IL－12與IFNα在治療傳染性疾病中的用途的制作方法

專利名稱：IL－12與IFNα在治療傳染性疾病中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及聯合使用白細胞介素-12(IL-12)與干擾素-α(IFNα)預防和治療傳染性疾病的領域。這種聯合用藥特別適用于預防和治療慢性傳染性疾病，例如病毒感染、細胞內細菌感染和寄生蟲感染。
傳染性疾病是成人發病和死亡的主要原因(Marglois(1993)《傳染性疾病雜志》168,9-14)。例如，病毒性肝病有可能誘發肝硬化及大多數肝癌，使每年有150萬人死于該病。目前據估計，全球有3億人以上是慢性肝炎B感染的攜帶者，而且每年還要新增5千萬人以上(Finter等(1991)《藥物》42,749-765)。慢性肝炎C感染盡管不是很常見，它也可能繼發肝硬化和肝細胞癌(3)，并且也許是西方國家肝病的主要致病因素(Scrip 2176(1996)p.20)。因此這些病毒感染的防治領域存在大量藥物需求。
這些傳染病的持續與T細胞產生耐受性并且沒有清除病毒有關(Reis&Rouse(1993)《今日免疫學》14,333-335)。目前，使用Ⅰ型干擾素也就是IFNα的療法，在促進病毒的清除方面已得到成功，實驗中測得血清中病毒RNA消失，患者的血清已發生轉化。不過，通常只在一部分患者體內觀察到持續療效，即25-30％表現有長期反應的肝炎B患者(Finter等，出處同上)。肝炎C患者產生的反應性是不定的，可取決于感染病毒的基因類型(Clarysse等(1995)《荷蘭醫學雜志》47,265-271)。Ⅰ型IFN療法的副作用包括流感樣癥狀、疲乏、體重下降和血小板數減少，限制常規用于臨床的最大劑量，降低了反應率。因此，能補充Ⅰ型IFN的作用的一些療法能夠有效提高反應率和改進慢性肝炎病毒感染的免疫療法的臨床療效。
白細胞介素12(IL-12)曾被稱為天然殺傷細胞刺激因子(小林等(1989)《實驗醫學雜志》170,827-845)和細胞毒淋巴細胞成熟因子(Stern等(1990)《美國國家科學院院報》87,6808-6812)，在幾種鼠腫瘤模型中具有潛在的抗腫瘤和抗轉移活性(Brunda等(1993)《實驗醫學雜志》178,1223-1230；Nastala等(1994)《免疫學雜志》153,1697-1706)。盡管IL-12發揮其抗腫瘤作用的機理尚不完全為人所知，但IL-12已顯示出具有誘導自然殺傷細胞和T細胞在體外的多種生物作用(Manetti等(1994)《實驗醫學雜志》179,1273-1283；Wu等(1993)《免疫學雜志》151,1938-1949；Tripp等(1993)《美國國家科學院院報》90,3725-3729；Seder等(1993)《美國國家科學院院報》90,10188-10192；Bloom等(1994)《免疫學雜志》152,4242-4254；Cesano等(1993)《免疫學雜志》151,2943-2957；Chan等(1992)《免疫學雜志》148,92-98)。IL-12激活細胞毒T淋巴細胞的作用在其抗腫瘤活性中被認為是至關重要的(Brunda等(1993)《實驗醫學雜志》178,1223-1230)。在嚴重性聯合免疫缺陷(8CID)和裸鼠(兩者均為T細胞缺損)中，以及在CD8+耗竭的胸腺機能正常的小鼠中，IL-12的抗腫瘤作用都有部分地保持(Brunda等(1993)《實驗醫學雜志》178,1223-1230；O′Toole等(1993)《免疫學雜志》150,294A)。這些結果證明，IL-12對鼠腫瘤具有潛在的體內抗腫瘤和抗轉移作用，還證明了CD8+T細胞對間介抗皮下腫瘤也具有關鍵作用。
