專利名稱：適宜用于抗原特異性免疫抑制治療的新型肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及一些肽以及它們在自身免疫疾病中關節軟骨的慢性破壞的治療中的用途、含有這些肽的藥物組合物、檢測樣品中自身反應性T細胞的診斷方法以及用于該方法的檢測試劑盒。
免疫系統是建立在通過構建針對自身抗原的耐受性而獲得的對異源抗原(非自體抗原)和自身抗原(自體抗原，衍生自個體自身)區別對待的原則上的。
免疫系統對抗異源蛋白對個體加以保護且通過激活如T-和B-淋巴細胞的特異性細胞和產生象白細胞介素、抗體和補體因子的可溶性因子對異源抗原的出現加以應答。免疫系統應答的抗原由抗原提呈細胞(APC)降解且該抗原的一個片段與一種主要組織相容性復合物(MHC)Ⅱ類糖蛋白一起表達在細胞表面上。此MHC糖蛋白-抗原片段復合物被提呈到T細胞上，后者憑借其T細胞受體共同識別抗原片段和與其結合的MHCⅡ類蛋白質。這樣，該T細胞被活化(即增殖和/或產生白細胞介素)導致引起該抗原遭受攻擊的活化的淋巴細胞的擴展(Grey等人，科學美國人(Sci.Am.)261:38-46,1989)。
自體抗原作為抗原片段通過MHC糖蛋白也不斷被加工和提呈到T細胞(Jardetsky等人，自然(Nature)353:326-329,1991)。自體識別因此對免疫系統而言是固有的。在普通環境下免疫系統對自體抗原耐受且避免激活對這些自體抗原的免疫應答。
當失去對自體抗原的耐受，免疫系統針對一種或多種自體抗原被激活，從而導致自身反應性T細胞的活化以及自身抗體的產生。這些現象稱為自身免疫。由于免疫反應一般是破壞性的(即指破壞入侵的異源抗原)，自身免疫反應可引起身體自己組織的破壞。
已通過一些研究確立了T細胞對自身免疫疾病的作用。在鼠中，實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)通過一高度限制性T細胞群介導，它們通過對復合到MHCⅡ類分子上的髓鞘質堿性蛋白質(MBP)的單一表位的特異性相關聯。在Lewis大鼠(一個對不同自身免疫疾病有高度易感性的種)中，已證實由T細胞介導該疾病。
在人自身免疫疾病中也認為與自身攻擊性T細胞的發育有關。一種破壞性自身免疫反應已參與不同疾病如類風濕性關節炎(RA)，其中關節軟骨的完整性通過慢性炎癥過程被破壞。軟骨的存在似乎對維持局部炎癥反應是必需的已證實在RA中軟骨的降解與軟骨反應性自身反應性T細胞的活性相關(Sigall等人，臨床實驗類風濕學(Clin.Exp.Rheumat.)6:59,1988；Glant等人，Biochem.Soc.Trans.18:796,1990；Burmester等人，類風濕性關節炎(Rheumatoicl arthritis)Smolen,Kalden,Maini(編)Springer-Verlag Berlin Heidel berg,1992)。此外，通過外科手術從RA病人中移去軟骨顯示降低了炎癥過程。因此軟骨蛋白被認為是有能力刺激T細胞的靶自身抗原。這些自身反應性T細胞的激活導致自身免疫疾病的發展。因此可以預期這些T細胞功能性的消除可對破壞性自身免疫過程的下調是有益的。然而，對類風濕性關節炎起始起作用的自身抗原性成分的確認目前仍舊難以捉摸。
導致軟骨破壞的炎性反應可以用不同的藥物治療。然而，這些藥物是非特異性的且有毒性副作用的免疫抑制劑。非特異性免疫抑制法因之成為極不適宜的治療。
抗原特異性無毒性免疫抑制法如WO-A-95 10 301中所述提供了一種非常吸引人的非特異性免疫抑制法的替代療法。該抗原特異性治療包括用類似或模擬存在于自身抗原之表位的合成T細胞反應性肽對病人治療。這些肽因而可用于誘導既針對它們自身也針對自身抗原的系統性免疫耐受(即特異性T細胞耐受)。誘導的系統性免疫耐受是基于長期觀察的現象，即已用一種抗原或表位喂食或吸入它后的動物當通過系統性途徑用該抗原或表位誘導該動物時不易產生針對該抗原或表位的系統性免疫應答。為了有效地使用肽誘導的系統性免疫耐受療法以治療T細胞介導的軟骨破壞，十分需要這樣的T細胞反應性肽，它們可使病人對活化負責炎性過程的T細胞的自身抗原脫敏。
本發明的目的在于提供在患T細胞介導的軟骨破壞的病人中可誘導對相應的軟骨抗原的系統性免疫耐受的肽，更具體地為特異性T細胞耐受。本發明的另一目的在于提供一種檢測參與關節軟骨破壞的自身反應性T細胞的方法以及用于此方法的檢測試劑盒。
本發明提供這樣的肽。
在本發明的第一方面提供了含有16到55個氨基酸的肽，該肽含有至少一種下列的氨基酸序列LVCYYTSWS (SEQ ID NO:60), FLCTHIIYS (SEQ ID NO:61), IIYSFANIS(SEQ ID NO:62), LKTLLSVGG (SEQ ID NO:63) , FIKSVPPFL (SEQ IDNO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO: 65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO:66),YDIAKISQH (SEQ ID NO:67), LDFISIMTY (SEQ ID NO:68), FISIMTYDF(SEQ ID NO:69), FRGQEDASP (SEQ ID NO:70), YAVGYMLRL (SEQ IDNO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO:72), LAYYEICDF (SEQ ID NO:73),LRGATVHRT (SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG (SEQ ID NO:75), LAGAMVWAL(SEQ ID NO:76), VWALDLDDF(SEQ ID NO:77)或LDLDDFQGS(SEQ IDNO:78)。
具體的，根據本發明的肽含有至少一種下列氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2),LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6),PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ IDNO:16), TFIKSVPPFLRTHGFD (SEQ ID NO:17), PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQID NO:18), HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQ ID NO:19), DLAWLYPGRRDKQHFT(SEQ IDNO:20), TIDSSYDIAKISQHLD (SEQ IDNO:28),DIAKISQHLDFISIMT (SEQ ID NO:29), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ IDNO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF(SEQ ID NO:39),GTLAYYEICDFLRGAT(SEQIDNO:46),EICDFLRGATVHRTLG (SEQ ID NO:47), RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ IDNO:48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ ID NO:53), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQID NO:54), LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55), WALDLDDFQGSFCGQD(SEQ ID NO:56)或DFQGSFCGQDLRFPLT(SEQ ID NO:57)。
