劑通過抑制脫氧胞苷酸激酶和DNA聚合酶來抑制DNA合成。
葉酸鹽拮抗劑，如氨甲喋呤與細(xì)胞內(nèi)酶二氫葉酸鹽還原酶緊密結(jié)合，最終由于嘧啶不能合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與使用這些化合物有關(guān)的毒性包括禿頭癥、抑制骨髓、嘔吐、惡心和中樞運(yùn)動(dòng)失調(diào)和其它癥狀。
植物生物堿，如長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿或鬼臼毒素依托泊苷和鬼臼噻吩甙通常抑制有絲分裂和DNA合成和依賴RNA的蛋白質(zhì)合成。這些藥物的毒性類似于上述藥物的毒性，包括肌病、骨髓抑制、外周神經(jīng)疾病、嘔吐、惡心和禿頭癥。
諸如阿霉素、正定霉素和放線菌素的抗腫瘤抗菌素可作為DNA的插入物，防止細(xì)胞繁殖，抑制依賴DNA的RNA合成并抑制DNA聚合酶。博來霉素使DNA切斷，絲裂霉素通過雙官能團(tuán)的烷化作用作為DNA合成的抑制劑。這些抗菌素有很多毒性，且毒性很嚴(yán)重，包括壞疽、骨髓抑制、過敏反應(yīng)、食欲減退、依賴劑量的心毒性和肺部纖維化。
用作癌癥化療的其它化合物是諸如順氯氨鉑的無機(jī)離子，諸如干擾素的生物應(yīng)答修飾劑，酶和激素。所有這些化合物與上述類似，都伴有毒性副反應(yīng)。
因此，人們極為希望提供安全和無毒的化療組合物，所述的組合物能有效地抑制和/或禁止腫瘤細(xì)胞繁殖和/或贅生物生長(zhǎng)。此外，極為有利的也是提供安全、有效和無毒且方便使用者的化療組合物。
因此需要安全有效、無毒和可口服給藥的有機(jī)化合物，它能抑制或阻遏哺乳動(dòng)物中惡性腫瘤的生長(zhǎng)，也需要使用這類化合物來治療癌癥，本發(fā)明的目的即為上述內(nèi)容。
發(fā)明綜述本發(fā)明涉及使用無明顯激素活性的甲狀腺素類似物，特別是3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)來抑制或阻遏惡性腫瘤生長(zhǎng)和治療癌癥。該方法一般涉及將能抑制或遏制惡性腫瘤生長(zhǎng)或治療癌癥有效量的甲狀腺素類似物給予哺乳動(dòng)物。甲狀腺素類似物典型的特征是沒有明顯的激素活性。
具體的是，本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物惡性腫瘤的方法，該方法包括給有惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物使用足以抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)用量的甲狀腺素類似物，其中甲狀腺素類似物的特征是在體外對(duì)微管蛋白組合的最初速度抑制達(dá)約35％或更高，優(yōu)選的是45％或更高，更好的是約70％或更高，最好是約90％或更高。
在一個(gè)示例性的技術(shù)方案中，用于本發(fā)明方法中的甲狀腺素類似物是有下式結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽
其中X=O、S、CH2、羧基或沒有X；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；和R6、R7、R8和R9各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
在另一個(gè)示例性的技術(shù)方案中，用于本發(fā)明的甲狀腺素類似物是有下式結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽
其中X=O、S、CH2。羧基或沒有X；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；和R7和R8各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，甲狀腺素類似物是3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1闡述了在E-ras20細(xì)胞上用4μM DIME培養(yǎng)18-24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。圖1A，無藥物處理(對(duì)照)；圖1B，藥物處理；圖1C，藥物處理。圖1A和1B放大150x；圖1C放大300x。
圖2是揭示DIME處理的E-ras轉(zhuǎn)移的牛上皮細(xì)胞腫瘤消失的曲線；圖3是揭示小鼠中血清半衰期(t)和DIM口服生物利用度的曲線。
圖4顯示了從105到106E-ras 20每個(gè)接種體上的細(xì)胞用DIME(10μM處理4天)進(jìn)行預(yù)處理的腫瘤生成作用。
圖5顯示了DIME濃度對(duì)由MDA-MB-231細(xì)胞菌落形成速率的作用。
圖6歸納了被0.0μM(a)、2.0μM(b)、5μM(c)和10μM(d)導(dǎo)致的DNA斷裂。用DIME對(duì)E-ras細(xì)胞(2×104細(xì)胞/cm2)進(jìn)行處理，然后進(jìn)行TUNEL分析。
圖7顯示了通過薄層層析分離的DIME(D)和它的羧酸(A)降解產(chǎn)物，A-549(肺癌)細(xì)胞萃取物(等當(dāng)量于2×106細(xì)胞)。在實(shí)驗(yàn)中，系列1和2顯示，在用1μM DIME培養(yǎng)4小時(shí)期間萃取物產(chǎn)生的酯化酶活性。系列2顯示酯化酶被125μM BNPP所抑制。系列3和4顯示除了細(xì)胞萃取物從與1μM DIME預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)的完整細(xì)胞中制備，然后洗滌和萃取外，其它與系列1和2相同。該實(shí)驗(yàn)顯示，酯化酶不被DIME所誘導(dǎo)。
圖8顯示BNPP對(duì)由DIME導(dǎo)致的A-59細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的增強(qiáng)作用。
圖9圖示了DIME對(duì)MDA-MB231細(xì)胞的作用。原始的引種密度為0.05×106/cm2.
圖10提供了在MDA-MB231人體乳房癌細(xì)胞核上進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)量分析，它顯示，暴露于藥物達(dá)18小時(shí)，具有G2內(nèi)含物的DNA核積聚，這表示M相被阻斷。
圖11顯示在13小時(shí)延遲有絲分裂后無規(guī)地分裂成6個(gè)子細(xì)胞的圖像?？?,0小時(shí)0小時(shí)0分鐘；框2,10小時(shí)55分鐘；框3,24小時(shí)20分鐘；框4,24小時(shí)40分鐘；框5,24小時(shí)55分鐘；框6,25小時(shí)10分鐘，框7,26小時(shí)35分鐘；框8,28小時(shí)20分鐘。
圖12顯示了DIME對(duì)MDA-MB231細(xì)胞在M相階段的作用。
圖13顯示了由DIME誘導(dǎo)的異常細(xì)胞分裂的定量分析。
圖14顯示了DIME對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)入M相速率的作用。
圖15(A、B和C)顯示在DIME-處理的MDA-MB-231細(xì)胞(轉(zhuǎn)位期分布)里染色體19DNA的雜交。圖16A是對(duì)照，圖16B是DNA染色成像，圖16C是用1μMDIME處理5天染色體19的雜交(轉(zhuǎn)位期)。
圖16(A、B和C)顯示DIME處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有絲分裂紡錘體的作用。A圖，對(duì)照(沒有藥物)；B圖，1μM DIME處理18小時(shí)；C圖，1μMDIME處理5天。
圖17顯示微管組裝的光學(xué)試驗(yàn)(MTP聚合)。GTP濃度是1μM(右端曲線)，左端曲線顯示了4μM DIME的作用。其它條件與表13所示的相同。
圖18顯示了隨著DIME濃度增加對(duì)MTP聚合的原始線性速率的影響。GTP濃度是1mM，其它條件與表13中的相同。
圖19顯示了Michaelis-Menten分析1μM DIME(封閉循環(huán))對(duì)MTP聚合初始線性速率的作用，它是GTP濃度的函數(shù)(開放循環(huán)，沒有藥物)。其它條件與表13相同。
發(fā)明詳述定義本文使用的“烷基”指飽和支鏈、直鏈或環(huán)烴基。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、環(huán)丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“鏈烯基”指有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和支鏈、直鏈或環(huán)烴基。該基團(tuán)對(duì)于雙鍵來說可為順式或反式。典型的鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、環(huán)丙烯基、丁烯基、異丁烯基、環(huán)丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、己烯基等。
“炔基”指有至少一個(gè)碳-碳三鍵的不飽和支鏈、直鏈或環(huán)烴基。典型的炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、異丁炔基、戊炔基、己炔基等。
“烷氧基”指-OR基團(tuán)，其中R是定義如上的烷基、鏈烯基或炔基。
“鹵素”指氟、氯、溴和碘取代基。
“哺乳動(dòng)物”指動(dòng)物或人。
“藥學(xué)上可接受的鹽”指保留了游離堿的生物效應(yīng)和性質(zhì)，通過與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)-甲苯磺酸、水楊酸等無機(jī)酸反應(yīng)得到的化合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括，如鈉和鉀的堿金屬鹽，堿土金屬鹽和銨鹽。
“藥效基團(tuán)”指分子部分或片段(或電子密度分布)關(guān)鍵的三維排列，它由受體識(shí)別(Burger's Medicinal Chemistry and Drug Delivery卷Ⅰ原理和實(shí)踐619，第5版，Johen Wiley & Sons，紐約)。
“治療有效量”指化合物或組合物能有效地阻止、抑制或擊退惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或使與癌癥疾病有關(guān)的癥狀改善的用量。
特定技術(shù)方案的闡述本發(fā)明涉及用特征為沒有明顯激素活性的甲狀腺素類似物治療哺乳動(dòng)物的惡性腫瘤和癌癥的方法。優(yōu)選的是，本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)某些沒有激素活性的甲狀腺素類似物是強(qiáng)效的、選擇性的和無毒的惡性腫瘤生長(zhǎng)的抑制劑。本文優(yōu)選的甲狀腺素類似物是DIME。
甲狀腺素是甲狀腺的氨基酸(Merck Index,1989,9348:1483)，甲狀腺素類似物是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。文獻(xiàn)中已述及甲狀腺激素，特別是甲狀腺素T3和T4，具有兩個(gè)明顯類型的生物作用一個(gè)對(duì)細(xì)胞代謝作用，第二個(gè)對(duì)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)作用(Jorgensen,1978，“甲狀腺激素和類似物Ⅱ，結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系”在激素蛋白質(zhì)和肽類，卷Ⅵ,107-204頁，C.H.Li，編輯，Academic Press,NY)。例如，甲狀腺素通過甲狀腺抑制攝入碘(Money等，1959，“各種甲狀腺素類似物對(duì)大鼠甲狀腺攝入碘-131的抑制”內(nèi)分泌學(xué)64:123-125)，并通過蝌蚪變形研究對(duì)細(xì)胞分化的誘發(fā)作用(Money等，1958，“一些甲狀腺素類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變對(duì)Rana Pipiens蝌蚪變形的作用”內(nèi)分泌學(xué)63:20-28)。另外，甲狀腺素和某些甲狀腺素類似物抑制了非惡性腫瘤小鼠腦垂體甲狀腺帶腫瘤的生長(zhǎng)(Kumaoka等，1960，“甲狀腺素類似物對(duì)可移植小鼠腦垂體腫瘤的作用”內(nèi)分泌學(xué)，66:32-38；Grinberg等，1962，“對(duì)小鼠腦垂體甲狀腺帶腫瘤的研究。Ⅴ.各種甲狀腺素類似物對(duì)生長(zhǎng)和分泌的作用，”癌癥研究22:835-841)。甲狀腺素和甲狀腺素類似物的結(jié)構(gòu)要求對(duì)細(xì)胞分化的代謝刺激和誘導(dǎo)是不相同的(參見Jorgensen,1978，“甲狀腺激素和類似物Ⅱ。結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系”In激素蛋白質(zhì)和肽類，卷Ⅵ,150頁，C.H.Li，編輯，Academic Press,NY)。例如，Money等已發(fā)現(xiàn)甲狀腺碘的攝入抑制與蝌蚪變形之間不相關(guān)(Money等，1958，“一些甲狀腺素類似物化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)Rana Pipiens蝌蚪變形的作用”內(nèi)分泌學(xué)63:20-28)。
根據(jù)這些陳述，人們認(rèn)為特定的甲狀腺素類似物可改變或誘導(dǎo)未經(jīng)確認(rèn)的細(xì)胞反應(yīng)，所述的甲狀腺素類似物沒有顯示出甲狀腺素T3和T4的作用模式(代謝或分化)。
化合物用于本發(fā)明方法的甲狀腺素類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽具有下式結(jié)構(gòu)
其中X=O、S、CH2，羧基或沒有；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；R4、R7、R8和R9各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，用于本發(fā)明方法的甲狀腺素類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽具有下列結(jié)構(gòu)式
其中X=O、S、CH2、羧基或沒有；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；R7和R8各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，甲狀腺素類似物是3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)。
文獻(xiàn)中已經(jīng)述及諸如DIME的甲狀腺素類似物。但是，不像甲狀腺素，DIME被報(bào)道沒有明顯的代謝或細(xì)胞分化活性(由蝌蚪變形測(cè)定)(Money等，1958,“The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on theMetamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles”Endocrinology 63:20-28；Stasilli等，1959,“Antigoitrogenic and Calorigenic Activities of Thyroxine Analogues inRats”Endocrinology 64:62-82)。例如，與甲狀腺素相比，DIME對(duì)甲狀腺攝入碘的抑制僅是很少的(15％)(Money等，1959,“The Effect of Various ThyroxineAnalogues on Suppression of Indine-131 Uptake by the Rat Thyroid”Endocrinology64:123-125)。此外，據(jù)報(bào)道DIME對(duì)非惡性小鼠腦垂體腺瘤的生長(zhǎng)沒有抑制活性(Kumaoka等，1960，“甲狀腺素類似物對(duì)可移植小鼠腦垂體腫瘤的作用”內(nèi)分泌學(xué)66:32-38；Grinberg等，1962,“Studies with Mouse Pituitary ThyrotropicTumors.V.Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion”癌癥研究(Cancer Research)22:835-841)。沒有報(bào)道對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，某些甲狀腺素類似物沒有明顯的激素活性，特別是DIME，不僅抑制了各種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(參見表3)，而且也誘導(dǎo)了微核化后腫瘤細(xì)胞凋亡。這些白細(xì)胞郁滯和殺細(xì)胞活性對(duì)結(jié)構(gòu)是敏感的。對(duì)DIME的13種結(jié)構(gòu)類似物和對(duì)應(yīng)物進(jìn)行試驗(yàn)表明，即使對(duì)甲酯和4’-甲氧基取代基作微小的改變也會(huì)使分子完全失活。雖然DIME在細(xì)胞分析和體內(nèi)都有高活性，4’-丙氧基和乙基酯對(duì)應(yīng)物是完全失活的。因此，DIME限定了分子部分的關(guān)鍵排列，或藥效基團(tuán)，它有特定的白細(xì)胞郁滯和殺細(xì)胞活性，結(jié)果有明顯的化療效用。
雖然不希望為理論所限定，但據(jù)信，本文所述的大多數(shù)甲狀腺素類似物的可能分子作用模式是細(xì)胞周期抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
真核細(xì)胞通過細(xì)胞分裂周期的進(jìn)程最初由依賴細(xì)胞素(cyclin)蛋白激酶所控制。最佳的研究時(shí)期是從G2到M相的過度期，它為由細(xì)胞素B復(fù)合的cdc2激酶控制(綜述參見，Dunphy,1994,Trends Cell.Biol.4:202-207)。cdc2激酶活化需要磷酰化，該過程需要由蛋白磷酸酶2A調(diào)節(jié)(綜述參見，Wera & Hennings,1995,Biochem.J.311:17-29)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，本文所述的甲狀腺素類似物運(yùn)用了蛋白磷酸酶2A體外和體內(nèi)的特異性活化。在體內(nèi)，蛋白磷酸酶2A的活化與cdc2激酶和MAP激酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)Ⅱ的去磷?；囊种葡喾?，這使后者的兩個(gè)酶都失活。DIME沒有代謝作用，也不抑制DNA、RNA或蛋白質(zhì)的生物合成途徑。這樣，最可能的作用模式是通過這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的去磷酰化來抑制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，磷酸酶2A的活化和cdc2激酶的同時(shí)抑制對(duì)于治療癌癥是重要的和有力的治療靶向。