干擾素(IFN)是天然來源的蛋白質，它們具有抗病毒、抗增生和免疫調節活性。已知人體中存在有四類截然不同的干擾素(Pestka等(1987)《生物化學年評》56,727-777；Emanuel&Pestka(1993)《生物化學雜志》268,12565-12569)。IFNα族代表了外周血白細胞受刺激產生的主要一類IFN(Pestka等，出處同上；Havell等(1975)《美國國家科學院院報》72,2185-2187；Cavalieri等(1977)《美國國家科學院院報》74,3287-3291)，成淋巴細胞和成髓細胞的細胞系受刺激也產生IFNα(Familletii等(1981)《抗微生物制劑與化學療法》20,5-9)。IFNα的抗病毒作用不是通過直接作用于病毒本身來實現，而是在抗病毒感染的保護作用的意義上由于其對靶向細胞的活性來實現其抗病毒作用。干擾素對癌腫瘤能夠發揮作用，還能夠對機體免疫系統產生影響，例如，激活巨噬細胞和NK細胞，強化細胞膜上大量免疫學上具有顯著作用的成分的表達。有關干擾素-cDNA的制備及其直接表達(尤其是在大胸肝菌中)的詳細論述，已成為許多公開出版物的主要內容。因此，例如重組干擾素的制備是已知的，例如可參見《自然》295(1982),503-508，《自然》284(1980),316-320,《自然》290(1981),20-26,《核酸研究》8(1980),4057-4074，以及歐洲專利第32134、43980和211148號。
IFNα已被證實對病毒感染的治療是有效的，例如肝炎B與肝炎C病毒(HBV、HCV)傳染，不過大量患者對該細胞活素并不產生應答。IL-12促進Thl成熟和提高CTL與NK活性的能力可能是其能夠對抗小鼠病毒傳染模型具有保護作用的關鍵(Orange等(1994)《免疫學雜志》152,1253-1264)。
本發明涉及聯合使用IL-12和IFNα來預防和治療傳染性疾病的領域。令人驚奇的是，次優劑量IL-12與IFNα最適度下的劑量促成了體外與體內抗傳染性疾病的有效保護作用，尤其是抗病毒與寄生蟲感染和細胞內細菌感染。
按照本發明，聯合使用IL-12與IFNα并與一種藥學上可接受的載體一起，對傳染性疾病的治療和預防是有效的，尤其是對慢性傳染性疾病，更優選為病毒感染，例如皰疹(HSV)、HIV、肝炎B、肝炎C等；細胞內細菌感染，例如肺結核、沙門氏菌病、李司忒氏菌病等；和寄生蟲感染，例如瘧疾、利什曼原蟲病、血吸蟲病。這些組合物的特征在于IL-12與IFNα相互具有協同作用。它們易于通過不同途徑給藥，包括胃腸外途徑，而且給藥量是安全的和足以治療或預防這些傳染性疾病。上述藥物組合物可含有用于治療傳染性疾病的其它化合物。本發明也提供了上述這些化合物在制備治療和預防上述傳染性疾病的藥物中的用途。
附圖的簡要說明