優選的，根據本發明的肽含有一種下列的氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG (SEQID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS(SEQIDNO:34),DYAVGYMLRLGAPASK (SEQIDNO:37),MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54)或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55) 。
更優選的，根據本發明的肽含有一種或多種下列氨基酸序列YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34),MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38),YLKLDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54)或LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55)。
根據本發明的肽含有16到55，優選地16到35，更優選地16到25，最優選地為16個氨基酸殘基。
根據本發明高度優選的肽是含有下列氨基酸序列的十六肽YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1) YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2),LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6),PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ IDNO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD(SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55),更具體的氨基酸序列是YTSWSOYREGDGSCFP (SEQ IDNO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ IDNO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQID NO:55)。
也在發明的范圍內的是根據本發明的肽的多聚體，如根據本發明的肽的二聚體或三聚體。一個根據本發明的多聚體也可以是含有同一肽的多聚體的均聚體(homomer)或是含有不同肽的異聚體(heteromer)。
根據發明的肽的特征性氨基酸序列可由隨機氨基酸序列做為兩側翼序列。優選的是對該肽有穩定化效果從而增加它們的生物學效力的兩側翼序列。
本發明基于這樣的出乎意料的發現，即人軟骨糖蛋白39(此后稱為HC gp-39)是激活特異性T細胞從而引起或介導炎性過程的RA病人中的靶自身抗原。HC gp-39產生的肽主要由來自RA病人的自身反應性T細胞識別而極少由來自健康供體的T細胞識別，這表明HC gp-39是RA中一種自身抗原。HC gp-39的關節炎致病特性在Balb/c鼠中被進一步證實。在Balb/c鼠中該蛋白的單次皮下注射可以引發動物中關節炎的征兆。HC gp-39所誘導疾病的過程特征為在前爪和/或后爪中周期性間歇發作且逐漸從輕微關節炎發展成為更嚴重的形式。也觀察到受損關節的對稱分布，其與間歇性發作的復發和結節的形成的觀察資料一起提示關節炎中尤其是RA的疾病過程。
更令人吃驚的是發現HC gp-39的使用導致免疫耐受且更重要的是延遲和/或抑制關節炎的發展。
由SEQ ID No.60-78列出的氨基酸序列，更具體的由SEQ ID No.1,2,5,6,12,16-20,28-30,34,37-39,46-48,53-57列出的序列與存在于HC gp-39的MHCⅡ類限制性T細胞表位相似。因此，根據發明的肽也可以理解為包括含有一種或多種上述確認的MHCⅡ類限制性T細胞表位的自身抗原HC gp-39的片段，它們也在本發明范圍之內。
雖然HC gp-39已在Hakala等人生物化學雜志(J.Biol.Chem.)268卷，No.34,25803(1993)中描述，其中它被描述為幾丁質酶蛋白質并建議作為類風濕性關節炎的一種合適的標記，但沒有針對HC gp-39的關節炎致病特性的暗示和建議。
根據發明的這些肽可以通過周知的用于肽合成的有機化學方法來制備，例如在美國化學協會雜志(J.Amer.Chem.Soc.)85:2149(1963)和國際肽蛋白質研究(Int.J.Peptide Protein Res.)35:161-214(1990)中所述的固相肽合成。
根據發明的這些肽也可由重組DNA技術制備。編碼根據發明的肽或其多聚體的核苷酸序列被插入到一個表達載體中。合適的表達載體是包含有復制和表達必需的控制區域的質粒、粘粒、病毒和YAC(酵母人工染色體)等等。表達載體可以被引入一宿主細胞中表達。合適的宿主細胞是例如細菌、酵母細胞和哺乳動物細胞。這些技術為本領域周知，如見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，1989。
根據發明的這些肽是T細胞反應性肽，其能被活化的自身反應性T細胞所識別也能刺激它們。這些自身反應性T細胞可在RA病人的血液中發現，但極少在健康供體中發現。
因此，根據本發明的這些合成肽(這些肽與在靶自身抗原HC gp-39上的MHCⅡ類限制性T細胞表位相似)非常適于治療，以在患T細胞介導的軟骨破壞(如關節炎，更具體的為類風濕性關節炎)的哺乳動物(更具體的為人)中誘導對HC gp-39的特異性T細胞耐受。
雖然WO95/01995和WO95/02188描述了作為RA標記的HCgp-39的診斷用途，但既未公開也未涉及HC gp-39的致關節炎特性。他們也未暗示或涉及根據本發明的HC gp-39或T細胞反應性肽的片段在抗原或肽特異性治療中用以在遭到攻擊的軟骨中誘導對HC gp-39的T細胞特異性耐受的用途。