雖然對(duì)酯和4’-位的改變會(huì)明顯影響DIME的作用，但用來抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)和治療癌癥的甲狀腺素類似物不限于DIME。例如，與DIME相比，4’-乙氧基對(duì)應(yīng)物對(duì)人體癌癥細(xì)胞顯示了約25-30％最大的殺細(xì)胞作用(實(shí)施例4)。也可預(yù)計(jì)DIME可在芳環(huán)位置或橋氧被取代，但不失去活性。
現(xiàn)已知甲狀腺素的芳環(huán)不在相同的平面里(Jorgensen,1978,“ThyroidHormones and Analogues Ⅱ.Structure-Activity Relationships”In:HormonalProteins and Peptides，卷Ⅵ,107-204頁，C.H.Li，編輯，Academic Press，紐約)?，F(xiàn)也已知甲狀腺素里的芳環(huán)的環(huán)位置可被各種取代基，包括烷基、鹵素、硝基和氨基所取代，它們都有不同程度的保留的激素活性(同上)。此外，可沒有與環(huán)連接的醚氧或被各種不對(duì)芳環(huán)限于相同平面的基團(tuán)或原子，如亞甲基、羧基或硫取代，而不明顯失去激素活性(同上)。因此，可預(yù)見在DIME上相似的取代基不會(huì)明顯失去抗癌活性。很明顯，DIME的2’-氯類似物對(duì)人體癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與DIME相比顯示了約25％最大的抑制作用(實(shí)施例5)。由于體外和體內(nèi)作用的直接相關(guān)關(guān)系(參見，實(shí)施例2-7)，用于本發(fā)明方法的有效化合物可常規(guī)地在體外分析篩選試驗(yàn)中識(shí)別。如實(shí)施例2-3所述，這類試驗(yàn)可篩選能活化蛋白質(zhì)磷酸酶2A的特定化合物。典型的是，用于本發(fā)明方法的化合物通過約2-3個(gè)因子增長(zhǎng)了蛋白質(zhì)磷酸酶2A的活性，由實(shí)施例2或3所述的分析試驗(yàn)測(cè)量。
這類試驗(yàn)也可篩選體外或體內(nèi)抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或消除腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特定化合物，這在實(shí)施例4-6中加以闡述。一般來說，用于本發(fā)明的活性化合物的I50(與對(duì)照培養(yǎng)物相比化合物使50％細(xì)胞培養(yǎng)物死亡的濃度)范圍是約0.5μm-5.0μm，這用實(shí)施例4所述的分析方法測(cè)量。
本技術(shù)領(lǐng)域人員知道，許多種惡性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞系可用來篩選活性，包括，當(dāng)不限于HL-60、HT-144、E-ras-20、DU-145、MDA-168、MCF-7、855-2和MDA-MB-231。當(dāng)然，其它對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域人員來說很明顯的體外和/或體內(nèi)分析來篩選抗腫瘤和/或抗-癌癥活性的方法也可用來識(shí)別用于本發(fā)明的有效的甲狀腺素類似物。
本文的化學(xué)式會(huì)有互變現(xiàn)象或構(gòu)形異構(gòu)化。本說明書中的分子式僅代表互變異構(gòu)或構(gòu)型異構(gòu)化形式的可能形式，應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明涵蓋了本文揭示的生物或藥理活性相似于DIME的所有互變異構(gòu)或構(gòu)型異構(gòu)形式。
除了上述化合物和它們的藥學(xué)上可接受的鹽，本發(fā)明可用化合物的溶劑化物及非溶劑化物形式(如水化形式)。
本文所述的化合物可用已知能制備化合物的任何方法來制備。合適方法由代表性實(shí)施例揭示。必需的起始物質(zhì)可由有機(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法得到。
癌癥本文揭示的甲狀腺素類似物可用來治療各種癌癥。這類癌癥包括，例如，但不限于，諸如咽、結(jié)腸、直腸、胰腺、胃、肝、肺、乳房、皮膚、前列腺、卵巢、子宮頸、子宮和膀胱癌的癌癥疾??；白血病；淋巴瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤；和肉瘤。
本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，癌癥與包括如，但不限于乳房和前列腺癌的實(shí)體腫瘤的形成有關(guān)，藥劑和給藥途徑用于本發(fā)明的甲狀腺素類似物可以藥效上可接受的鹽形式或藥物組合物形式給予人體本身，所述的藥物組合物中，治療有效量，即能有效抑制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)或改善與癌癥疾病有關(guān)的癥狀劑量的化合物與合適的載體或賦形劑混合。
給藥途徑本文揭示的甲狀腺素類似物和藥物組合物可通過各種途徑給藥。合適的給藥途徑包括，如口服、直腸給藥、經(jīng)粘膜給藥或腸內(nèi)的給藥；非胃腸道給藥，包括肌注、皮下給藥、髓內(nèi)注射及鞘內(nèi)注射、直接的心室內(nèi)注射、靜注、腹腔內(nèi)注射、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
可替換的是，化合物可以局部給藥而不是全身給藥方式，如將化合物直接注射到實(shí)體腫瘤里，它常是貯藏或緩釋劑型。
此外，可以靶向給藥系統(tǒng)，如在用腫瘤特異性抗體涂覆的脂質(zhì)體里給予化合物。脂質(zhì)體可靶向給予并被腫瘤選擇性地?cái)z入。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的甲狀腺素類似物和藥物組合物可口服給藥。
組合物/制劑本文的藥物組合物可以本身已知的方法，如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制糖衣藥丸、弄成粉、乳化、膠囊化、陷入或凍干方法制備。
用于本發(fā)明的藥物組合物從而可用常規(guī)方法用一種或多種生理上可接受的包括賦形劑和佐劑的載體配制，所述的載體使活性化合物能在藥學(xué)上使用。正確的制劑根據(jù)所選擇的給藥途徑而定。對(duì)于注射，本發(fā)明試劑可配制成水溶液，優(yōu)選的是在生理配伍的緩沖劑，如Hanks’s溶液、Ringer’s溶液或生理鹽水緩沖液。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，制劑中使用適合穿透屏障的滲透劑。這類滲透劑是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
對(duì)于口服給藥，可通過使化合物與本技術(shù)領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體混合來容易地配制化合物。這類載體能使化合物配制成片劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、漿、懸浮劑等，供被治療的病人口服攝入?？诜o藥的藥物制劑可這樣得到使化合物與固體賦形劑混合，任意地研磨所得的混合物，需要時(shí)，在加入合適的輔劑后加工顆粒混合物，以得到片劑或糖衣藥丸的核芯。合適的賦形劑是，具體的是填料，諸如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖；和諸如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、土豆淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的纖維素制劑。需要時(shí)，可加入崩解劑，如聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或它的鹽，如藻酸鈉。
糖衣藥丸核被合適的包衣所涂覆。為了達(dá)到該目的，可使用濃縮的糖溶液，它可任選地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波沫膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。可向片劑或糖衣藥丸包衣中加入顏料或色素供識(shí)別或區(qū)分活性化合物的不同組合劑量?？煽诜乃幬镏苿┌ㄓ擅髂z制備的壓入固定(push-fit)膠囊，及由明膠和諸如丙三醇或山梨醇的增塑劑制備的密封軟膠囊。壓入-固定膠囊可含活性組分，它與諸如乳糖的填料、如淀粉的粘合劑和/或如滑石粉或硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑和任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可溶于或懸浮在合適的液體里，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥的制劑可配制成適合這類給藥的劑量。
對(duì)于口頰給藥，組合物可為用常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式。
對(duì)于吸入給藥，用于本發(fā)明的化合物常規(guī)地以來自壓力化包裝或噴霧器形式，通過使用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體以氣霧劑形式來釋放。對(duì)于壓力化氣霧劑，劑量單位可通過裝一個(gè)閥以釋放計(jì)量的劑量。用于吸入或吹入的明膠膠囊和囊芯(cartridge)可配制成含化合物與諸如乳糖或淀粉的合適粉末的粉末混合物。
化合物可配制成經(jīng)注射，如通過大丸藥注射或連續(xù)注入的非胃腸道給藥的制劑。注射制劑可為單位劑型存在，如，在安瓿或多劑量容器里加入防腐劑。組合物可為在油或水賦形劑中的懸浮劑、溶液或乳液，可含諸如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑的配制劑。
非胃腸道給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸浮劑可制備成油狀的注射懸浮液。合適的親脂溶劑或賦形劑包括諸如芝麻油的脂肪油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三甘油酯，脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖酐。任選的是，懸浮液也可含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度以制得高濃度溶液的試劑。
可替換的是，活性組分可為粉末形式，使用前以合適的賦形劑，如滅菌、無熱源的水組成制劑。
化合物也可配制成直腸組合物，如栓劑或保持的灌腸劑，如，含諸如可可脂或其它甘油酯的常規(guī)栓劑基底。
除前所述，化合物也可配制成貯藏制劑。這樣長(zhǎng)作用制劑可通過植入來給藥(如皮下植入或肌內(nèi)植入)或通過肌注來給予。例如，化合物可與合適的聚合材料或疏水材料(如在可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂，或難以溶解的衍生物，如難溶解的鹽一起配制。
實(shí)施本發(fā)明的疏水性化合物的合適藥物載體是助溶系統(tǒng)，包括芐醇、非極性表面活性劑、能以水混和的有機(jī)聚合物和水相。助溶系統(tǒng)可為VPD助溶劑系統(tǒng)。VPD是3％(w/v)芐醇、8％(w/v)非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65％(w/v)聚乙二醇300和余量的無水乙醇。VPD助溶劑系統(tǒng)(VPD:5W)由用在水溶液中的5％(w/v)右旋糖按1∶1稀釋的VPD。該助溶劑系統(tǒng)能很好地溶解疏水性化合物，其本身對(duì)全身給藥的毒性很低。自然地，助溶劑系統(tǒng)的比例可以改變只要考慮不破壞它的溶解度和毒性特征。此外，對(duì)助溶劑組分的特性地可改變例如，可用其它低毒性非極性表面活性劑來代替聚山梨醇酯80；可改變聚乙二醇的片斷大小；其它生物配伍的聚合物可代替聚乙二醇，如，聚乙烯吡咯烷酮；其它糖或多糖可代替右旋糖。
可替換的是，可對(duì)疏水藥物化合物使用其它給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是公知的疏水藥物給藥的賦形劑或載體的例子?？墒褂媚承┯袡C(jī)溶劑，如二甲亞砜，但常有毒性較大的問題。另外，可用緩釋系統(tǒng)，如含治療劑的固體疏水聚合物半滲透材料來釋放化合物。已有各種緩釋材料，且為本技術(shù)領(lǐng)域所公知。緩釋膠囊根據(jù)它們的化學(xué)性質(zhì)，在數(shù)周直至100天里釋放化合物。藥物組合物也可包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或賦形劑的例子包括，但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和諸如聚乙二醇的聚合物。
其它適合于本文的甲狀腺素類似物給藥的制劑是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，可在如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.美國(guó)，最近版本中發(fā)現(xiàn)。
有效劑量適合用于本發(fā)明的藥物組合物包括含治療有效量活性組分的組合物。本技術(shù)領(lǐng)域人員，特別在根據(jù)本發(fā)明所揭示的細(xì)節(jié)基礎(chǔ)上能測(cè)定治療有效劑量。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何化合物，可用細(xì)胞培養(yǎng)分析最初評(píng)估治療有效劑量。例如，一個(gè)制劑可配制成動(dòng)物模式，以得到包括了細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)得的I50(即，使50％細(xì)胞培養(yǎng)物致死的試驗(yàn)化合物濃度)或I100(即，使100％細(xì)胞培養(yǎng)物致死的試驗(yàn)化合物濃度)的循環(huán)濃度范圍。這類信息可用來更精確地測(cè)定人體的有用劑量。原始劑量可通過將本文揭示的甲狀腺素類似物在細(xì)胞培養(yǎng)分析試驗(yàn)里的效果與已知抗癌癥藥，如長(zhǎng)春新堿的效果進(jìn)行比較來配制。在該方法中，這樣得到原始的劑量將細(xì)胞培養(yǎng)分析里得到的甲狀腺素類似物和已知抗癌藥的有效濃度比乘以已知抗癌藥物的有效劑量。例如，若甲狀腺素類似物在細(xì)胞培養(yǎng)分析里的有效性是長(zhǎng)春新堿的兩倍(即，在同樣分析試驗(yàn)中I50DIME等于I50長(zhǎng)春新堿的一半)，甲狀腺素類似物的最初有效劑量是長(zhǎng)春新堿已知?jiǎng)┝康囊话?。用這些最初的原則，具有本技術(shù)領(lǐng)域基本技能的人員可以測(cè)定人體的有效劑量。也可從體內(nèi)數(shù)據(jù)來評(píng)估原始劑量。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，250毫克/千克管飼法給藥每天一次，一周5天，持續(xù)32天能足以明顯地抑制裸鼠中乳房癌異源移植物(MDA-MB-231)的生長(zhǎng)(參見實(shí)施例7.3)。研究也顯示，DIME的血清半衰期(t1/2)為約2-2.5小時(shí)，本身(per os)給藥的生物利用度為87％(參見實(shí)施例7.2)。具有本技術(shù)領(lǐng)域一般技能的人員可基于該數(shù)據(jù)使人體給藥最優(yōu)化。
可個(gè)別地調(diào)節(jié)劑量和間隔以使活性化合物的血藥水平維持在治療有效量上。一般口服給藥病人的劑量為約50-2000mg/kg/天，通常為約250-1000mg/kg/天，優(yōu)選的是約500-700mg/kg/天，最佳的是約350-550mg/kg/天。優(yōu)選的是，在每天給予多劑后能達(dá)到治療有效的血清水平。
對(duì)于局部給藥或選擇性攝入，藥物的有效局部濃度與血藥水平不相關(guān)。本技術(shù)領(lǐng)域人員能使治療有效的局部劑量最優(yōu)化而無需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)然，給予組合物的用量將根據(jù)被治療的對(duì)象、對(duì)象的體重、病情的嚴(yán)重程度、給藥方式和醫(yī)生的判斷而定。
當(dāng)能檢測(cè)到腫瘤或甚至不可檢測(cè)到腫瘤時(shí)可重復(fù)間隔地進(jìn)行化療。
此外，由于它無明顯的毒性(下面將作討論)，可單獨(dú)進(jìn)行治療或與其它抗癌藥或其它藥物，如AZT、抗炎藥、抗生素、皮質(zhì)類固醇、維生素等合并給藥。
可以預(yù)見本文揭示的甲狀腺素類似物和其它藥物之間可能的協(xié)同作用。另外也可預(yù)見到多個(gè)甲狀腺素類似物之間的可能的協(xié)同作用。
毒性通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥物過程，如通過測(cè)定LD50(使50％種群致死的劑量)和ED50(對(duì)50％種群產(chǎn)生治療有效的劑量)來測(cè)定本文所述的甲狀腺素類似物的毒性和治療效果。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，可表達(dá)為L(zhǎng)D50和ED50的比。治療指數(shù)高的化合物是優(yōu)選的。這些細(xì)胞培養(yǎng)分析試驗(yàn)和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可用于制定對(duì)人體使用無毒的劑量范圍。這類化合物的劑量?jī)?yōu)選地在包括幾乎無毒或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍里。劑量可在該范圍里根據(jù)使用的劑型和給藥途徑而定。確切的制劑、給藥途徑和劑量可通過個(gè)體醫(yī)生根據(jù)病人情況來選擇。(參見，如Fingl等，1975,In治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)(ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第1章，p.l)。