圖1鼠T輔助淋巴細胞體外分化為成熟Th1或Th2細胞。CD4+T淋巴細胞從鼠脾臟提取。這些細胞用固定的抗CD3抗體激活。用IL-12、IL-4和/或IFNα培養5天后，用ELISA法分析上清液的IFNγ和IL-10。
圖2用IL-12和/或IFNα分化的輔助T淋巴細胞產生IFNγ。純化的CD4+脾細胞用抗CD3激活。將該細胞在含有IL-12和/或IFNα的培養基中培養5天。
圖3用IL-12和/或IFNα分化的輔助T淋巴細胞產生IL-10。純化的CD4+脾細胞用抗CD3激活。將細胞在含有IL-12和/或IFNα的培養基中培養5天。用ELISA法測定IL-10。
圖4IL-12與IFNα共同給藥抗全身HSV感染在用IL-12、IFNα或運兩種細胞活素的聯合治療后，將BALB/c小鼠(每組15只)用HSV-2感染，如一些方法中所述。測量每天的死亡率，直至第20天腹膜內注射(p.i.)，并與感染的、未治療的對照動物比較。
圖5IFNγ損耗對IL-12+IFNα的抗HSV感染保護的作用在相對于HSV-2感染時間的第-3、-1、0、2和4天用抗干擾素γ抗體給藥(XMG1、2,100μgip.)。用IL-12與IFNα治療動物，詳見實施例。
圖6用HSV-2抗原刺激脾細胞培養物產生IFNγ在感染后培養10天，從未被UV激活的、HSV-2刺激的脾細胞產生IFN-γ。
圖7IL-12+IFNα共同給藥抗全身mCMV感染的保護作用在用IL-12、IFNα或這兩種細胞活素的聯合治療后(如一些方法中所述)，將BALB/c小鼠(每組15只)用mCMV感染。每天測量死亡率，直至第14天p.i.。
本發明提供了IL-12與IFNα在制備治療傳染性疾病、尤其是慢性傳染性疾病的藥物中的用途。這些傳染性疾病是由病毒、細菌、寄生蟲和其他微生物的轉移所引起的。按照本發明，IL-12與IFNα聯合的一個特定用途是制備用于預防和治療病毒性疾病的藥物，尤其是慢性病毒感染，例如肝炎、皰疹、乳頭狀瘤、或人免疫缺陷病毒感染。本發明進一步的實施方式包括上述化合物在預防和治療細菌傳染性疾病中的用途，優選為細胞內細菌傳染性疾病，例如肺結核、沙門氏菌病或李斯特氏菌病。本發明也涉及上述化合物在治療寄生蟲感染中的用途。寄生蟲傳染性疾病包括瘧疾、利什曼原蟲病或血吸蟲病等傳染性疾病。
此外，本發明也涉及用于治療上述疾病的相應的藥物組合物。該藥物組合物的特征在于它們含有IL-12、IFNα和一種藥學上可接受的載體。這些組合物可另外含有一種或多種用于預防和治療傳染性疾病的化合物。
本發明的結果表明，次優劑量的IL-12與IFNα能夠協同產生抗傳染性疾病的保護作用，該作用至少在部分程度上是以IFNγ介導。令人驚奇的是，體外實驗數據顯示，從IL-12/IFNα治療動物的脾細胞產生IFNγ增加。因此，Th1對傳染性疾病的反應升高，強化了IL-12/IFNα聯合療法的有益效果。
已經建立起體外Th1/Th2分化系統，來分析IFNα和IL-12的作用。圖1說明了T輔助淋巴細胞體外分化成成熟Th1或Th2細胞的主要特征。圖2所示實驗證實了IFNα與次優劑量的IL-12在誘導IFNγ上的協同作用，將其作為Th1細胞活性的量度。該作用與IFNα抑制IL-10產生(一種Th2淋巴活素)有關(圖3)。