根據本發明，關節軟骨受到T細胞介導的破壞的病人可以用包含一種或多種根據本發明的肽以及一種藥學可接受的載體的藥物組合物治療。根據本發明的藥物組合物的使用將誘導對遭受攻擊的關節軟骨中的自身抗原性蛋白質和其它顯示由一種或多種根據發明的肽的氨基酸序列表征的或模擬的確定的MHCⅡ類結合性T細胞表位的自身抗原的系統性免疫耐受，特別是對這些病人的特異性自身反應性T細胞的耐受。所誘導的耐受從而將導致在遭受攻擊的關節軟骨中局部炎性反應的降低。
非常適用于本發明的藥物組合物中的肽是有16-55，優選地16-35，更優選地16-25，最優選地16個氨基酸殘基的肽，這些肽包含至少一種下列的氨基酸序列LVCYYTSWS (SEQ ID NO:60), FLCTHIIYS(SEQ ID NO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO:62), LKTLLSVGG (SEQ IDNO:63), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO: 65),LYPGRRDKQ (SEQ ID NO:66), YDIAKISQH (SEQ ID NO:67), LDFISIMTY(SEQ ID NO:68), FISIMTYDF (SEQ ID NO:69), FRGQEDASP (SEQ IDNO:70), YAVGYMLRL (SEQ ID NO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO:72),LAYYEICDF (SEQ ID NO:73), LRGATVHRT (SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG(SEQ ID NO:75), LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76), VWALDLDDF (SEQ IDNO:77) 或 LDLDDFQGS (SEQ ID NO:78),更具體的是一種下列的氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1),YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5),THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12),NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ ID NO:16), TFIKSVPPFLRTHGFD (SEQ IDNO:17), PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQ ID NO:18), HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQID NO:19), DLAWLYPGRRDKQHFT (SEQ ID NO:20), TIDSSYDIAKISQHLD(SEQIDNO:28),DIAKISQHLDFISIMT (SEQIDNO:29),QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ IDNO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF (SEQ ID NO:39), GTLAYYEICDFLRGAT(SEQIDNO:46),EICDFLRGATVHRTLG (SEQIDNO:47),RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ ID NO:48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ IDNO:53), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54), LAGAMFVWALDLDDFQG (SEQID NO:55), WALDLDDFQGSFCGQD (SEQ ID NO:56) 或 DFQGSFCGQDLRFPLT(SEQ ID NO:57)。
在根據發明的藥物組合物中特別優選的是有16-55，優選地16-35，更優選地16-25，最優選地為16個氨基酸殘基的肽，這些肽包含至少一種下列氨基酸序列 YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1),YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5),THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12),QHLDFISIMTYDFHGA(SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ IDNO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG(SEQ ID NO:55)。
在根據發明的藥物組合物中高度優選地是有16-55，優選地16-35，更優選地16-25，最優選地為16個氨基酸殘基的肽，這些肽包含至少一種下列氨基酸序列YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD(SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55)。
在根據發明的藥物組合物中最優選的是含有下列氨基酸序列的十六肽 YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1) YTSWSQYREGDGSCFP (SEQIDNO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ IDNO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ IDNO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD(SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55),更具體的是氨基酸序列YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ IDNO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ IDNO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQID NO:55).