使用本文揭示的甲狀腺素治療癌癥的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們沒有毒性。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，每天口服1克/千克劑量，持續(xù)12-15天，裸鼠沒有不良效果(參見實(shí)施例7.1)。由于靜注DIME的血清半衰期(t1/2)約為2-2.5小時(shí)，重復(fù)每天給予的甲狀腺素類似物的劑量不會(huì)產(chǎn)生預(yù)期的不良效果。
已對(duì)本發(fā)明作了闡述，下列實(shí)施例僅通過示例來闡述發(fā)明物質(zhì)，不供限定。
實(shí)施例1化合物合成合成14個(gè)甲狀腺素類似物，純化并特征化。下表1提供了每個(gè)合成化合物的結(jié)構(gòu)和選擇的物理數(shù)據(jù)。
表1合成的甲狀腺素類似物

序 R1R2R3R4熔點(diǎn)式質(zhì)譜質(zhì)譜號(hào) (℃)(計(jì)算值)(測(cè)定值)1 CH3O CH3O H H 153-155C15H12I2O4509.882513 509.8829602 EtOCH3O H H 123-125C16H16I2O4523.898163 523.8987373 n-PrO CH3O H H 114-116C17H16I2O4537.913813 537.9140144 n-BuO CH3O H H 82-84 C18H19I2O4551.929463 551.9300005 CH3O EtO H H 96-98 C14H16I2O4523.898163 523.8982026 CH3O HOH H 233-235C14H19I2O4ref7 CH3O H2N H H 207-209C14H11I2NO3494.882847 494.8818808 CH3O (CH3)HN H H 181-183C13H13I2NO3508.898497 508.8989719 CH3O (CH3)2N H H 162-164C14H13I2NO3522.914148 522.91436410 HO CH3O H H 204(分解) C14H10I2O4495.866863 495.86745311 H CH3O H H 142-144C14H10I3O3479.871948 479.87255312 I CH3O H H 139-141C14H9I2O3605.768600 605.76783913 H CH3O H CH3O 123-125C13H12I2O4509.882513 509.88238714 CH3O CH3O Cl H 132-134C15H11ClI2O4543.843541 543.843424ref根據(jù)Borrows等J.Chem.Soc.1949:S183-S190。
b分解溫度。
1.1 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)根據(jù)Borrows等1949“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅰ。酪氨酸和它的部分衍生物的制備，和得到甲狀腺素的新途徑”J.Chem.Soc.1949(同上，頒布1號(hào))S185-S190所述來制備3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯，并用95％乙醇重結(jié)晶，熔點(diǎn)153-155℃。
質(zhì)譜FAB,m/z(相對(duì)強(qiáng)度)510(M+,100),479(4.5),384(4.5)。M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C15H12I2O4的計(jì)算值，509.882513；測(cè)定值，509.882960(偏差=-0.9ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.719(3H，單個(gè))，3.876(3H，單峰)，6.693(2H，雙峰，J=9.45Hz，有細(xì)分裂)，6.845(2H，雙峰，H=9.36Hz，有細(xì)分裂)，8.390(2H，單峰)。
1.2 3,5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物2)用Borrows等，1949“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅰ。酪氨酸和它的部分衍生物的制備，和得到甲狀腺素的新途徑”J.Chem.Soc.1949(增補(bǔ)，頒布1號(hào))S185-S190所述來制備3,5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)。
1.2.1 3,5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯在室溫下的50毫升燒瓶里，使4-乙氧基苯酚(Aldrich)(1492毫克，10.8毫摩爾)與2.0MKOH水溶液(5.50毫升)攪拌形成4-乙氧基苯酚酸鉀。加入4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯(Ullmann,1909,Annalen der Chemie 366:92-93；商業(yè)來源Spectrum Chemical Company,Gardena，美國(guó)加利福尼亞；2606毫克，10.0毫摩爾)，讓混合物加熱回流1小時(shí)，在冰浴里冷卻，有橡膠樣團(tuán)塊產(chǎn)物沉積出來。加入冷的1.0M KOH(水溶液20毫升)，繼續(xù)冷卻使產(chǎn)物固化。打碎橙黃色固體，在吸力濾器里收集，用水淋洗并干燥。用熱的95％乙醇(50毫升)結(jié)晶材料(3.08克)得到2.56克(70.6％得率)3,5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。熔點(diǎn)101-103℃。
質(zhì)譜(EI)高分辨的M+:C16H14N2O3的計(jì)算值362.075016；測(cè)定值，362.074793(偏離=0.6ppm)。
1.2.2 3,5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯將3,5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯部分(724.4mg,2.00毫摩爾)溶于冰乙酸(50毫升)，在Parr型4561小反應(yīng)器中與10％鈀/碳催化劑混合(Aldrich)(200毫克)混合，在H2(43psi)氣氛下加料，在氛圍溫度下快速攪拌直至由于反應(yīng)停止而使壓力下降(6分鐘，最終為16psi)。混合物立即經(jīng)硅藻土床過濾以除去催化劑，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去乙酸溶劑得到褐色油狀殘留物，它是3,5-二胺衍生物的粗制品。粗制品二胺溶于冰乙酸(6.0ml)，通過在3分鐘里將它滴加到攪拌著的、冰冷卻的亞硝酸鈉溶液(345毫克，5毫摩爾)在濃硫酸里(3.5ml)里進(jìn)行四氮化。在冰浴溫度下攪拌30分鐘后，粘稠的混合物被移入室溫下的快速攪拌的在蒸餾水(2.5ml)中的碘化鉀(3.0克)溶液。讓黑色混合物攪拌30分鐘，最后在70℃下加熱5分鐘。將混合物倒入乙酸乙酯(100毫升)，加入水(50毫升)。將兩相混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，再加入乙酸乙酯(50毫升)和水(50毫升)，將產(chǎn)物萃取入乙酸乙酯。有機(jī)層(乙酸乙酯)用兩次水(每次50毫升)洗滌，用無水硫酸鈉干燥。通過蒸發(fā)除去乙酸乙酯得到黑色焦油狀的殘?jiān)?br> 該粗制品溶于丙酮(8毫升)，用制備型薄層層析板(5)純化(Whatman，硅膠，1000微米層，20厘米×20厘米，具有熒光指示劑)。板在正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸(3∶1∶0.8v/v/v)中展開。產(chǎn)物帶(Rf=0.84)，UV光下觀察，從各自的板上收集，匯合，用乙酸乙酯(3×50毫升)洗脫硅膠(保持在燒結(jié)的玻璃漏斗里)。除去乙酸乙酯得到類白色固體，用95％乙醇(10毫升)結(jié)晶。得率兩批白色晶體總量為275毫克(26％，基于2毫摩爾二硝基前體)。熔點(diǎn)123-125℃。
質(zhì)譜EI,m/z(相對(duì)強(qiáng)度)524(M+,100),496(16.7),310(9.1),242(6.1),211(7.6),155(6.1)。M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C16H14I2O4的計(jì)算值523.898163；測(cè)定值，523.898737(偏差=-1.1ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)1.303(3H，三峰，J=6.94Hz),3.877(3H，單峰)，3.971(2H，四重峰，J=6.95Hz),6.678(2H，雙峰，J=8.98Hz，細(xì)分裂)，6.879(2H，雙峰，J=9.06Hz，有細(xì)分裂)，8.389(2H，單峰)。
1.3 3,5-二碘代-4-(4’-正丙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物3)按實(shí)施例1.2所述制備3,5-二碘代-4-(4’-正丙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。通過用4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯處理4-正-丙氧基苯酚酸鉀(從市售的4-正-丙氧基苯酚制備)的水溶液來合成二硝基前體。二硝基產(chǎn)物經(jīng)H2/Pd(C)還原得到二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通過與碘化鉀反應(yīng)(Sandmeyer反應(yīng))轉(zhuǎn)化為二碘代產(chǎn)物。用制備型TLC純化和并重結(jié)晶。
1.4 3,5-二碘代-4-(4’-正丁氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物4)如實(shí)施例1。2所述制備3,5-二碘代-4-(4’-正丁氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。通過用4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯處理4-正-丁氧基苯酚酸鉀(從市售的4-正-丁氧基苯酚制備)的水溶液來合成二硝基前體。二硝基產(chǎn)物經(jīng)H2/Pd(C)還原得到二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通過與碘化鉀反應(yīng)(Sandmeyer反應(yīng))轉(zhuǎn)化為二碘代產(chǎn)物。用制備TLC純化和并重結(jié)晶。
1.5 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸乙酯(化合物5)通過3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯合成3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸乙酯，前者在Borrows等，1949,J.Chem.Soc.1949:S185-S190中得以揭示。這樣，在10毫升燒瓶里，將3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸(99.2毫克，0.200毫摩爾)轉(zhuǎn)化為3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯。真空下除去過量硫酰氯后，攪拌下加入無水乙醇(5.0ml)，讓混合物在70℃下加熱5分鐘。除去過量乙醇，干燥的殘留物溶于熱的95％乙醇(4.0ml)，從中產(chǎn)物酯在冰箱(3℃)里結(jié)晶。得率55.8毫克(53％)淺黃色晶體。熔點(diǎn)96-98℃。
質(zhì)譜(EI):M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C16H14I2O4的計(jì)算值523.898163；測(cè)定值，523.898202(偏差=-0.1ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)1.336(3H，三重峰，J=7.19Hz),3.717(3H，單峰)，4.336(2H，四重峰，J=7.06Hz),6.695(2H，雙峰，J=9.34Hz，有細(xì)分裂)，6.895(2H，雙峰，J=9.20，有細(xì)分裂)，8.389(2H，單峰)。
1.6 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸(化合物6)如Borrows等，1949,J.Chem.Soc.1949:S185-S190所述來合成3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸。
1.7 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺(化合物7)通過使化合物1酰胺化來合成3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺。在125毫升燒瓶里，將3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)(100毫克，0.196毫摩爾)溶于無水甲醇(60毫升)。將無水氨氣以中等速度在室溫下通入溶液達(dá)5分鐘。在用塞子塞住的燒瓶里靜置1小時(shí)后，重復(fù)用氨氣處理(5分鐘)，讓混合物在用塞子塞住的燒瓶里靜置48小時(shí)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇/氨，干燥的殘留物溶于甲醇∶水(7∶3v/v)(30毫升)，在冰箱(3℃)里結(jié)晶。得率58.3毫克(60％得率)淺黃色晶體。熔點(diǎn)207-209℃。
質(zhì)譜(FAB):M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C14H11I2NO3的計(jì)算值494.882847；測(cè)定值，494.881880(偏差=2.0ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.716(3H，單峰)，6.682(2H，雙峰，J=8.93Hz),6.895(2H，雙峰，J=8.99Hz),7.528(1H，單峰)，8.113(1H，單峰)，8.402(2H，單峰)。
1.8 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺(化合物8)通過3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯來制備3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺(參見實(shí)施例1.5)。使酰氯與過量甲胺在四氫呋喃里在室溫下(1小時(shí))反應(yīng)，過濾除去甲胺-鹽酸鹽沉淀物，蒸發(fā)溶劑，用95％乙醇使產(chǎn)物結(jié)晶。
1.9 3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N,N-二甲基苯甲酰胺(化合物9)通過3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯來制備3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N,N-二甲基苯甲酰胺(參見實(shí)施例1.5)。使酰氯與過量甲胺在四氫呋喃里在室溫下(1小時(shí))反應(yīng)，過濾除去甲胺-鹽酸鹽沉淀物，蒸發(fā)溶劑，用無水乙醇使產(chǎn)物結(jié)晶。
1.10 3,5-二碘代-4-(4’-羥基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物10)如實(shí)施例1.2所述制備3,5-二碘代-4-(4’-羥基苯氧基)苯甲酸甲酯。如Borrows等，1949，“甲狀腺素相關(guān)物質(zhì)的合成，部分Ⅱ，二硝基二苯基醚的制備”J.Chem.Soc.1949(增補(bǔ)本，頒布1號(hào))S190-199所述的方法，通過使4-氯-3,5-二硝基苯甲酸與氫醌在吡啶溶液里反應(yīng)來制備二硝基前體。
1.11 3,5-二碘代-4-苯氧基苯甲酸甲酯(化合物11)如實(shí)施例1.2所述制備3,5-二碘代-4-苯氧基苯甲酸甲酯。通過用4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯處理苯酚酸鉀水溶液(從市售苯酚中制備)來合成二硝基前體。二硝基產(chǎn)物用H2/Pd(C)還原成二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通過與碘化鉀反應(yīng)轉(zhuǎn)化為二碘產(chǎn)物(Sandmeyer反應(yīng))。用制備型TLC純化并結(jié)晶。
1.12 3,5-二碘代-4-(4’-碘代苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物12)如實(shí)施例1.2所述制備3,5-二碘代-4-(4’-碘代苯氧基)苯甲酸甲酯。由于二硝基前體里的碘取代基本身易于被H2/Pd(C)還原，碘代-二硝基前體被鐵粉在乙酸/95％乙醇里還原成碘-二胺(參見，如Gemmill等，1956,“3-碘-、3,3’-二碘和3,3’-二碘代-5-溴代甲狀腺素”J.Am.Chem.Soc.78:2434-2436)。然后用Sandmeyer反應(yīng)使碘代-二胺進(jìn)行四氮化并轉(zhuǎn)化為二碘產(chǎn)物。用制備TLC純化后，產(chǎn)物用乙醇結(jié)晶。(熔點(diǎn)139-141℃)質(zhì)譜(EI):M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C14H9O3I3計(jì)算值605.768600；測(cè)定值，605.767839(偏差=1.3ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.879(3H，單峰)，6.628(2H，雙峰，J=8.97Hz，有細(xì)小分裂)，7.670(2H，雙峰，J=9.12Hz有細(xì)小分裂)，8.396(2H，單峰)。
1.13 3,5-二碘代-4-(3’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物13)如實(shí)施例1.2所述制備3,5-二碘代-4-(3’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物3)。通過用4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯處理3-甲氧基苯酚酸鉀水溶液(從市售苯酚中制備)來合成二硝基前體。二硝基產(chǎn)物用H2/Pd(C)還原成二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通過與碘化鉀反應(yīng)轉(zhuǎn)化為二碘產(chǎn)物(Sandmeyer反應(yīng))。用制備型TLC純化并結(jié)晶。