使用2型單純皰疹病毒(HSV-2)和鼠細胞肥大病毒(mCMV)建立起來的皰疹病毒感染模型進一步支持了這些數據。HSV-2的全身感染i.p感染后，HSV-2分布于多個部位，特別是外周及中樞神經系統。隨后在CNS中復制，引起致命性大腦炎。IL-12與IFNα均顯示了對HSV-2全身感染的致命作用具有劑量依賴的保護作用。實施例2中，每只小鼠使用50ngIL-12皮下注射(s.c.)或20ngIFNαi.p.，作為細胞活素的次優劑量，仍使HSV誘發的死亡率分別為100％和80％(圖4)，當次級治療劑量的IL-2與IFNα共同給藥時，觀察到第20天p.i.的存活率有顯著提高(p＜0.01)，同時死亡率降低至22％±9(表1)，而對照組為94％±4。對取自未被UV激活的、HSV-2刺激的脾細胞培養物的上清液中IFNγ的量進行比較結果是接受共同給藥治療的動物高于接受單用兩種細胞活素之一治療的動物(圖6)。用IFNγ中和抗體XMG1.2先對動物的IFNγ進行耗盡作用，可部分逆轉共同療法中所觀察到的存活率明顯升高。與IFNγ沒有耗盡的共同給藥療法(圖5)相比，存活率降低了30％(p＜0.06)。這表明，IFNγ僅是共同給藥療法產生保護作用的部分原因。表1:HSV-2(333)全身感染的小鼠存活率
三次實驗的平均±s.e.m.HSV-2的帶狀皰疹樣感染IL-12與IFNα共同給藥提高了較嚴重的帶狀皰疹樣HSV-2感染模型的存活率。HSV-2接種在皮膚表面，導致感覺神經元感染、病毒退行性軸突運輸至感覺神經節并在此部位復制。然后病毒從感染的神經節出現在受軸突支配的皮膚部位，產生特征性帶狀皰疹病變。動物也表現有漸進性CNS感染并發展為致命性大腦炎。與未經治療的病毒感染小鼠或單用單一療法治療的小鼠相比，使用IL-12與IFNα共同給藥的療法(表2)使該感染的存活率顯著升高了40％(p＜0.01)。共同給藥療法也降低了帶狀皰疹病變發展的嚴重性，盡管該作用是很不確定的(3次試驗中有2次顯著降低)。mCMV的全身感染鼠CMV感染導致機體許多大量組織產生病理改變，不過病毒復制的主要部位是唾液腺的腺泡細胞。發生死亡的原因被認為是器官組織的損傷和與之有關的免疫介導的病理上因素。在該致命的mCMV感染中，IL-12與IFNα聯合給藥所獲得的存活率高于單用單一療法治療的組。在第-2和-1天以每只小鼠5-50ngi.p.的劑量只用IL-12，對致命的mCMV感染有100％的保護作用，但在感染后給藥并不能改變疾病的病理效果。為了產生出一種IL-12的次優劑量方案，將感染的時間相對于IL-12治療的時間延遲2、4或6天。IFNα給藥在治療學上獲得抗mCMV誘發死亡率的20-30％保護作用，但沒有明顯的劑量相關的效果。初步實驗表明，每只小鼠400ng IFNαi.p.是次優劑量。該劑量的IFNα與IL-12共同給藥的療法能獲得高出受到病毒感染的對照組或單用單一療法組的存活率(表3)。這些結果在51Cr-釋放化驗中反映了用來自以相同IL-12方案治療的動物的脾細胞測量的NK活性。NK活性在IL-12治療后2天為最大，隨后以時間依賴的方式降低(數據沒有表示出來)。這說明，在該模型中所觀察到的以IL-12為媒介的存活中，NK活性起到一定作用。表2:HSV-2(333)帶狀皰疹樣感染的小鼠存活率
*兩次實驗的平均±s.e.m.表3鼠CMV感染的小鼠存活率組劑量 死亡率*窗口第5天 第10天
兩次實驗的平均±s.e.m.