根據發明的這些肽有這樣的優點與免疫抑制藥物的非特異性抑制效果相比它們對自身反應性T細胞有特異性效果從而使免疫系統的其它組份未受觸動。使用根據發明的這些肽的治療將是安全的且不會有毒性副作用。
通過使用高或低劑量的根據發明的這些肽可以獲得系統性免疫耐受。肽的量將依賴于給藥的路線、給藥時間、病人的年齡以及一般健康狀況和飲食。
一般地，可以使用0.01到1000μg肽每千克體重，優選地0.5到500μg，更優選地0.1到100μg的肽。
藥學可接受的載體為本領域技術人員周知，且包括如無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和水。其它載體可以是如MHCⅡ類分子，如需要后者可植入脂質體中。
此外，依據發明的藥物組合物可以包含一種或多種佐劑。合適的佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁、amphigen、tocophenols、單苯膦基脂質A、胞壁酰二肽和皂角苷如Quill A。優選地，根據發明用于耐受治療的佐劑是粘膜性佐劑如霍亂毒素B亞單位或carbomers，其結合到粘膜性上皮上。佐劑的量取決于該佐劑自身的本質。
此外，根據發明的藥物組合物可以包含一種或多種穩定劑如碳水化合物包括山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖，蛋白質如白蛋白或酪蛋白以及象堿性磷酸鹽的緩沖液。
合適的給藥路線是肌內注射、皮下注射、靜脈注射或腹膜內注射、口腔給藥和鼻噴霧。
根據發明的這些肽也非常適用于檢測參與慢性炎癥及關節軟骨破壞的活化的自身反應性T細胞的存在的診斷方法。
根據發明的診斷方法包括下列步驟a)從個體的血樣中分離外周血單核細胞(PBMC)，
b)在合適條件下培養該PBMC，c)在根據發明的一種或多種肽存在下培養該PBMC培養物，且d)檢測T細胞反應，如一種增殖反應，指示在個體中活化的自身反應性T細胞的存在。
T細胞增殖反應的檢測可以通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入來檢測。
也包括在發明的范圍內的是含有一種或多種根據發明的肽的檢測試劑盒。這些檢測試劑盒也適于在根據發明的診斷方法中使用。
下面的實施例是發明的闡明且不應解釋為限制發明的范圍。
實施例方法病人本研究包括7名依照ARA標準(Arnett等人，(1988)，類風濕關節炎(Arthritis Rheum.)31,315)診斷為患RA的DR4(DRB1*0401)陽性病人。經同意取得外周血樣品。他們是年齡在46-79歲的5名女性和2名男性。他們疾病的持續時間從10年以上到30年以上。七位病人中的三位至少有3個腫脹的關節。四位病人未顯示任何活動性疾病的跡象。所有病人均服藥四位病人用潑尼松(Prednisone)治療，三位病人接受抗類風濕劑且有四位病人同時用NSAID治療。
帶有DR4(DRB1*0401)特異性的來自5位健康供體的外周血樣品經同意后取得且包括在本次研究中作為對照。HLA-DR多態性的定義通過Ficoll-Paque梯度的標準離心方法分離自肝素化的外周血的病人和健康供體的外周血單核細胞用PHA(Welcome,Dartford，英國)刺激以獲得5×106-107個淋巴細胞。QIA amp血試劑盒(QIAGEN Inc.)用于根據制造商指示從培養的細胞中純化染色體DNA。利用一種DR“低分辨率”SSP試劑盒分析染色體DNA提取物。用Dynal DRB1*04-SSP試劑盒進行DR4亞型分型。MHC DR型分型在荷蘭(Nijmegen)University Hospital移植血清學實驗室(TramsplantSerology Laboratory)中進行。
表
肽的合成在Eurosequence(Groningen，荷蘭)合成這些肽。利用固相FMOC化學法以10μmol的規模從C-端到N-端合成這些肽。通過一些其它制備方法部分純化粗品肽。如制造商所示，至少35％的凍干產品中含有所需的全長產品。剩余部分含鹽和殘留的溶劑。利用序列分析、氨基酸序列分析和/或RF-HPLC檢查終產品的質量。合成的肽的序列列于表Ⅱ。
表Ⅱ用于本研究的肽的氨基酸序列