1.14 3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物14)除了用替換的方法代替二硝基前體還原外，其它用實(shí)施例1.2所述的一般方法來合成3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物14)。
1.14.1 3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯如實(shí)施例1.2.1所述，通過使2-氯-4-甲氧基苯酚(Aldrich Chemical Co.，美國(guó)WI)成為2-氯-4-甲氧基苯酚酸鉀與4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯反應(yīng)來制備二硝基前體。用乙醇結(jié)晶得到3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯的橙色結(jié)晶(得率66％)。熔點(diǎn)116-119℃。
質(zhì)譜(EI):M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C15H11ClN2O8計(jì)算值382.020393；測(cè)定值，382.020187(偏差=0.5ppm)。
1.14.2 3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯由于二硝基前體里的2’-氯取代基在H2/Pd(C)還原里易于反應(yīng)，故與實(shí)施例1.12相似，用乙酸/95％乙醇里的鐵粉將前體還原成2’-氯二胺。這樣，在250ml燒瓶里，3,5-二硝基-4-(2’-氯-4‘-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(765.5毫克，2.00毫摩爾)溶于冰醋酸(35毫升)和95％乙醇(35毫升)，將溶液加熱到70℃，加入鐵粉(2.00克)。在熱浴(70℃)里激烈打旋混合物。打旋3分鐘后，混合物出現(xiàn)褐色。在70℃下繼續(xù)打旋35分鐘。然后將混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗里，加入水(250毫升)和乙酸乙酯(250毫升)，產(chǎn)物萃取入乙酸乙酯層，讓乙酸乙酯相與水相分開(3小時(shí))。用無水Na2SO4干燥萃取物，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙酸乙酯得到固化的粗制的3,5-二氨基產(chǎn)物。
將粗制的二氨基產(chǎn)物立即溶于冰醋酸(6.0ml)，按實(shí)施例1.2所述四氮化并經(jīng)Sandmeyer反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3,5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。如實(shí)施例1.2所述，經(jīng)制備型薄層層析純化(Rf=0.70)，產(chǎn)物用95％乙醇重結(jié)晶(250.8毫克類白色晶體，23％得率)。熔點(diǎn)132-134℃。
質(zhì)譜EI,m/z(相對(duì)強(qiáng)度)546(34),545(16),544(M+,100),418(6),382(6)。M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C15H11ClI2O4計(jì)算值543.843541；測(cè)定值，543.843424(偏差=0.2ppm)。
1H NMR光譜，DMSO-d6(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.747(3H，單峰)，3.881(3H，單峰)，6.328(1H，雙峰，J=8.97Hz),6.780(1H，雙峰，J=9.10Hz和J=2.95Hz),7.195(1H，雙峰，J=3.02Hz),8.400(2H，單峰)。
1.15其它化合物用上述的合成方法從合適的起始物質(zhì)里合成本文所述的另外的甲狀腺素，這對(duì)有機(jī)化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域人員來說是很顯然的。本技術(shù)領(lǐng)域里也可發(fā)現(xiàn)其它指南叢書，特別是Borrows等，1949，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成，部分Ⅰ。酪氨酸和它的衍生物的制備，和新途徑制備甲狀腺素”J.Chem.Soc.1949(增補(bǔ)本，頒布1號(hào))S185-S190；Borrows等，1949，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅱ。二硝基苯基醚的制備”J.Chem.Soc.1949(增補(bǔ)本，頒布1號(hào))S190-S199；Clayton等，1951，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅷ。一些鹵代和硝基-二苯基醚的制備”J.Chem.Soc.1951:2467-2473；Gemmill等，1956,“3-碘代-、3,3’-二碘代-和3,3’-二碘代-5-溴甲狀腺素”J.Am.Chem.Soc.78:2434-2436；Meltzer等，1957，“甲狀腺素類似物(Thyroxine Analogs”J.Org.Chem.22:1577-1581；Crowder等，1958，“雙芐基異喹啉(Bisbenzylisoquinolines)部分Ⅱ。5-(2-氨乙基)-4’-羧基-2,3-二甲氧基二苯基醚的合成”J.Chem.Soc.1958:2142-2149；Jorgensen,1978，“甲狀腺激素和類似物，Ⅰ．合成，物理性質(zhì)和理論計(jì)算”In；激素蛋白質(zhì)和肽類，卷Ⅵ,57-105頁，C.H.Li編輯，AcademicPress(在此并入供參考)；和Jorgensen,1978“甲狀腺激素和類似物，Ⅱ．結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系”In激素蛋白質(zhì)和肽類，卷Ⅵ,107-204頁，C.H.Li編輯(在此并入供參考)。
實(shí)施例2純化蛋白磷酸酯酶2A的活化對(duì)表1所列的化合物1和3進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸酯酶2A活化的試驗(yàn)。
2.132P-標(biāo)記的組蛋白H1底物的制備體積為100微升的組蛋白H1根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用蛋白激酶C(UpstateBiotechnology,Inc.，紐約)磷酰化。可替換的是，在用P13-Suc瓊脂糖技術(shù)(Smythe和Newport,1992,“Coupling of Mitosis to the Completion of S phase in XenopusOccurs via Modulation of the Tyrosine Kinase that Phosphorylates p34cdc2”,Cell 68:787-797)后，用在4-8階段快速繁殖的Mytilus Edulis胚胎純化得到的p34cdc2激酶進(jìn)行磷酰化。
2.2磷酸酯酶含量測(cè)定使125ng純化的蛋白磷酸酯酶2A(Upstate Biotechnology,Inc.，紐約；Usui等，1983,J.Biol.Chem.258:10455-10463)與甲狀腺素類似物(50μM)在緩沖液(20mM MOPS或Tris,pH7.5,1mM MgCl2,609Mβ-巰基乙醇)于23℃下預(yù)培養(yǎng)10分鐘?？偟姆磻?yīng)體積為20微升。加入32P-標(biāo)記的組蛋白H1底物(10微克，105cpm)，讓脫磷酰反應(yīng)在23℃下持續(xù)5分鐘，然后通過加入2微升Laemmli緩沖液來終止反應(yīng)。對(duì)同樣含125ng未處理的蛋白磷酸酯酶2A進(jìn)行同樣的反應(yīng)作為對(duì)照。
磷?；兔摿柞；慕M蛋白H1通過凝膠電泳進(jìn)行分離(12％SDS-PAGE)，割下含磷酰化組蛋白H1，通過閃爍計(jì)數(shù)器分析32P活性。
2.3結(jié)果在5分鐘內(nèi)去磷酰化的速度是去磷?；磻?yīng)初速度(v初)的指示值。下表2列出了化合物1和3的v初。
表2蛋白磷酸酯酶2A的活化甲狀腺素類似物 活性/5分鐘(cpm)對(duì)照 10217±1708化合物124655±8600化合物3 7521±1562報(bào)告值是三個(gè)樣品的平均值。
這些結(jié)果顯示與DIME(化合物1)一起預(yù)培養(yǎng)蛋白質(zhì)磷酸酯酶2A的時(shí)間短(10分鐘)，它超過了組蛋白H1脫磷酰化的v初雙倍。4’-丙氧基相應(yīng)物不使蛋白磷酸酯2A活化。這些數(shù)據(jù)表明，即使DIME藥效基團(tuán)結(jié)構(gòu)末端(即甲氧基和甲酯基團(tuán))的最小改變也明顯影響活性。在體外惡性細(xì)胞分析(實(shí)施例3)觀察到和觀察小鼠體內(nèi)抗腫瘤生成作用(參見實(shí)施例4和6)得到這些數(shù)據(jù)與蛋白磷酸酯酶2A活性有很大的相關(guān)性。
實(shí)施例3 蛋白質(zhì)磷酸酯酶A2在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物里的活化根據(jù)Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和使Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)缺失(Modification ofGrowth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tomorigenicity of Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-Amino-1,2-Benzopyrone(INH2BP))”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志(International J.Oncology)8:239-252。表3顯示了由DIME(化合物1)活化的結(jié)果。所有其它化合物是無效的。
表3DIME對(duì)E-ras20細(xì)胞核萃取物的磷酸酯酶活性作用磷酸酯酶活性(fmol Pi/毫克蛋白質(zhì)×分鐘)E-ras核萃取物(每次測(cè)定用5-10微克蛋白質(zhì))29±5E-ras核萃取物+50μMDIME 44±7DU-145(每次測(cè)定用5-10微克蛋白質(zhì)) 12.1±3DU-145+50μMDIME 19.1±2.5Pi=無機(jī)磷酸鹽這些結(jié)果顯示，50μM DIME使在E-ras轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞和DU-145細(xì)胞中的蛋白磷酸酯酶2A活化至少兩倍。
實(shí)施例4對(duì)人體癌細(xì)胞的殺細(xì)胞作用在體外對(duì)7種人體癌細(xì)胞試驗(yàn)化合物1-13的殺細(xì)胞作用。DIME(化合物1)具有最大活性，乙氧基衍生物(化合物2)的活性是最大活性的25-30％。
4.1實(shí)驗(yàn)方案從ATCC得到7種人體癌細(xì)胞(Rockville,MD)，并保持在推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基里。將細(xì)胞以2×104細(xì)胞/cm2密度植入坑(2cm2)。在植入時(shí)向培養(yǎng)基中加入各種濃度的化合物1-13。
使培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)72小時(shí)(5％CO2，大氣壓)。培養(yǎng)后用胰蛋白酶使細(xì)胞分離，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器里計(jì)數(shù)。
4.2結(jié)果DIME(化合物1)的活性最大，乙氧基類似物(化合物2)的活性是最大活性的25-30％。所用其它被試驗(yàn)的類似物(化合物3-13)完全沒有活性。
DIME(化合物1)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做成下表4。I100表示該濃度下沒有存活細(xì)胞；I50表示與對(duì)照相比，該濃度下50％細(xì)胞存活。
表4DIME對(duì)各種人體癌細(xì)胞系的作用細(xì)色胞系I50(μM) I100(μM)HT144(黑素瘤) 0.54.0DU145(前列腺癌)0.53.5HeLA(子宮頸) 0.63.5HL-60(前髓細(xì)胞白血病) 0.63.0MDA-MD-231(乳房癌) 0.43.0SK-Br-3(乳房癌)0.65.0T470(管乳房癌) 0.73.5實(shí)施例5對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn)化合物1和14對(duì)MDA-MD-231癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。與DIME(化合物1)相比化合物14顯示約25％抑制活性。
5.1實(shí)驗(yàn)方案從ATCC(美國(guó)馬里蘭)得到人體癌細(xì)胞MDA-MD-231，保持在推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基里。使細(xì)胞在37℃下在化合物1和14的各種濃度存在下生長(zhǎng)3天。
5.2結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果制成下表5。
表5MDA-MD-231細(xì)胞的生長(zhǎng)速率化合物1(μM) 細(xì)胞(×106) 化合物14 細(xì)胞(×106)0.0 0.950.0 0.950.5 0.200.5 0.951.0 0.101.0 0.712.0 0.092.0 0.20與DIME(化合物1)相比，DIME(化合物14)的2’-氯類似物顯示了約25％的抑制活性。
實(shí)施例6:E-ras移植的牛上皮細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)性的缺失在高腫瘤生長(zhǎng)的E-ras移植的牛上皮細(xì)胞系里試驗(yàn)DIME(化合物1)的形態(tài)作用。
6.1實(shí)驗(yàn)方案將E-ras移植的牛上皮細(xì)胞(Bauer等，1996,Intl.J.Oncology 8:239-252)暴露于10μM DIME達(dá)3天。將DIME-處理過的細(xì)胞(105或106細(xì)胞/100μL)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，腫瘤持續(xù)了25天。
6.2結(jié)果如圖1所示，暴露于10μM DIME達(dá)3天的E-ras移植的上皮細(xì)胞會(huì)誘發(fā)出廣泛的小核化(micronucleation)，與腫瘤生長(zhǎng)的缺失相符。如圖2所示，暴露于未處理的細(xì)胞的動(dòng)物有腫瘤生長(zhǎng)(頂部曲線)，在第25天死于腫瘤。在注射前將細(xì)胞暴露于10μM DIME則幾乎完全消除了腫瘤生長(zhǎng)性(較低的曲線)。即使在3個(gè)月后未經(jīng)體內(nèi)藥物治療也不出現(xiàn)腫瘤。
實(shí)施例7體內(nèi)實(shí)驗(yàn)下列實(shí)驗(yàn)顯示了無毒性，生物利用度，血清半衰期(t1/2)和DIME處理人體乳房癌異源移植入小鼠的體內(nèi)效果。
7.1毒性讓10個(gè)裸鼠每天口服14C-標(biāo)記的DIME(化合物1)(1.0g/kg，在0.1毫升玉米油里)，持續(xù)12-15天。在治療階段觀察到小鼠都沒有病狀。
7.2血清半衰期(t1/2)和生物利用度口服給予小鼠126毫克/kg14C-標(biāo)記的DIME(化合物1)。給藥后，在15和30分鐘，1、2、4、6、8和24小時(shí)采血。在液體閃爍計(jì)數(shù)器里分析血液等分物(50微升)，數(shù)據(jù)表達(dá)為微克-等當(dāng)量/毫升。通過RSTRIP方法(Micromath,Salt LakeCity,UT)來分析血藥數(shù)據(jù)。用24.5mg/kg14C-標(biāo)記的DIME對(duì)小鼠平行組進(jìn)行靜注給藥，采血時(shí)間為10、20和30分鐘，和1、2、4、6和8小時(shí)。
7.2.1結(jié)果14C-標(biāo)記的DIME(毫克-當(dāng)量/毫升)的血藥水平如圖3所示。對(duì)于口服給藥，血藥濃度-時(shí)間曲線下的面積是665.28微克-小時(shí)/毫升(由圓形代表的數(shù)據(jù))，對(duì)于靜注給藥為156微克-小時(shí)/毫升(由正方形代表的數(shù)據(jù))?？诜o予DIME的生物利用度用標(biāo)準(zhǔn)率×劑量的方法從這些數(shù)據(jù)中算得為83％。DIME的半衰期(t1/2)是約2-2.5小時(shí)。
7.3體內(nèi)效果人體腫瘤在無胸腺的小鼠(如裸鼠)里生長(zhǎng)成的異源移植物的能力是研究對(duì)人體腫瘤治療的生物反應(yīng)的有用的體內(nèi)模型。由于人體腫瘤異源移植到無胸腺小鼠里的首次成功(Rygaard和Povlsen,1969,Acta Pathol.Microbial.Scand.77:758-760)，許多不同的人體腫瘤細(xì)胞系(如乳房的、肺部的、泌尿生殖器的、胃腸道的、頭部和頸部的、惡性膠質(zhì)瘤、骨癌和惡性黑素瘤)也已成功地移植入裸鼠并在其中生長(zhǎng)。人體乳房腫瘤細(xì)胞系，包括MCF-7、ZR75-1和MDA-MB-231已能在裸鼠皮下得到皮下移植物(Warri等，1991,Intl.J.Cancer 49:616-23；Ozzello &Sordat,1980，“由人體乳房細(xì)胞系移植到無胸腺的裸鼠產(chǎn)生的腫瘤行為”Eur.J.Cancer 16:553-559；Osbourne等，1985,Cancer Res.45:584-590；Siebert等，1983,Cancer Res.43:2223-2239)。
該實(shí)驗(yàn)顯示在裸鼠中抑制了MDA-MB-231異源移植物。