總之，結果說明，次優劑量的IL-12與IFNα共同促成了體外與體內抗傳染性疾病的有效保護作用。這些研究表明，由于接受共同給藥療法的脾細胞在體外刺激后產生高濃度的INFγ，存活率升高可能與Th1誘導增加有關。
IFNγ的重要作用也已表現在對細胞內細菌(李司忒氏菌屬單核細胞質基因)的防御上。在感染前進行抗IFNγ治療可提高易感性，而重組IFNγ可提高抗藥性。IFNγ的一個主要功能是激活巨噬細胞的microzidal活性，例如產生活性的氧化中間體。此外，已有若干發現證實IFNγ對消除被感染的宿主細胞內寄生蟲(L.major)具有重要作用。鼠巨噬細胞對寄生蟲的破壞作用是IFNγ誘導這些細胞產生氧化氮的結果。
尤其是正如實驗性皰疹病毒感染模型所示，IL-12與IFNα聯合在病毒性疾病的控制上提供了優于單一療法的明顯而新的優點。
聯合治療方案在抗其它致命病毒(這里HSV-2)全身感染上提供了顯著的保護作用，所用劑量水平在單獨給藥時僅或多或少是有效的。組合療法也是顯著降低了致命HSV-2帶狀皰疹樣感染的死亡率，并且重要的是已表現為降低該感染模型病變的嚴重程度。后一個觀察結果表明，聯合療法將對限制病毒性疾病的臨床表現有效。IL-12與IFNα聯合也顯著提高了其他致命mCMV感染的存活率，而在以前，我們在單獨給藥治療時對此是無能為力的。
在一些實施例中，IL-12在預防學意義上給藥，也就是說，在小鼠暴露給病毒抗原之前給藥。因此，IL-12對聯合療法的戲劇性作用的貢獻很可能是通過非特異性機制、特別是通過誘導IFNγ來起作用的。數據證實，由共同給藥療法提供的大部分保護作用都歸因于IFNγ的誘導作用。IL-12/IFNα聯合對存活的體內協同作用可以與體外脾細胞對IFNγ產生的抗原特異性誘導作用相關。
IL-12與IFNγ均是對宿主免疫應答施加影響的自然界存在的分子，這兩種細胞活素都具有控制病毒性疾病的能力。據目前所知，IL-12與IFNα的作用方式是非常不一樣的，不過近來有證據顯示，有可能存在一種途徑，IFNα藉此改變IL-12的表達水平。誘導這兩種細胞活素(或之一)的結果是產生一種不利于病毒繼續感染的免疫環境。
IL-12通過影響免疫狀況發揮其抗病毒作用。具體來說，IL-12誘導IFNγ，提高NK細胞對病毒感染細胞的溶胞作用，并誘導Th1型應答。Th1表現型細胞反應發展的結果是CD8+T細胞對病毒感染細胞的細胞毒性增加了，以及一類免疫球蛋白轉變為IgG2a，同時抑制IgE合成。于是IL-12優化了有效清除病毒所需的環境。
與IL-12相比，IFNα被認為不是主要通過免疫調節來發揮作用的，而是誘發感染細胞的一般性抗病毒狀態(Gresser等(1976)《實驗醫學雜志》144,1316-1323)。抗病毒狀態涉及誘發針對病毒復制周期中一定范圍階段的細胞機制。IFNα激活了細胞核內干擾素刺激反應成分(ISRE)，導致大量蛋白質的產生。這些蛋白質包括具有特異性抗病毒功能的Mx蛋白質(Weitz等(1986)《干擾素研究雜志》9,679-689)，一種被雙鏈RNA激活為磷酸化真核生物起始因子2的蛋白激酶，依次阻滯轉譯和病毒組合(Hovanessian(1989)《干擾素研究雜志》9,641-647)，和2′,5-低聚腺苷酸合成酶涉及新生成病毒成分的降解作用(Pestka等，出處同上)。
IFNα與IL-12的聯合療法通過雙重方式使患者受益。首先，IL-12在引導免疫應答中的重要作用可破壞對傳染性抗原的耐受性；其次，IL-12對細胞毒T細胞反應的作用將有助于確保該反應足以促進傳染劑的整體清除效果。這種控制傳染性疾病的細胞活素聯合的方法對重要的醫藥需求領域具有潛在影響。
總之，結果說明，次優劑量的IL-12與IFNα共同促成了體外與體內抗傳染性疾病的有效保護作用。這些研究表明，由于在體外刺激后，給以共同給藥療法的脾細胞產生高濃度的IFNγ，存活增加可能與Th1誘導的提高有關。