肽的HLA-DR結合鑒定利用針對DR-復合物上一種單形態決定簇的單克隆抗體L243(Lampson,L.A和R.Levy,(1980)，免疫學雜志(J.Immunol)125:293-299)從純合的EBV轉化的人B成淋巴細胞細胞系Huly138IC2和BM92中純化DR4(DRB1*0401)和DR4(DRB1*0404)分子。
通過半定量競爭結合鑒定完成肽結合研究(Joosten等人，1994，國際免疫學(Int.Immunol.)6:751)。簡言之，純化的HLA-DR分子(30nM DR4(DRB1*0401)或15nM DR4(DRB1*0404))在pH5.0下與50nM生物素化的標記肽(HA309Y→F)及一定濃度范圍的競爭性肽在終體積25μl的結合緩沖液中(含有0.01％NaN3,0.05％NP-40,5％DMSO,1mM AEBSF,1mM N-乙酰馬來酰亞胺，8mM EDTA和10μM胃酶抑素A)一起培養。在室溫(RT)下培養44小時后，利用96孔真空點雜交儀(Hybri.dot,BRL)和硝酸纖維素膜(Hybond ECL,Amersham，英國)從游離的標記肽中分離HLA-DR-結合標記肽。該硝酸纖維素濾膜用在0.1M馬來酸，150mM NaClpH7.5中的0.5％DNA封閉液(Boehringer)封閉0.5-1小時后，用含0.05％Tween20(Sigma)的PBS洗滌濾膜且與1∶10,000稀釋的鏈親和素-HRPO一起孵育(Southern生物技術)。通過Western雜交ECL試劑盒(Amersham)采用增強的化學發光術檢測生物素化的肽。對預閃的膠片曝光10分鐘(Hyperfilm-ECL,Amersham)。通過掃描膠片且用Image Quant/Excel分析軟件分析圖像。
結合DRB1*0401-編碼的分子的特定肽的親和力與標記肽的競爭相關。這種相對結合的親和力用信號降低到50％(IC50)時肽的濃度來表示。血單核細胞的增殖反應為了確認在HC gp-39內的T細胞表位，測定長度為16個氨基酸、重疊10個氨基酸的59個肽誘導來自帶有DR4(DRB1*0401)特異性的(表1)RA病人和健康對照的PBMC的增殖反應的能力。表2列出了所測試的肽的序列。
通過Ficoll-Paque梯度的標準離心法分離獲自肝素化的靜脈外周血中的PBMC。四份濃度為1.5×105細胞/孔的細胞在補加10％熱滅活的自身血漿、L-谷氨酸、2-ME和抗生素的培養基中于平底微孔板中培養。細胞分別在僅有培養基、或者有植物血細胞凝集素(PHA)存在時(2.5μg/ml)以鑒定細胞的存活、或者在有10或100μg/ml的HC gp-39衍生的肽存在下培養。在一些情況下，由于單個供者的有限的PMBC數量則測試了2或3套系列肽。培養物在總體積210μl下37℃且有5％CO2的濕潤空氣中培養7天。在最后18小時時用0.25μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]TdR)脈沖標記培養物。在燒結玻璃漏斗上收集細胞且用氣體閃爍法(Packard Matrix 96β計數儀)測量[3H]TdR的摻入。只有在10和100μg/ml均引起增殖反應的肽才認為含有一種T細胞表位。如果刺激系數值(SI，抗原特異性計數每5分鐘(cp5m)/背景cp5m)超過或等于2就定義為反應陽性。結果通過血單核細胞的增殖反應對T細胞表位的檢定通過測量在DR4(DRB1*0401)-陽性的RA病人和健康供體中的PBMC增殖反應來分析針對HC gp-39-衍生的肽的T細胞反應性。在自身血漿中測試增殖反應。在表ⅢA和ⅢB中列出的7次實驗的結果顯示針對59個衍生于HC gp-39的重疊序列的RA病人的反應(表ⅢA)和健康供體的反應(表ⅢB)。發現對兩種濃度(100和10μg/ml)的肽均反應的供體稱為反應者，而對所測的兩種濃度均不反應的供體稱為無反應者(NR)。
在一個或多個供體中觀察到對單獨的肽1、2、5、6、12、15、30、34、37、38、40、41、54和55(號碼對應于相應每種肽的SEQ ID NO，例如，肽30指有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的肽)有反應，因此將這些序列確定為T細胞表位。
有趣的是，僅在RA病人中觀察到對肽2、34、38、40、54和55有反應。
另一方面，目前肽12和41僅誘導健康供體(230,235)中的反應。