7.3.1實(shí)驗(yàn)方案從ATCC(Rockville,MD)得到MDA-MB-231(人體乳房癌)細(xì)胞并保持在推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基里。20個(gè)裸鼠每個(gè)都皮下接種MDA-MB-231細(xì)胞(106細(xì)胞/100微升)。10個(gè)鼠一組通過管飼法給予DIME(250毫克/千克，10毫升/千克在玉米油里)，每天給予一次，每周5天，持續(xù)32天。另一組(對(duì)照)的10個(gè)小鼠根據(jù)相同的給藥劑量給予賦形劑。用Vernier測(cè)徑器每周測(cè)兩次，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定平均腫瘤體積。用不配對(duì)、雙尾t-試驗(yàn)進(jìn)行組之間的比較，用變異分析來分析結(jié)果。
7.3.2結(jié)果在接種后14、21、28和32天時(shí)測(cè)量處理和未處理小鼠平均腫瘤體積，結(jié)果如下表5所示。
表6DIME處理后的MDA-MB-231腫瘤體積處理組 14天±SEMa21天±SEMa28天±SEMa32天±SEMa(p值) (p值)(p值) (p值)對(duì)照(賦形劑) 286.6±42.0 622.2±58.1 979.0±1541176.6±222.4DIME 172.0±34.3 285.7±62.4 430±85.6 543.8±122.1(250mg/kg) (p=0.06) (p=0.02) (p=0.01) (p=0.01)減少％ 40％ 54％ 56％ 54％aSEM=均值標(biāo)準(zhǔn)誤這些數(shù)據(jù)表明DIME即使在非最佳治療方案下也有明顯減少惡性腫瘤生長(zhǎng)的作用。
7.4體內(nèi)效果如上所述試驗(yàn)其它甲狀腺素類似物。根據(jù)這些試驗(yàn)，類似物顯示了預(yù)期的活性。
實(shí)施例8制劑下列實(shí)施例提供了例舉性的、非限制的對(duì)哺乳動(dòng)物，特別是人、病人給予本發(fā)明的甲狀腺素類似物的制劑。雖然實(shí)施例顯示了DIME制劑，但應(yīng)當(dāng)明白本文所述的任何甲狀腺素類似物可配制成下列制劑。
8.1 片劑每片含60毫克活性組分的片劑制成如下DIME60毫克淀粉45毫克微晶纖維素 45毫克羧甲基淀粉鈉4.5毫克滑石粉 1毫克聚乙烯吡咯烷酮(10％，在水中)4毫克硬脂酸鎂0.5毫克150毫克使活性組分、淀粉和纖維素經(jīng)過美國(guó)45號(hào)篩，并徹底混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得的粉末混合，然后經(jīng)過美國(guó)14號(hào)篩。使顆粒在50-60℃下干燥，通過美國(guó)18號(hào)篩。然后將已通過了美國(guó)60號(hào)篩的羧甲基淀粉、硬脂酸鎂和滑石粉加入顆粒中，混合后，用壓片機(jī)壓制混合物以得到每片重達(dá)150毫克的片劑。
可通過濕法制粒，然后壓制可從列于表1中的組分里制備片劑。
8.2明膠膠囊用下列組分制備硬膠囊DIME 250毫克/膠囊干燥淀粉 200毫克/膠囊硬脂酸鎂 10毫克/膠囊使上述組分混合并以460毫克量填入硬的明膠膠囊8.3氣霧劑溶液制備含下列組分的氣霧劑溶液DIME 0.25％(w/w)乙醇 29.75％(w/w)推進(jìn)劑22(氯二氟甲烷) 77.00％(w/w)
使活性化合物與乙醇混合，將混合物加到部分推進(jìn)劑22中，冷卻到-30℃，轉(zhuǎn)移到填充裝置。然后將所需的量裝入不銹鋼容器，用剩余的推進(jìn)劑稀釋。將閥門單元固定在容器里。
8.4栓劑如下制備每個(gè)含225毫克活性組分的栓劑DIME 225毫克飽和脂肪酸甘油酯 2000毫克使活性組分經(jīng)美國(guó)60號(hào)篩，并懸浮在用最少必須熱量使之熔化脂肪酸甘油酯中。然后將混合物倒入容量為2克的栓劑模中，并讓它冷卻。
8.5混懸劑如下制備每5毫升含50毫克藥物的混懸劑DIME 50毫克羧甲基纖維素鈉 50毫克糖漿 1.25毫升苯甲酸溶液 0.10毫升調(diào)味品 適量著色劑 適量純水加到 5毫升使活性組分經(jīng)過美國(guó)45號(hào)篩，與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合形成平滑的糊狀。苯甲酸溶液、調(diào)味品和一些著色劑用一部分水稀釋，并攪拌加入。然后加入足量的水以得到所需的體積。
實(shí)施例9在6-氨基-1,2-苯并吡喃的第5位上用碘原子代替H可明顯提高母體化合物的pADPRT抑制效力、抗HIV活性和抗腫瘤作用。Cole等，1991“通過聚(ADP-核糖)聚合酶的兩個(gè)配對(duì)物6-氨基-1,2-苯并吡喃酮和5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮在培養(yǎng)物里抑制HIV-1Ⅲb在AA-2細(xì)胞里的復(fù)制”BiochemBiophys.Res.Commun.180:504-514；Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃(INH2BP)治療來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)的缺失”Intl.J.Oncol.8:239-252。問題在于在特定芳族分子里碘取代基的數(shù)目增加是否會(huì)改善它們的分子藥理性質(zhì)。為了該解決該問題，我們首先分析移植二碘代化合物，如甲狀腺激素類似物的細(xì)胞作用。
現(xiàn)已確認(rèn)，甲狀腺激素類似物的代謝和產(chǎn)生變形作用視其化學(xué)結(jié)構(gòu)而定。Jorgensen,E.1978，“甲狀腺激素和類似物。Ⅱ．結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系在“激素蛋白質(zhì)和肽類”Ⅵ卷，Li CH(編輯)，Academic Press，美國(guó)紐約，108-203頁。在1949年第一次合成了激素失活的3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)(Borrows等，1949，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成，部分Ⅰ．酪氨酸及其一些衍生物的制備和甲狀腺素的合成的新途徑”J.Chem.Soc.補(bǔ)充頒布號(hào)1:S185-S190)，但沒有報(bào)道該物質(zhì)有明顯的代謝或變形作用，Money等，1958，“一些甲狀腺素類似物的化學(xué)結(jié)果改變對(duì)Rana pipiens蝌蚪變形的作用”內(nèi)分泌學(xué)63:20-28；Stasili等，1959，“甲狀腺素類似物在大鼠中抗致甲狀腺腫的活性和產(chǎn)熱活性”內(nèi)分泌學(xué)64:62-82Money等1959，“各種甲狀腺素類似物對(duì)由大鼠甲狀腺攝入的131I的抑制作用”內(nèi)分泌學(xué)64:123-125；Kumaoka等，1960，“甲狀腺素類似物對(duì)可移植小鼠的腦垂體腫瘤的作用”內(nèi)分泌學(xué)66:32-38；Grinberg等，1962，“對(duì)小鼠腦垂體甲狀腺帶腫瘤的研究。Ⅴ．各種甲狀腺素類似物對(duì)生長(zhǎng)和分泌的作用”，癌癥研究(Cancer Res.)22:835-841。在由發(fā)明者較早提出的著作中，已顯示DIME可在細(xì)胞培養(yǎng)物中和體內(nèi)作為潛在的殺腫瘤劑。Kun等，1996,“3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯誘導(dǎo)的腫瘤凋亡解(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4’-methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”文摘號(hào)102,Int.J.Oncol.9補(bǔ)充829；Zhen等，1997，“由DIME誘導(dǎo)的人體癌癥細(xì)胞M相阻斷和內(nèi)復(fù)制(Induction ofMetaphase Block and Endoreduplication in Human Cancer Cells by 3,5-diiodo-4(4’-methoxyphenoxy)Benzoate(DIME)”文摘，Amer.Assoc.Cancer Res.，美國(guó)待批專利申請(qǐng)08/655,267(1996,6,4提交)“Method of Treating Malignant Tumors withThyroxine Analogs having no significant Hormonal activity”顯示了細(xì)胞信號(hào)和癌癥合成的癥狀，和對(duì)DIME結(jié)構(gòu)同類物和類似物(僅側(cè)鏈取代不同)的測(cè)試，描寫了DIME殺腫瘤活性的結(jié)構(gòu)特異性。
下列著作顯示了與DIME和其類似物17比較的結(jié)構(gòu)活性，并揭示了CIME本身的細(xì)胞水平的殺腫瘤作用。對(duì)DIME的藥物代謝和細(xì)胞攝入分析表明它對(duì)動(dòng)物沒有體內(nèi)毒性的理由。對(duì)DIME的作用模式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析和生化機(jī)制分析是連續(xù)研究的對(duì)象。
用來合成表1中1-4和10-18化合物的取代苯酚由Aldrich Chemical Co.(美國(guó)威斯康辛)出售。從4-氯-3,5-二硝基苯甲酸(Aldrich)制備4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯，Ullmann F,1909,“die 4-chlor-3,5-dinitrobenzoesaure”,Annalen der Chemie36:92-93。
9.1一般合成使每個(gè)取代苯酚(作為它的苯酚酸鉀鹽)與4-氯-3,5-二硝基苯甲酸甲酯反應(yīng)得到3,5-二硝基-4-(取代苯氧基)苯甲酸甲酯，然后還原成相應(yīng)的3,5-二胺，并通過Sandmeyer反應(yīng)轉(zhuǎn)化為目標(biāo)的3,5-二碘化合物。Kun等，1996，“通過DIME使腫瘤凋亡(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘號(hào)102,Int.J.Oncol.9補(bǔ)充829。一般來說，還原是催化氫化，但對(duì)于R1或R3是鹵原子(化合物12和14)的情況，還原通過在乙酸/乙醇中的鐵粉進(jìn)行，以避免脫鹵化。Kun等，1996，“通過DIME使腫瘤凋亡(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘號(hào)102,Int.J.Oncol.9補(bǔ)充829。純化通常通過制備型薄層層析和結(jié)晶來進(jìn)行。對(duì)于表7中R2不是甲氧基的化合物(化合物5-9)，用另外的合成反應(yīng)?；衔?通過化合物1的堿水解來制備。Borrows等，1949，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅰ。制備酪氨酸和它的衍生物和用新方法得到甲狀腺素(The Synthesis of Thyroxine and Related Substances.PartI.The preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives,and a New Route tothyroxine”J.Chem.Soc.補(bǔ)充頒布號(hào)1:S185-S190。通過使Borrows等，1949，“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅰ。制備酪氨酸和它的衍生物和用新方法得到甲狀腺素(The Synthesis of Thyroxine and Related Substances.Part I.Thepreparation of Tyrosine and Some of its Derivatives,and a New Route to thyroxine”J.Chem.Soc.補(bǔ)充頒布號(hào)1:S185-S190。所述的化合物6的酰氯依次與無水乙醇、甲胺和二甲胺反應(yīng)可制備化合物5、8和9。Kun等，1996，“通過DIME使腫瘤消散(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘號(hào)102,Int.J.Oncol.9補(bǔ)充829。通過使1與氨在無水甲醇中反應(yīng)可得到化合物7。所有化合物由熔點(diǎn)和高分辨的質(zhì)譜定出特征(表7)，已知的羧酸6除外。對(duì)化合物1-14測(cè)量1H NMR光譜，所有的結(jié)果都是令人滿意的。
表7

化合物序號(hào)R1 R2 R3R4M.P.℃ 分子式 計(jì)算值 測(cè)定值1 CH3CH30 H H 153-155C15H12I2O4509.882513509.8829602 EtO CH30 H H 123-125C16H14I2O4523.898163523.8987373 n-PrO CH30 H H 114-116C17H16I2O4537.913813537.9140144 n-BuO CH30 H H 82-84 C18H18I2O4551.929463551.9300005 CH3O EtOH H 96-98 C16H14I2O4523.898163523.8982026 CH3O HO H H 233-235C14H10I2O4a7 CH3O H2N H H 207-209C14H11I2NO3494.882847494.8818808 CH3O (CH3)HN H H 181-183 C15H13I2NO3508.898497508.8989719 CH3O (CH3)2N H H 162-164 C16H15I2NO3522.914148522.91436410CH3O H H 204-decC14H10I2O4495.966963495.86745311CH3O H H 142-144C14H10I2O3479.871948479.87255312CH3O H H 139-141C14H9I3O3605.768600605.76783913CH3O HCH3O 123-125C15H12I2O4509.882513509.88238714CH3O CH3O ClH 132-134C15H11ClI2O4543.843541543.84342415CH3O CH3O HCH3O 189-192C16H14I2O3539.893078539.89393016CH3O H H 116-119C16H14I2O3507.903248507.90342517CH3O H H 125-128C15H12I2O3493.887598493.88693618CF3O CH3O H H 94-97 C15H9F3I2O4563.854248563.855633元素分析以前Borrows等在J.Chem.Soc.1949,S185-S190中有報(bào)告。
9.2化合物1的合成化合物1(DIME，熔點(diǎn)153-155℃)的合成根據(jù)以前Borrows等1949“甲狀腺素和相關(guān)物質(zhì)的合成。部分Ⅰ。酪氨酸和它的部分衍生物的制備，和得到甲狀腺素的新途徑”J.Chem.Soc.頒布號(hào)1:S185-S190所述方法進(jìn)行?；A(chǔ)的光譜測(cè)定如下(以前未對(duì)該化合物進(jìn)行報(bào)道)。乙醇中的紫外吸收光譜τ max(ε)為289nm(4.20×103),232nm(3.0g×104),213nm(2.48×104)。質(zhì)譜FAB,m/z(相對(duì)強(qiáng)度)510(M+,100),479(4.5),384(4.5)。M+峰的高分辨率數(shù)據(jù)C15H12I2O4的計(jì)算值為509.882513；測(cè)定值為509.882960(偏差為-0.9ppm)。DMSO-d6中的1H NMR譜(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.719(3H，單峰)，3.876(3H，單峰)，6.693(2H，雙峰，J=9.45Hz，細(xì)分裂)，6.845(2H，雙峰，H=9.36Hz，細(xì)分裂)，8.390(2H，單峰)。
9.3化合物7的合成化合物7(3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺)通過在室溫下將氨氣吹入無水甲醇(60ml)中的化合物1(100mg,0.196mmole)5分鐘來制得。在用塞子塞住的燒瓶里靜置1小時(shí)后，再次用氨氣處理混合物，然后使混合物在用塞子塞住的燒瓶里靜置48小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇/氨，將干燥的殘留物溶于溫?zé)岬募状肌盟?7∶3v/v)(30毫升)，在冰箱(3℃)里結(jié)晶。得率58.3毫克(60％)淺黃色晶體。熔點(diǎn)207-209℃。質(zhì)譜(FAB):M+峰的高分辨數(shù)據(jù)C14H11I2NO3的計(jì)算值494.882847；測(cè)定值，494.881880(偏差=2.0ppm)。1H NMR光譜，DMSO-d6中(相對(duì)于TMS的δ(ppm)值)3.716(3H，單峰)，6.682(2H，雙峰，J=8.93Hz細(xì)分裂)，6.895(2H，雙峰，J=8.99Hz，細(xì)分裂)，7.528(1H，單峰)，8.113(1H，單峰)，8.402(2H，單峰)。
9.4細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)減少(Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss ofTomorigenicity of Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with5-Iodo-6-Amino-1,2-Benzopyrone(INH2BP))”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志(Intl J.Oncol)8:239-252中所述的方法培育E-ras20細(xì)胞；HT144(黑素瘤)、DU145(前列腺癌)、HeLa(子宮頸癌)、HL60(前髓細(xì)胞白血病)、MDA-MD-231(乳房癌)、SK-Br-3(乳房癌)、T47D(管乳房癌)、A559(肺癌)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)，并在指定的培養(yǎng)基中培育。以2×104細(xì)胞/cm2的起始細(xì)胞密度來測(cè)試培養(yǎng)物中DIME的效果，在加入藥物72小時(shí)后，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中胰蛋白酶消化后直接進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定DIME對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(通過錐蟲藍(lán)排斥來鑒別完整的細(xì)胞)進(jìn)行比較。