白細胞介素-12可按本領域已知的方法制備，例如以下文獻歐洲專利申請433827號，國際專利申請WO9005147與WO9205256，小林等《實驗醫學雜志》170,827-845(1989)；Stern等(1990)《美國國家科學院院報》87,6808-6812。白細胞介素-12可按已知的常規的化學合成法、重組法制備，或可從天然原料提純。
包含在本發明組合物中的IFNα可以是來源于任何天然物質(例如白細胞、成纖維細胞、淋巴細胞)或由其衍生的物質(例如細胞系)，或者是那些用重組DNA技術制得的物質。關于IFNα的克隆和引導其表達(尤其在大腸桿菌中)已成為許多公開出版物的主要內容。重組IFN的制備是已知的，例如Gray等(1982)《自然》295,503-508,Goeddel等(1980)《自然》284,316-320和(1981)《自然》290,20-26，歐洲專利174143號。有多種類型的IFNα，如IFNαⅠ、IFNα2；還有它們的亞型包括但不限于IFNα2A,IFNα2B、IFNα2C和IFNαⅡ(也被稱為IFNαⅡ或ω-IFN)。
適用于藥物組合物的術語“IL-12”與“IFNα”也包括類似于那些純化和/或重組蛋白質的多肽，但是這種修飾是天然產生的或故意設計的，例如含有倒置、缺失、嵌入和變型的分子(如IFNα和/或IL-12的pegylated形式)以及任何可從上述分子得到的雜合的或共有的IL-12或IFNα分子。
為了實施本發明的聯合療法，IL-12聯合IFNα對患者給藥，也就是說，在患者接受IL-12的相同或不同時間階段將IFNα給藥。
有關本發明的IL-12與IFNα的藥學上可接受的制劑可用本領域普通技術人員已知的制劑方法制備。這些制劑可以通過標準途徑給藥。一般來說，這些制劑可以胃腸外給藥(例如靜脈內、皮下或肌肉內)，局部、透皮、口服或直腸途徑也包括在內。此外，這些制劑中可加入可持續釋放IL-12和/或IFNα的生物可降解的聚合物，該聚合物被植入在需要進行藥物釋放的部位附近。生物可降解的聚合物及其用途例如Brem等(1991)《神經外科學雜志》74,441-446所述。IL-12與IFNα的劑量將取決于所治療的疾病、特定的化合物及其他臨床因素，如人或動物的體重與身體條件和IL-12的給藥途徑。本發明既可應用于人類，也可應用于獸醫用途，這是可以理解的。對人胃腸外給藥來說，IL-12大約1000ng至10ng/kg體重、優選約為300ng至30ng/kg，一周1至3次，這樣劑量一般是足夠的。對IFNα來說，大約50μg至0.1μg/kg體重、優選約為15μg至1μg，一周1至3次，該劑量一般是足夠的。不過一般認為上面給出的上限和下限供說明之用，是可以突破的。
制劑包括那些適用于胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內、皮內、氣管內和硬腦膜外)給藥的制劑。制劑可以方便地以單位劑型方式存在，并可按常規制藥工藝制備。這些工藝包括將IL-12和/或IFNα與藥物載體或賦型劑混合的步驟。一般來說，通過將IL-12及IFNα與液體載體均勻地立即混合來制得這種制劑。適用于胃腸外給藥的制劑包括含水與不含水的無菌注射溶液，其中可含有抗氧化劑、緩中劑、抑菌劑以及使制劑與需接受給藥的血液等滲的溶質；和含水與不含水的無菌懸液，其中可包含懸浮劑和增稠劑。這些制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并可貯藏在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在使用前立即加入無菌液體載體，例如注射用水。
優選的單位劑量制劑是含有給藥成分的每日劑量或單位、每日亞劑量的制劑(如上所述)或其適當的餾分。