此外，如表3中所見，也發現對下列套肽肽1/2、1/2/3、4/5/6、5/6、15/16、17/18、19/20、28/29/30、29/30、37/38、37/38/39/、39/40、46/47/48、53/54、55/56和55/56/57的反應。這些結果與上面提到的大多數單獨的肽的結果相一致。此外，針對套肽的反應限定了含有附加T細胞表位的區域，即由肽16-20(112-151殘基)、28-29(184-205殘基)、38-40(244-271殘基)、46-48(292-319殘基)和53-57(334-373殘基)所覆蓋的區域。
7個DR4(DRB1*0401)陽性RA病人中的6個有針對HC gp-39衍生的肽或肽套的反應，因此將其稱為反應者。在健康供體組(HD),5個供體中的3個被稱為反應者。一般地，RA病人似乎比健康供體(健康供體230是一個例外)對更多的HC gp-39區域有反應。例如針對單獨肽測試的來自RA病人272的PBMC似乎與總數達11個肽(1、2、5、6、30、34、37、38、40、54和55)反應。其它病人(病人287是一個例外)的PBMC顯示針對與這11個肽重疊的肽套的反應且確認了含有T細胞表位(肽14-20和46-48)的一些附加區域。
來自健康供體(230)的PBMC進一步證實了在肽1、5、6、15、30和37中T細胞表位的存在。
總之，最經常識別的肽或肽套中含有肽1/2、5/6、30、37/38、54/55。T細胞表位和DRB4(DRB1*0401)結合的關聯肽1、2、5、6、12、15、30、34、37、38、40、41、54和55均被發現刺激外周血衍生的T細胞。與此發現相應的是，已發現所有這些肽以相對高的親和力結合到DR4(DRB1*0401)上(除了以中等相對親和力結合的肽2和38)。用肽套而不是用單獨的肽測試肽3、4、16、17、18、19、20、28、29、30、46、47、48、53、56和57。非常可能的是這些肽中的一些也含有相關T細胞表位。在任何情況下，這些肽全能以從高到中等的相對親和力(除了以弱相對親和力結合的肽20)與DRB4(DRB1*0401)結合。
表ⅢA來自RA病人的PBMC的肽誘導的增殖反應
pos=對100和10μg/ml的肽或肽套的反應呈陽性(SI≥2均認為陽性)。這些肽一起(長度為16個氨基酸且重疊10個氨基酸)覆蓋了成熟HC gp-39的完整的成熟序列(殘基22-383)。在Eurosequence合成這些肽(Groningen，荷蘭)。RA=類風濕性關節炎病人。0401=帶有RA相關的HLA-DRB1*0401特異性的供體。NR=無反應者。R=反應者。BG=無抗原的孔中每5分鐘×10-3所測量的背景計數的平均值。+++=高親和力結合物(IC50＜1μM)；++=良好親和力結合物(1＜IC50＜10μM)；+=中等結合物(10＜IC50＜100μM)；+/-=弱結合物(100＜IC50＜1000μM)；-=不結合物(IC50＞1000μM)。表ⅢB來自健康供體的PBMC的肽誘導的增殖反應<
pos=對100和10μg/ml的肽或肽套的反應呈陽性(SI≥2均認為陽性)。這些肽一起(長度為16個氨基酸且重疊10個氨基酸)覆蓋了成熟HC gp-39的完整的成熟序列(殘基22-383)。在Eurosequence合成這些肽(Groningen，荷蘭)。RA=類風濕性關節炎病人。0401=帶有RA相關的HLA-DRB1*0401特異性的供體。NR=無反應者。R=反應者。BG=無抗原的孔中每5分鐘×10-3所測量的背景計數的平均值。+++=高親和力結合物(IC50＜1μM)；++=良好親和力結合物(1＜IC50＜10μM)；+=中等結合物(10＜IC50＜100μM)；+/-=弱結合物(100＜IC50＜1000μM)；-=不結合物(IC50＞1000μM)。縮略語AEBSF:4-(2-氨乙酰基)-苯磺酰氟BB結合緩沖液BCA二辛可寧酸BSA牛血清白蛋白DMSO二甲基亞砜ECL增強化學發光法EDTA乙二胺四乙酸FACS熒光活化的細胞分選儀HLA人白細胞抗原HPLC高壓液相色譜HRP辣根過氧化物酶MHC ClassⅡ主要組織相容性復合物Ⅱ類NMR核磁共振NP-40:Nonider P-40PBS磷酸緩沖鹽溶液PVDF聚偏二氟乙烯RA類風濕性關節炎SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Akzo Nobel N.V.