9.5E-ras20細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)作用如前所述，測(cè)定E-RAS20細(xì)胞在無胸腺的裸鼠中的致腫瘤性。Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)減少”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志8:239-252。如同腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定中那樣，在接種了106MDA-MB-231細(xì)胞的無胸腺的小鼠中測(cè)定DIME在體內(nèi)抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。在約10-14天后，當(dāng)皮下腫瘤出現(xiàn)時(shí)，開始進(jìn)行DIME懸浮劑口服給藥治療(一天一次)，并持續(xù)28-32天(如Kun等，1996,“用3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使腫瘤凋亡”，摘要號(hào)102,Int.J.Oncol.9增刊829中所述)。
9.6菌落形成的定量測(cè)定菌落形成的定量測(cè)定如Vidair等，1986“細(xì)胞間Na+,K+,Ca2+和Mg2+在高溫殺死細(xì)胞中的作用的評(píng)價(jià)”Radiation Res.105:187-200所述那樣進(jìn)行。
9.7 DIME-瓊脂糖凝膠親和柱用水洗滌EAH-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)(2.0g，濕型)，將溶劑交換成60％DMF(水性)。將濕餅重新懸浮在含有DIME羧酸衍生物(化合物6)(60mg)的60％DMF(1.0ml)和10倍量的N,N′二環(huán)己基碳二亞胺(Sigma)中，在室溫下輕微轉(zhuǎn)動(dòng)懸浮液16小時(shí)。然后在燒結(jié)玻璃濾器上收集瓊脂糖凝膠顆粒，隨后用DMF、二噁烷、DMF、DMF水溶液(66％、50％和33％)以及水洗滌。根據(jù)取代的珠粒的紫外吸收譜，DIME-基團(tuán)的含量范圍為每毫升濕餅中有1-2μmol。
9.8[14C]-DIME的代謝(a)將每份小鼠組織勻漿物(大腦、腎、肝、肺)與含有20μM[14C]-DIME(10.55mCi/mmol)的1.0ml MES緩沖液(100mM pH6.5)合并，組織勻漿物中包括1.0ml勻漿緩沖液(50mM Tris(pH7.4),400mM NaCl,10mM MgCl2,1mM EDTA,0.5％NP-40,0.5mM PMSF)中的0.2g組織，使混合物在37℃下培育4小時(shí)。然后在每個(gè)試管中依次加入乙酸乙酯(1.5ml)、硫酸銨(900mg)和60％高氯酸(160μl)，每次加入后均進(jìn)行渦流攪拌。靜止10分鐘，用臺(tái)式離心促進(jìn)相分離。棄去上層(乙酸乙酯)，下層水性和中間相物質(zhì)用第二部分乙酸乙酯(1.5ml)萃取。合并的乙酸乙酯萃取物含有原始培育物中總cpm(約4×105cpm)的90％以上。用N2氣流將萃取物蒸干，各殘余物用乙酸乙酯(100μl)吸收，并等份(10μl)加在分析用硅膠TLC平板(Whatman PE SIL G/UV可移動(dòng)平板，厚250μm,10cm×20cm)，用正己烷/乙酸乙酯/乙醇(v∶v∶v=3∶1∶0.8)展開。通過放射自顯影可以看到包括作為參比標(biāo)準(zhǔn)的[14C]-DIME在內(nèi)的分析物條帶。平板上其它的參比標(biāo)準(zhǔn)(非放射性的DIME及其羧酸同系物)在紫外光下可以看到。(b)[14C]-DIME在培育中細(xì)胞中的代謝細(xì)胞與[14C]-DIME一起培育(每個(gè)測(cè)試中有2-5×106個(gè))，然后如(a)中所述進(jìn)行勻漿，測(cè)定代謝物。
9.9 DIME的胞間濃度使9.6cm2孔(3ml培養(yǎng)基)中的單層培養(yǎng)物暴露于[14C]-DIME(10.55mCi/mmol)24小時(shí)，然后用含有未標(biāo)記的DIME的1ml培養(yǎng)基洗滌7次。將細(xì)胞溶解在1ml的4％Na2CO3，和0.2 M NaOH中，用閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定放射性。通過血細(xì)胞容量計(jì)和細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定用未標(biāo)記DIME處理的平行孔中的細(xì)胞體積。
9.10 DNA切割產(chǎn)物的測(cè)定根據(jù)測(cè)定試劑盒生產(chǎn)商(Boehinger Mannheim,Indianapolis,IN,USA,Cat.No.168-4817)的說明，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)來測(cè)定作為凋亡信號(hào)的DNA切割產(chǎn)物。
9.11結(jié)果羧基-酯酶抑制劑二[對(duì)-硝基苯]磷酸酯(BNPP)(Heymann等，1968，“羧基-酯酶抑制劑二[對(duì)-硝基苯]磷酸酯抑制小鼠中非那西汀和乙酰苯胺誘導(dǎo)的正鐵血紅蛋白癥”，Biochem.Pharmacol.18:801-811)購(gòu)自Sigma。
DIME及其同源物和類似物的結(jié)構(gòu)專一性可以通過測(cè)定表7和表8來測(cè)得。我們已經(jīng)制備了17種具有新結(jié)構(gòu)的DIME類似物，并比較了化合物中的10個(gè)的抗腫瘤活性(表8)，結(jié)果顯示出足以獲得一些大致的結(jié)論。選用的生物測(cè)定方法是測(cè)定藥物對(duì)裸鼠中E-ras細(xì)胞的體內(nèi)致腫瘤性的抗腫瘤發(fā)生作用(Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和使Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)明顯減少”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志8:239-252)。用10μM DIME或類似物培育E-ras20細(xì)胞(105或106)4天，然后將105和106個(gè)細(xì)胞皮下接種到裸鼠(每個(gè)測(cè)試5只)中，通過直接測(cè)定腫瘤體積來測(cè)定腫瘤形成的速度(cf.2)。如DIME本身所示(圖4)，腫瘤形成完全消除。對(duì)9種DIME類似物進(jìn)行相同的抗腫瘤發(fā)生試驗(yàn)，以DIME的效果計(jì)為100％(比較25天時(shí)的腫瘤大小)，抗腫瘤效率計(jì)算成DIME活性的百分?jǐn)?shù)。應(yīng)當(dāng)注意，E-ras20細(xì)胞對(duì)于DIME不如人腫瘤那樣敏感，因此，這些結(jié)果只能作為比較DIME類似物的一個(gè)根據(jù)。表8中歸納的結(jié)果描述了R1和R2中的取代基決定了抗腫瘤效率。這一效果在比較R1中R1CH3O,EtO,n-Pro,nBuO時(shí)是特別明顯的，這說明，側(cè)鏈參數(shù)(而不是“甲狀腺素樣”核心結(jié)構(gòu)本身的結(jié)合)賦予了藥學(xué)專一性。
該結(jié)論通過DIME瓊脂糖凝膠親和柱的初級(jí)蛋白結(jié)合研究得以證明。在該親和柱中，DIME與R2骨架共價(jià)連接，因此該DIME衍生物的破壞腫瘤作用明顯低于DIME(與表8中的結(jié)果類似)，(參見Kun等，美國(guó)專利申請(qǐng)No.08/655,267，1996年6月4日提交，“用沒有明顯激素活性的甲狀腺毒素類似物治療惡性腫瘤的方法”，該申請(qǐng)公開的內(nèi)容納入本文作參考)。但是細(xì)胞抽提物滲濾通過該柱會(huì)使蛋白質(zhì)與親和性骨架結(jié)合；其中一種被吸收的蛋白質(zhì)被確認(rèn)為是微管蛋白。DIME的蛋白結(jié)合通過前述的著絲粒(centricon)方法來測(cè)定(Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和使Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞洗腫瘤生長(zhǎng)減少”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志8:239-252)。根據(jù)Scatchard作圖計(jì)算，在細(xì)胞抽提物中有蛋白質(zhì)(甚至是BSA)存在時(shí)，可獲得109-1010的KD值，這表示DIME與各種蛋白間有可能為疏水締合。根據(jù)DIME-瓊脂糖凝膠親和柱的結(jié)果，我們將這種結(jié)合歸為DIME“核心”結(jié)構(gòu)的作用。
表8E-ras20致腫瘤性的抑制DIME以及一些結(jié)構(gòu)類似物的效率化合物編號(hào) 效率(％)1 1002 935 839 647 536 453 448 2210144 4測(cè)定25天時(shí)腫瘤減少的大小，將DIME類似物對(duì)E-ras20細(xì)胞在無胸腺的小鼠體內(nèi)致腫瘤性的藥效與DIME(化合物1，視為100)作比較。DIME或其類似物(表7)的預(yù)處理是在皮下(s.c.)接種前用10μm處理4天，a如表7中所指定的。
從表8可以推出DIME類似物的相對(duì)活性，然而本試驗(yàn)主要側(cè)重于DIME本身的細(xì)胞殺死作用，以確定適用于更詳細(xì)地分析DIME類似物的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。將DIME(圖1)抗腫瘤發(fā)生作用延伸到體內(nèi)條件，通過對(duì)裸鼠給予DIME(每日0.25-1.0g/kg的口服劑量)會(huì)在25-35天內(nèi)產(chǎn)生70-85％的腫瘤消退(Kun等，1996,“用甲基-3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使腫瘤凋亡”，摘要號(hào)102,Int.J.Oncol.9增刊829)。由于下述一些可能存在的原因，這些大劑量沒有產(chǎn)生顯著的毒性。由于0.25g/kg和1.0g/kgDIME有相同的抗腫瘤效果，因此，劑量應(yīng)答的對(duì)應(yīng)關(guān)系不明顯。這種似是而非的結(jié)論可通過藥物被選擇性吸收人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞來解釋。
在本研究中，我們側(cè)重于顯微分析細(xì)胞殺死的方法。如圖5所述的，在10天內(nèi)，MDA-MB-231細(xì)胞的菌落形成能力被濃度為1-2μM的DIME大幅度降低。當(dāng)在與細(xì)胞培育8小時(shí)的終止前除去DIME時(shí)，細(xì)胞殺死受到抑制，藥物誘導(dǎo)的形態(tài)改變完全被逆轉(zhuǎn)。在用1-10μM DIME預(yù)培育后，重新平板培養(yǎng)洗至不含DIME的細(xì)胞8小時(shí)會(huì)使正常的細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制重新開始。在藥物處理8小時(shí)后產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡的不可逆途徑的關(guān)鍵因素還未知道，它有待于進(jìn)一步的研究。然而，一個(gè)容易檢測(cè)到的由于DIME而誘導(dǎo)最終細(xì)胞死亡的因素是如圖6所示的藥物濃度-依賴型DNA的斷裂。
DIME的一個(gè)顯著的性質(zhì)是其對(duì)體內(nèi)腫瘤有明顯的選擇性。我們進(jìn)行了藥物代謝和細(xì)胞吸收DIME的試驗(yàn)，以進(jìn)一步表征這一性質(zhì)。在前述條件下(Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和使Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞洗腫瘤生長(zhǎng)減少”國(guó)際腫瘤學(xué)雜志8:239-252)，使細(xì)胞與[14DIME一起培育，結(jié)果使得細(xì)胞吸收的藥物不能用含有非放射性DIME(與培育時(shí)胞外濃度相同)的PBS洗滌脫離細(xì)胞(cf.2)。細(xì)胞(如MADA-MP-231)中的藥物吸收速度非常高的與DIME敏感性較低的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞最容易被殺死(表9)。我們研制出一種正常腎細(xì)胞(CV-1細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化表型，這種表型表現(xiàn)出沒有接觸抑制，并有迅速的增倍時(shí)間(12小時(shí)，而非轉(zhuǎn)化表型為54小時(shí))。如表9中所示的，腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞通常比未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(CV-1)或?qū)IME殺死的敏感性較差的細(xì)胞(如E-ras20)更容易吸收DIME。已建立的細(xì)胞系已經(jīng)經(jīng)受了不滅危險(xiǎn)期(immortality crisis)，因此，生理上不嚴(yán)格操作的細(xì)胞、我們的藥物吸收結(jié)果以及體內(nèi)明顯缺少DIME毒性均表明，完整的動(dòng)物的正常細(xì)胞不會(huì)吸收或只吸收很少的DIME。另一方面，正常小鼠器官的勻漿物使DIME有活性代謝(脫酯化)(如表10所述)?！癉IME酯酶”活性的最高速度發(fā)生在大腦勻漿物中。
表9DIME的吸收細(xì)胞類型 胞外DIMEa,b胞內(nèi)DIMEE-ras2-(24小時(shí)) 10 105±20(n=4)MDA-MB-231(24小時(shí))2 120±15(n=4)CV-1(24小時(shí)) 225±4,(n=3)CV-1-轉(zhuǎn)化細(xì)胞(24小時(shí)) 266+6,(n=3)四種細(xì)胞類型在培育24小時(shí)(見方法)后的DIME細(xì)胞濃度。aμM；bDIME的濃度選擇成引起100％的生長(zhǎng)抑制，留下20-50×104連接細(xì)胞/cm2。
表10在各種組織勻漿物中用酯酶將DIME切割成其羧酸a組織 [14C]-DIMEb[14C]-酸a,b大腦 14.9(305,000cpm) 3.6(73,800cpm)17.1(350,000cpm) 2.0(41,250cpm)肝186.(381,000cpm) 1.4(27,900cpm)肺19.4(396,000cpm) 1.0(20,500cpm)a表7中的化合物6。b用nmol表示，用薄層層析分離，從在37℃在2.0ml勻漿物中培育4小時(shí)的20.0mol[14C]-DIME開始。cpm值的偏差為±2％。[14C]-DIME的比放射活性為20,470cpm/nmol。
人肺腫瘤細(xì)胞(A-549)的試驗(yàn)也證明了DIME的藥物代謝和殺腫瘤細(xì)胞作用的相互關(guān)系。如圖4所示，A-549細(xì)胞很容易切割DIME中的酯鍵(R2)，而用二(對(duì)-硝基苯)磷酸酯(Heymann,1968，“羧基-酯酶抑制劑二[對(duì)-硝基苯]磷酸酯抑制小鼠中非那西汀和乙酰苯胺誘導(dǎo)的正鐵血紅蛋白癥”，Biochem.Pharmacol.18:801-811)會(huì)使DIME對(duì)A-549細(xì)胞有更多的細(xì)胞殺死效果(從圖Ⅴ可以看出)。表11中歸納了DIME對(duì)各種癌細(xì)胞的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用(以3天內(nèi)使50％細(xì)胞停止生長(zhǎng)的DIME濃度表示)的比較。圖6中顯示了最終濃度為0.5,1.0和2.0μM的DIME對(duì)MDA-MB-231的作用的時(shí)間曲線。
表11DIME對(duì)各種人癌細(xì)胞系的作用細(xì)胞系I50,μM(第3天)E-ras20 1.0LHT144(黑素瘤) 0.5DU145(前列腺癌) 0.5HeLA(子宮頸癌) 0.6HL60(前髓細(xì)胞白血病) 0.4MDA-MD-231(乳房癌)0.4SK-Br-3(乳房癌) 0.6T470(管乳房癌) 0.7對(duì)于DIME暴露試驗(yàn)，以2×104細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞接種入2cm2孔中。在接種時(shí)加入各種濃度的DIME。然后培育細(xì)胞培養(yǎng)物3天(37℃,5％,CO2氣氛中)。
DIME是一種獨(dú)特的殺腫瘤細(xì)胞分子，因?yàn)槌藢?duì)完整動(dòng)物中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞外，它沒有宏觀可觀察到的體內(nèi)毒性，通過藥物吸收測(cè)定可以明顯看出，對(duì)DIME細(xì)胞殺死作用敏感的那些細(xì)胞會(huì)最易親和該藥物。DIME也不同程度地抑制了培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的非癌細(xì)胞的復(fù)制(未顯示)，然而藥物并未表現(xiàn)出有體內(nèi)毒性。因此，細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞對(duì)DIME的滲透性與體內(nèi)細(xì)胞的功能不同。這種明顯的腫瘤專一性的原因主要取決于培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞和動(dòng)物組織中生長(zhǎng)的細(xì)胞的一些細(xì)胞膜性能(還未知)間的差異，這有待進(jìn)一步的研究。這種細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞以及體內(nèi)調(diào)控的細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞)間對(duì)DIME的明顯的滲透性差異不會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)(Kun等，1996，“用甲基-3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使腫瘤凋亡”，摘要號(hào)102,Int.J.Oncol.9:增刊829)，因?yàn)轶w內(nèi)的腫瘤細(xì)胞已被進(jìn)入的DIME殺死(Kun等，1996，“用甲基-3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使腫瘤凋亡”，摘要號(hào)102，Iht.J.Oncol.9增刊829)。體內(nèi)給予的DIME劑量(0.25-1.0g/kg)大大超過了細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的胞外殺腫瘤細(xì)胞濃度(0.5-2.0μM)，說明腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)會(huì)吸收少部分的給予體內(nèi)的DIME，而體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞看上去保留了與細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)DSME相同的靈敏性，即培養(yǎng)物中和體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞有相似的藥物吸收。體內(nèi)腫瘤細(xì)胞膜與細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞系的相似之處看來是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)新的習(xí)性，這還需要進(jìn)一步的分析。除了腫瘤中對(duì)DIME滲透有明顯的體內(nèi)選擇性外，腫瘤細(xì)胞與通常沒有可檢測(cè)DIME酯酶活性(未顯示)的正常細(xì)胞不同(除了A-549細(xì)胞(肺癌)外)。對(duì)這些細(xì)胞的研究(圖4,5)明顯說明，DIME本身而不是其酯酶產(chǎn)生的代謝物是殺腫瘤細(xì)胞的分子。從表8可以看出，DIME的甲酯基團(tuán)(R2)被更長(zhǎng)的乙酯或酰胺基團(tuán)代替后仍能使某些DIME類似物對(duì)E-ras20細(xì)胞有相當(dāng)?shù)目鼓[瘤效率。在這個(gè)研究中，只對(duì)DIME進(jìn)行了相當(dāng)詳細(xì)地分析，但各種“活性”DIME類似物也值得進(jìn)一步的注意，因?yàn)樗鼈兛赡苓€有被用于其它化學(xué)治療用途的細(xì)胞和體內(nèi)效果。關(guān)于DIME及其類似物中的碘原子，這些龐大的原子無疑會(huì)在兩個(gè)苯環(huán)間形成構(gòu)象限制，并且同時(shí)可能是細(xì)胞滲透中的關(guān)鍵決定因素。