對片劑、包衣片、錠劑或硬膠囊的制備來說，本發明化合物可與藥學上惰性的、無機或有機賦型劑混合。適用于片劑、錠劑或硬膠囊的賦型劑實例包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石或硬脂酸或其鹽。
適用于軟膠囊的賦型劑例如包括植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。對溶液和糖漿的制備來說，可以使用的賦型劑例如包括水、多元醇、蔗糖、轉化糖和葡萄糖。對可注射溶液來說，可以使用的賦型劑例如包括水、醇、多元醇、甘油和植物油。對栓劑和局部或皮下用藥來說，可以使用的賦型劑例如包括天然或硬化油、蠟、脂肪和半固體或液體多元醇。藥物組合物也可含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、用于調節滲透壓的鹽、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。它們也可含有其他有治療作用的試劑。
下列實施例用來詳細說明本發明，而不是以任何方式限制本發明。
實施例例1體外Th1細胞的成熟如下進行關于Th1細胞的體外成熟實驗a)鼠脾細胞來自8-10周齡雌性C57BL7/6小鼠的脾臟用來制備脾細胞在Hank培養基+1％FCS中的單細胞懸液。按照標準方法(Cambier等(1987)《斯勘的納維亞免疫學雜志》27,59)用Geys溶液除去紅細胞，并用Percoll梯度離心法將細胞預活化。b)CD4+純化將每毫升107脾細胞在Hank培養基中培養，加入10μg/ml mAb抗IA/IE(克隆M5/114,Bhattacharya等(1981)《免疫學雜志》127,2488)和10μg/ml mAB抗CD8(克隆53-6.7,Ledbetter等(1979)《免疫學評論》47,63)。在冰上培養30分鐘后洗滌(3X)，細胞以5×106個/ml再次懸浮。加入100μl磁力珠(綿羊抗大鼠)，在4℃下旋轉30分鐘后，用磁體除去靶細胞(結合在珠上的)。CD4+細胞的純度超過90％。將這些細胞再次以106個/ml懸浮在完整的1MDM中。c)CD4+細胞的活化在48池細胞培養皿上涂mAb抗CD3(克隆2Cll,Leo等(1987)《PNAS》84,1374，涂敷濃度為5μg/ml)。洗滌培養皿(3X)，每池加入500μl純凈CD4+細胞懸液和細胞活素(IL-12、IL-4、IFN+A/D、天然IFN+)及其組合。在37℃與7.5％CO2下培養5天后，用商業上可得到的淋巴活素特異性ELISA法分析細胞培養物的IFNγ與IL-10。
例2病毒感染a)小鼠使用6至8周齡規定不含病原體的雌性BALB/c小鼠，由Harlan-Olac提供。b)病毒原料用含有2％FCS的DMEM培養基(Gibco第22320-022號)使HSV-2(菌株333)WT和mCMV Smith菌株(ATCC第VR-194號)分別在Vero(ATCC第CCL-81)單細胞層培養物和3T3L1(ECACC第86052701號)細胞中生長。當觀察到有完整的細胞病變時，用攪拌法從燒瓶中除去匯合了單細胞層。這之后通過凍融與超聲處理以釋放病毒，然后以3000rpm離心15分鐘使之澄清。用標準空斑化驗法測定單細胞層的病毒滴定度。從細胞培養物中得到的mCMV原料在此階段在小鼠體內是非毒性的，因此通過小鼠進行的病毒繼代移種制得毒性原料。簡單地說，將稀釋的原料i.p.注射到小鼠體內，感染后10天除去唾液腺。然后勻化淤血的組織，以釋放病毒，并以1400rpm離心10分鐘使之澄清。然后再將含有傳染性病毒的上清液通過小鼠進行繼代移種，產生可能體內引起100％死亡率的病毒原料。c)小鼠的HSV-2感染給動物單次i.p.注射104-105pfu/100μl，進行全身感染。每天監測動物的死亡率，直至感染后(p.i.)