(B)街道Velperweg76(C)城市Arnhem(D)國家荷蘭(F)郵編代碼6824BM(G)電話6421-666376(H)傳真0421-650592(I)電傳37503akpha nl(ⅱ)發明名稱適宜用于抗原特異性免疫抑制治療的新型肽(ⅲ)序列數78(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統；PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0,version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gln Tyr Arg Glu Gly1 5 10 15
(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Tyr Thr Ser Trp Ser Gln Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro1 510 15(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe15 10 15(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His Ile Ile1 5 10 15(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile1 5 10 15(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp His Ile Asp15 10 15(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述Asp His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met1 5 10 15(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu Asn Thr Leu Lys Asn15 10 15(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述Leu Tyr Gly Met Leu Asn Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述Leu Ser Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile15 10 15(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:15的序列描述Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:16的序列描述Asn Thr Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:17的序列描述Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg Thr His Gly Phe Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:18的序列描述Pro Pro Phe Leu Arg Thr His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:19的序列描述His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:20的序列描述Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg Arg Asp Lys Gln His Phe Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:21的序列描述Pro Gly Arg Arg Asp Lys Gln His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met1 5 10 15(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:22的序列描述Gln His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe Ile Lys1 5 10 15
(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:23的序列描述Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:24的序列描述Glu Phe Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:25的序列描述Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:26的序列描述Leu Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:27的序列描述Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:28的序列描述Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gln His Leu Asp15 10 15(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:29的序列描述Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:30的序列描述Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe His Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:31的序列描述Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly15 10 15(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:32的序列描述Phe His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:33的序列描述Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe Arg Gly Gln Glu Asp Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:34的序列描述Ser Pro Leu Phe Arg Gly Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser1 510 15(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:35的序列描述Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:36的序列描述Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:37的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:37的序列描述Asp Tyr Ala Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:38的序列描述Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met Gly Ile Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:39的序列描述Pro Ala Ser Lys Leu Val Met Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe1 5 10 15
(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:40的序列描述Met Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:41的序列描述Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:42的序列描述Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile1 5 10 15(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:43的序列描述Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:44的序列描述Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:45的序列描述Arg Phe Thr Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:46的序列描述Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg Gly Ala Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:47的序列描述Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg Gly Ala Thr Val His Arg Thr Leu Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:48的序列描述Arg Gly Ala Thr Val His Arg Thr Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:49的序列描述Arg Thr Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr Lys Gly Asn Gln Trp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:50的序列描述Val Pro Tyr Ala Thr Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:51的序列描述Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:52的序列描述Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser Lys Val Gln Tyr Leu Lys Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:53的序列描述Val Lys Ser Lys Val Gln Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala1 5 10 15
(2)SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:54的序列描述Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:55的序列描述Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu AspAsp Phe Gln Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO:56的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:56的序列描述Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:57的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:57的序列描述Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp Leu Arg Phe Pro Leu Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO:58的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:58的序列描述Cys Gly Gln Asp Leu Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:59的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:59的序列描述Leu Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO:60的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:60的序列描述Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser1 5(2)SEQ ID