實(shí)施例10:DIME對(duì)細(xì)胞和核形態(tài)的作用下面提供了關(guān)于用甲狀腺素類似物治療廣泛癌癥的更廣概念的其它證據(jù)。我們已經(jīng)報(bào)道了DIME是一種誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中和體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞死亡的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。選擇性殺腫瘤細(xì)胞作用最能通過該藥物選擇性滲透進(jìn)人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞來加以解釋(Mendeleyev等，1997,“-3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的結(jié)構(gòu)特異性和殺腫瘤細(xì)胞作用”，Intl.J.Oncol.，在出版)。如這里所描述的，將腫瘤細(xì)胞暴露在1-4DIME下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)的改變和有絲分裂阻斷，這暗示有幾個(gè)DIME作用的生化位點(diǎn)參與。重要的是，在分析生化水平位點(diǎn)前首先要用細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定DIME的細(xì)胞作用方式。本實(shí)施例涉及有絲分裂時(shí)DIME對(duì)細(xì)胞與核的形態(tài)和發(fā)展的作用。
10.1顯微形態(tài)E-ras細(xì)胞的顯微形態(tài)用早先報(bào)道的技術(shù)(Mendeleyev等，1997，“甲基-3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的結(jié)構(gòu)特異性和殺腫瘤細(xì)胞作用”，Intl.J.Oncol.，在出版；Bauer等，1996，“通過用5-碘代-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理來修飾與生長(zhǎng)相關(guān)的酶途徑和使Ras-轉(zhuǎn)移牛上皮細(xì)胞洗腫瘤生長(zhǎng)減少”)來進(jìn)行測(cè)定。
10.2中期顯象(M Phase Visualization)的制備從ATCC(Rockville,MD,USA)購(gòu)得MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞培育在37℃、T-75搖瓶中補(bǔ)充有10％FCS的基本必需培養(yǎng)基α(Minimum Essential Medial-α)內(nèi)。在收集中期-阻斷細(xì)胞和制備細(xì)胞涂布物(spread)前，在培養(yǎng)物中加入0.1μg/ml秋水仙酰胺(不加入DIME)培養(yǎng)4小時(shí)，作為對(duì)照。DIME和秋水仙酰胺在中期細(xì)胞周期阻斷方面的效果是不可區(qū)別的，因此在測(cè)試DIME對(duì)中期涂布物的效果時(shí)，不加入秋水仙酰胺。從0.025％胰蛋白酶消化5分鐘的T-75胰蛋白酶消化物中分離獲得細(xì)胞107，離心沉淀，重新懸浮并保持在37℃、10ml 75mM KCl中10分鐘，重新沉淀，用10ml甲醇-乙酸固定，連續(xù)更換甲醇-乙酸四次。將等份的最終細(xì)胞懸液(100μl)滴在乙醇-清洗的載玻片上，用空氣干燥。
10.3原位雜交人染色體專一性探針由ONCOR(Gaithersburg,MD,USA)生產(chǎn)。用Pinkel等(1986，“用定量高靈敏度熒光雜交的細(xì)胞遺傳分析”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2934-2938)描述的方法的改進(jìn)方案進(jìn)行雜交。用胃蛋白酶(0.01N HCl中20μg/ml)在37℃處理載玻片固定的細(xì)胞10分鐘，然后依次在70％、85％和100％的乙醇中脫水，浸入70％甲酰胺，然后是70℃、2X標(biāo)準(zhǔn)鹽水檸檬酸(IX SSC是0.5MNaCl,0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)中2分鐘，使DNA變性，并如上所述在乙醇中脫水?？傮w積為10μl的雜交混合物包括50％甲酰胺IX SSC、10％右旋酶酐硫酸鹽、0.5μg鯡精子DNA和1-5μg蛋白酶K處理過的人胎盤DNA。預(yù)先將鯡精子DNA和人胎盤DNA超聲處理成200-600bp片段，加入約40ng核苷酸的異羥基詳?shù)攸S毒苷化的探針DNA(在70℃下變性5分鐘)，在37℃下培育1小時(shí)。將該混合物加到含有固定細(xì)胞的載玻片上，密封在蓋玻片下，在37℃下培育2-3天。在雜交完成后，在45℃下用50％甲酰胺，2X SSC,pH7.0洗滌三次(3×5分鐘)，在PN緩沖液中(包括0.1M NaH2PO4和0.1M NaHPO4,0.1％Nonidet P-40,pH8.0)在45℃下洗滌兩次，然后用在PNM緩沖液(在離心除去固體后，是含有0.02％疊氮鈉的5％無脂干牛奶)中的5μg/ml抗異羥基洋地黃毒苷FITC、2μg/ml兔抗羊FITC(Boehringer Mannheim)在室溫下處理20分鐘，在每次培育后各用PN緩沖液洗滌兩次各3分鐘，用抗褪色溶液(Vector Labs,Burlingame,CA,USA)中的0.4μM D API(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)對(duì)DNA染色。在裝有多條帶通過過濾器的蔡斯熒光顯微鏡(Chroma Technology,Brattleboro,VT,USA)上觀察載玻片，測(cè)定每個(gè)核細(xì)胞的FISH信號(hào)前數(shù)。
10.4時(shí)間推移(time-lapse)的可視顯微法(videomicroscopy)將密封在T-25組織培養(yǎng)搖瓶中的細(xì)胞放在溫度控制的培育室單元中，以使倒轉(zhuǎn)的相對(duì)比顯微鏡封閉。培育室與環(huán)境房間光線隔絕。每5分鐘，打開顯微鏡光12秒，在該時(shí)間內(nèi)用購(gòu)自Compix,Inc.(Mars,PA,USA)的作圖系統(tǒng)捕捉圖象。用相同公司的軟件分析圖象順序。
10.5流式細(xì)胞計(jì)數(shù)使受不同處理作用的細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿，用胰蛋白酶消化，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌。對(duì)于核分析，將細(xì)胞固定在Vindelov檸檬酸鹽細(xì)胞緩沖液(1000ml溶液中有蔗糖250mM，檸檬酸三鈉二水合物40mM,DMSO 50ml,pH7.6)中。從血液中獲得的正常人淋巴細(xì)胞用作對(duì)照。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)每個(gè)細(xì)胞樣品和對(duì)照計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到2×106細(xì)胞/毫升?？傮w積2ml中有每個(gè)細(xì)胞系的2百萬個(gè)細(xì)胞用新鮮的PBS洗滌兩次，在37℃下用200μg/ml RNA酶處理30分鐘，并用10μg/ml丙基碘鎓(propidium iodide)染色45分鐘。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析在裝有空氣冷卻、調(diào)至488nm的亞弧激光的FACScan臺(tái)式流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton-Dickinson,San Jose,CA,USA)上進(jìn)行。收集兩萬個(gè)結(jié)果作為6個(gè)參數(shù)列表方式數(shù)據(jù)，以便進(jìn)行分析和檔案保存。在1024個(gè)數(shù)據(jù)通道分辨率下，得到兩個(gè)光散射參數(shù)(正向和側(cè)向)，在576/26nm和620nm上方測(cè)得的丙基碘鎓熒光，以及熒光脈沖寬度和面積的雙重辨別。獲取數(shù)據(jù)設(shè)定在通道100上方的丙基碘鎓正性結(jié)果?？刂崎y門以排斥小的碎片，在獲取后獲得大的團(tuán)塊和細(xì)胞雙聯(lián)體。
10.6免疫細(xì)胞化學(xué)將細(xì)胞固定在-20℃的甲醇中5分鐘。初級(jí)抗體是小鼠單克隆抗β微管蛋白(Amersham)，次級(jí)抗體來自山羊，其與來自Cappel的熒光素異硫氰酸酯(Durham,NC,USA)結(jié)合。細(xì)胞核的DNA通過在0.05μg/ml 4′-6-二酰胺(diamidono)-2-苯基吲哚(DAPI)中培育10分鐘來染色。染色的細(xì)胞可用蔡斯40xPlan-Neofluar或Nikon60xPlanApo目鏡來觀察。對(duì)于有絲分裂期間的細(xì)胞分類，分裂前期和分裂中期合并成一類，因?yàn)楹茈y區(qū)分前期后階段與中期。
10.7結(jié)果圖10中描述了4μM DIME在與E-ras 20細(xì)胞一起培育18-24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。腫瘤細(xì)胞增大，尤其在300倍放大倍數(shù)下可見，并出現(xiàn)許多微核。進(jìn)一步研究這些細(xì)胞變化的特征。在MDA-MB231人乳房癌細(xì)胞核上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(圖11)，結(jié)果證明通過受藥物作用18小時(shí)，有DNA G2含量的核累積，暗示有中期阻斷。
上述觀察結(jié)果鼓勵(lì)我們測(cè)定受DIME作用的細(xì)胞中進(jìn)入有絲分裂的動(dòng)力學(xué)。使細(xì)胞在含有IμM DIME的培養(yǎng)基中培育，然后進(jìn)行材料和方法部分中所述的時(shí)間推移的可視顯微測(cè)定。圖12示出的圖表示有絲分裂延遲13小時(shí)并不規(guī)則地分裂成6個(gè)子細(xì)胞。相反，對(duì)照細(xì)胞中有絲分裂只延遲約0.5小時(shí)(見圖13)，并且總是分裂成2個(gè)子細(xì)胞(數(shù)據(jù)未列出)。
時(shí)間推移的可視顯微法也能使我們監(jiān)測(cè)上述不規(guī)則細(xì)胞分裂獲得的子細(xì)胞的命運(yùn)。在1μM DIME存在下，觀察到有20％的有絲分裂產(chǎn)生了融合的子細(xì)胞(表12)，它們通常形成如圖10所示類型的多核大細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞沒有表現(xiàn)出在這種分裂后有融合。
表12DIME誘導(dǎo)子細(xì)胞在有絲分裂后融合監(jiān)測(cè)的有絲分裂數(shù)目a其后有子細(xì)胞融合的有絲分裂數(shù)目b1.0μMDIME35 7對(duì)照32 0a有絲分裂通過細(xì)胞連續(xù)受DIME作用期間的時(shí)間推移可視顯微法來監(jiān)測(cè)；b子細(xì)胞的融合通常在細(xì)胞分裂后幾分鐘內(nèi)發(fā)生，融合涉及2-5個(gè)子細(xì)胞。
測(cè)定在1μM DIME存在下發(fā)生的細(xì)胞分裂，以定量地評(píng)價(jià)每次有絲分裂獲得的子細(xì)胞數(shù)目(圖14)。每次有絲分裂的子細(xì)胞數(shù)在1-6之間。在對(duì)照細(xì)胞中，細(xì)胞總是(33/33)分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。因此，這里描述的藥物誘導(dǎo)的有絲分裂長(zhǎng)期延遲之后將是高度異常的細(xì)胞分裂。
圖15顯示了培育在1μM DIME中的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的比例。曲線幾乎是重合的，這說明DIME不影響細(xì)胞經(jīng)歷分裂間期的速度。相反，藥物使有絲分裂所費(fèi)的平均時(shí)間提高了20多倍(圖13)。通過它們縮合和增大的染色質(zhì)(圖16)和異常的有絲分裂紡錘體(圖17)，可以確認(rèn)受DIME阻斷的圓形細(xì)胞的確處于有絲分裂期間。
用對(duì)染色體1、2、7、11和19有專一性的探針進(jìn)行中期細(xì)胞核原位雜交的染色體分析。它們都產(chǎn)生了相似的結(jié)果，因此只對(duì)染色體19進(jìn)行描述。圖16A、B和C中顯示了染色體19的典型結(jié)果。在所有例子中均采用MDA-MB-231(人乳房癌)細(xì)胞。圖16A顯示了染色體19的原位雜交。受1μM DIME作用18小時(shí)沒有可檢測(cè)的效果，因此圖16A和16B均代表了對(duì)照和藥物處理的細(xì)胞。圖16B是DNA染色(DAPI)，其描述了DNA染色與染色質(zhì)重合，而圖16A是對(duì)染色體19進(jìn)行染色。然而，細(xì)胞暴露在藥物(1μM DIME)作用下5天將誘導(dǎo)一些細(xì)胞中期染色質(zhì)大量積累，有約40條染色體19的信號(hào)，約100條染色體(圖16C)。不能獲得染色體斷裂的任何證據(jù)，即使該藥物處理最終將殺死細(xì)胞(Mendeleyev等，1997,“3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的結(jié)構(gòu)特異性和殺腫瘤細(xì)胞作用”，Intl.J.Oncol.,10:689-695)。
圖17顯示了暴露于1μMDIME 18小時(shí)后有絲分裂紡錘體的結(jié)構(gòu)。圖17A是未經(jīng)藥物處理的MDA-MB-231癌癥細(xì)胞里小管染色的(tubulin-stained)有絲分裂的紡錘體。圖17B顯示了經(jīng)18小時(shí)暴露于藥物后對(duì)異常小管分布進(jìn)行撞擊。這些多中心結(jié)構(gòu)在暴露于1μM DIME達(dá)5天后變得更為厲害(圖17C)。小管的細(xì)胞多中心分布(圖17B和17C)類似于體外加入中心體后小管的核化，如Mitchison等，1984，“通過分離中心體使微管組合核化(Microtubule Assembly Nucleated byIsolated Centrosomes)”Nature312:232-237。但是，我們不能通過免疫熒光檢測(cè)到異常中心體的數(shù)目(數(shù)據(jù)未顯示)，這樣18小時(shí)DIME(1μM)處理后使小管明顯多中心核化可能不直接與中心體有關(guān)。這些圖沒有顯示是否1μM DIME誘導(dǎo)小管去聚合或抑制再聚合。
在初步研究(資料未顯示)中，我們已經(jīng)通過免疫細(xì)胞技術(shù)研究了某些與紡錘體相關(guān)的蛋白質(zhì)。Cdc-2激酶在沒有1μM DIME時(shí)與紡錘體無關(guān)，但在細(xì)胞暴露于藥物達(dá)18小時(shí)后，它能誘導(dǎo)cdc-2-激酶-紡錘體連接。藥物處理不改變對(duì)中心體蛋白中心體粒周圍(pericentrin)由抗血清的染色換式，因?yàn)橹灰姷絻蓚€(gè)焦點(diǎn)(foci)。細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)B-微管-紡錘體相關(guān)物也沒有改變。但是，誘導(dǎo)紡錘體磁極中心組織異常的藥物仍與細(xì)胞周期蛋白B結(jié)合。蛋白磷酸酯酶2a(pp2a)-紡錘體相關(guān)物相同于中心體粒周圍蛋白(pericentrin)或細(xì)胞周期蛋白B，它不為藥物處理(1μM處理18小時(shí))所影響。