第20天為止。在動物左肋部用25G針在皮上劃痕，涂以含有106pfu病毒的10μl飛沫，進行帶狀皰疹樣感染。每天監測動物的帶狀皰疹樣病變發展情況和死亡率，直至第14天p.i.為止。d)小鼠的mCMV感染在所有致命感染實驗中，用5×103pfu唾液腺衍生的病毒制劑感染小鼠。每天監測感染的病征、記錄死亡率，直至第15天p.i.為止。e)用IL-12與IFNα給藥以5ml每kg體重i.p.注射或皮下(s.c.)注射PBS+1％w/v BSA中的50ng重組鼠IL-12(比活度為2.1×108U/mg)(Hoffmann-La Roche,Nutley,NJ)。治療性給藥開始于感染后6小時，以后每天一次，持續4天。預防性療法由在感染前如結果中所述的時間的兩次注射組成，每天一次。以5ml每kg體重i.p.注射PBS+1％w/v BSA中的重組人IFNα-A/D(比活度為5×107U/mg)(Hoffmann-La Roche,Nutley,NJ)，時間是感染前2小時，然后是4、24、48和72小時p.i.。劑量范圍為每天20與400mg之間。f)體內IFNγ的耗竭大鼠抗小鼠IFNγ抗體，XMG1.2(Pastka等(1987)出處同上)。該IFNγ中和抗體在無菌注射用水中以5ml每kg體重i.p.給藥。為了實現體內IFNγ耗竭，每只小鼠在相對于感染的第-3和-1天、感染后第0和2與5天給以總計為5次劑量的100μg IFNγ抗體。該方案體內使由IL-12治療產生的血清IFNγ水平降低了大約95％。g)體外IFNγ產生在感染后第7至10天從每組得到脾的單細胞懸液，然后在103pfu未被UV激活的HSV-2的存在下，在37℃、5％CO2條件下，在完整的RPMI1640(Gibco培養基第52400-033號)中培養48小時。然后除去上清液，在-80℃下冷凍，然后用商業上可得到的試劑盒(Amersham培養基第RPN2717號)；通過ELISA法化驗IFNγ水平。
權利要求
1．白細胞介素-12(IL-12)與干擾素-α(IFNα)的聯合使用在制備治療和預防感染的藥物中的用途。
2．根據權利要求1的用途，其中的感染是一種慢性感染。
3．根據權利要求2的用途，其中的感染是一種慢性病毒性感染。
4．根據權利要求3的用途，其中的感染是肝炎、乳頭狀瘤、人免疫缺陷癥或皰疹病毒感染。
5．根據權利要求1或2的用途，其中的感染是一種細菌感染。
6．根據權利要求5的用途，其中的感染是肺結核、沙門氏菌病或李斯特氏菌病。
7．根據權利要求1或2的用途，其中的感染是一種寄生蟲感染。
8．根據權利要求7的用途，其中的感染是瘧疾、利什曼病或血吸蟲病。
9．用于治療權利要求1至8中任一項所述的疾病的白細胞介素-12與干擾素-α。
10．與一種或多種治療權利要求1至8中任一項所述的疾病的化合物聯合使用的白細胞介素-12和干擾素-α。
11．一種藥物組合物，含有白細胞介素-12、干擾素-α和一種藥學上可接受的載體。
12．權利要求11的組合物，含有一種或多種治療傳染性疾病的附加的化合物。
13．一種預防權利要求1-8中任一項所定義的疾病的方法，該方法包括將治療有效量的IL-12與IFNα對哺乳動物給藥。
14. IFNα與IL-12在預防和治療權利要求1-8中任一項所定義的疾病中的用途。
15．如上所述的本發明。
全文摘要
本發明提供了可用于治療和預防傳染性疾病的聯合的IL－12與IFN
文檔編號A61P31/04GK1218410SQ97194603
公開日1999年6月2日 申請日期1997年5月7日 優先權日1996年5月13日
發明者戈特弗里德·阿爾伯, 杰奎琳·A·卡爾, 弗蘭克·A·馬特納, 邁克爾·J·馬爾奎因, 凱瑟琳·帕爾默, 瓊·A·L·羅格森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司