NO:61的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:61的序列描述Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser1 5(2)SEQ ID NO:62的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:62的序列描述Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser1 5(2)SEQ ID NO:63的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:63的序列描述Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly Gly1 5(2)SEQ ID NO:64的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:64的序列描述Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu1 5(2)SEQ ID NO:65的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:65的序列描述Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu1 5(2)SEQ ID NO:66的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:66的序列描述Leu Tyr Pro Gly Arg Arg Asp Lys Gln1 5(2)SEQ ID NO:67的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:67的序列描述Tyr Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gln His1 5(2)SEQ ID NO:68的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:68的序列描述Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr1 5(2)SEQ ID NO:69的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:69的序列描述Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe1 5(2)SEQ ID NO:70的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:70的序列描述Phe Arg Gly Gln Glu Asp Ala Ser Pro1 5
(2)SEQ ID NO:71的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:71的序列描述Tyr Ala Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu1 5(2)SEQ ID NO:72的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:72的序列描述Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser1 5(2)SEQ ID NO:73的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:73的序列描述Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe1 5(2)SEQ ID NO:74的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:74的序列描述Leu Arg Gly Ala Thr Val His Arg Thr1 5(2)SEQ ID NO:75的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:75的序列描述Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO:76的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:76的序列描述Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:77的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:77的序列描述Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe1 5(2)SEQ ID NO:78的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)SEQ ID NO:78的序列描述Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser1 權利要求
1．含有16到55個氨基酸殘基的肽，該肽含有至少一種下列氨基酸序列LVCYYTSWS (SEQ ID NO:60), FLCTHIIYS (SEQ IDNO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO:62), LKTLLSVGG (SEQ IDNO:63), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO:65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO:66), YDIAKISQH (SEQ ID NO:67),LDFISIMTY(SEQ ID NO:68), FISIMTYDF(SEQ ID NO:69),FRGQEDASP(SEQ ID NO:70), YAVGYMLRL(SEQ ID NO:71),MLRLGAPAS(SEQ ID NO:72), LAYYEICDF(SEQ ID NO:73),LRGATVHRT(SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG(SEQ ID NO:75),LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76),VWALDLDDF (SEQ ID NO:77)或LDLDDFQGS (SEQ ID NO:78)。
2．含有16到55個氨基酸殘基的肽，該肽含有至少一種下列氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP(SEQIDNO:2), LDRFLCTHIIYSFANI(SEQIDNO:5),THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ IDNO:12), NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ ID NO:16), TFIKSVPPFLRTHGFD(SEQIDNO:17),PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQIDNO:18),HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQ ID NO:19), DLAWLYPGRRDKQHFT (SEQ IDNO:20), TIDSSYDIAKISQHLD (SEQ ID NO:28), DIAKISQHLDFISIMT(SEQIDNO:29), QHLDFISIMTYDFHGA(SEQIDNO:30),SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ IDNO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF(SEQIDNO:39), GTLAYYEICDFLRGAT(SEQIDNO:46),EICDFLRGATVHRTLG (SEQ ID NO:47), RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ IDNO:48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ ID NO:53), YLKDRQLAGAMVWALD(SEQ IDNO:54),LAGAMVWALDLDDFQG(SEQ ID NO:55),WALDLDDFQGSFCGQD (SEQ ID NO:56) 或 DFQGSFCGQDLRFPLT (SEQID NO:57)。
3．根據權利要求1或2的肽，該肽含有至少一種下列氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG(SEQIDNO:1),YTSWSQYREGDGSCFP (SEQIDNO:2),LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ IDNO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA(SEQIDNO:30),SPLFRGQEDASPDRFS (SEQIDNO:34),DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ IDNO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54)或LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55)。
4．根據權利要求1到3的任一項的肽，該肽含有至少一種下列氨基酸序列YTSWSQYREGDGSCFP(SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ IDNO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDROLAGAMVWALD(SEQ ID NO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55)。
5．根據權利要求1到4的十六肽，該肽含一種下列氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREG(SEQ IDNO:1) YTSWSQYREGDGSCFP(SEQIDNO:2) ,LDRFLCTHIIYSFANI(SEQIDNO:5),THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ IDNO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS(SEQIDNO:34), DYAVGYMLRLGAPASK(SEQIDNO:37),MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ IDNO:54) 或 LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55)。
6．根據權利要求1到5的任一項的肽，其用作一種藥物。
7．含有根據權利要求1到5的任一項的一種或多種肽以及藥學可接受的載體的藥物組合物。
8．一種用于檢測活化的自身反應性T-細胞的診斷方法，其包括下列步驟a)從個體血樣分離外周血單核細胞(PBMC),b)在合適條件下培養PBMC,c)在根據權利要求1到5的任一項的一種或多種肽存在下培養該PBMC培養物，和d)檢測T-細胞反應，如增殖反應，顯示個體中活化的自身反應性T細胞的存在。
9．用于檢測活化的自身免疫反應性T細胞的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包含一種或多種根據權利要求1到5的任一項的肽。
全文摘要
本發明涉及含有16到55個氨基酸殘基的肽,該肽含有至少一種下列氨基酸序列:LVCYYTSWS(SEQ IDNO:60),FLCTHIIYS(SEQ ID NO:61),IIYSFANIS(SEQ IDNO:62),LKTLLSVGG(SEQ ID NO:63),FIKSVPPFL(SEQ IDNO:64),FDGLDLAWL(SEQ ID NO:65),LYPGRRDKQ(SEQ IDNO:66),YDIAKISQH(SEQ ID NO:67),LDFISIMTY(SEQ IDNO:68),FISIMTYDF(SEQ ID NO:69),FRGQEDASP(SEQ IDNO:70),YAVGYMLRL(SEQ ID NO:71),MLRLGAPAS(SEQ IDNO:72),LAYYEICDF(SEQ ID NO:73),LRGATVHRT(SEQ IDNO:74),YLKDRQLAG(SEQ ID NO:75),LAGAMVWAL(SEQ IDNO:76),VWALDLDDF(SEQ ID NO:77)或LDLDDFQGS(SEQID NO:78)。該肽可以用于T－細胞介導的關節軟骨的破壞的治療。基于這些肽的藥物組合物可用于誘導對在自身反應性T－細胞進攻下的自身抗原的系統性免疫耐受。
文檔編號A61K49/00GK1216551SQ97194031
公開日1999年5月12日 申請日期1997年4月22日 優先權日1996年4月24日
發明者A·M·H·布茨, G·F·M·威荷吉登 申請人:阿克佐納貝爾公司