這些例舉性研究包含了進(jìn)一步研究細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)。在初步實(shí)驗(yàn)中也試驗(yàn)了磷酸酯酶在蛋白質(zhì)-紡錘體相關(guān)物里可能的作用。暴露于100nM細(xì)胞外加入的okadaic酸達(dá)18小時(shí)僅消滅了cdc-2激酶和pp2a-紡錘體相關(guān)物，這表明涉及了蛋白質(zhì)磷酸酯酶(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果似乎與早先的1μM DIME的作用有區(qū)別，后者在暴露于藥物達(dá)18-24小時(shí)里發(fā)生，后面的結(jié)果是藥物處理5天后可見到形成的染色體數(shù)目。但是，可能后者僅反應(yīng)了由DIME與特定細(xì)胞位點(diǎn)結(jié)合引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的一系列結(jié)果。早期包括明顯的細(xì)胞學(xué)改變，特別是大的多核細(xì)胞的外觀改變。人們公知在輻照損傷后會(huì)形成微核，在后期由于缺少著絲點(diǎn)和微管紡錘體連接，而使無中心的染色體片段不能進(jìn)行核聚集以極化，Bedford,J.S.,1991，“暴露于離子化輻照的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的亞損傷、潛在的致命損傷和染色體畸變”J.Radiation Oncol.Biol.Phys.21:1457-1469。時(shí)間推移研究顯示，硫酸長(zhǎng)春花堿也誘發(fā)中期阻滯的多核細(xì)胞，Kirshan,1968,“Time Lapse and Ultrastructure Studies on the Reversal ofMitotic Arrest Induces by Vinblastine Sulfate in Earl’s L cells”J.Natl.CancerInstitute 41:581-595，這里顯示了結(jié)果(圖10)，除了長(zhǎng)春花屬生物堿對(duì)動(dòng)物顯示出嚴(yán)重的毒性作用外，DIME沒有毒性。蛋白質(zhì)磷酸酯酶2a(pp2a)也誘導(dǎo)多核化的表述，Wera等，1995,“Deregulation of Transitional Control of the 65 kDaRegulatory Subunit(PR65 Alpha)of Protein phosphatase 2A leads to MultinucleatedCells”J.Biol.Chem.270:21374-21381，很清楚地表明該復(fù)雜過程(多核化)的發(fā)展機(jī)制可能涉及許多可能相關(guān)的酶活性。這些結(jié)果顯示pp2a在DIME細(xì)胞(1.c.1)里的活化，可能是由于DIME對(duì)該酶的直接作用。DIME對(duì)各種細(xì)胞酶的作用模式細(xì)節(jié)在各自生化報(bào)告里已作報(bào)道。
最容易觀察到的由DIME誘導(dǎo)的細(xì)胞現(xiàn)象之一是DIME對(duì)中期(M相)的阻滯(圖11和13)，與colcemid或特別與長(zhǎng)春花屬生物堿極為類似，它可被DIME代替。如與染色體1、2、7、11和19的DNA-熒光雜交所示，由于細(xì)胞不能分裂造成了染色體的積聚，使DIME有滯后效應(yīng)(5-天)。DIME對(duì)DNA沒有明顯的直接作用。在雙鏈DNA中的內(nèi)切物(圖12)，Mendeleyev等，1997,“DIME的結(jié)構(gòu)特異性和殺腫瘤作用”Int.J.Oncology 10:689-695，是DIME與癌癥細(xì)胞相互作用的結(jié)果，最能反映DNA核酸細(xì)胞內(nèi)切酶的上調(diào)作用，它們?cè)贒IME處理的細(xì)胞里通過聚(ADP-核糖)糖水解酶的間接作用進(jìn)行去-聚-ADP-核糖化(de-poly-ADP-ribosylated)(參考文獻(xiàn)1的腳注1)。核酸細(xì)胞內(nèi)切酶活化不僅僅是DIME導(dǎo)致生長(zhǎng)中細(xì)胞死亡的單個(gè)原因，因?yàn)橐阎?xì)胞的分化機(jī)制會(huì)導(dǎo)致凋亡，Wertz等，1996,“Diverse Molecular Provocation of Programmed Cell Death”TIBS 21:359-364。在DIME處理的細(xì)胞中出現(xiàn)異常染色體紡錘體表示DIME對(duì)小管系統(tǒng)初始的細(xì)胞作用，已知這在細(xì)胞分裂中起關(guān)鍵的作用，Murray等，1993,“TheCell Cycle:an Introduction.”,Oxford University Press，美國(guó)紐約。
由于DIME是“激素樣失活的”甲狀腺激素類似物，那么出現(xiàn)了一個(gè)有趣的問題，甲狀腺激素的代謝前體(或分解物)在保持生理差異上，作為“抗惡性腫瘤”讀出調(diào)節(jié)劑是否起了作用。對(duì)甲狀腺素代謝物的殺腫瘤作用的研究作了肯定的回答。
實(shí)施例11對(duì)小管聚合作用的影響在下列實(shí)驗(yàn)中，激素樣失活的甲狀腺素類似物DIME以1-5μM的濃度抑制了MTP的依賴GTP的聚合，這由光學(xué)試驗(yàn)測(cè)定。該抑制作用嚴(yán)格地依賴于GTP濃度。在MTP聚合為線性速率，然后發(fā)生Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)和抑制為“混合”類型，其中GTP的km和U最大可同時(shí)改變的情況下，DIME和GTP的濃度之間是相關(guān)的。DIME的化學(xué)類似物在與它們體內(nèi)抗腫瘤作用的同時(shí)也抑制了MTP聚合。MTP位點(diǎn)是對(duì)DIME早期細(xì)胞反應(yīng)的位點(diǎn)之一。
將人體乳房癌癥細(xì)胞(MDA-MB-231)暴露于1μM DIME，在藥物處理18小時(shí)里誘發(fā)異常的紡錘體結(jié)構(gòu)，這樣推定的DIME-微管-蛋白質(zhì)(MTP)相互作用似乎是早期細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)的一個(gè)組成，Zhen等，1997,“Cellular Analysis of themode of action of methyl-3,5-diiodo-4-(4’-methoxyphenoxy)benzoate(DIME)ontumor cells”Intl..J.Oncol.。異常的紡錘體結(jié)構(gòu)是DIME-MTP相互作用或DIME與微管的器官中心的組成反應(yīng)或與接著得到的或同時(shí)的目前尚未定義的系統(tǒng)反應(yīng)的結(jié)果。由于，原位對(duì)依賴時(shí)間的MTP系統(tǒng)的定量分析不適合于最初的速度測(cè)量，現(xiàn)將神經(jīng)小管的體外部件系統(tǒng)作為DIME與MTP相互作用的定量分析模式。由Gaskin等，1974,“Turbidimetric studies of the in vitro assembly anddisassembly of porcine neurotubules”J.Mol.Biol.89:737-758；和Kirschner等，1974，“來自哺乳動(dòng)物大腦的微管它們脫聚合的產(chǎn)物的性質(zhì)和組裝和去組裝的可能機(jī)理”，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71:1159-1163；該系統(tǒng)適合于MTP組裝部件的體外動(dòng)力學(xué)分析。MTP組裝件的時(shí)間進(jìn)程由引發(fā)、繁殖和終止步驟構(gòu)成，Gaskin等，1974,“Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassemblyof porcine neurotubules”J.Mol..Biol.89:737-758。在給定條件下的繁殖速率與動(dòng)力學(xué)分析成線性，它用用來對(duì)DIME和GTP濃度進(jìn)行評(píng)估。我們已經(jīng)顯示，由DIME對(duì)MTP組裝件的抑制作用會(huì)發(fā)生在體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生或抑制細(xì)胞復(fù)制或最后誘發(fā)細(xì)胞死亡所需的藥物濃度的相同濃度，Mendeleyev等，1997,”Structureal specificity and tumoricidal action of DIME”Int.J.Oncol.10:689-695和上表8；因此DIME-MTP相互作用是DIME作用的明顯多向性細(xì)胞機(jī)制的最可能的組成。
11.1微管蛋白(MTP)的分離公開的方法，如Gaskin等，1974,“Turbidimetric studies of the in vitroassembly and disassembly of porcine neurotubules”,J.Mol.Biol.89:737-758；Tiwari等，1993，“使微管蛋白得率成倍的pH和溫度依賴的循環(huán)方法”，Anal.Biochem.215:96-103，適合于MTP的制備和對(duì)聚合作用的光學(xué)試驗(yàn)。使牛或兔腦在含100mM Pipes/K+(pH7.4)、4M EGTA、1M MgCl2、0.5mM DTT和0.1mMPMSF的等體積冰冷緩沖液(pH7.4)里均質(zhì)化，在4℃下以39000g離心1小時(shí)。向該上層液中加入DMSO(8％最終濃度)和GTP(1mM最終濃度)，然后在37℃下培養(yǎng)30分鐘。使微管在37℃、100,000g下成丸達(dá)30分鐘。讓丸化物在冰上培養(yǎng)15分鐘，然后再懸浮于冰凍的PEM緩沖液(100mM Pipes/K+(pH6.9)、1mMEGTA、1mM MgCl2)。再重復(fù)一次溫?zé)岬木酆戏磻?yīng)和冰凍的去聚合反應(yīng)循環(huán)，用冰凍的、再懸浮單體化的MTP(8-10mg/ml蛋白質(zhì))對(duì)聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行光學(xué)試驗(yàn)。兔腦或牛腦都得到同樣的MTP制劑。
光學(xué)試驗(yàn)的組合物如圖和表12所示。通過加入100微升MTP溶液(相當(dāng)于0.8-1.0毫克蛋白質(zhì))來開始聚合反應(yīng)，然后在裝有熱溫度控制的試管支持器的Perkin-Elmer552雙束分光計(jì)測(cè)量在350nm的吸收以測(cè)量原始的線性速度增加，并在37℃下記錄。(見圖1)11.2結(jié)果和討論圖18顯示了MTP的聚合的光學(xué)分析。除了GTP濃度是1mM(右側(cè)曲線)、DIME的濃度為4μM(左側(cè)曲線)外，其它按照表7的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。很明顯MTP聚合作用以線性方式進(jìn)行。這樣最大的聚合速率條件符合如Berne,B在1974“Interpretation of light scattering from long rods”,J.Mol.Biol.89:755-758一文所述。因此，可以通過比較各種藥物和活化劑濃度存在下的線性速度來測(cè)定〔DIME〕和〔GTP〕之間的定量相關(guān)性。1mM GTP濃度下，DIME濃度梯度地增長(zhǎng)會(huì)抑制MTP聚合作用(圖18)。
如圖20所示，1μM DIME與〔GTP〕定量相關(guān)的抑制和雙倒數(shù)圖產(chǎn)生了“混合”類型的抑制，Dixon等，1964,Enzymes,234-237頁，Acad.Press,Inc.，美國(guó)紐約。V最大和km值在50％的km的GTP從6.7μM改變成14μM，而v最大降低到50％時(shí)發(fā)生改變?；旌弦种频淖詈?jiǎn)單介入，根據(jù)Briggs-Haldane等式(參見7)是k2，即，〔ES〕分解成E和P(產(chǎn)物)，直接被影響，然后它改變了km和v最大。k2的真正性質(zhì)是未知的，它需要對(duì)GTP水解反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，已有著作進(jìn)行報(bào)道。變構(gòu)修飾也可得到相似的結(jié)果，Dixon等，1964 Enzymes,234-237頁，Acad.Press,Inc.，美國(guó)紐約。本實(shí)驗(yàn)的目的是將DIME與它的類似物對(duì)MTP聚合反應(yīng)的效果進(jìn)行比較(參見表12)，用細(xì)胞病理方法(如體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng))來校正結(jié)果。
在DIME和作用于MTP聚合(表13)的其類似物7的化學(xué)結(jié)構(gòu)和它們對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制性之間有很明顯的相關(guān)性(與表8比較或上述的Mendeleyev等文獻(xiàn)比較)。例如，取代基R1用EtO和正-丁氧基代替CH3O會(huì)逐漸消除MTP聚合作用的抑制性，幾乎都平行于減少抗腫瘤生成作用(與表8或上述的Mendeleyev等文獻(xiàn)比較)。另一方面，R2取代基中，羧酸代替甲酯會(huì)完全消除對(duì)MTP聚合作用的抑制效應(yīng)，但使抗腫瘤生成作用減少一半，該實(shí)驗(yàn)對(duì)E-ras20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行(參見表8和圖5或上述的Mendeleyev等)?？赡苁沁@類用量差異會(huì)影響細(xì)胞類型的特異性改變。
表13DIME和一些類似物在體外微管組裝件里的作用

化合物序號(hào)R1R2對(duì)初始速度的抑制百分?jǐn)?shù)1CH3O CH3O932EtO CH3O764n-BuO CH3O86CH3O HO 05CH3O EtO 357CH3O H2N 439CH3O (CH3)2N618 CF3O CH3O7該分析系統(tǒng)由240微升含8％DMSO的PEM緩沖液和GTP(最終濃度為1mM)、10μM最終濃度的藥物(加入3微升)或溶劑對(duì)照物和0.6毫克MTP(60微升)構(gòu)成。在37℃下、λ=350nm下檢測(cè)微管組裝件，最初速度被計(jì)算為mA350/分鐘。對(duì)照的最初速度為180mA350/分鐘。這些值是雙份分析的平均值。
對(duì)MTP聚合的抑制會(huì)有很復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)果。在胞質(zhì)分裂中該抑制干擾了微管的牽引力，并防止形成斷裂的皺紋，而所述的皺紋是細(xì)胞分裂所必需，Burton等，1997,“Traction force of cytokinesis measured with optically modified elasticsubstrate”,Nature 385:450-454。由DIME對(duì)MTP聚合的抑制應(yīng)當(dāng)用該藥物的生化位點(diǎn)進(jìn)行校正。與Mendeleyev等(同上)進(jìn)行比較，DIME直接活化pp2-酶，因此需要用有DIME誘導(dǎo)的染色體相關(guān)的現(xiàn)象與該效果等同。例如，最近Kawabe等在1997,”HOXII interacts with protein phosphatase pp2a and ppl and disruptsG2/M cell cycle check point”Nature 385:454-458一文報(bào)道了，pp2-酶可調(diào)節(jié)G2/M過渡時(shí)期，pp2-酶也是潛在的致癌基因，它對(duì)促進(jìn)腫瘤生成進(jìn)行抑制。也DIME使pp2-酶活化可能抵抗腫瘤的生成。
在這些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上可見，甲狀腺素類型的類似物，如DIME能阻滯癌癥細(xì)胞的有絲分裂。本發(fā)明提供了通過使用這些技術(shù)，使用細(xì)胞類型、染色體染色或其它細(xì)胞里的DNA分析來快速篩選這類化合物。
前述說明書內(nèi)容被認(rèn)為足以使本技術(shù)領(lǐng)域人員能實(shí)施本發(fā)明。對(duì)藥學(xué)領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的人員很明顯的上述實(shí)施本發(fā)明模式的各種修飾也被包括在下列權(quán)利要求書的范圍里。
權(quán)利要求
1．一種治療哺乳動(dòng)物惡性腫瘤的方法，該方法包括對(duì)有惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物給予足以抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)的量、沒有明顯激素活性的甲狀腺素類似物，其中甲狀腺素類似物的特征在于是能使約35％或更高的體外微管蛋白組合的初始速度得到抑制的化合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺素類似物具有下式
及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X=O、S、CH2、羧基或沒有；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；和R6、R7、R8和R9各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中甲狀腺素類似物具有下式
和它的藥學(xué)上可接受的鹽，其中X=O、S、CH2、羧基或沒有；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；和R7、R8各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中甲狀腺素類似物是3,5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中甲狀腺素類似物以能有效使惡性腫瘤退行的有效量給予。
6．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中惡性腫瘤選自癌和肉瘤。
7．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中甲狀腺素類似物由口服給予。
8．一種治療癌癥的方法，該方法包括對(duì)有癌癥的哺乳動(dòng)物給予治療腫瘤有效量的甲狀腺素類似物，其中甲狀腺素類似物具有下式
及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X=O、S、CH2、羧基或沒有；Y=O或S；R1=甲基或乙基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基和鹵素；和R6、R7、R8和R9各自獨(dú)立地選自H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)鏈烯基、(C1-C4)炔基、羥基、(C1-C4)烷氧基、鹵素、NO2和NH2。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中癌癥選自癌和肉瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了用無明顯激素活性的甲狀腺素類似物治療腫瘤癌癥,特別是惡性腫瘤的方法。甲狀腺素類似物以有效地使惡性腫瘤生長(zhǎng)抑制或退行的量或治療癌癥有效的量給予患者。特別優(yōu)選的甲狀腺素類似物是能使約35%或更高的體外的微管蛋白組合的初始速度得到抑制。
文檔編號(hào)A61K31/192GK1226826SQ97196979
公開日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1997年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月4日
發(fā)明者E·庫(kù)恩, J·門德列耶夫 申請(qǐng)人:奧科特默股份有限公司